一种速生白榆的组培快繁方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及植物组织培养技术领域，特别设及一种速生白愉的组培快繁方法。
【背景技术】
[0002] 白愉化Imus P皿ila)为愉科愉属植物，根系发达，适应性强，耐寒耐旱，耐中度盐碱，可 作滨海盐碱地造林和绿化树种，速生白愉在实际应用中优势明显，但传统的杆插无性繁殖 法成活率低、扩繁周期长，致使其扩繁和推广受到影响。
[0003] 目前国内针对白愉的研究主要W资源保存、杂交育种、实生苗选育、非常规育种为 主，将细胞和组织培养用于白愉遗传改良的较少，目前公开的白愉组织培养中，外植体W茎 段诱导效果较好，叶片分化效果不佳，培养基WMS最常用，激素 W6-节氨基腺嚷岭(6-BA)为 主，辅W吗I噪乙酸（IAA)、糞乙酸(NAA)、嚷苯隆(TDZ)等，王静华等(2009) W白愉茎段和叶片 为外植体进行白愉再生研究，茎段再生效果较好，最适增值培养基为MS + 6-BA 0.10 mg/L +IBA 0.005mg/L，增值系数为243%，平均茎高2.65cm。最适生根培养基为:MS +IBA 0.Olmg/ L，生根率100%，生根系数8.94,但主根较少。现有专利中，辛全伟等(2012)公布了一种耐盐 白愉的继代和生根配方;慕德宇等(2014)公布了一种耐盐速生白愉继代培养基EM及激素配 比;林大为等(2014)公布了一种白愉组培苗复壮的方法，W上研究集中在基本培养基研发、 继代、壮苗、生根等一个或两个环节且缺少炼苗过程，鲜有完整白愉再生体系，无法很好的 指导生产。
【发明内容】
[0004] 为了解决W上现有技术中白愉组织培养方法不系统、无法很好的指导生产的问题，本 发明提供了一种完整的速生白愉的组培快繁方法。
[0005] 本发明是通过W下步骤得到的： 本发明所述速生白愉的组培快繁方法，由无菌外植体的获得，丛生芽诱导，组培苗复 壮，生根培养和炼苗步骤组成。
[0006] 其中：所述无菌外植体获得:5-6月份采取新生嫩枝和嫩芽为外植体，用饱和洗洁 净水浸泡5~IOmin，后用毛笔轻刷表面，再用流水冲洗30~60min;移至超净工作台，用70~75% 酒精消毒20~30s，无菌水冲洗2~3次，再用1%次氯酸钢溶液消毒8~IOmin，后用无菌水冲洗5~ 8次，每次不少于3min，最后再置于少量无菌水中，防止接种时间过长造成外植体缺水失活。 接种时，用无菌滤纸吸去外植体表面多余水分，获得无菌外植体。
[0007] 其中：所述丛生芽诱导的方法是:将灭菌后的外植体剪成Icm左右带蔽芽小段接种 于快繁培养基上，在25±2°C，光照14~1化，光强30001X条件下培养20~30天，获得丛生芽;其 中所述快繁培养基的组成为:DKW + TDZ 0.075~0.2 mg/L + 6-BA 0.025~0.075 mg/L+ IBA 0.025~0.075 mg/L + NAA 0~0.1 mg/L+薦糖20~30g/L+琼脂6.5g/L+AC 0.5g/L，抑值 为5.8~6.0;其中DKW培养基组分为:硝酸锭1416. Omg/L，棚酸4.8mg/L，无水氯化巧112.5mg/ L，硝酸巧1367.0mg/L，五水硫酸铜0.25mg/L，乙二胺四乙酸二钢45.4mg/L，屯水硫酸铁 33.8mg/L，硫酸儀361.49mg/L，一水硫酸儘33.5mg/L，钢酸钢0.39mg/L，六水硫酸儀 0.005mg/L，憐酸二氨钟265. Omg/L，硫酸钟1559. Omg/L，六水硝酸锋17. Omg/L，盐酸硫胺素 5.22mg/L。
[000引 其中：优选快繁培养基为：DKW + TDZ 0.1-0.2 mg/L + 6-BA 0.025-0.05 mg/L+ IBA 0.025-0.075mg/L + NAAO-0.1 mg/L+薦糖25g/L+琼脂6.5g/L +AC 0.5g/L。
[0009] 所述最适宜的快繁培养基为：DKW + TDZ 0.2 mg/L + 6-BA 0.05 mg/L+ IBA 0.025mg/L + NAAO.l mg/L+薦糖25g/L+琼脂6.5g/L +AC 0.5g/L。
[0010] 其中：所述组培苗复壮的方法是:在无菌条件下将获得的丛生芽分成单株，切去基 部愈伤组织，接种到复壮培养基上，在25 ±2°C，光照14~1化，光强30001X条件下培养20~30 天，得到茎杆粗壮，叶片开展，叶色浓绿的健壮组培苗；复壮培养基为：MS培养基+ TDZ 0.025111邑/1+6-84 0.1111邑/1+184 0.05111邑/1+4(：0.5/1+薦糖25邑/1+琼脂6.5邑/1，口巧直为5.8 ~6.0 ;其中MS培养基组分为：硝酸锭1650 . Omg/L，硝酸钟1900 . Omg/L，二水合氯化巧 440.0 mg/L，屯水硫酸儀370.0 mg/L，憐酸二氨钟170mg/L，乙二胺四乙酸二钢37.3mg/L，屯水 硫酸铁27.8mg/L，舰化钟0.83mg/L，四水硫酸儘22.3mg/L，二水钢酸钢0.25mg/L，棚酸 6.2mg/L，五水硫酸铜0.025mg/L，六水氯化钻0.025mg/L，肌醇100 . Omg/L，盐酸硫胺素 O.lmg/L，盐酸化唉醇0.5 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L。
[0011] 其中：所述生根培养的方法是:在无菌环境下将复壮后的组培苗剪去基部愈伤组 织，接种到生根培养基上，在25±2°C，光照14~1化，光强30001X条件下培养20~30天，得到生 根组培苗;生根培养基组成为DKW或1/2DKW或1/2MS培养基+ IBA 0.01~0.05 mg/L + NAA 0~0.05mg/L + AC0.5g/L+薦糖12.5g/L+琼脂6.5g/L，pH值为5.8~6.0。
[001 ^ 其中1/2DKW培养基组分为：硝酸锭708. Omg/L，棚酸4.8mg/L，无水氯化巧56.25mg/ L，硝酸巧683.5mg/L，五水硫酸铜0.25mg/L，乙二胺四乙酸二钢45.4mg/L，屯水硫酸铁 33.8mg/L，硫酸儀361.49mg/L，一水硫酸儘33.5mg/L，钢酸钢0.39mg/L，六水硫酸儀 0.005mg/L，憐酸二氨钟132.5mg/L，硫酸钟779.5mg/L，六水硝酸锋17 . Omg/L，盐酸硫胺素 5.22mg/L。
[0013] 其中1/2MS培养基组分为：硝酸锭825 . Omg/L，硝酸钟950 . Omg/L，二水合氯化巧 220.0 mg/L，屯水硫酸儀185. Omg/L，憐酸二氨钟85. Omg/L，乙二胺四乙酸二钢37.3mg/L，屯 水硫酸铁27.8mg/L，舰化钟0.83mg/L，四水硫酸儘22.3mg/L，二水钢酸钢0.25mg/L，棚酸 6.2mg/L，五水硫酸铜0.025mg/L，六水氯化钻0.025mg/L，肌醇100 . Omg/L，盐酸硫胺素 O.lmg/L，盐酸化唉醇0.5 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L。
[0014] 其中：优选DKW或 1/2MS培养基+IBA 0.01-0.05 mg/L+NAAO-0.05 mg/L+ AC 0.5g/ L+薦糖 12.5g/L+琼脂 6.5g/L，pH 值为 5.8~6.0。
[0015] 最适宜的生根培养基为：1/2MS培养基WBA 0.05 mg/L+NAA0.025 mg/L+ AC 0.5g/L+薦糖 12.5g/L+琼脂 6.5g/L，pH 值为 5.8~6.0。
[0016] 其中：所述炼苗的方法是:将获得的生根组培苗移至遮阴溫室，遮阴法控制自然光 500-10001X，室内溫度20~25°C，湿度40% W上，闭瓶炼苗2-3天，开瓶盖炼苗2-3天，取出小 苗，洗净培养基后，移栽至赔石:草炭=1:1的基质中，在溫室内继续炼苗30-40天，待根系发 育正常，苗株生长健壮后移栽至大田。
[0017] 本发明的有益效果： 1)本发明公开的速生白愉组培快繁方法是将外植体直接接种到快繁培养基上获得丛 生芽，并将丛生芽分成单株后接种到复壮培养基上进行复壮，再将复壮组培苗接种到生根 培养基上。步骤中没有初代培养，得到无菌苗直接进行快繁，快繁后经壮苗再进行生根，提 高了组培苗生根质量和炼苗成活率，经检索在目前公开的能找到的快繁方法的文献中，本 发明的快繁出苗率是最高的，即速生白愉扩繁系数可达到4.5,生根率达到96.3%，炼苗成活 率 95〇/〇。
[0018] 2)本发明建立了针对速生白愉的组培快繁体系，利用改良培养基即在DKW培养基 基础上添加不同浓度的和不同种类的激素提高繁殖效率，解决了速生白愉快繁难题，并且 本发明方法较常规步骤扩繁系数高、出苗质量好，为速生工厂化育苗或规模化生产及推广 奠定了良好基础。
【附图说明】
[0019] 图1:本发明所述速生白愉组培及炼苗情况 其中：a:芽增殖b:组培苗复壮C:生根情况d:炼苗。
【具体实施方式】
[0020] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明。 实施例
[0021] 5-6月份采取新生嫩枝和嫩芽为外植体，用饱和洗洁净水浸泡5~lOmin，后用毛笔 轻刷表面，再用流水冲洗30~60min;移至超净工作台，用70~75%酒精消毒30s，无菌水冲洗2~ 3次，再用1%次氯酸钢溶液消毒8min，后用无菌水冲洗5~8次，每次不少于3min，最后再置于 少量无菌水中，防止接种时间过长造成外植体缺水失活。接种时，用无菌滤纸吸去外植体表 面多余水分，接种到含不同激素配比的快繁培养基上(见表1)。在25(±2)°C，光照14~1化， 光强30001x条