酶（pegademase)、用 于治疗生长不足的药物，例如腺苷脱氨酶（Adagen)、美卡舍明（mecasermin)、瑞恩法贝特 (rinfabate)，用于治疗囊性纤维化的药物，例如阿尔法链道酶、百慕时（Pulmozyme)，用于 治疗代谢失调的药物，例如β半乳糖苷酶、重组半乳糖苷酶（Fabrazyme)、阿尔法阿糖苷 酶、孤儿药（Myozyme)、拉罗尼酶（Laronidase)、阿尔图拉酶（Aldurazyme)，用于治疗生殖 器疣病灶的药物，例如阿尔法干扰素-η3、阿尔费隆Ν，用于治疗肉芽肿病的药物，例如干 扰素 γ-lb、爱克汀穆恩（Actimmune);用于治疗生长不足的药物，例如培维索孟、索马威 特（Somavert)、索马特罗滨（somatropin)、健豪宁（Genotropin)、优范滨（Nutropin)、优 猛范（Humatrope)、萨瑞斯亭（Serostim)、硝甲阿托品丙酸酯（Protropin);用于治疗心 力衰竭的药物，例如奈西立肽、奈特瑞科尔（Natrecor);用于治疗血友病的药物，例如凝 血因子，如因子 VIII、Helixate FS、拜科奇（Kogenate)FS、因子 IX、BeneFIX、因子 Vila、 诺其（Novoseven)、去氨加压素（desmopressin)、斯代米特（Stimate)、DDAVP ;造血药物， 例如非格司亭（Filgrastim) (G-CSF)、优保津（Neupogen)、奥普瑞白介素（Oprelvekin)、 优美佳（Neumega)、培非格司亭（Pegfilgrastim)、优拉斯塔（Neulasta)、沙格司亭 (Sargramostim)、沙格司亭（Leukine);用于治疗丙肝的药物，例如阿尔法干扰素-2a、罗 扰素 A、阿尔法干扰素-2b、甘乐能（Intron) A、阿尔法康干扰素 （Interferon alfacon)-l、 干复津、阿尔法聚乙二醇干扰素_2a、派罗欣、阿尔法聚乙二醇干扰素-2b、PEG-甘乐能；用 于治疗HIV的药物，例如恩夫韦地、恩夫韦（Fuzeon) ;Fab例如Fab (抗凝血酶）、阿昔单抗 (Abciximab)、阿昔单抗（ReoPro);单克隆抗体，例如达利珠单抗、赛尼哌；抗病毒单克隆抗 体，例如帕利珠单抗、塞那吉斯（Synag i s);用于治疗哮喘的单克隆抗体，例如奥马珠单抗、 索雷尔（Xolair);用于诊断性成像的单克隆抗体，例如阿西莫单抗、CEA-Scan、卡罗单抗喷 地肽、ProstaScint、沙妥莫单抗喷地肽、OncoScint CR/OV，用于诊断性成像的Fab，例如诺 非单抗（Nofetumomab)、疏诺莫单抗（Verluma);免疫抑制单克隆抗体，例如巴利昔单抗、舒 莱（Simulect)、莫罗莫那（Muromonab)-〇)3、正克隆（0rthoclone)0KT3;用于治疗恶性肿 瘤的单克隆抗体，例如阿仑单抗、坎帕斯、替坦替伊莫单抗、泽娃灵、利妥昔单抗、美罗华、曲 妥珠单抗、赫塞汀；用于治疗类风湿性关节炎（RA)的药物，例如阿达木单抗、修美乐、英利 昔单抗、瑞米凯德；用于用作放射免疫治疗剂的单克隆抗体，例如托西莫单抗和碘I131、托西 莫单抗、百克沙；用于治疗黄斑变性的药物，例如哌加他尼钠、哌加他尼；用于治疗恶性肿 瘤的药物，例如阿地白介素（aldesleukin)、阿地白介素（Proleukin)、白介素-2、天冬酰胺 酶、爱施巴（Elspar)、拉布立酶（Rasburicase)、埃立特（Elitek)、地尼白介素 （Denileukin diftitox)、安塔克（Ontak)、培门冬酶、培加帕酶（Oncaspar)、戈舍瑞林、亮丙瑞林；用于 治疗多发性硬化症（MS)的药物，例如醋酸格拉替雷（Glatiramer acetate)(例如共聚 物-1)、克帕松、β干扰素_la、阿沃纳斯、β干扰素_la、利比（Rebif)、β干扰素-lb、 倍泰龙（Betaseron);用于治疗粘膜炎的药物，例如帕利夫明、科皮维斯（Kepivance);用 于治疗肌张力障碍的药物，例如神经毒素、A型肉毒杆菌毒素、BOTOX、BOTOX化妆品、B型 肉毒杆菌毒素、MY0BL0C ;用于治疗骨质疏松症的药物，例如特立帕肽、骨稳（Forteo);用 于治疗银肩病的药物，例如阿法赛特、阿密凡夫；用于治疗RA的药物，例如阿巴西普、恩 瑞舒、阿那白滞素、加利利（Kineret)、依那西普、恩博（Enbrel);溶栓剂，例如阿替普酶、 阿克伐司（Activase)、rtPA、阿尼普酶（Anistreplase)、依米那酶（Eminase)、瑞替普酶 (Reteplase)、瑞替伐酶（Retavase)、链球菌激酶（Streptokinase)、链激酶（Streptase)、 替奈普酶（Tenecteplase)、TNK酶、尿激酶、雅激酶（Abbokinase)、Kinlytic ;用于治疗骨 质疏松症的药物，例如降血钙素（例如鲑鱼）、鲑鱼降钙素（Miacalcin)、复能素，用于治 疗皮肤溃疡的药物，例如贝卡普勒明、瑞格瑞尼克斯（Regranex)、胶原酶、水杨酸檀香酯 (Santyl)〇
[0100] 尚不清楚的是什么决定了白蛋白辄合物、融合多肽或缔合物（例如但不限 于Levemir?，库尔茨斯P(Kurtzhals P)等人生物化学杂志（Biochem. J.) 1995 ; 312:725-731)的血浆半衰期，但似乎是白蛋白与所选治疗剂的组合的结果。希望的是能够 控制给定白蛋白辄合物、缔合物或白蛋白融合多肽的血浆半衰期，从而可以实现与缔合物、 辄合物或融合物的单独组分给出的血浆半衰期相比更长或更短的血浆半衰期，以便能够根 据意欲治疗的适应症的详情来设计具体药物。
[0101] 为了辅助这个设计，本发明提供了一种使用非灵长类动物模型评估与野生型HSA 相比的变体HSA的一种或多种（若干种）药代动力学特性的方法。"药代动力学"被理解为 确定外部给予给活生物体的物质的命运。给药途径可以例如是经口、经肠（经直肠）、经粘 膜或不经肠的。优选地，给药是不经肠的。优选的不经肠给药途径选自静脉内、肌内、皮下 或胸膜内给药。在本发明中，测量的一种或多种优选的药代动力学特性选自半衰期、分布容 积、生物利用度、曲线下面积（AUC)、清除率以及免疫原性。相对于白蛋白、白蛋白变体及其 片段和修饰形式，测量的优选的药代动力学特性是半衰期。通常通过向模式动物皮下、肌内 或静脉内注射相关HSA样品（例如野生型HSA或变体HSA或修饰的HSA)而测量HSA的半 衰期。对于靶向经口、经肠（经直肠）或经粘膜递送的配制品，也可以选择其他给药途径。 剂量可以取决于动物模型而变化，在1至l〇〇mg/kg之间，优选5至50mg/kg，优选从10至 40mg/kg，更优选从15至30mg/kg的剂量通常应是适当的，除非分子特别大，则可以增加剂 量。在注射之前并且随后每隔一段时间从动物中收集血液样品。间隔将取决于动物模型， 因为预期半衰期随动物的大小而变化（参见表2)。对于小鼠，取样时间可以例如是注射后 12、24、72、168、240以及300小时。对于猪，取样时间可以例如是2、4、8、12、16、20、24、28以 及32天。熟练人员通常应已知基于这些分子和该动物哪些取样时间是适当的。可以将血 浆与样品分离并储存在_80°C下。可以例如通过ELISA、质谱法或中尺度发现（Meso Scale Discovery) (MSD)分析剩余在血清中的HSA样品的量。简言之，可以使用用针对治疗剂或检 测标签的抗体包衣的板捕获不同白蛋白分子并且添加第二检测抗体（例如针对HSA或治疗 剂或检测标签的备用表位）定量存在于样品中的HSA的量，或可替代地，可以使用放射性标 记的白蛋白分子量化剩余在血清中的白蛋白的量（在所有情况下，检测手段都不应该改变 白蛋白按其特征性方式与FcRn受体的接合）。此外，列于表2中的参考文献描述了测量不 同动物模型中的白蛋白的半衰期的不同方法。使用白蛋白的放射性标记的方法是较不优选 的，因为这是对白蛋白或变体的一种另外的修饰并且因此可以影响白蛋白的半衰期。
[0102] 实施方式
[0103] L -种用于评估与野生型HSA相比的变体HSA的一种或多种（若干种）药代动力 学特性的方法，该方法包括
[0104] a.选择一种非灵长类动物物种，其中在pH 6下，野生型HSA对所述动物的天然 FcRn的结合亲和力与所述动物的天然白蛋白对所述FcRn的结合亲和力相同或比所述动物 的天然白蛋白对所述FcRn的结合亲和力高；
[0105] b.向a)中所选的该非灵长类动物物种的一个动物给予该变体HSA并且向该非灵 长类动物物种的另一个动物给予该野生型HSA ;并且
[0106] c.测量该变体HSA和该野生型HSA的一种或多种（若干种）药代动力学特性。
[0107] 2.根据实施例0所述的方法，其中当与所述动物的天然白蛋白的结合亲和力相比 时，野生型HSA对所述动物的天然FcRn的结合亲和力在0. 8与3. 5倍之间。
[0108] 3.根据实施例0或0所述的方法，其中使用表面等离子体共振和一种可溶性动物 FcRn评估结合亲和力，该可溶性动物FcRn包括来自同一动物物种的一条FcRn重链和一种 β 2-球蛋白。
[0109] 4.根据以上实施例中任一项所述的方法，其中当与SEQ ID NO: 16比对时，该天然 FcRn在对应于位置161的位置中具有一个组氨酸。
[0110] 5.根据以上实施例中任一项所述的方法，其中当与SEQ ID NO: 16比对时，该天然 FcRn在对应于位置52的位置中具有一个缬氨酸。
[0111] 6.根据以上实施例中任一项所述的方法，其中当与SEQ ID NO: 16比对时，该天然 FcRn在对应于位置52的位置中具有一个结I氨酸并且在位置161中具有一个组氨酸。
[0112] 7.根据以上实施例中任一项所述的方法，其中该非灵长类动物物种是一种野生型 动物或一种转基因动物。
[0113] 8.根据实施例0所述的方法，其中该野生型动物选自下组，该组由以下各项组成： 猪、奶牛、山羊、绵羊以及骆驼。
[0114] 9.根据实施例0所述的方法，其中该野生型动物是猪。
[0115] 10.根据实施例0所述的方法，其中该转基因动物是一种双转基因兔或一种双转 基因啮齿类动物，优选小鼠、豚鼠或大鼠，并且这些转基因是人白蛋白和一种当与SEQ ID NO: 16比对时在对应于位置161的位置中具有一个组氨酸的FcRn。
[0116] 11.根据实施例0所述的方法，其中当与SEQ ID NO: 16比对时，该FcRn另外在位 置52中具有一个缬氨酸。
[0117] 12.根据实施例0或0所述的方法，其中当与SEQ ID NO: 16比对时，该FcRn另外 在位置54中具有一个谷氨酸，在位置56处具有一个谷氨酰胺并且在位置166处具有一个 组氨酸。
[0118] 13.根据实施例0至0所述的方法，其中该转基因 FcRn选自人类、黑猩猩、猕猴、奶 牛、山羊、绵羊、骆驼以及猪。
[0119] 14.根据实施例0至0所述的方法，其中该转基因 FcRn是人类。
[0120] 15.根据以上实施例中任一项所述的方法，其中通过与一种配偶体融合、辄合或缔 合而修饰该变体HSA和野生型HSA。
[0121] 16.根据实施例0所述的方法，其中该配偶体是一种治疗剂或一种疫苗。
[0122] 17.根据以上实施例中任一项所述的方法，其中测量的该一种或多种（若干种）药 代动力学特性选自半衰期、分布容积、AUC、生物利用度、清除率以及免疫原性。
[0123] 18.根据以上实施例中任一项所述的方法，其中测量的该药代动力学特性是半衰 期。
[0124] 19.根据以上实施例中任一项所述的方法，其中皮下、肌内或静脉内给予该白蛋 白。
[0125] 20.根据以上实施例中任一项所述的方法，其中一种变体HSA或修饰的变体HSA被 选择用于在临床前试验中使用，该变体HSA或修饰的变体HSA当与野生型HSA或修饰的野 生型HSA相比时具有一种或多种（若干种）改进的药代动力学特性。
[0126] 21.根据实施例0所述的方法，其中该变体HSA具有比野生型HSA长的半衰期。
[0127] 22. -种通过如实施例0至0中任一项所述的方法选择的变体HSA。
[0128] 23. -种通过与配偶体融合、辄合或缔合而修饰的变体HSA，其中通过如实施例0 至0中任一项所述的方法选择该融合、辄合或缔合。
[0129] 24.根据实施例0所述的变体，其中该配偶体是一种治疗剂或一种疫苗。
[0130] 25. -种猪动物模型用于比较对照分子与测试分子的一种或多种（若干种）药代 动力学特性的用途，其中该对照分子包括野生型HSA并且该测试分子包括一种HSA变体。
[0131] 26. -种转基因兔或啮齿类动物模型用于比较对照分子的一种或多种（若干种） 药代动力学特性与测试分子的一种或多种（若干种）药代动力学特性的用途，其中该对照 分子包括野生型HSA并且该测试分子包括一种HSA变体，该转基因兔或啮齿类动物模型表 达一种当与SEQ ID NO: 16比对时在对应于位置161的位置中具有一个组氨酸的FcRn及人 白蛋白并且已经被敲除了对应的天然蛋白。
[0132] 27.根据实施例0所述的用途，其中当与SEQ ID NO: 16比对时，该FcRn另外在位 置52中具有一个缬氨酸。
[0133] 28.根据实施例0或0所述的用途，其中该转基因 FcRn选自人类、黑猩猩、猕猴、绵 羊、牛以及猪。
[0134] 29.根据实施例0至0中任一项所述的用途，其中包含野生型HSA的该分子和包含 变体HSA的该分子进一步包括一种辄合配偶体、融合配偶体或缔合配偶体。
[0135] 30.根据实施例0所述的用途，其中该配偶体是一种治疗剂或一种疫苗。
[0136] 31.根据实施例0至0中任一项所述的用途，其中评估所选配偶体和将它连接至该 对照和测试分子上的方法对这些药代动力学特性的影响。
[0137] 32.根据实施例0所述的用途，其中该对照分子是连接至该配偶体上的野生型HSA 并且该测试分子是一种使用连接这些分子的相同方法连接至相同配偶体上的变体HSA。
[0138] 33.根据实施例0或0所述的用途，其中该配偶体是一种辄合在该白蛋白的不同位 置处的辄合配偶体（对于对照和测试分子两者而言，位置是相同的）。
[0139] 34.根据实施例0或0所述的用途，其中该配偶体是一种用不同辄合技术辄合至该 白蛋白上的辄合配偶体（对于对照和测试分子而言，辄合技术是相同的）。
[0140] 35.根据实施例0或0所述的用途，其中该配偶体是一种与或不与在该白蛋白的 C-末端和/或N-末端处的不同连接物融合的融合配偶体（对于对照和测试分子而言，连接 物是相同的）。
[0141] 36. -种转基因兔或啮齿类动物，其基因组在其内源FcRn重链基因和内源血清白 蛋白基因中包括一种纯合破坏，该纯合破坏阻止功能性兔或啮齿类动物FcRn HC蛋白和功 能性兔或啮齿类动物血清白蛋白的表达，并且该基因组进一步包括一个表达当与SEQ ID NO: 16比对时在对应于位置161的位置中具有一个组氨酸的FcRn的异源DNA序列和一个编 码人血清白蛋白（HSA)的异源DNA序列，并且其中所述纯合破坏，并且其中该动物表达当与 SEQ ID NO: 16比对时在位置161中具有一个组氨酸的功能性FcRn HC蛋白及功能性HSA。
[0142] 37. -种转基因动物，其基因组在其内源FcRn HC基因和血清白蛋白基因中包括 一种纯合破坏，该纯合破坏阻止功能性动物FcRn HC蛋白和功能性动物血清白蛋白的表达， 并且该基因组进一步包括一个编码人FcRn HCQiFcRn HC)的异源DNA序列和一个编码人血 清白蛋白（HSA)的异源DNA序列，并且其中该动物表达一种功能性hFcRn HC蛋白和功能性 HSA0
[0143] 38.根据实施例0或0所述的转基因动物，其中该FcRn与SEQ ID NO: 9的成熟序 列或与 SEQ ID N0:16 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、 100%-致并且当与SEQ ID NO: 16比对时，该FcRn HC在位置161中具有一个组氨酸。
[0144] 39.根据实施例0或0所述的转基因动物，其中该FcRn HC包括SEQ ID NO: 16。
[0145] 40.根据实施例0至0中任一项所述的转基因动物，其中该人类HSA与SEQ ID 勵:290%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、100%-致。
[0146] 41.根据实施例0至0中任一项所述的转基因动物，其中该动物或啮齿类动物是小 ￡3 邱U
[0147] 42.根据实施例0至0中任一项所述的转基因动物，其中该异源DNA置换该内源基 因并且由此破坏它们
[0148] 43.根据实施例0至0中任一项所述的转基因动物，其中独立于该异源DNA的插入 而完成对该内源基因的破坏，从而允许在基因组中在不同于该内源基因的地方插入该异源 DNA0
[0149] 实例
[0150] 材料与方法
[0151] 来自GE医疗公司的胺偶联试剂盒（BR-1000-50)包含1-乙基-3-(3-二甲基氨基 丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS)、1.0 M乙醇胺-HCl pH 8. 5
[0152] 白蛋白：
[0153] 在本发明实例中使用的白蛋白处于成熟形式。使用如针对WO 2012/059486方法 1 (提供引用而特此结合）中的变体描述的产生方法，使用公开获得的数据库提供的序列 (参见以下序列）重组地产生来自人类、小鼠、兔及绵羊的血清白蛋白。使用相同方法制备 来自狗、猪、食蟹猴、豚鼠及大鼠的血清白蛋白。
[0154] -野生型人血清白蛋白（HSA) (SEQ ID NO: 1，来自还指示于SEQ ID NO: 2中的氨基 酸25至609的成熟序列）。
[0155] -野生型猕猴血清白蛋白（rmSA) (SEQ ID NO:3,来自氨基酸25至608的成熟序 列）。
[0156] -野生型狗血清白蛋白（DSA) (SEQ ID NO:4,来自氨基酸25至608的成熟序列）。
[0157] -野生型猪血清白蛋白（PSA) (SEQ ID NO: 5,来自氨基酸25至607的成熟序列）。
[0158] -野生型大鼠血清白蛋白（RSA) (SEQ ID NO: 6,来自氨基酸25至608的成熟序列）。
[0159] -野生型小鼠血清白蛋白（MSA) (SEQ ID NO: 7,来自氨基酸25至608的成熟序列）。
[0160] -野生型豚鼠（GPSA) (SEQ ID NO: 18,来自氨基酸25至608的成熟序列）。
[0161] -野生型食蟹猴（CSA) (SEQ ID NO: 19,来自氨基酸24-608的成熟序列）
[0162] 通过用P、F、W、H或Y取代天然K573或用A取代天然HSA K500而产生这些变 体HSA分子。已知的是K500A变体不结合至人FcRn上（一种空粘合剂）。如描述于TO 2011/051489实例1，方法3和4(通过引用而特此结合）中的制备这些变体。如描述于TO 2013/135896实例1(通过引用而特此结合）中的制备具有以下取代T83N+N111E+K573P的 变体HSA分子。如描述于PCT/EP 2013/073426实例1，方法2(通过引用而特此结合）中的 制备具有以下取代E492G+K573P+K574H+Q580K的变体HSA分子。
[0163] 广生白蛋白和具有c-myc标签的白蛋白变体，以使得可以在猴和猪中检测人类白 蛋白和人类白蛋白变体，因为针对HSA的抗体不能将天然rmSA和天然PSA与HSA区分开。 通过将具有序列EQKLISEEDL的表位融合至白蛋白序列的N-末端而添加 c-myc标签，对于 细节参见实例3。
[0164] 可溶性FcRn分子：
[0165] 已经描述了编码截短版本的小鼠和人FcRn重链cDNA的三个胞外结构域（al_a3) 的载体，这些胞外结构域遗传地融合至一个编码日本血吸虫谷胱甘肽s-转移酶（GST)的 上（安德森（Andersen)等人（2008)FEBS J 275(16)，4097-4110;安德森等人（2010) 生物化学杂志（J Biol.Chem. )12 ;285(7) :4826-36,安德森等人，2011生物化学杂志 286:5234-5241)。通过Genscript合成截短版本的来自猕猴、大鼠、猪及狗的FcRn HC cDNA 的三个胞外结构域（al_a3)，并且使用限制酶切位点XhoI (NEB)和HindIII (NEB)将其亚克 隆进同一载体系统中。所有载体还包含一个编码人类β 2-微球蛋白的cDNA和埃-巴二氏 病毒（Epstein-Barr virus)复制原点（oriP)。在贴壁的人类胚肾293Ε细胞中产生可溶 性GST-标记的FcRn分子，并且如描述的（伯恩特森（Berntzen)等人（2005)免疫学方法 杂志（J Immunol Methods) 298, 93-104)使用GSTrap柱纯化分泌的受体。
[0166] 下面列出了 FcRn链的蛋白序列。
[0167] -人类（shFcRn)对应于SEQ ID NO:9的氨基酸24至291
[0168] -猕猴（srmFcRn)对应于 SEQ ID NO: 10 的氨基酸 22 至 290
[0169] -猪（pFcRn)对应于 SEQ ID NO: 11 的氨基酸 23 至 290
[0170] -狗（dFcRn)对应于 SEQ ID NO: 12 的氨基酸 23 至 289
[0171] -小鼠（smFcRn)对应于SEQ ID NO: 13的氨基酸21至293
[0172] -大鼠（srFcRn)对应于SEQ ID NO: 14的氨基酸23至292
[0173] -人类β 2-微球蛋白示于SEQ ID NO: 15(来自氨基酸21至119的成熟序列）中。
[0174] -豚鼠（gpFcRn)对应于SEQ ID NO: 17的氨基酸25至298
[0175] -食蟹猴（CynoFcRn)对应于SEQ ID NO: 20的氨基酸24-297。食蟹猴β 2-微球 蛋白示于SEQ ID Ν0:21(来自氨基酸21至119的成熟序列）中
[0176] -猪β 2-微球蛋白示于SEQ ID NO:22(来自氨基酸21至118的成熟序列）中
[0177] -豚鼠 β 2-微球蛋白示于SEQ ID N0:23(来自氨基酸27至125的成熟序列）中
[0178] 表面等离子体共振（SPR):
[0179] 使用Biacore 3000仪器（GE医疗公司）进行SPR实验。按照制造商的说明书，使用 GE医疗胺偶联化学将CM5传感器芯片的流动池与来自以下物种之一的可溶性FcRn偶联： 人类（shFcRn)、大鼠（srFcRn)、小鼠（smFcRn)、称猴（srmFcRn)、狗（dFcRn)或猪（pFcRn) (约900-2500个共振单位（RU))。通过注射IOmM乙酸钠 （pH 5. 0) (GE医疗公司）中的2或 lOμg/ml FcRn而进行偶联。将pH 6. 0的磷酸盐缓冲液（67mM磷酸盐缓冲液，0. 15M NaCl， 0. 005 %吐温20)用作运行缓冲液和稀释缓冲液。使用pH 7. 4的HBS-EP缓冲液（0.0 lM HEPES，0.15MNaCl，3mMED