一种甜薯茎尖离体快速繁殖的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物组织培养领域，涉及一种甜薯茎尖离体快速繁殖的方法。
[0002]
【背景技术】
[0003] 甜薯(D. esculenta (Lout) brukill)为山药同属不同种食用植物，山药为薯截 科(Dioscoreaceae)薯截属(Dioscorea L.)薯截(D. polystachya Turcz·)，自《神农本草 经》就被列为上品即滋补食物，含多糖、淀粉、蛋白质、游离氨基酸和微量元素等多种成分， 具有免疫调节、抗氧化、降血糖、降血脂、抗肿瘤、抗突变、调节脾胃功能等功效，是中国著名 的补益中药，也是传统的保健菜肴。甜薯食用部分为类似马铃薯状的球形块茎，肉质细嫩、 食味佳、入口绵软，可做蔬菜、杂粮或药用等。
[0004] 目前甜薯是品种丰富但无规模栽培的农家小种，我们近年来从海南农家引种，并 通过耐寒性筛选获得了在江苏适生的品系，通过营养成分检测发现，其多糖含量为目前市 场公认的多糖含量最高的铁棍山药的3~4倍;且与江苏主栽的直根类山药品种不同，甜薯为 浅根类植物，种植无需挖深沟、筑高垄、套管等，收获也容易，因此，极大地降低了生产成本； 甜薯一棵植株可生长30-40个球状块茎，亩产可达3000斤以上，产量大；同时，就其社会效益 来看，甜薯抗旱耐肥、少病虫害且长势强，适合在江苏省缺水缺肥的低山丘陵地区种植，并 且因其对光照要求不高，不仅可种植在已有的耕地上，还可以在次生林、经济林间的空地种 植，不用与现有农作物抢占土地资源，从而缓解土地资源日益匮乏的矛盾。多糖含量高、浅 根系易种好收、产量高、江苏适生等诸多优点，使得甜薯成为一个新兴的、开发潜力大、前景 好的山药新种。不仅为苏南甚至苏中地区山药生产者提供了品质优良的山药新种，而且丰 富了消费者的蔬菜市场，更有利于江苏低山丘陵地区的改造利用，具有良好的经济效果与 社会效益。
[0005] 此外，传统的山药种植是在收获季节选健壮、无病虫害的块茎贮藏，次年种植季节 取出切断种植，这种传统的"春种、秋收、冬藏"方式存在种块严重浪费、繁殖速度很慢、人力 物力消耗大等问题;而且，由于长期的无性繁殖，导致病毒和病害的积累与传播，致使品质 退化、产量下降。前人研究表明，通过组织培养脱除病毒的方法不仅可以极大提高山药繁殖 系数，而且也会解决长期营养繁殖所造成的病毒病和品质退化等问题，在很多种或品种如 铁棍山药、怀山药、叉蕊薯蓣等中已有很多报道。甜薯中尚未见组织培养获得脱毒苗的研究 报道，本发明将以甜薯为研究对象，通过不同外植体、不同激素种类与浓度处理等多因素多 水平的实验，筛选出了最佳实验条件，建立了甜薯组织培养的最佳快速繁殖体系，为甜薯的 产业化生产提供了理论依据和实践指导。
【发明内容】
[0006] 本发明提供了一种甜薯茎尖离体快速繁殖的方法，通过组织培养技术，选择甜薯 茎尖，消毒灭菌后接种入不同的激素和浓度的培养基进行培养，并筛选出最佳快速获得脱 毒苗的体系，解决甜薯长期无性繁殖品质退化、产量下降的问题。
[0007] 为了达到上述目的，本发明采用的技术步骤如下： (1) 将所采健康甜薯的幼嫩茎尖进行灭菌消毒； (2) 将步骤(1)中消毒后的茎尖切去伤口部分； (3) 将步骤(2)中的茎尖接入已经灭菌的MS培养基中进行诱导出芽形成多芽体； (4) 将步骤(3)中的多芽体分株后转入继代培养基进行继代培养； (5) 将步骤(4)中继代生长成的无根幼苗转入生根培养基进行生根培养。
[0008] 其中步骤(1)中的幼嫩茎尖可采甜薯生长约三个月之后植株的茎尖； 步骤(2 )中茎尖切去与消毒液接触的伤口； 步骤(4)中多芽体要分株继代培养； 步骤(5)中幼苗的基部一定要插入培养基里生长。
[0009] 步骤（2)(3)(4)(5)中的操作最好在超净工作台上完成，要保持在无菌条件下操 作； 本发明提供获得甜薯脱毒苗快速繁殖的最佳组培体系，以提高甜薯的品质和产量，具 有较大的实际应用价值。
[0010]
【附图说明】
[0011] 图1是茎尖刚开始接入培养基。
[0012] 图2是茎尖培养出了多芽体。
[0013] 图3是多芽体分株后接入培养基。
[0014] 图4是将培养出的无根小苗接入生根培养基长出根的脱毒苗。
[0015]
【具体实施方式】
[0016] 下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。MS培养基、蔗糖、琼脂、激素 KT(激动素)均由索莱宝公司生产，1/2 MS培养基由上海丽臣商贸有限公司生产，酒精由南 京化学试剂有限公司生产，聚乙烯吡咯烷酮K-30(PVP)由国药集团化学试剂有限公司生产， 激素 NAA(a-萘乙酸）和IBA(3-吲哚丁酸）由上海楷洋生物技术有限公司生产，激素6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)购自上海瑞永生物科技有限公司，实验中甜薯是在南京中山植物园内种植 的。下面对其培养过程进行详细描述。
[0017] 1.采样 自南京中山植物园园内引种的甜薯中取生长壮、无病虫危害植株的幼嫩茎尖，用自来 水冲洗干净，用无菌水漂洗3~5次。
[0018] 2.培养基的制备 诱导培养基:采用MS基本培养基，加入蔗糖30 g/L和琼脂10g/L，附加不同浓度 的ΝΑΑ(0· lmg/L，0·5mg/L)+KT(l ·0 mg/L，2·0 mg/L)诱导培养的基础上，适当调整，做继代 培养基。
[0019] 继代培养基：采用MS基本培养基，加入蔗糖30 g/L和琼脂10g/L，0.5mg/L + KT 2.0 mg/L〇
[0020] 生根培养基：采用1/2 MS培养基，加入蔗糖30 g/L和琼脂10g/L，IBA 2.〇11^/1，灭菌前将培养基的口!1值调至5.8，封口后高压灭菌（121°(：)2〇1^11。
[0021] 以上培养基均加入PVP0.01%，冷却凝固后备用。
[0022] 3.外植体消毒 在超净工作台上，将洗净的茎尖用75%乙醇消毒10-15s，再放入0.1% HgC12溶液中 消毒3-4min，消毒后，用无菌水冲洗4-5次。
[0023] 4.接种外植体于诱导培养基上 将消毒后的外植体切成长0.5 cm左右的茎尖，接种在诱导培养基上，每个处理10 瓶，每瓶接种3个。
[0024] 5.诱导培养 培养接种后放入培养室内，温度(24±2)°C，每天光照16 h，光照强度2 000 lx。定期 观察记录污染情况，每两周换一次培养基，30 d后统计无污染的生芽率。多芽体形成后，分 株继代培养。
[0025] 6.生根培养 芽苗长到2~3 cm时，选取生长健壮的芽苗接种于生根培养基中诱导生根，每瓶接种3 个芽苗，30天后调查组培苗生根情况。
[0026] 7.观察统计生长结果 由表1可以看出诱导培养基中最佳激素浓度是NAA 0.1 mg/L + KT 2.0 mg/L，实验得 出继代生长培养基最佳激素浓度是NAA 0.5mg/L + KT 2.0 mg/L，生根培养最佳的激素浓 度是IBA 2.0 mg/L。
[0027] 表1不同激素浓度对茎尖形成多芽体的诱导的影响
【主权项】
1. 一种甜薯茎尖离体快速繁殖的方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 将所采健康甜薯的幼嫩茎尖进行灭菌消毒； (2) 将步骤(1)中消毒后的茎尖接入已经灭菌的MS培养基中诱导出多芽体； (3) 将步骤(2)中的再生芽转入继代培养基进行继代培养； (4) 将步骤(3)中的生长成的无根幼苗转入生根培养基进行生根培养。2. 根据权利要求1所述的甜薯茎尖离体快速繁殖的方法，其特征在于，步骤（1)中所述 的幼嫩茎尖可采甜薯生长约三个月之后植株，用自来水冲洗干净，用无菌水漂洗3~5次。3. 根据权利要求1所述的甜薯茎尖离体快速繁殖的方法，其特征在于，步骤（1)中所述 的消毒方法是再用75%乙醇消毒10-15s，再放入0.1% HgC12溶液中消毒3-4min，消毒 后，用无菌水冲洗4-5次。4. 根据权利要求1所述的甜薯茎尖离体快速繁殖的方法，其特征在于，步骤(2)中茎尖 是切成长〇.5cm左右。5. 根据权利要求1所述的甜薯茎尖离体快速繁殖的方法，其特征在于，步骤(2)所述的 茎尖要切除接触升汞的伤口。6. 根据权利要求1所述的甜薯茎尖离体快速繁殖的方法，其特征在于，步骤(2)所述的 诱导培养基是采用MS基本培养基，加入蔗糖30 g/L和琼脂10g/L。7. 根据权利要求1所述的甜薯茎尖离体快速繁殖的方法，其特征在于，步骤(2)中所述 的筛选出的诱导培养基中最佳激素浓度是NAA 0.1 mg/L + KT 2.0 mg/L。8. 根据权利要求1所述的甜薯茎尖离体快速繁殖的方法，其特征在于，步骤(3)中所述 的继代培养基最佳激素浓度是NAA 0.5mg/L + KT 2.0 mg/L，培养基其他成分与权利要求6 所述相同。9. 根据权利要求1所述的甜薯茎尖离体快速繁殖的方法，其特征在于，步骤(4)中所述 的生根培养最佳的激素浓度是IBA 2.0 mg/L，培养基其他成分与权利要求6所述相同。10. 根据权利要求1所述的甜薯茎尖离体快速繁殖的方法，其特征在于，步骤(4)中所述 的无根幼苗要长到2~3 cm时，选取生长健壮的无根苗接种于生根培养基中诱导生根，每 瓶接种3个。11. 根据权利要求1所述的甜薯茎尖离体快速繁殖的方法，其特征在于，步骤(2)(3)(4) 中所述的培养基均加入PVP0.01%。12. 根据权利要求1所述的甜薯茎尖离体快速繁殖的方法，其特征在于，步骤(2)(3)(4) 中所述的培养条件都是放入培养室内，温度(24±2)°C，每天光照16 h，光照强度2 000 lx〇
【专利摘要】本发明公开了一种甜薯茎尖离体快速繁殖的方法。通过离体培养甜薯的成熟幼嫩的茎尖，筛选出了最佳实验条件，建立了甜薯组织培养的最佳快速繁殖体系，可以得出诱导出芽培养基中最佳激素浓度是NAA？0.1？mg/L+KT？2.0？mg/L，和继代培养基中最佳激素浓度是NAA？0.5mg/L+KT？2.0mg/L，生根培养最佳的激素浓度是IBA？2.0mg/L。该方法能够快速获得甜薯的脱毒苗，提高甜薯的品质和产量，为甜薯的产业化生产提供了理论依据和实践指导。
【IPC分类】A01H4/00
【公开号】CN105613302
【申请号】CN201610178808
【发明人】孙小芹, 李定红, 杭悦宇
【申请人】江苏省中国科学院植物研究所
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2016年3月28日