专利名称：：甘蓝显性核基因雄性不育系选育及其制种技术的制作方法
技术领域：
：本发明涉及甘蓝显性核基因雄性不育系选育及其制种技术，属于甘蓝杂种优势利用领域。杂种优势利用是白菜、甘蓝等十字花科作物的一种主要育种途径。长期以来，国内外都是利用自交不亲和系的方法配制甘蓝杂交种。日、美等国在50-60年代就利用自交不亲和系配制甘蓝杂交种，我国从70年代开始就利用自交不亲和系配制甘蓝杂交种。这种方法的不足是亲本必须用人工蕾期授粉方法繁殖，成本高；亲本多代自交易产生生活力退化；由于自交不亲和性是相对的，因此，配制出的杂交种种子的杂交率很难达到100％，而利用雄性不育系生产一代杂种可克服上述缺点。因此，研究和选育可利用的甘蓝雄性不育系一直是国内外甘蓝遗传育种工作者的一个研究热点。到目前为止，国内外研究的甘蓝雄性不育性主要分为三类第一类是隐性核不育，Dickson(1970)；Enge(1974)；Goshew(1974)等先后报道在甘蓝类作物中发现受隐性核基因控制的雄性不育，该类不育材料既无法找到100％不育的保持系，也很难找到联锁的标记基因，用组培方法繁殖不育材料又成本太高，因而很难利用。第二类是Perrason(1972)报道的黑芥胞质核质互作型甘蓝雄性不育，这类不育材料存在花瓣不完全开放，蜜腺不发达，不能吸引昆虫授粉等严重缺陷。第三类是来源于ogura的萝卜胞质不育，该不育材料的最大问题是低温苗期黄化，另外也存在花朵不能正常开放和蜜腺不发达等缺陷。近年来，国外一些学者利用细胞融合的方法消除Ougra萝卜异源胞质不良影响的研究方面已取得重要进展。目前已基本上解决了苗期低温黄化的问题。但从新引入国内的该不育材料来看，新的萝卜胞质甘蓝不育系上依然存在蜜腺小，不能吸引授粉昆虫，自然授粉结实性差等缺陷。基于以上种种原因，甘蓝雄性不育制种方法至今一直未能在实际制种中推广应用。本发明的目的是从甘蓝自然群体中选择显性核基因雄性不育系采用自交/测交/回交方法使该雄性不育系成为稳定纯合显性不育系，使该雄性不育系不育株率达到100％，不育度达到100％，与优良自交系配制杂交种，其杂种率达到95％以上。本发明是在长期的甘蓝遗传育种实践中，从甘蓝原始材料79-399的自然群体中发现雄性不育系植株79-399-3，通过研究证明其不育性的主效基因是一对显性核基因控制，在此基础上，利用该材料在一定基因背景与环境条件下的敏感特性，通过自交、回交、测交等方法，选育出纯合显性不育系。将纯合显性不育系与优良的临时保持系杂交，获得不育性及经济性状稳定的雄性不育系，再利用雄性不育系与配合力好的自交系杂交，配制出甘蓝杂交种。从而创立起利用雄性不育系配制甘蓝杂交种的制种新方法。一种甘蓝显性核基因雄性不育系的选育及其制种方法，包括显性核型雄性不育基因的选择，纯合，保存，繁殖不育系，配制杂交种，本发明是从甘蓝材料79-399繁殖田的自然群体中选择含有CDMs399-3基因的显性核不育系，用显性核不育系与筛选的保持系杂交繁殖不育系；用显性核不育系与自交系配制杂交种。用自交、回交、测交方法纯合显性核不育系。利用组织培养方法，保存纯合显性核不育系。本发明的实质是利用优良的显性不育系配制强优势的甘蓝杂交种，具有以下优点1.本发明选育的甘蓝显性不育系，优于到目前为止国内外已报道的各种类型甘蓝雄性不育材料①不育株率达100％，显著优于不育株率只有50％的隐性不育材料。②不育性受显性核基因控制，避免了现有的胞质不育存在的不育胞质带来的不良影响。③主要经济性状优良，无苗期低温黄化，显著优于存在低温苗期黄化的R1胞质甘蓝不育。开花结实正常，蜜腺发达，显著优于花瓣不完全开放，蜜腺小，不能很好地吸引昆虫授粉的黑芥胞质甘蓝不育系及近年新引进的经过改造的萝卜胞质甘蓝不育系。2.用于制种的不育系种子是由纯合显性不育无性系与临时保持系在隔离区内自由授粉配制而成的，生活力强，配制杂交种时种子产量高，并且不用人工授粉，比人工蕾期授粉繁殖自交不亲和系成本低得多。3.不育性稳定。杂交种种子的杂交率可达100％。图1为不育系和杂交种选育系谱2为不育系遗传模式图下面叙述具体实施例方式本
发明内容包括甘蓝显性核基因CDMs399-3的发现；不育性的遗传机制；纯合显性不育系的筛选、繁殖技术；雄性不育系选育、繁殖技术；用雄性不育系配制一代杂种的杂交制种技术。一.甘蓝显性核基因CDMs399-3的发现及其不育性的遗传机制1979年春从甘蓝原始材料79-399繁种田的自然群体中发现雄性不育株79-399-3。为研究其不育性的遗传机制，用该不育株作母本，用79-399-3材料的可育株作父本进行测交，1981、1982、1984、1991、1992、1993、1994年春季观察到79-399-3及其衍生后代中分离出的不育株与正常可育株测交，其后代育性呈1∶1分离，而正常可育株的自交后代完全可育。部分不育株在一定的遗传背景和环境条件下出现微量花粉，这种具有微量花粉的不育株自交后代育性呈3∶1分离(表1、表2)。表1.不育株与正常可育株的测交后代育性表现年份观察植株总数雄性不育植株数可育植株数P(1∶1)19817340.711982209110.65198414680.591991209110.6519928444400.66199319029879150.10199415327897430.24总计3558183617200.25表2.微量花粉敏感不育株自交后代育性表现年份观察植株总数雄性不育植株数可育植株数P(3∶1)1993147103440.171994314227870.27总计4613301310.10以上结果表明该不育材料的不育性受一对显性主效核基因的控制，且微量花粉不育株的微量花粉中也携带有不育基因。现已将核显性核基因定名为CDMs399-3。其遗传模式如下该不育材料叶色绿或深绿，低温下不黄化，不育株现蕾后无死花蕾或死花蕾少，花朵正常开放，蜜腺发达，能正常吸引蜜蜂授粉。这些性状均显著优于黑芥和萝卜胞质不育材料。(表3)表3.几份甘蓝雄性不育材料开花植株及其花器形态</tables>研究结果表明，不育材料花药败育的主要特征出现在四分孢子形成后不久。可育材料在四分孢子形成后，其胼胝质分解，小孢子游离出来，而对应的不育材料胼胝质不分解，四分孢子继续被包裹在胼胝质壁中不能释放出来而逐渐败育。研究结果还表明，该不育材料的不同测交后代育性表现可分为稳定和环境敏感两种类型。稳定类型在不同环境条件下不育株率和不育度均可保持100％，而环境敏感类型在一定遗传背景和环境条件下，则可出现微量有生命力的花粉(表4)，这一情况说明，该材料不育性除受显性主效基因控制外，还存在修饰基因的影响。表4.几个不育材料在不同环境条件下的育性表现</tables>注不育度＝(不育花总数÷调查总花数)×100温度是影响敏感类型育性表达的主要环境因子。温度(主要是平均温度和最低温度)对育性表达的影响达到极显著相关水平。温度敏感时段在开花前的1-3周，最敏感期在开花前16-21天，临界平均温度约为15-20℃。试验已证明该显性不育材料存在着环境敏感性，即在一定的遗传背景和环境条件下有些显性基因处于杂合状态下的不育植株可出现有生活力的微量花粉。这种微量花粉不育植株的自交后代中，可分离出不育基因纯合的纯合显性不育株。纯合显性不育株与杂合显性不育株在不育性表现上有时很难区分，为鉴别出纯合显性不育株，可将所有微量花粉不育株自交后代中出现的不育株与2-3个可育株测交，如果几个测交后代均表现为100％不育，则可认为该测交组合的母本不育株为纯合显性不育株。在育种中利用的优良纯合显性不育株，不仅需要显性不育基因纯合、不育性稳定，而且要求其经济性状优良，主要性状整齐、稳定，因此，在鉴定不育基因是否纯合的同时，应在田间对其主要经济性状进行鉴定。为选育出优良的纯合显性不育系，一般采用以下方法1.连续自交法在不育材料群体中选经济性状优良育性敏感的不育植株自交，并在其自交后代中继续选性状优良而育性敏感的不育株连续自交，在经过3-5代纯化的自交后代中，可选育出经济性状优良而不育基因纯合的优良纯合显性不育系。2.二环系法(杂交自交法)在不育材料群体中，选择经济性状较好不育性敏感的不育株与一优良自交系杂交，然后在其后代中选经济性状优良不育性敏感的不育株连续自交5代左右，可从中选育出优良的纯合显性不育株。3.回交法选经济性状较好，不育性敏感的不育株为母本，经济性状优良、配合力好的自交系为父本，连续回交5代左右，然后选敏感不育株自交，可从中选育出优良的纯合显性不育株。通过近几年的鉴定，已筛选出几份优良的纯合显性不育系，318P5、330L13、323P2、323P6等(表6)。表5.几份优良纯合显性不育系不育性表现纯合年份1995年1996年不育系试验地点大棚露地合计大棚露地阳畦合计调查株数372012231651318-P5不育株率100100100100100100100不育度100100100100100100100调查株数33643411330-L13不育株率100100100100100100100不育度100100100100100100100调查株数333339323-P2不育株率100100100100100100不育度100100100100100100调查株数331623948323-P6不育株率100100100100100100不育度100100100100100100表6优良纯化显性雄性不育系318p5不育性表现1996春调查日期地点株号4.114.144.164.194.234.254.285.15.45.75.111---------------------------------大2---------------------------------棚3---------------------------------4---------------------------------阳5---------------------------畦6---------------------------7---------------------------露8---------------------------地9---------------------------10---------------------------注---表示彻底不育、无花粉三、优良显性雄性不育系的繁殖技术纯合显性不育株不育性稳定，在各种不同环境下不出现花粉，因此，纯合显性不育株不能自交繁殖，需要在试验室条件下用组织培养的方法保存、扩繁。一般在4-5月份取纯合显性不育株的花枝或侧芽在试验室进行组织培养，9-10月份将生根的组培苗移植于大田。冬季在保护地越冬春化，第二年春季开花。如果直接用纯合显性不育系配制杂交种则成本太高，用纯合显性不育系与可育的自交系(保持系)杂交，获得不育性稳定的显性雄性不育系，用这种显性不育基因杂合的雄性不育系制种，则可大大降低生产成本。但是，由于该不育材料的不育性除受显性主效基因控制外，还受微效修饰基因的影响，不育性的表现与基因背景的关系十分密切，因此，并不是所有可育自交系与纯合显性不育系杂交都可获得不育性稳定的雄性不育系，而需要通过广泛测交筛选临时保持系，优良的临时保持系应具有以下几个条件1.与纯合显性不育系测交其后代不育性稳定(不育株率达到100％，常年不育度100％或不低于95％)。2.主要农艺性状优良、稳定一致，并与纯合显性不育系相似。3.自交亲和或不亲和性弱，开花结实性状好。用连续自交法或二环系法选育纯合显性不育系时，临时保持系主要由可育的姊妹系中筛选。用回交法选育纯合显性不育系时，回交父本本身就可能是优良的临时保持系用优良的纯合显性不育系作母本，临时保持系作父本，两者按3∶1定植于特别严格的隔离区内自由授粉，由纯合显性不育系植株上收到的种子即是用于配制一代杂种的显性雄性不育系种子。通过近几年的筛选，现在获得95-414、95-415、95-438、95-422、95-423、94-346、96-291、96-296、96-304、96-305等几份显性雄性不育系，他们在不同环境条件下，不育株率都达到100％，不育度也达到100％或接近100％(表7、表8)。表7。几份优良显性雄性不育系不育性表现显性年份1995年1996年育系试验地点大棚露地合计大棚露地阳畦合计÷调查株数10354538189294-346不育株率100100100100100100100不育度100100100100100100100调查株数61420911183895-414不育株率100100100100100100100不育度10010010099.910099.999.9调查株数64104391695-415不育株率100100100100100100100不育度100100100100100100100调查株数538832246495-438不育株率100100100100100100100不育度100100100100100100100表8显性雄性不育系95-415不育性表现1996春调查日期地点株号4.114.144.194.234.254.285.15.45.75.111------------------------------大2------------------------------棚3------------------------------4------------------------------5------------------------------6------------------------------7------------------------------阳8------------------------------畦9------------------------------10------------------------------11------------------------------12------------------------------13------------------------------露14------------------------------地15------------------------------16------------------------------注---表示彻底不育、无花粉四、优良杂交组合的选配及其制种技术(一)优良杂交组合的选配选配甘蓝显性雄性不育系优良杂交组合的方法基本上与其他常规育种途径相同，选用配合力好、主要性状及来源与不育系有一定差异的自交系作父本与雄性不育系杂交，进行配合力测定，选出最优组合。为降低父本繁殖的成本用作父本的自交系最好是在隔离条件下自由授粉繁殖的自交亲和系。通过近几年的努力，已初步选出96春118、96春128、96春129、96秋172、96春193、96秋219等几个优良组合，其主要性状见表9。表9.几个显性雄性不育系配出的优良杂交组合调查项目开展度外叶球宽×球高中心柱长紧实度平均单球重折亩产增产％定植到收组合(cm)数(cm)(cm)(Kg)(Kg)获天数96春11843.2×43.812.214.6×15.48.30.500.863931.138.715296春12834.6×34.89.011.8×13.76.90.680.693154.011.695296春12941.6×41.611.012.7×13.76.70.610.703199.712.9052中甘11号41.0×41.016.612.5×13.58.60.560.622834.0CK5296秋17254.6×57.014.018.9×14.96.80.521.444113.56.15996秋19358.0×55.417.221.2×14.57.60.421.444113.56.15996秋21953.2×53.016.719.8×15.26.30.471.484227.89.159中甘8号59.6×60.616.225.2×12.75.20.401.673876.1CK82(二)显性不育系的制种技术1.适期播种甘蓝为植株春化植物，雄性不育系和父本自交系若播种过晚，会因植株过小而不易抽薹开花，若播种过早不仅易发生病害，而且在种株后期发生早衰。华北地区适宜的播种期，早熟材料为8月下旬，晚熟材料在7月下旬到8月上旬。2.保护制种亲本安全越冬并完成春化华北中部及其以北地区，种株应假植在阳畦等保护条件下越冬。华北南部种株可在露地越冬，为防冻害可在种株基部培土。3.严格注意制种田的空间隔离甘蓝容易与甘蓝类作物发生杂交，因此，甘蓝制种田与其他甘蓝类采种田空需间隔离1000米以上。4.保证蜂源甘蓝为虫媒花，雄性不育系无花粉不能自交，杂交时全靠父本自交系提供的花粉授粉，每亩制种田至少要放一箱蜂，才能基本上满足传粉需要。5.控制双亲制种时的适宜比例用雄性不育系制种，只有从雄性不育系植株上收获的种子是一代杂种，为提高杂交种的产量，制种时可适当加大雄性不育系种株的比例，一般不育系的比例以3∶1为宜。6.严格保证亲本纯度在制种的各个环节，注意亲本的去杂去劣，开花期若在雄性不育系中偶然现微量花粉株，也应尽量尽快拔除。权利要求1.一种甘蓝显性核基因雄性不育系的选育及其制种方法，包括显性核型雄性不育基因的选择，纯合，保存，繁殖不育系，配制杂交种，其特征在于从甘蓝材料79-399繁殖田的自然群体中选择含有CDMs399-3基因的显性核不育系，用显性核不育系与筛选的保持系杂交繁殖不育系，用显性核不育系与自交系配制杂交种。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于采用自交、回交、测交方法纯合显性核不育系。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于利用组织培养方法保存显性核不育系。全文摘要本发明利用甘蓝显性核型雄性不育基因CDMs399-3在一定遗传环境条件下的敏感性，通过自交、回交、测交选育出纯合显性不育系，利用组织培养保存，繁殖纯合显性不育系，通过测交筛选临时保持系，用临时保持系与纯合显性不育系杂交获得不育株率100％，不育度100％或不低于95％的不育系，不育系与配合力优良的自交系杂交配制一代杂种。该方法具有杂交制种时一代杂种种子杂交率能达到100％，亲本原种不需人工授粉，从而降低制种成本等优点。文档编号A01H1/02GK1158216SQ9612078公开日1997年9月3日申请日期1996年11月28日优先权日1996年11月28日发明者方智远,孙培田,刘玉梅,杨丽梅,王晓武,庄木,侯安福,卞春松申请人:中国农业科学院蔬菜花卉研究所