专利名称：犬五联(犬狂犬、犬瘟热、犬细小病毒、犬腺病毒2型、犬副流感)活疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及采用犬副流感病毒、犬瘟热病毒、狂犬病毒、细小病毒、腺病毒制成的为病毒性抗原的医药制品。
犬狂犬病、犬瘟热、犬细小病毒性肠炎、犬传染性肝炎/犬传染性喉气管炎和犬副流感是犬群中常见的六大传染病，其中有的疫病发病率与死亡率高达50-100％，严重影响了军犬警犬的发展和名贵犬品种的保种以及民间守门防盗犬的生命安全。国外美、英、法、日、俄等国在70年代就已开始研制预防以上六种犬传染病的单项活疫苗，到80年代后期，在四联(无狂犬)苗的基础上研制成功了包括钩端螺旋体菌素在内的犬五联苗。60年代中期我国虽有兽用狂犬病羊脑灭活苗，但因工艺复杂、剂量大、副作用强烈、成本高，很难满足全国各地防疫需要。1983年农科院中国兽药监察所从国外引进了狂犬ERA弱毒株，并和有关厂家协作试制成功了兽用狂犬病活疫苗。尤其是犬瘟热迄今我国仍无源于我国本土制苗的种子毒，且用国外种毒制备的疫苗与我国野毒抗原性仍有偏移，结果导致了部分用苗单位的动物保护不确实。
本发明的目的是采用获自我国病犬体内分得的野毒并经致弱驯化的犬瘟热弱毒株为对象，以及和从国外引进的狂犬病毒、犬细小病毒、犬腺病毒2型、犬副流感病毒一起配制成五联苗，并加适当耐热稳定剂而制成。该五联苗安全性可靠、免疫效果好、且针对性强，适合我国病犬疾病的预防，可用于预防狂犬病、犬瘟热、犬细小病毒、犬传染性肝炎/犬传染性喉气管炎和犬副流感六种传染病；且制苗工艺科学，程序可操作性强，经济效益可观，适于工业化生产。
本发明的目的是这样实现的犬五联(犬狂犬、犬瘟热、犬细小病毒、犬腺病毒2型、犬副流感)活疫苗。其生产工艺主要流程是种毒分离鉴定→细胞上传代驯化→变温变速扩增→收毒→安全、效力检验→浓缩→测定毒价→按比例配苗→加稳定剂→分装→冻干→成品检验→贴签包装。其中作为制苗用种毒的犬狂犬病毒毒株ERA-836为国内多数现行制苗的毒种，犬细小病毒CPV-XN1、犬腺病毒2型CAV2-XN3和犬副流感病毒CPIV-XN4三株病毒均由从国外引进的SoLovary公司出品的犬四联苗中分离鉴定筛选而得，其特别之处在于本发明中的犬瘟热病毒弱毒株为在我国西北地区病犬体内分得的一株野毒，经在种源有异的细胞上传代驯化、克隆扩增、诱变减毒、筛选而得，经鉴定，此毒株驯化谱清晰(见表)遗传稳定性可靠、与国际标准毒株SH-CDVOnder-stepoot株具有共同抗原性。因此，该犬瘟热病毒弱毒毒株系制备活疫苗的最佳候选毒株。
在疫苗生产过程中本发明提供了一种变温变速旋转培养新工艺。经理论探讨可能在35℃培养的病毒，随着增殖不断释放在培养液中，该病毒因对光色素及盐离子抵抗力较脆弱，使病毒在液体里不断灭活，这样就降低了单位体积内的毒价，如果待病变达30％时，将温度降至22℃增高转速，待病变形成80-90％时收毒，这样可提高毒价33％左右，平均TCID50可提高3倍。
本发明还提供了采用培养物物理性冻融浓缩新技术。将驯化后病毒苗液半成品冷冻后，再将冻结的毒液移至室温下，令其自然融化，抽弃上层约1/3或1/2的区带液体，将剩余毒液进行滤过，所得滤液即为制苗用浓缩性原苗。
本发明还提供了一种新的耐热稳定剂配方，用于保护疫苗的抗原性，见表II。
附图
为犬五联疫苗的工艺流程简图。
下面将结合(附图)实施例作进一步详述。
从国外引进的Solovary公司制作的犬四联苗中，分离筛选出增殖性良好的CPV-XN1、CAV2-XN3、和CPIV-XN4毒株，另外还通过离体异种细胞交叉传代，获得我国唯一的CPV-112毒株，狂犬病毒ERA-836则系国内现行制苗弱毒株。用于培养的鸡胚成纤维细胞(CEF)用SPF鸡胚自行制备，BHK21株地鼠肾细胞，非洲绿猴肾细胞系Vero，F81株猫肾细胞系和MDCK株狗肾细胞系，均由农业部中监所或卫生部药品检定所提供。将ERA-836、CPV-XN1、CPV-XN112，CAV2-XN2和CPIV-XN4分别在BHK21、F81CFF、MDCK和Vero细胞上培养。
其过程分别为
①CDV-XN112鸡胚绒毛尿囊膜上盲传5代→鸡胚成纤维细胞上连传47代→三次蚀斑克隆筛选种毒→MDCK细胞上传40代→鸡胚成纤维细胞上传20代。传至90代时，该毒株对犬即失去致病性。
②CPV-XN1在F81上传1-5代。即为制苗用犬细小病毒性肠炎疫苗种毒，③CAV2-XN3在MDCK上传2-5代，即为犬肝炎与喉气管炎疫苗种子毒。
④CPIV-XN4在Vero增养7天即为犬副流患种子毒。
⑤ERA-836前期由兰州兽医生物药厂提供，后期在BHK21细胞上培养制备而得。
在培养过程中当病毒的CPE达30％时，就将培养瓶由35℃、转速8-9转/分转移至22℃、转速14转/分条件下，以提高单位体积内的毒价。
培养过程完成后测定疫苗的安全性、效力及病毒抗原滴度，然后将装有单种疫苗的培养瓶在-30℃下冷冻12小时，然后将培养瓶移至室温下，待瓶内毒液自然融化后，抽弃上层约1/2-1/3液体，下层的毒液即为浓缩后的疫苗液，换算效价后，可将ERA-636、CPV-XN1，CDV-XN112，CAV2-XN3和CPIV-XN4培养液按0.15、0.40、0.15和0.15ml的比例混合均匀，将此弱毒苗液与耐热稳定剂等量混合，充分摇匀，铜网过滤后，定量分装于瓶中，每瓶2ml，置可自动压塞的冻干机中冻干升华，最后测定其真空度含水量，并做三检后于低温或4-8℃保藏。
将疫苗作无菌、安全与效力测定。(见表III)。
本发明的优点1、针对性强生产犬五联苗中所用的犬瘟热弱毒株为从我国病犬体内分得，与进口的四株毒株按适当比例配比适于我国病犬六种传染病犬狂犬病、犬瘟热、犬细小病毒性肠炎、犬传染性肝炎/犬传染性喉气管炎、犬副流感的预防，确系我国病犬传染病预防首选特效药品。
2、保护性好此犬五联苗中所用的耐热稳定性配方速溶性好，耐热性强，外观可与进口疫苗相比美。
3、毒价效力高生产工艺中采用转温转速培养及冷冻浓缩两种新工艺，使疫苗中平均毒价提高1～2倍左右，且保持原抗原滴度的稳定性，可保持五种弱毒病毒粒子的完整性。值得一提的是该工艺还可剔除苗液中的小牛血清，避免犬体接种后所产生的异种蛋白性过敏反应发生，使单位体积内病毒含量成倍地提高。
本发明生产工艺科学，设备要求不高、可适于工业化大批量生产，因而此犬五联苗高效价廉，有利于在我国普遍推广应用。
表I CDV-XN112株毒株驯化谱增殖 乳鼠神回 归※传代代次 增殖基质 温度 CPETCID50经毒力 电镜 动 物1代鸡胚绒 35℃ 非脓性※ 1-1两相热毛尿囊膜 蚀斑±2代鸡胚绒 35℃ 10-2± 萎顿毛尿囊膜3代鸡胚绒 35℃ 10-3+ 萎顿毛尿囊膜4-5代 鸡胚成 33℃+10-3.510-4+ 萎顿纤维细胞6-10代 蚀斑克隆 33℃+10-410-3+ 一过型(Vero)11-30代 小斑扩增 33℃+10-410-3.5+减食一天(Vero)31-50代 小斑扩增 33℃+10-4.510-3+一过型(Vero)51-80代 犬MDCK 33℃+10-5.010-4+无异常细胞81-100代 犬MDCK 33℃+10-5.510-3+无异常细胞101-110代 鸡胚成33℃+10-4.510-2+无异常纤维细胞
权利要求
1.犬五联(犬狂犬、犬瘟热、犬细小病毒、犬腺病毒2型、犬副流感)活疫苗，其生产工艺主要流程是种毒分离鉴定→细胞上传代驯化→变温变速扩增→收毒→安全、效力检验→浓缩→测定毒价→按比例配苗→加稳定剂→分装→冻干→成品检验→贴签包装。其中作为制苗用种毒的犬狂犬病毒毒株ERA-836为国内多数现行制苗的毒种，犬细小病毒CPV-XN1、犬腺病毒2型CAV2-XN3和犬副流感病毒CPIV-XN4三株病毒均从国外引进的SoLovary公司出品的犬四联苗中分离鉴定筛选而得，其特征在于本发明中的犬瘟热病弱毒株为在我国西北地区病犬体内分得的一株野毒，经在种源有异的细胞上传代驯化、克隆扩增、诱变减毒、筛选而得，经鉴定，此毒株驯化谱清晰，遗传稳定性可靠、与国际标准毒株SH-CDV株具有共同抗原性，该犬瘟热病毒弱毒毒株系制备活疫苗的最佳候选毒株。
2.根据权利要求1所述的犬五联苗，其特征在于在疫苗生产过程中本发明提供了一种变温变速培养新工艺，即在培养过程中待细胞病变达30％时，将温度调降并增高转速，待病变形成80-90％时收毒，这样可提高毒价33％左右，平均TCID50可提高3倍。
3.根据权利要求1或2所述的犬五联苗，其特征在于在疫苗生产过程中本发明还提供了一种培养物物理性冻融浓缩新技术，将病毒苗液半成品冷冻后，再将冻结的毒液移至室温下，令其自然融化，抽弃上层约1/3或1/2的区带液体，将剩余毒液进行滤过，所得滤液即为制苗用浓缩性原苗。
4.根据权利要求3所述的犬五联苗，其特征在于本发明还提供了一种新的耐热稳定剂配方，用于保护疫苗的抗原性，其配方为脱脂奶粉800～1200g，三馏水600～9000ml，蔗糖3％～10％，明胶0.1～0.4％，VC 1∶100～1∶200，谷氨酸钠6％～10％，丁胺卡那霉素100～200万μ，两性霉素3.25～6.25mg，强力解毒敏50～200毫升/万，K2HO410～13.15g，KH2PO42.0～4.48g。
全文摘要
犬五联(犬狂犬、犬瘟热、犬细小病毒、犬腺病毒2型、犬副流感)活疫苗。本发明采用我国病犬体内分得的野毒并经致弱驯化的犬瘟热弱毒株为对象，以及和从国外引进的狂犬病毒、犬细小病毒、犬腺病毒2型、犬副流感病毒一起配制成五联苗，并加适当耐热稳定剂而制成，在制苗过程中本发明提供了转温扩增、物理冷冻浓缩新技术、及改良的耐热稳定剂，使疫苗浓度高，免疫效果好，且针对性强，生产工艺科学，设备要求不高，因而此五联苗高效价廉，有利于在我国普遍推广应用。
文档编号A01N63/04GK1137347SQ9510674
公开日1996年12月11日 申请日期1995年6月22日 优先权日1995年6月22日
发明者李六金 申请人:中国人民解放军第四军医大学