TA，0.005%表面活性剂P20)的注射液（GE医疗公司）来进行表 面的再生。用于确定结合动力学，在25°C下，以恒定流速（50 μ Ι/min)向固定的受体上注射 白蛋白的连续稀释物（1〇-〇.3μΜ)。在所有实验中，将数据调零并减去参比池。使用简单 的一对一朗缪尔（Langmuir)结合模型（BIAevaluation 4. 1软件（BIAcore AB))(卡尔森 (Karlsson)等人（1997)，免疫学方法杂志（J. Immunol. Methods) 200,121-133)计算缔合速 率GO和解离速率（kd)。
[0180] 用于定量人血清清蛋白动物模型的测定
[0181] 将EIA Maxisorb板（Nunc)在磷酸盐缓冲盐水（PBS)中用1. 25 μ g/mL的抗c-myc 捕获抗体仏1^31113匕9132)包衣过夜，然后用30(^1^?83+0.05%(￥八）吐温-20(?831')(?!1 7.4)洗涤3次。将板用30(^1^?83+5%(￥八）脱脂奶粉+1%(￥八）吐温-20+10%^八） 大鼠血清（西格玛公司（Sigma)) (pH 7.4)阻断2h。将血浆样品以1:10稀释于PBST中， 然后在PBST中与10%哥廷根迷你猪柠檬酸钠血浆或雌性食蟹猴柠檬酸钠血浆（SeraLab 目录号分别为PSCG0F-444-M-32556和PSCF-118-M-32555)混合。在每个具有稀释于PBST 中的10%迷你猪血浆或食蟹猴血浆中的纯化的c-myc HSA的板上都包括一条最高浓度为 1000ng/mL并具有十二个2倍稀释点的标准曲线。将板在室温（RT)下孵育lh，然后如上洗 涤。将PBST中的1. 5 μ g/mL的100 μ 1抗HSA生物素 （Abeam ab81426)添加至每个孔中并 将这些板在室温下孵育30min。将板如上洗涤并且将PBST中的100 μ 1的1. 25 μ g/mL链霉 亲和素 -HRP (西格玛公司）添加至每个孔中并将这些板在室温下孵育30min。将板如上洗 涤并用100 μ L的TMB-超级底物（皮尔斯公司（Pierce))激发信号。使用EnSpire多模式 酶标仪（?金埃尔默公司（Perkin Elmer))在450nm下测量吸光度。在两种情况下，将每 个板上的标准曲线拟合至4-参数非线性回归模型并且使用落入标准曲线的线性范围内的 稀释度计算每个时间点的血浆HSA浓度。
[0182] PK 分析
[0183] 使用Phoenix WinNonLin 6. 3对组平均血衆浓度曲线进行非隔室药代动力学分 析。使用标称时间点和剂量并且将分析中的所有数据点进行等量加权。将每种HSA变体的 平均血浆浓度对时间的曲线与2-隔室模型拟合，以生成曲线拟合。评估以下药代动力学参 数：
[0184] Cniax最大血清浓度
[0185] AUC 从0直到无限的血清浓度曲线下面积
[0186] t1/2血浆中的终末消除半衰期
[0187] Vz 消除阶段过程中的分布容积
[0188] Cl 全身清除率
[0189] 实例1白蛋白对人类、大鼠、小鼠及猕猴FcRn的结合动力学
[0190] 分析HSA和变体HSA对来自人类、小鼠、大鼠及猕猴的可溶性FcRn的结合亲和力 并且将HSA结合与天然白蛋白的结合相比较。
[0191] SPR结果示于图1至4中并且结合动力学总结于表5中。
[0192] 表5 :白蛋白对人类、大鼠、小鼠及猕猴FcRn的结合动力学
[0195] a.使用简单的一阶（1:1)双分子相互作用模型获得动力速率常数。动力学值表示 双份的平均值。
[0196] b.使用由BIAevaluation 4. 1软件提供的平衡（Req)结合模型获得稳态亲和力常 数。
[0197] c.数据取自安德森（Andersen)等人，自然通讯（Nature Commun.)，出版中
[0198] ND=未确定的。
[0199] NA =由于动力学较快未获得。
[0200] 结论
[0201] 在酸性pH下，与野生型相比，所有HSA变体都对人FcRn显示出显著改善的结合， 并且这种增加主要归因于解离速率更慢。
[0202] 当与天然白蛋白相比时，HSA非常微弱地结合至大鼠和小鼠 FcRn上。因此，大鼠 或小鼠白蛋白将在与大鼠或小鼠 FcRn的结合中胜过HSA。由于这个原因，大鼠和小鼠不是 用于评估HSA在体内的一种或多种（若干种）药代动力学特性的希望的动物模型。另一方 面，HSA对猕猴FcRn具有可测量的结合亲和力，并且该结合比天然猕猴白蛋白的结合好1. 3 倍。这指示猕猴是一种适于HSA和HSA变体的药代动力学研究的动物模型，因为天然猕猴 白蛋白在FcRn结合中不会胜过HSA。
[0203] 实例2白蛋白对狗和猪FcRn的结合动力学
[0204] 在该实例中，分析HSA和变体HSA对来自狗和猪的FcRn的结合亲和力并且将HSA 结合与天然白蛋白的结合相比较。
[0205] SPR结果示于图5和6中并且结合动力学总结于表6中。
[0206] 表6 :白蛋白对狗和猪FcRn的结合动力学
[0208] a.使用简单的一阶（I: 1)双分子相互作用模型获得动力速率常数。动力学值表示 双份的平均值。
[0209] b.基于稳态亲和力测量值估计KD。
[0210] NA =由于动力学较快未获得。
[0211] 结论
[0212] HSA以比天然狗白蛋白的结合亲和力低6. 8倍的亲和力结合狗FcRn。因此，非常 有可能的是狗白蛋白将在结合至狗FcRn中胜过HSA。由于这个原因，狗不是用于评估HSA 在体内的一种或多种（若干种）药代动力学特性的希望的动物模型。
[0213] 另一方面，HSA对猪FcRn具有比天然猪白蛋白的结合高2. 9倍的结合亲和力。这 指示猪是一种适于HSA和HSA变体的药代动力学研究的动物模型，因为与HSA相比，天然猪 白蛋白即使过量地存在也不能在PFcRn结合中胜过HSA。
[0214] 实例3c_myc标记的HSA和HSA变体的制备
[0215] 使用例如描述于萨拉布鲁克，J. (Sambrook, J.)和D. W.拉塞尔（D. W. Russell)， 2001(分子克隆实验指南（Molecular Cloning: a laboratory manual)，第 3 版，冷泉港实 验室出版社（Cold Spring Harbor Laboratory Press)，冷泉港，纽约）中的标准分子生物 学技术表达HSA和HSA变体。
[0216] 目的是从酵母中分泌野生型（Wt)人白蛋白和掺入修饰K573P或 E492G+K573P+K574H+Q580K或T83N+N111E+K573P的变体人白蛋白，这些变体人白蛋白在成 熟白蛋白序列的N-末端掺入了 c-myc表位。通过使用被称为修饰的融合前导区（具有氨 基酸序列MKWVFIVSILFLFSSAYS的mFL)的前导序列前体、将一种另外的修饰掺入原区（氨 基酸RSLD)中而使能从酵母中分泌。通过包含氨基酸序列EEAEAEAESSRLKR而进一步修饰 该修饰的融合前导区（mFL)，上述氨基酸序列包括Kex2p二元（KR)切割位点12568和一个 具有序列EQKLISEEDL的插入在白蛋白序列的N-末端的c-myc表位。
[0217] 所有表达盒都包括酿酒酵母PRBl启动子和修饰的酿酒酵母ADHl终止子（mADHt)。
[0218] 先前已经描述了编码野生型白蛋白和变体的质粒（参见材料与方法部分中的参 考文献）。用Bglll/SacII将这些质粒类似地消化至完全，并且分离较大的8. 585kb片段并 用类似的编码修饰的融合前导序列 MKWVFIVSILFLFSSAYS RSLDEEAEAEAESSRLKREQKLISEEDL 的(λ 26kb Bglll/SacII 片段置换。
[0219] 在体内产生表达质粒（即经由在酿酒酵母中同源重组；一种被称为缺口修复或 体内克隆的技术-参见奥尔-韦弗（〇rr-Weaver)&绍斯塔克（Szostak)，1983,美国国家 科学院院刊（Proc. Natl. Acad. Sci. USA. )80:4417-4421)。用 Nsil/Pvul 将包含 c-myc 标 签的修饰的质粒消化至完全并且分离7. 41kb片段。将IOOng的4个分离的片段单独地与 100ngAcc65I/BamHI消化的pDB3936(披露于WO 2010/092135中）混合并用于直接转化酿 酒酵母菌株A CirO。菌株A是酿酒酵母DYB7的一种衍生物（佩恩（Payne)等人（2008)应 用与环境微生物（Applied and Environmental Microbiology)第74卷（24) :7759_7766)， 该衍生物具有四个拷贝的整合进基因组中的Η)Ι。使用如描述于WO 2011/051489中的西 格玛酵母转化试剂盒实现菌株A的转化。还基本上如描述于WO 2011/051489实例1 (通 过引用而特此结合）中的进行酵母转化体在摇瓶培养中的生长，酵母海藻糖原料的制备 以及c-myc标记的白蛋白和白蛋白变体的分批补料发酵，其中修饰如下，在两种情况下都 使用BMMS发酵液（无氨基酸和硫酸铵（Difco)的0· 17% (w/v)酵母氮源、37. 8mM硫酸 铵、36mM梓檬酸、126mM正磷酸氢二钠 （pH 6. 5)、2% (w/v)鹿糖，用NaOH调节至pH 6. 5)。 使用AlbuPure基质色谱（ProMetic生物科学公司（ProMetic BioSciences))，随后是 如描述于（埃文斯（Evans)等人（2010)蛋白质表达与纯化（Protein Expression and Purification)第 73 卷，第 2 期，第 113-124 页）中的 DE-FF，随后在 S印hacryl S200 高分 辨率凝胶过滤（GE医疗公司）上纯化而进行c-myc标记的白蛋白和白蛋白变体的第二步纯 化，以便将+2058 Da错误切割的前导区的水平减至低于5% (w/v)。
[0220] 实例4白蛋白对猪、食蟹猴和豚鼠 FcRn的结合动力学
[0221 ] 在该实例中，分析HSA、变体HSA白蛋白和c-myc标记的HSA对来自猪、食蟹猴和豚 鼠的FcRn的结合亲和力并且将HSA结合与天然白蛋白（猪或豚鼠）的结合相比较。
[0222] 对描述于材料与方法部分中的测定作出以下改变而进行SPR测定：
[0223] 通过GeneArt合成可溶性FcRn受体并在HEK细胞中进行表达。可溶性FcRn在 β -链的C-末端上包含一个HIS-标签而非重链上的一个GST并且使用的β -链是该动物的 天然β-链（对于对应的序列，参见材料与方法部分）。通过HIS捕捉柱纯化可溶性FcRn， 随后使用IgG柱进行另外的纯化。将可溶性FcRn受体稀释至20 μ g/mL。在SPR测定中用 作运行缓冲液的磷酸盐缓冲液是pH 5.5而非pH 6.0。将白蛋白在20μΜ至0. 156μΜ的范 围内稀释并以30 μ L/min流动。使用1:1朗缪尔或稳态模型。
[0224] 结合动力学总结于表7中。
[0225] 表7 :白蛋白对猪和豚鼠的结合动力学
[0228] *使用稳态模型确定无动力学KD值
[0229] NA =由于动力学较快未获得。
[0230] 结论
[0231] 野生型HSA和PSA对猪FcRn的结合亲和力是可比较的。结合亲和力稍微低于预期 的结合亲和力并且可能归因于可溶性受体的品质不像预期的那样高。然而，天然猪白蛋白 与野生型HSA之间的0. 9倍差异仍指示猪是一种适于HSA和HSA变体的药代动力学研究的 动物模型，因为与HSA相比，天然猪白蛋白即使过量地存在也不能在pFcRn结合中胜过HSA。
[0232] c-myc标签似乎影响野生型HSA至猪FcRn的结合，然而，以如此低的亲和力（高 的KD)，该分子中非常少的干扰可以影响该结合。对于白蛋白变体而言，c-myc标签似乎 增强结合（573P)或不影响结合。所有HSA变体都以大于野生型HSA和PSA的亲和力结 合至猪FcRn上。HSA变体T83N+N111E+K573P对猪FcRn具有最快的缔合并且HSA变体 E492G+K573P+K574H+Q580K形成最稳定的复合体（最慢的解离速率（kd))。
[0233] 使用食蟹猴FcRn的比较研究显示当与天然食蟹猴白蛋白对食蟹猴FcRn的结合相 比时，野生型HSA的结合亲和力是0. 9倍。这指示食蟹猴和猪相对于比率是可比较的，尽管 结合亲和力就其本身而论对于食蟹猴FcRn而言稍微较高，然而如上所提及，这可能归因于 在本研究中猪FcRn品质较低。c-myc标签对结合亲和力具有非常少的影响。
[0234] 野生型HSA和猪SA非常差地结合至豚鼠 FcRn上。c-myc标签融合至白蛋白上似 乎抑制结合。当与野生型猪和人类SA以及人白蛋白变体相比时，豚鼠 SA对豚鼠 FcRn具有 最高的亲和力。由于这个原因，豚鼠不是用于评估HSA在体内的一种或多种（若干种）药 代动力学特性的希望的动物模型。
[0235] 实例5猪PK研究
[0236] 在8头雌性哥廷根迷你猪（埃尔加德哥廷根迷你猪公司（Ellegaard Gdttingen Minipigs A/S)，:S〇r0: Landevej 302，DK_4261Dalmose)体内进行 PK 研究。在适应期开始 时，这些迷你猪约5个月大并且体重为7. 8-9. 7kg。将这些动物分成4组，每组2个动物。 根据表8,以lmg/kg(0. 2ml/kg)的5mg/ml剂量溶液的剂量向两个动物的耳缘静脉中经由 venf Ion静脉内给予在N-末端C-myc标记的野生型HSA、在N-末端C-myc标记的白蛋白变 体K573P、在N-末端C-myc标记的白蛋白变体E492G+K573P+K574H+Q580K以及在N-末端 C-myc标记的白蛋白变体T83N+N111E+K573P :
[0237] 表8 :用于猪PK研究的剂量给予表
[0240] 按以下间隔将从颈静脉收集的两毫升（2ml)血液样品放入柠檬酸钠试管中：给药 前，给药后 〇· 25、2、8、24、48、72、96、120、144、168、192、216、240、264、288、312、360、408、456 以及504小时。在4°C、2000G下离心10min之前，将血液样品在冰上保存大约20min。立即 将血浆从每个样品中转移至三个适当标记的750 yL微型管中，每个管中大约250 μ 1，并且 最后将剩余的血浆在这三个管之间共享，并置于架子中。将血浆样品储存在-80°C下直到测 定。
[0241] 结果:
[0242] 在测试的8个动物中，仅有4个动物的PK分析是成功的，如从血浆内浓度-时间 曲线的终末消除阶段的斜率的决定系数（R2(Rsq))中所判断的，该决定系数需高于0.85以 得到AUC、t1/2、Vz及CL的可接受的估计值。来自动物1、2、5及7的药代动力学研究的结果 示于表9中。
[0243] 表9来自猪PK研究的药代动力学参数
[0245] 结论:
[0246] 与野生型人白蛋白相比，人白蛋白变体E492G+K573P+K574H+Q580K和 T83N+N111E+K573P分别显示出1. 8和1. 7倍更长的半衰期。这清楚地指示可以将白蛋白变 体的半衰期延长与野生型HSA的半衰期相比较并且可以用当前模型观察到变体HSA与野生 型HSA之间的半衰期的明显区别。
[0247] 足够有趣的是，具有最长半衰期的HSA变体在Biacore中与对猪FcRn具有最强结 合亲和力的HSA变体相关（参见实例4)。然而，在得出存在这样一种相关性的结论之前，必 须记住的是这些变体的PK数据仅基于针对每种变体的一个动物。
[0248] 半衰期的延长是降低的清除率的结果，这转而反映增加的AUC。
[0249] 实例6比较性食蟹猴PK研究
[0250] 在8只雌性食蟹猴（亨廷登生命科学（Huntingdon Life Sciences)，亨廷顿研究 中心（Huntingdon Research Centre)，伍利路（Woolley Road)，奥尔肯伯里（Alconbury)， 亨廷顿，剑桥郡PE284HS.英国）体内进行PK研究。在适应期开始时，这些食蟹猴是2. 5-3. 0 岁并且体重为2. 5-3. 5kg。将这些动物分成4组，每组2个动物。根据表10,以lmg/kg(lml/ kg)的lmg/ml剂量溶液的剂量经由隐静脉向两个动物静脉内给予在N-末端C-myc标记的 野生型HSA、在N-末端C-myc标记的白蛋白变体K573P、在N-末端C-myc标记的白蛋白变 体 E492G+K573P+K574H+Q580K 以及在 N-末端 C-myc 标记的白蛋白变体 T83N+N111E+K573P。
[0251] 表10 :用于食蟹猴PK研究的剂量给予表
[0253] 按以下间隔使用无菌刺血针经由适合的静脉穿刺从未麻醉的动物体内抽取0. SmL 的血液样品放入具有3. 8%柠檬酸钠（0. 13M)的HLS标准管中：给药前，给药后0. 25、2、8、 24、48、72、96、120、144、192、240、288、336、384、432、480、528、576、624、720、816、912、1008、 1104以及1200小时。在离心（在4°C下，2000x g持续10分钟）之前，通过翻转将样品充 分混合并且立即在湿冰上放置最多10分钟。将血浆吸移进标记的1.4mL微型管中，在干冰 上快速冷冻并保存在_80°C下。将血浆样品储存在-80°C下直到测定。
[0254] MM.
[0255] 来自该药代动力学研究的结果示于表11中。
[0256] 表11来自食蟹猴PK研究的药代动力学参数
[0257]
[0258] 结论:
[0259] 与野生型人白蛋白相比，人白蛋白变体K573P、E492G+K573P+K574H+Q580K和 T83N+N111E+K573P分别显示出I. 6、2. 1和2. 4倍更长的半衰期
[0260] 半衰期的延长是降低的清除率的结果，这转而反映增加的AUC。
【主权项】
1. 一种用于评估与野生型HSA相比的变体HSA的一种或多种（若干种）药代动力学特 性的方法，该方法包括 a. 选择一种非灵长类动物物种，其中在pH 6下，野生型HSA对所述动物的天然FcRn的 结合亲和力与所述动物的天然白蛋白对所述FcRn的结合亲和力相同或比其更高； b. 向a)中所选的该非灵长类动物物种的一个动物给予该变体HSA并且向该非灵长类 动物物种的另一个动物给予该野生型HSA ;并且 c. 测量该变体HSA和该野生型HSA的一种或多种（若干种）药代动力学特性。2. 根据权利要求O所述的方法，其中当与所述动物的天然白蛋白的结合亲和力相比 时，野生型HSA对所述动物的天然FcRn的结合亲和力在0. 8与3. 5倍之间。3. 根据权利要求0或0所述的方法，其中当与SEQ ID NO: 16比对时，该天然FcRn在对 应于位置161的位置中具有一个组氨酸。4. 根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中当与SEQ ID NO: 16比对时，该天然 FcRn在对应于位置52的位置中具有一个缬氨酸。5. 根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中该非灵长类动物物种是一种野生型动 物或一种转基因动物。6. 根据权利要求0所述的方法，其中该野生型动物是猪。7. 根据权利要求0所述的方法，其中该转基因动物是一种双转基因兔或一种双转基因 啮齿类动物，优选小鼠、豚鼠或大鼠，并且这些转基因是人白蛋白和一种当与SEQ ID N0:16 比对时在对应于位置161的位置中具有一个组氨酸的FcRn。8. 根据权利要求0所述的方法，其中当与SEQ ID NO: 16比对时，该FcRn另外还在位置 52中具有一个缬氨酸。9. 根据权利要求0或0所述的方法，其中该转基因FcRn选自人类、黑猩猩、猕猴、奶牛、 山羊、绵羊、骆驼以及猪。10. 根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中通过与一种配偶体如治疗剂融合、辄 合或缔合而修饰该变体HSA和野生型HSA。11. 根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中一种变体HSA或修饰的变体HSA被选 择用于在临床前试验中使用，该变体HSA或修饰的变体HSA当与野生型HSA或修饰的野生 型HSA相比时具有一种或多种（若干种）改进的药代动力学特性。12. 根据权利要求0所述的方法，其中该变体HSA具有比野生型HSA更长的半衰期。13. -种通过如权利要求0或0所述的方法选择的变体HSA。14. 一种通过与配偶体融合、辄合或缔合而修饰的变体HSA，其中通过如权利要求0或 〇所述的方法选择该融合、辄合或缔合。15. -种猪动物模型用于比较对照分子与测试分子的一种或多种（若干种）药代动力 学特性的用途，其中该对照分子包括野生型HSA并且该测试分子包括一种HSA变体。16. -种转基因的兔或啮齿类动物模型用于比较对照分子的一种或多种（若干种）药 代动力学特性与测试分子的一种或多种（若干种）药代动力学特性的用途，其中该对照分 子包括野生型HSA并且该测试分子包括一种HSA变体，该转基因的兔或啮齿类动物模型表 达一种当与SEQ ID NO: 16比对时在对应于位置161的位置中具有一个组氨酸的FcRn及人 白蛋白并且已经被敲除了对应的天然蛋白。17. 根据权利要求O或O所述的用途，其中包含野生型HSA的该分子和包含变体HSA的 该分子进一步包括一种辄合配偶体、融合配偶体或缔合配偶体，如治疗剂。18. 根据权利要求O至O中任一项所述的用途，其中评估所选配偶体和将它连接至该对 照分子和测试分子上的方法对这些药代动力学特性的影响。19. 根据权利要求O所述的用途，其中该配偶体是一种与或不与该白蛋白的C-末端和 /或N-末端处的不同连接物融合的融合配偶体（对于对照分子和测试分子而言，连接物是 相同的）。20. -种转基因动物，其基因组在其内源FcRn HC基因和血清白蛋白基因中包括一种 纯合破坏，该纯合破坏阻止功能性动物FcRn HC蛋白和功能性动物血清白蛋白的表达，并且 该基因组进一步包括一个编码人FcRn HCQiFcRn HC)的异源DNA序列和一个编码人血清白 蛋白的异源DNA序列，该人FcRn HC与SEQ ID NO: 16具有至少90% -致性并且当与SEQ ID NO: 16比对时在位置161中具有一个组氨酸，该人血清白蛋白与SEQ ID NO:2具有至少 95%-致性，并且其中该动物表达一种功能性hFcRn HC蛋白和功能性。21. 根据权利要求0所述的转基因动物，其中该动物是小鼠。
【专利摘要】本发明涉及一种使用非灵长类动物物种评估人血清白蛋白变体的药代动力学特性的方法，其中该动物的天然白蛋白对于HSA与所述动物体内的FcRn受体的结合提供最少竞争。在该非灵长类动物物种中，野生型HSA对所述动物的天然FcRn的结合亲和力与所述动物的天然白蛋白对该天然FcRn的结合亲和力相同或比其更高。本发明还涉及特别适于评估人血清白蛋白变体的药代动力学的动物模型。
【IPC分类】A01K67/00
【公开号】CN105007722
【申请号】CN201480008869
【发明人】J·卡梅伦, D·斯利普, I·桑德里, J·T·安德森
【申请人】诺维信生物制药丹麦公司
【公开日】2015年10月28日
【申请日】2014年2月14日
【公告号】EP2956002A1, WO2014125082A1, WO2014125082A9