一种草莓茎尖超低温脱毒的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于草莓脱毒技术领域，特别涉及一种草莓茎尖超低温脱毒的方法。
【背景技术】
[0002] 草莓（FragariaXananassaDuch.)是蔷薇科（Rosaceae)草莓属（Fragaria)宿 根性多年生常绿草本植物。果实鲜嫩多汁、色泽艳丽、香气怡人、口感酸甜适中，是我国传统 的优秀浆果果品之一。草莓果实富含维生素C、有机酸、糖、矿物质及果胶等多种营养成分。 近年来研宄发现草莓所含的親花单宁（Ellagitannins)、花青素（Anthocyanins)和原花青 素（Proanthocyanidins)等生物活性物质能预防心脑血管和癌症的发生，因此草莓倍受消 费者青睐。
[0003] 草莓繁殖常采用传统的匍匐茎埋压或分株繁殖，这种无性繁殖方式提高了病毒侵 染植株的几率，病毒侵染草莓植株后将破坏细胞的代谢，使其表现出生长缓慢、植株矮小、 叶片失绿或变色等特征，从而严重影响果实品质和产量，严重减产可达30%?80%。目前， 已发现约62种侵染草莓的病毒，其中以草莓皱缩病毒（Strawberrycrinklevirus，SCV)、 草莓斑驳病毒（Strawberrymottlevirus，SMoV)、草莓轻型黄边病毒（Strawberrymild yellowedgevirus，SMYEV)和草莓镶脉病毒（Strawberryveinbandingvirus，SVBV)四 种病毒浸染造成的危害最为严重。在栽培过程中，这四种病毒往往同时存在，单独侵染时， 除草莓皱缩病毒外其他三种病毒都不表现出明显症状，但会导致植株矮小、产量下降和品 质变劣，造成严重的经济损失。
[0004] 种苗是生产的起点。为避免病毒给生产带来的巨大影响，实现草莓的无病毒苗栽 培生产化，是目前我国草莓业势在必行的发展趋势。目前无病毒苗主要通过热处理脱毒法、 茎尖脱毒法、热处理结合茎尖脱毒法、花药培养法、珠心组织培养法、微茎尖嫁接脱毒法、愈 伤组织培养法和抗病毒剂法等生物技术方法获取，其中热处理结合茎尖脱毒法运用最为 广泛，然而此法与新兴的超低温冷冻疗法相比，存在着操作困难，耗时长和脱毒率不高等缺 点。超低温冷冻疗法是一种新型高效脱除植物病毒的新技术，已在马铃薯、柑桔、葡萄、李、 甘薯等植物上进行研宄并取得一定成果，目前该法被认为是最有效脱除植物病毒的方法， 为脱毒苗的生产开辟了一条新的途经。但是，该技术在草莓上的研宄几乎空白，四川又是我 国冬草莓的生产大省，因此建立草莓超低温疗法脱毒技术势在必行。
【发明内容】
[0005] 为克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种草莓茎尖超低温 脱毒的方法。
[0006] 本发明的目的通过下述技术方案实现：一种草莓茎尖超低温脱毒的方法，具体包 括以下步骤：
[0007] 剥离2mm草莓茎尖转移至预培养基，在4°C黑暗条件下进行预培养，蔗糖浓度为 0.3?0.5111〇1*171，预培养时间为3?5(1，预培养结束后的茎尖，在251：条件下放入60% PVS2培养基中加载30?90min后，转移至PVS2培养基溶液中，于0°C条件下处理1?3h， 然后转入I. 5ml冻存管中，投入液氮中处理lh，将冻存管快速转移至40°C水中，水浴化冻 2min后的茎尖放入洗液中洗涤2次，每次20min，直至茎尖漂浮在洗液表面，最后将处理结 束的莖尖转入恢复培养基中，21?25°C暗培养一周后转入16h? (T1光照下培养，光照强度 为52ymol? (m2 ?S)'获得草莓脱毒苗。
[0008] 所述的预培养基成为以5培养基+2%甘油+0.3?0.5111〇1吨- 1蔗糖+6.5§吨-1琼 脂，pH5. 8。
[0009] 所述的PVS#§养基的配方为：MS培养基+30%甘油+15%乙二醇+15%二甲基亚 砜+4(^.171蔗糖。
[0010] 所述的60%PVS#§养基为：0. 6mol?I蔗糖的MS液体培养基与PVS2培养基的 体积比为40:60。
[0011] 所述的洗液为含有I. 2mol?I71蔗糖的MS培养基。
[0012] 所述的恢复培养基的配方为：MS培养基+0. 4mg 05mg?PNAA+O. 15mg?L _^3+6. 5g?L-1 琼脂 +30g?L―1 蔗糖。
[0013] 本发明中的草莓茎尖超低温脱毒的原理为：
[0014] 超低温冷冻疗法的脱毒原理主要是利用茎尖分生组织细胞与分化细胞结构上的 差异。为忍受超低温（-196°c)的极端环境，材料需经过脱水处理后再放入液氮中，以免细 胞内大量冰晶形成，降低对细胞器和细胞膜的损伤，从而提高细胞存活率。茎尖分生组织 细胞具有体积较小，液泡小和较大核质体积比等特点，脱水更容易，在液氮环境中不易被冻 死；而分化细胞体积较大，含有较大的液泡和较小的核质比，脱水处理较难，在超低温环境 下易被冻死。此外，茎尖分生组织所在区域所含病毒少或不含病毒，而分化组织细胞所在区 域往往是病毒积累区。因此，当茎尖分生组织经液氮处理后，受伤死亡的细胞往往是分化细 胞，存活的细胞是不含病毒的分生组织细胞，继而通过培养使其形成无病毒植株。
[0015] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0016] 本发明超低温冷冻疗法应用到草莓脱毒的领域，建立了草莓茎尖超低温脱毒的方 法，具有操作简单，耗时短和脱毒率高的优点。本发明的草莓茎尖超低温脱毒方法的超低温 保存成活率为69. 03 %，其脱毒率达100 %，具有很好的技术效果和推广前景。
【附图说明】
[0017] 图1为脱毒再生苗RT-PCR电泳结果图，其中，M为marker，l?8为不同脱毒再生 苗。
[0018] 图2为再生脱毒苗图，其中，A为草莓茎尖超低温脱毒后恢复再生，B脱毒再生苗诱 导成完整植株。
[0019] 图3为脱毒苗生根和移栽图，其中，A为脱毒再生苗诱导生根，B脱毒再生苗移栽炼 苗。
【具体实施方式】
[0020] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[0021] 实施例I
[0022] 本发明提供了一种草莓茎尖超低温脱毒的方法，具体包括以下步骤：
[0023] 剥离2mm草莓茎尖转移至预培养基（MS培养基+2 %甘油+3M蔗糖+6.58.171, pH5. 8)，在4°C黑暗条件下进行预培养，蔗糖浓度为0. 3?0. 5mol?L'预培养时间设为 3?5d，预培养结束后的茎尖，在25°C条件下放入60 %PVS2培养基（PVS2培养基：MS培养 基+30%甘油+15%乙二醇+15%二甲基亚砜+4(^.171蔗糖，60%PVS2培养基：0.6mol?厂1 蔗糖MS液体培养基与PVS2的体积比为40:60)中加载30?90min后转移至100%PVS2培 养基溶液中，于(TC条件下处理1?3h，然后转入I. 5ml冻存管中，投入液氮中处理Ih，将冻 存管快速转移至40°C水中，水浴化冻2min后的茎尖放入洗液（MS培养基+1. 2mol?I71蔗 糖）中洗涤2次，每次20min，直至茎尖漂浮在洗液表面，最后将处理结束的茎尖转入恢复培 养基中（恢复培养基为MS+0. 4mg?Lh-BA+O. 05mg?LiNAA+O. 15mg?L1GAfG. 5g?L1琼脂 +30g吨―1)，21?25°C暗培养一周后转入16h^cf1正常光照（光照强度为52ymol? (m2 .s)-1) 下培养，获得草莓脱毒苗。一周之后统计存活率。
[0024] 进行获得的草莓脱毒苗的脱毒率检测
[0025] 将检测不含病毒的株系转移至生根培养基上（生根培养基为MS培养基+6. 5g*L1 琼脂+SOg*!/1鹿糖。待根长枝2cm左右时，进行炼苗移栽。提取再生苗叶片总RNA，反转录 成cDNA。取逆转录产物cDNAIy1进行单一PCR反应，检测草莓脱毒苗的脱毒率。PCR体系 中所加的引物为筛选的合适引物（如表1中所示），浓度为0.2ymol 体系中加 Iy1)，体系中还包括：TaqMixlOml，用超纯水补充至20y1，整个操作必须在冰上进行。PCR反应程序为：94°C，3min;94°C，Imin;退火温度（SCV1/SCV2 为 58°C，SMoVl/SMoV2 为 60°C， SMYEV1/SMYEV2 为 50°C，SVBV1/SVBV2 为 52°C)，40s;72°C，40s，35 个循环；最后 72°C延伸 5min。用2. 0 %的琼脂糖凝胶电泳EB染色检测扩增产物，脱毒再生苗RT-PCR电泳结果如图 1所示。
[0026] 表1四种病毒基因组特异片段相关的引物对
[0027]
【主权项】
1. 一种草莓茎尖超低温脱毒的方法，其特征在于：具体包括以下步骤： 剥离2_草莓茎尖转移至预培养基，在4°C黑暗条件下进行预培养，蔗糖浓度为0. 3? 0. 5mol · Γ1，预培养时间为3?5d，预培养结束后的茎尖，在25°C条件下放入60% PVS#§ 养基中加载30?90min后，转移至PVS2培养基溶液中，于0°C条件下处理1?3h，然后转 入I. 5ml冻存管中，投入液氮中处理lh，将冻存管快速转移至40°C水中，水浴化冻2min后 的茎尖放入洗液中洗涤2次，每次20min，直至茎尖漂浮在洗液表面，最后将处理结束的 莖尖转入恢复培养基中，21?25°C暗培养一周后转入16h · (Γ1光照下培养，光照强度为 52μπι〇1 · (m2 · sr1，获得草莓脱毒苗。
2. 根据权利要求1所述的草莓茎尖超低温脱毒的方法，其特征在于：所述的预培养基 成为：MS培养基+2%甘油+3M蔗糖+6. 5g · L-1琼脂，pH5. 8。
3. 根据权利要求1所述的草莓茎尖超低温脱毒的方法，其特征在于：所述的PVS 2培养 基的配方为：MS培养基+30%甘油+15%乙二醇+15%二甲基亚砜+40g · Γ1蔗糖。
4. 根据权利要求1所述的草莓茎尖超低温脱毒的方法，其特征在于：所述的60% PVS 2 培养基为：〇. 6mol · Γ1蔗糖的MS液体培养基与PVS 2培养基的体积比为40:60。
5. 根据权利要求1所述的草莓茎尖超低温脱毒的方法，其特征在于：所述的洗液为含 有I. 2mol · L-1蔗糖的MS培养基。
6. 根据权利要求1所述的草莓茎尖超低温脱毒的方法，其特征在于：所述的恢复培养 基的配方为：MS 培养基 +0· 4mg · Ll-BA+O. 05mg · LlAA+O· 15mg · T1GAje. 5g · Γ1 琼脂 +30g · L-1 鹿糖。
【专利摘要】本发明公开了一种草莓茎尖超低温脱毒的方法，属于草莓脱毒技术领域。所述的草莓茎尖超低温脱毒的方法，具体包括以下步骤：取感染病毒的草莓外植体，切取茎尖，预培养，投入液氮，化冻和洗涤，恢复培养和植株再生，再生植株病原体检测。本发明超低温冷冻疗法应用到草莓脱毒的领域，建立了草莓茎尖超低温脱毒的方法，具有操作简单，耗时短和脱毒率高的优点。本发明的草莓茎尖超低温脱毒方法的超低温保存成活率为69.03％，其脱毒率达100％，具有很好的技术效果和推广前景。
【IPC分类】A01H4-00
【公开号】CN104604685
【申请号】CN201510050577
【发明人】罗娅, 汤浩茹, 邱静, 李雁翎, 田钰, 冉谢然夫, 凌亚杰, 王小蓉, 张勇, 陈清
【申请人】四川农业大学
【公开日】2015年5月13日
【申请日】2015年1月31日