一种寄生性线虫寄生阶段的体外培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生命科学领域，涉及生物体的培养方法，尤其是一种寄生性线虫寄生 阶段的体外培养方法。
【背景技术】
[0002] 目前，寄生性线虫的体外培养仅限于寄生性线虫营自由生活阶段，对于营自由生 活线虫和营自由生活阶段寄生性线虫的培养较好，但尚无寄生性线虫营寄生生活阶段的体 外培养方法，其体外培养的难度和宿主体内培养成本的昂贵制约了寄生性线虫科学研究的 发展。线虫（A.cantonensis)第三期幼虫为寄生阶段幼虫。
[0003] 通过检索，与本发明专利申请相似的现有技术为如下两种：
[0004] (1)寄生性线虫营自由生活阶段的体外培养多采用灭菌后的粪汁液体培养基。
[0005] (2)营自由生活线虫（秀丽隐杆线虫）的体外培养采用的NGM固体培养基。
[0006] 通过对比，本发明专利申请与上述相关的公开文献存在本质的不同。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于克服原有技术的不足之处，提供一种方法简单、操作方便，首次 体外培养营寄生生活阶段寄生性线虫、为寄生性线虫的科学研究提供技术支持的寄生性线 虫寄生阶段的体外培养方法。
[0008] 本发明解决技术问题所采用的技术方案是：
[0009] -种寄生性线虫寄生阶段的体外培养方法，步骤如下：
[0010] ⑴培养基配制
[0011] ①固体培养基平板的组成成分及配制：
[0012] 琼脂粉 2g;IMKH2PO4-K2HPO4缓冲液（PH= 6. 0)2. 5ml;IMMgSO40.Iml;IM CaCl2O.Iml；
[0013] 将上述培养基成分溶于CldH2O中，定容至IOOml制成溶液A;
[0014] 高压灭菌后，待溶液冷却至37-45°C后，向溶液A中加入0.Iml胆固醇乙醇溶液，制 成溶液B;
[0015] 其中，所述胆固醇乙醇溶液的配置方法为：胆固醇粉末溶于100%乙醇中，配置成 的胆固醇乙醇溶液中胆固醇浓度为5mg/ml;
[0016] 将溶液B混匀后倒板，待凝固后制成固体培养基平板；
[0017] ②液体培养基的的组成成分及配制：
[0018] NaCl0? 5g;Na2HP04 ?H2O0? 06g;NaHC030 . 4g;葡萄糖Ig;
[0019] 将上述固体成分溶于ddH20中，定容至100ml制成溶液C;
[0020] ⑵培养：
[0021] ①选择已感染寄生性线虫（A.cantonensis)的螺，处理感染线虫的螺后，将在螺 体内寄生的线虫的第三期幼虫用钼金丝挑取或是移液器吸取至制备好的固体培养基平板 表面上；
[0022] ②用移液器吸取溶液C置于固体培养基平板表面上，使溶液C液面厚度达 0. 3-0. 6cm，显微镜下观察，虫体能够自由游动；
[0023] ③将含有虫体的培养基置于15_22°C下培养；
[0024] ④每天补充溶液C，保持液面厚度达0. 3-0. 6cm，并每天打开平皿盖，水平摇动培 养基，使虫体与氧气充分接触，虫体培养0-23天，得与在福寿螺体内营寄生生活所处的滞 育状态相同的体外饲养后A.cantonensisL3幼虫。
[0025] 而且，所述步骤⑴中将溶液B混匀后倒在直径6cm的培养皿中，7ml/平皿，液面厚 度为1-1. 5cm，待凝固后制成若干固体培养基。
[0026] 而且，所述步骤⑴中高压灭菌的条件为经121°C，30min。
[0027] 而且，所述步骤⑴②中溶液C还经过滤除菌。
[0028] 而且，所述步骤⑵中螺为福寿螺。
[0029] 本发明取得的优点和积极效果是：
[0030] 本发明方法简单、操作方便，分析了寄生性线虫营寄生生活阶段的生理、生化特 征，该方法成功地建立了A.cantonensisL3(营寄生生活阶段的感染性3期幼虫体）体外培 养技术，首次体外培养营寄生生活阶段寄生性线虫，为寄生性线虫的科学研究提供技术支 持，可以为其他寄生性线虫体外培养提供借鉴，该培养方法的建立可为研究A.cantonensis 的宿主转换提供了良好的技术平台；该培养方法兼顾了虫体存活时间和活力两个因素，在 保障虫体活力和感染力的同时，最大化的延长了虫体的寿命，可以用于虫体感染力方面的 研究，也可以通过体外对A.cantonensis第三期幼虫进行相关处理用于科学研究。
【附图说明】
[0031] 图1为本发明方法的不同温度下的A.cantonensisL3幼虫寿命检测图；
[0032] 图2为本发明方法的16°C培养温度下，A.cantonensisL3幼虫的形态（23天）与 螺体内L3幼虫形态比较图；其中，图2-A为16°C培养温度下，L3虫体明场DIC形态图；图 2-B为16°C培养温度下，L3虫体全虫DAPI染色图；图2-C为福寿螺体内L3虫体明场DIC形态图；图2-D为福寿螺体内L3虫体全虫DAPI染色图。
【具体实施方式】
[0033] 为能进一步了解本发明的内容、特点及功效，兹例举以下实施例，并配合附图详细 说明如下。需要说明的是，本实施例是描述性的，不是限定性的，不能由此限定本发明的保 护范围。
[0034] 本发明中所使用的试剂，如无特殊规定，均为本领域的常规试剂；本发明中所使用 的方法，如无特殊规定，均为本领域的常规方法。
[0035] 本发明培养方法的原理如下：
[0036] (1)由于A.cantonensis第三期幼虫没有抵抗干燥的能力，所以以固体琼脂板为 基础培养基；
[0037] (2)寄生性线虫的生活过程中，体内不能合成留醇类化合物，所以在基础培养基中 加入了胆固醇；
[0038] (3)寄生性线虫营自由生活阶段和寄生生活阶段的主要区别在于虫体在宿主内可 以直接获得营养物质，而虫体内脂肪含量减少，所以在培养基中加入了葡萄糖；
[0039] (4)模拟虫体寄生生活阶段，螺体内环境pH、离子种类和浓度；
[0040] (5)宿主螺为变温动物，所以在建立饲养方法时加入了变量一温度。
[0041] 实施例1
[0042] 一种寄生性线虫寄生阶段的体外培养方法，步骤如下：
[0043] (1)培养基配制
[0044] 固体培养基平板的组成成分及配制方法：
[0045] 表1固体培养基平板的组成成分表
[0046]
【主权项】
1. 一种寄生性线虫寄生阶段的体外培养方法，其特征在于：步骤如下： ⑴培养基配制 ① 固体培养基平板的组成成分及配制： 琼脂粉 2g;IMKH2PO4-K2HPO4缓冲液（PH= 6. 0)2. 5ml;IMMgSO4O.Iml;IMCaCl2O.Iml; 将上述培养基成分溶于CldH2O中，定容至IOOml制成溶液A ; 高压灭菌后，待溶液冷却至37-45°C后，向溶液A中加入0.Iml胆固醇乙醇溶液，制成溶 液B; 其中，所述胆固醇乙醇溶液的配置方法为：胆固醇粉末溶于100%乙醇中，配置成的胆 固醇乙醇溶液中胆固醇浓度为5mg/ml; 将溶液B混匀后倒板，待凝固后制成固体培养基平板； ② 液体培养基的的组成成分及配制： NaCl 0? 5g ;Na2HP04 ? H2O 0? 06g ;NaHC030 . 4g ;葡萄糖 Ig ; 将上述固体成分溶于ddH20中，定容至100ml制成溶液C; ⑵培养： ① 选择已感染寄生性线虫（A.cantonensis)的螺，处理感染线虫的螺后，将在螺体内 寄生的线虫的第三期幼虫用钼金丝挑取或是移液器吸取至制备好的固体培养基平板表面 上； ② 用移液器吸取溶液C置于固体培养基平板表面上，使溶液C液面厚度达0. 3-0. 6cm， 显微镜下观察，虫体能够自由游动； ③ 将含有虫体的培养基置于15_22°C下培养； ④ 每天补充溶液C，保持液面厚度达0. 3-0. 6cm，并每天打开平皿盖，水平摇动培养基， 使虫体与氧气充分接触，虫体培养0-23天，得与在福寿螺体内营寄生生活所处的滞育状态 相同的体外饲养后A. cantonensis L3幼虫。
2. 根据权利要求1所述的寄生性线虫寄生阶段的体外培养方法，其特征在于：所述步 骤⑴中将溶液B混匀后倒在直径6cm的培养皿中，7ml/平皿，液面厚度为1-1. 5cm，待凝固 后制成若干固体培养基。
3. 根据权利要求1所述的寄生性线虫寄生阶段的体外培养方法，其特征在于：所述步 骤⑴中高压灭菌的条件为经121°C，30min。
4. 根据权利要求1所述的寄生性线虫寄生阶段的体外培养方法，其特征在于：所述步 骤⑴②中溶液C还经过滤除菌。
5. 根据权利要求1所述的寄生性线虫寄生阶段的体外培养方法，其特征在于：所述步 骤⑵中螺为福寿螺。
【专利摘要】本发明涉及一种寄生性线虫寄生阶段的体外培养方法，步骤如下：⑴培养基配制；⑵培养：①选择已感染寄生性线虫的螺，处理感染线虫的螺后，将在螺体内寄生的线虫取至固体培养基平板表面上；②用移液器吸取溶液C置于固体培养基平板表面上；③将含有虫体的培养基置于15-22℃下培养；④每天补充溶液C，保持液面厚度达0.5cm，并每天打开平皿盖，水平摇动培养基，使虫体与氧气充分接触，培养23d后即得寄生性线虫。发明方法简单、操作方便，分析了寄生性线虫营寄生生活阶段的生理、生化特征，该方法成功地建立了A.cantonensis L3(营寄生生活阶段的感染性3期幼虫体)体外培养技术，首次体外培养营寄生生活阶段寄生性线虫，为寄生性线虫的科学研究提供技术支持。
【IPC分类】A01K67-033
【公开号】CN104542505
【申请号】CN201510034226
【发明人】闫宝龙, 黄慧聪, 孙委委, 闫兰竹
【申请人】温州医科大学
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2015年1月23日