专利名称:一种用于作物防病增产的微生物制剂及其制备方法
所属技术领域：
本发明涉及用于作物防病增产的微生物制剂及其制备方法。
背景技术：
作物病害如油菜菌核病、花生白绢病、茄子黄萎病、辣椒疫病、丹参根腐病、红花枯萎病、棉花立枯病和枯萎病等土传病害不但严重影响作物的产量和品质，而且病害的病原菌可以在土壤中存活和随土壤传播。对于这些病害的防治，常用的化学药剂不但防治效果差，而且滥用化学农药还会造成严重的农残污染问题。目前，国内外针对灰霉病、立枯病、白绢病、纹枯病、枯萎病等作物病害的生物防治，分离筛选出了一些具有一定防病效果的木霉菌株，并进行了相应的扩大培养研究，但还存在一些问题，如生产出的制剂适用作物少，防病范围窄；或者生产原料的来源受地域限制；或者生产工序复杂、生产成本高；或者用量较大，往往每亩需用几公斤到几十公斤。如中国专利申请“一种微生物杀菌剂及其制备方法”，公开号CN1337164A，这种微生物杀菌剂仅适用于烟草，仅对烟草立枯病、猝倒病、黑胫病、赤星病有效，其生产原料烟梗的来源地域性强，并且生产过程中需要使用专用设备发酵罐。又如中国专利申请“速效抗病真菌有机肥料及其生产方法”，公开号CN1283599，该抗病真菌有机肥用量较大，每亩需施用40kg-50kg。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于作物防病增产的微生物制剂，该种微生物制剂生产周期短、成本低；原料来源广、价格低廉；产孢量大；使用方便、安全；适用作物广、防病对象多、促生增产作用显著；还可减轻污染，为生产和发展优质无公害农产品提供技术保证。
本发明另一目的是提供一种制备上述用于作物防病增产的微生物制剂的方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是一种用于作物防病增产的微生物制剂，它含有的组分及质量配比为12～16份的哈茨木霉(Trichoderma harzianum)菌株T23 CGMCC No.0975，84～88份的植物粉碎材料，该植物粉碎材料的组成为玉米粉或麦麸或二者的混合物及米糠、玉米杆粉、棉籽壳粉、木屑中的一种或至少两种的混合物。
制备上述一种用于作物防病增产的微生物制剂的方法，其步骤依次为(1)菌种试管培养采用马铃薯葡萄糖琼胶固体培养基(PDA)，将哈茨木霉菌株T23接种于含链霉素40～70ppm的固体培养基(PDA)中，在18℃～30℃温度下，培养1～7天；(2)液体发酵培养将玉米粉或麦麸或二者的混合物与水按1∶300～500的质量比例混匀装于三角瓶中，在121℃、15磅下高温加压消毒20～30分钟，制得培养液；冷却后将(1)步试管中培养出的哈茨木霉菌株T23按接种在三角瓶中，菌株与培养液的质量比例为1∶400～500，并在温度为20℃～30℃，光暗比为1∶0.8-1.2的光暗交替环境中，恒温振荡培养3～5天；(3)固体发酵培养将米糠、玉米杆粉、棉籽壳粉、木屑中的一种或至少两种的混合物与水按1∶0.8～1.2的比例混匀，装于耐温塑料袋中，在121℃、15磅下高温加压消毒120～150分钟，冷却后倒入已消毒的培养床中，形成固体培养料；将(2)步制得的液体发酵培养物与该固体培养料按1∶8～10的质量比例接种液体发酵培养物，在18℃～32℃、相对湿度90％以上、自然光照下、消毒的培养室内，通风培养1～3天即制成固体发酵培养物。
(4)制剂的制备将固体发酵培养物自然风干至含水量在8％～10％，再用粉碎机粉碎，过100目筛后，测定孢子含量，菌株T23孢子含量达到3×1010个/克即为合格品。
本发明采用的哈茨木霉菌株T23，是从四川简阳的中药材丹参根际土壤中，利用病原菌作诱饵分离筛选而得。即采用尼龙网片作载体，先将消毒的尼龙网片放入接有病原菌的培养皿内，等尼龙网片上长满菌体后，将尼龙网片置于土样表面，培养3-5天后，拮抗木霉菌即可寄生到尼龙网片的病原菌上，揭下尼龙网片放在马铃薯葡萄糖琼胶固体(PDA)培养基上，选取木霉菌株纯化培养，就可获得具有拮抗作用的木霉菌株；通过对这些菌株与多种病原菌的拮抗试验，从中筛选出拮抗作用显著的哈茨木霉菌株T23。
该菌株对引起农作物死苗、枯萎病、根腐病和白绢病等病害的立枯丝核菌、尖孢镰刀菌、齐整小核菌等病原菌的拮抗指数达1级，对病原菌菌丝生长抑制率均在85％以上。
本发明采用的哈茨木霉菌株T23具有以下微生物学特性1、形态学特性孢子梗丛束疏松，环状排列，主分枝呈树状，次级分枝多级，常2～3个一组，直角伸出；孢子球形、近球形、或倒卵形。
2、培养学特性在PDA培养基上，1～2天菌落为白色，老熟后转为暗绿色。
该菌株已于2003年07月03日，在中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏登记号为CGMCC NO.0975。
与现有技术相比，本发明的有益效果是(1)生产周期短，操作简易。从菌种培养到制剂的生产全程仅需5～11天。
(2)生产成本低液体和固体发酵所需的培养料分别为玉米粉、米糠等，其来源十分丰富，价格低廉。
(3)产孢量大根据本方法生产出的液体发酵培养物中的木霉菌孢子含量为0.5×108～2×108个/ml；制成的微生物制剂成品中，木霉菌孢子含量在3×1010～9×1010个/克，木霉菌孢子粉的重量百分比占12％～16％，米糠、玉米粉等植物粉碎材料占84％～88％。
(4)适用作物广，防病对象多，促生增产作用显著。适用作物包括粮油作物、蔬菜、中药材，防病对象涉及由镰刀菌、立枯丝核菌、大丽轮枝菌、菌核菌、疫菌和齐整小核菌等病原菌引起的枯萎病、立枯病、菌核病、白绢病等化学农药难于防治的土传病害，防治效果显著，且可使作物显著增产。
(5)采用本发明方法制备上述的微生物制剂，不仅可以防病、增产，达到提高种植效益的目的，还可减轻污染，为生产和发展优质无公害农产品提供技术保证。
本发明的微生物制剂对多种作物防病增产的效果由下面的对比实验证明用于油菜的试验表明，油菜移栽时土壤穴施上述微生物制剂0.2kg/亩，能有效地减轻油菜菌核病的发生，对油菜菌核病的防治效果达62.9％，比目前常用的化学农药多菌灵的防治效果(55.7％)好。并且油菜的千粒重比空白对照增加5.6％，油菜增产5.3％。
用于花生的试验表明，花生播种时土壤穴施上述微生物制剂0.25kg/亩，花生出苗快、整齐、缺窝少。花生出苗早1-2天，出苗率提高7个百分点，缺窝率下降7个百分点，产量比空白对照增产10.2％。
用于辣椒的试验表明，辣椒移栽时土壤穴施上述微生物制剂0.2kg/亩，能使辣椒增产14.0％。
用于茄子的试验表明，茄子移栽时土壤穴施上述微生物制剂0.2kg/亩，能有效地减轻茄子黄萎病的发生，对其黄萎病的防治效果为55.9％，比目前常用的化学农药多菌灵的防治效果(40.4％)好，并使茄子增产12.9％。
用于丹参的试验表明，丹参播种时土壤穴施上述微生物制剂0.2kg/亩，对丹参根腐病防治效果为55.7％，与多菌灵的防治效果(57.5％)相当；对丹参出苗有促进作用，处理后的出苗率为83.8％，显著高于多菌灵的71.3％和空白对照的64.4％；并使丹参增产8.2％。
用于川红化的试验表明，川红化播种时土壤穴施上述微生物制剂0.2kg/亩，能有效控制川红花枯萎病的发生，对其枯萎病的防治效果为70.4％，高于化学药剂多菌灵的防治效果(60.9％)。并促进出苗和幼苗的生长，处理后的川红花出苗率为87.5％，显著高于空白对照的73.9％；单株鲜重和干重分别为3.23g和0.46g，均显著高于空白对照的2.70g和0.41g。
用于棉花的试验表明，棉花播种时用上述微生物制剂拌种处理棉花(制剂∶棉种为1∶100)后，可有效减少棉花死苗和枯萎病的发生。对棉花立枯病的防治效果为70.0％，对棉枯萎病的防效可达60.4％，高于或相当于化学药剂多菌灵的防治效果(分别为54.6％和61.2％)；同时，用该微生物制剂处理后的棉花出苗率为80.9％，显著高于空白对照的出苗率(51.6％)。
下面结合实施例对本发明进一步说明。
具体实施方式
实施例一本例的微生物制剂中植物粉碎材料的组成为玉米粉及米糠。其制备方法的步骤依次为(1)菌种试管培养采用马铃薯葡萄糖琼胶固体培养基(PDA)，将哈茨木霉菌株T23接种于含链霉素50ppm的固体培养基(PDA)中，在温度为25℃下，培养1～3天，具体培养时间以菌丝布满培养基表面为准。
PDA培养基中加入链霉素的目的，在于防止细菌和其它霉菌的生长。
(2)液体发酵培养采用玉米粉与水按1∶400的质量比例混匀装于三角瓶中，在121℃、15磅下高温加压消毒25min，制得培养液；冷却后将试管中的哈茨木霉菌株T23接种在三角瓶中，哈茨木霉与培养液的质量比例为1∶450，置于温度25℃，光暗比为1∶1的光暗交替环境中，振荡培养3～5天，培养制成液体发酵培养物。具体培养时间，以能确保液体发酵培养物中的菌株T23孢子含量达到0.5×108～2×108个/ml为宜。
(3)固体发酵培养将米糠与水按1∶1的质量比例混匀，装于耐温塑料袋中，在121℃、15磅下高温加压消毒130min，冷却后倒入已消毒的培养床中，按液体发酵培养物固体培养料为1∶9的质量比例接种液体发酵培养物，在温度25℃、相对湿度90％以上，自然光照，在消毒的培养室内通风培养1～3天制成固体发酵培养物。具体培养时间应以固体发酵培养物中的菌株T23孢子含量能达到3×1010～9×1010个/克为宜。
(4)制剂的制备将固体发酵培养物自然风干至含水量在8％～10％后，用粉碎机粉碎，过100目筛后，进行孢子含量测定，微生物制剂中的菌株T23孢子含量达到3×1010个/克即为合格品。
实施例二本例的微生物制剂中植物粉碎材料的组成为麦麸及玉米杆粉。其制备方法的步骤依次为(1)菌种试管培养采用马铃薯葡萄糖琼胶固体培养基(PDA)，将哈茨木霉菌株T23接种于含链霉素40ppm的固体培养基(PDA)中，在温度为22℃下，培养1～3天，具体培养时间以菌丝布满培养基表面为准。
(2)液体发酵培养采用麦麸与水按1∶500的质量比例混匀装于三角瓶中，在121℃、15磅下高温加压消毒30min，制得培养液；冷却后将试管中的哈茨木霉菌株T23接种在三角瓶中，哈茨木霉菌株T23与培养液的质量比例为1∶500，置于温度23℃，光暗比为1∶1.2的光暗交替环境中，振荡培养3～5天，培养制成液体发酵培养物。具体培养时间，以能确保液体发酵培养物中的菌株T23孢子含量达到0.5×108～2×108个/ml为宜。
(3)固体发酵培养将玉米杆粉与水按1∶0.8的质量比例混匀，装于耐温塑料袋中，在121℃、15磅下高温加压消毒150min，冷却后倒入已消毒的培养床中，按液体发酵培养物固体培养料为1∶10的质量比例接种液体发酵培养物，在温度28℃、相对湿度90％以上，自然光照，在消毒的培养室内通风培养1～3天制成固体发酵培养物。具体培养时间以固体发酵培养物中的菌株T23孢子含量能达到3×1010～9×1010个/克为宜。
(4)制剂的制备同实施例一。
实施例三本例的微生物制剂中植物粉碎材料的组成为麦麸及米糠。其制备方法的步骤依次为(1)菌种试管培养采用马铃薯葡萄糖琼胶固体培养基(PDA)，将哈茨木霉菌株T23接种于含链霉素70ppm的固体培养基(PDA)中，在温度为28℃下，培养1～3天，具体培养时间以菌丝布满培养基表面为准。
(2)液体发酵培养采用麦麸与水按1∶300的质量比例混匀装于三角瓶中，在121℃、15磅下高温加压消毒20min，制得培养液；冷却后将试管中的哈茨木霉菌株T23接种在三角瓶中，哈茨木霉菌株T23与培养液的质量比例为1∶400，置于温度27℃，光暗比为1∶0.8的光暗交替环境中，振荡培养3～5天，培养制成液体发酵培养物。具体培养时间，以能确保液体发酵培养物中的菌株T23孢子含量达到0.5×108～2×108个/ml为宜。
(3)固体发酵培养将米糠与水按1∶1.2的质量比例混匀，装于耐温塑料袋中，在121℃、15磅下高温加压消毒120min，冷却后倒入已消毒的培养床中，按液体发酵培养物固体培养料为1∶8的质量比例接种液体发酵培养物，在温度22℃、相对湿度90％以上，自然光照，在消毒的培养室内通风培养1～3天制成固体发酵培养物。具体培养时间，以固体发酵培养物中的菌株T23孢子含量能达到3×1010～9×1010个/克为宜。
(4)制剂的制备同实施例一。
实施例四本例的微生物制剂中植物粉碎材料的组成为玉米粉、麦麸的混合物及棉籽壳粉。其制备方法的步骤依次为(1)菌种试管培养采用马铃薯葡萄糖琼胶固体培养基(PDA)，将哈茨木霉菌株T23接种于含链霉素60ppm的固体培养基(PDA)中，在温度为18℃下，培养1～7天，具体培养时间以菌丝布满培养基表面为准。
(2)液体发酵培养采用玉米粉与麦麸的混合物与水按1∶450的质量比例混匀装于三角瓶中，在121℃、15磅下高温加压消毒30min，制得培养液；冷却后将试管中的哈茨木霉菌株T23接种在三角瓶中，哈茨木霉菌株T23与培养液的质量比例为1∶450，置于20℃，光暗比为1∶0.9的光暗交替环境中，振荡培养3～5天，培养制成液体发酵培养物。具体培养时间，以能确保液体发酵培养物中的菌株T23孢子含量达到0.5×108～2×108个/ml为宜。
(3)固体发酵培养将棉籽壳粉与水按1∶0.9的质量比例混匀，装于耐温塑料袋中，在121℃、15磅下高温加压消毒150min，冷却后倒入已消毒的培养床中，按液体发酵培养物固体培养料为1∶10的质量比例接种液体发酵培养物，在温度18℃、相对湿度90％以上，自然光照，在消毒的培养室内通风培养1～3天制成固体发酵培养物。具体培养时间，以固体发酵培养物中的菌株T23孢子含量能达到3×1010～9×1010个/克为宜。
(4)制剂的制备同实施例一。
实施例五本例的微生物制剂中植物粉碎材料的组成为玉米粉、麦麸的混合物及木屑。其制备方法的步骤依次为(1)菌种试管培养采用马铃薯葡萄糖琼胶固体培养基(PDA)，将哈茨木霉菌株T23接种于含链霉素70ppm的固体培养基(PDA)中，在温度为30℃下，培养1～3天，具体培养时间以菌丝布满培养基表面为准。
(2)液体发酵培养采用玉米粉、麦麸的混合物与水按1∶450的质量比例混匀装于三角瓶中，在121℃、15磅下高温加压消毒20min，制得培养液；冷却后将试管中的哈茨木霉菌株T23接种在三角瓶中，哈茨木霉菌株T23与培养液的质量比例为1∶450，置于30℃，光暗比为1∶1的光暗交替环境中，振荡培养3～5天，培养制成液体发酵培养物。具体培养时间，以能确保液体发酵培养物中的菌株T23孢子含量达到0.5×108～2×108个/ml为宜。
(3)固体发酵培养将木屑与水按1∶1.1的质量比例混匀，装于耐温塑料袋中，在121℃、15磅下高温加压消毒120min，冷却后倒入已消毒的培养床中，按液体发酵培养物固体培养料为1∶8的质量比例接种液体发酵培养物，在温度32℃、相对湿度90％以上，自然光照，在消毒的培养室内通风培养1～3天制成固体发酵培养物。具体培养时间，以固体发酵培养物中的菌株T23孢子含量能达到3×1010～9×1010个/克为宜。
(4)制剂的制备同实施例一。
上述各实施例的微生物制剂均含有12-16份质量的哈茨木霉菌株T23，84-88份质量的植物碎粉材料。
上述各实施例的固体发酵培养中使用的容器及培养室消毒的具体方式均为采用熏蒸消毒，按每平方米用高锰酸钾1g、甲醛10ml进行熏蒸10～12小时，备用。
固体发酵培养时使用的植物粉碎材料既可为上述为各实施例那样选取米糠、玉米杆份、棉籽壳份或木屑中的一种，也可以选取它们中的至少两种的混合物。
本发明的微生物制剂在液体培养、固体培养时所使用的植物材料，也可用其它适宜培养哈茨木霉菌的现有植物材料进行替代。
本发明的微生物制剂的制备步骤中1、菌种试管培养的适宜温度为22℃～28℃，在此温度条件下1～3天菌丝即可布满培养基表面；在18℃以下，菌丝生长较慢，需6天才能布满培养基表面，在30℃以上时，菌丝需7天才能布满培养基表面。
2、液体发酵培养的适宜温度为23℃～27℃，其培养时间一般为84-96小时即可满足要求；养温度在20℃以下，菌株T23孢子含量小于0.5×108个/ml，在30℃以上时，菌株T23孢子含量小于0.4×108个/ml，在23℃～27℃时，菌株T23孢子含量为0.5×108个～2×108个/ml，25℃时孢子含量达最高达2×108个/ml。
3、固体发酵培养的适宜温度为22℃-28℃，培养时间一般为36-60小时，在18℃以下时，需培养4天以上，在32℃以上时，木霉生长明显受阻，也需培养4天以上，在22℃需培养3.5天菌丝才能布满固体发酵物表面，在25℃时，菌丝1天即可布满固体发酵物表面。
权利要求
1.一种用于作物防病增产的微生物制剂，它含有的组分及质量配比为12～16份的哈茨木霉(Trichoderma harzianum)菌株T23 CGMCC No.0975，84～88份的植物粉碎材料，该植物粉碎材料的组成为玉米粉或麦麸或二者的混合物及米糠、玉米杆粉、棉籽壳粉、木屑中的一种或至少两种的混合物。
2.一种制备权利要求
1所述的微生物制剂的方法，其步骤依次为(1)菌种试管培养采用马铃薯葡萄糖琼胶固体培养基(PDA)，将哈茨木霉菌株T23接种于含链霉素40～70ppm的固体培养基(PDA)中，在18℃～30℃温度下，培养1～7天；(2)液体发酵培养将玉米粉或麦麸或二者的混合物与水按1∶300～500的质量比例混匀装于三角瓶中，在121℃、15磅下高温加压消毒20～30分钟，制得培养液；冷却后将(1)步试管中培养出的哈茨木霉菌株T23接种在三角瓶中，菌株与培养液的质量比例为1∶400～500，并在温度为20℃～30℃，光暗比为1∶0.8-1.2的光暗交替环境中，恒温振荡培养3～5天；(3)固体发酵培养将米糠、玉米杆粉、棉籽壳粉、木屑之一种或至少两种的混合物与水按1∶0.8～1.2的质量比例混匀，装于耐温塑料袋中，在121℃、15磅下高温加压消毒120～150分钟，冷却后倒入已消毒的培养床中，形成固体培养料；将(2)步制得的液体发酵培养物与该固体培养料按1∶8～10的质量比例接种液体发酵培养物，在18℃～32℃、相对湿度90％以上、自然光照下、消毒的培养室内，通风培养1～3天即制成固体发酵培养物。(4)制剂的制备将固体发酵培养物自然风干至含水量在8％～10％，再用粉碎机粉碎，过100目筛后，测定孢子含量，菌株T23孢子含量达到3×1010个/克即为合格品。
专利摘要
本发明公开了一种用于作物防病增产的微生物制剂及其制备方法，该种微生物制剂的主要组份及质量配比为12～16份的哈茨木霉(Trichoderma harzianum)菌株T23CGMCC No.0975，84～88份的植物粉碎材料，该植物粉碎材料的组成为玉米粉或麦麸或二者的混合物及米糠、玉米杆粉、棉籽壳粉、木屑中的一种或至少两种的混合物。本发明的微生物制剂，生产周期短、成本低；原料来源广、价格低廉；产孢量大；使用方便、安全；适用作物广、防病对象多、促生增产作用显著；还可减轻污染，为生产和发展优质无公害农产品提供技术保证。
文档编号A01N63/04GKCN1488257SQ03135663
公开日2004年4月14日 申请日期2003年8月25日
发明者曾华兰, 李琼芳, 叶鹏盛, 何炼, 江怀仲, 谭永久, 何洪华 申请人:四川省农业科学院经济作物育种栽培研究所, 四川省农业科学院经济作物育种栽培研导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan