一种镰孢菌菌剂、含脂肽类化合物的农药及用图
【专利摘要】本发明公开了一种镰孢菌菌剂、含脂肽类化合物的农药及用途。具体地，本发明的菌剂包含有效量的海洋来源镰孢Fusarium sp.L691的发酵液或发酵提取物。由所述提取物中分离得到的化合物1和化合物2为脂肽类化合物，可用作农药。研究发现本发明的菌剂及化合物可以拮抗多种植物病原真菌和细菌，特备是对特别是对小麦赤霉菌和小麦根腐菌有很强拮抗效果，可用用于预防、抑制和/或杀灭植物真菌和/或细菌病害。CGMCC No.1032620150127
【专利说明】
一种镰孢菌菌剂、含脂肽类化合物的农药及用途
技术领域
[0001] 本发明总地涉及酯肽类化合物，更具体地，涉及从真菌中提取的酯肽类化合物及 其抗菌用途。
【背景技术】
[0002] 镰刀属（Fusarium)又称为镰孢属，分布广，种类多，是污染粮食和饲料的常见霉 菌菌属之一，目前已发现44个种和7个变种。镰孢生长过程中产生多种有毒代谢产物，不 但造成植物萎蔫、根腐、穗腐等腐烂病，而且是自然产生的最危险的食品污染物之一，对人 畜健康危害十分严重。
[0003] 镰孢属产生的毒素种类很多，其中与动物和人类有关的主要是玉米赤霉烯酮、 单端孢霉毒素、串珠镰刀菌素和伏马菌素等，其中的单端孢霉毒素又分为A和B两类 (侯然然，张敏红.霉菌毒素对畜禽的危害及其防控方法的研究进展[J].中国畜牧兽 医，2007, 34 (1) : 13-16)。大多数镰孢都能产生玉米赤霉烯酮，该毒素往往与其它单端孢霉 毒素共存于饲料之中而引起动物中毒（王怡净，张立实.玉米赤霉烯酮毒性研究进展[J]. 中国食品卫生杂志，2002, 14(5) :40-44)。伏马菌素是一组结构类似的霉菌代谢产物，目 前已明确伏马菌素 Bl和B2可引起动物中毒（江涛，罗雪云，计融.伏马菌素的研究进展 [J] ·中国食品卫生杂志，1998, 10 (4) : 28-30)。
[0004] 镰孢能生活在各种宿主上，其中有许多种类与昆虫有密切的关系，作为 虫生真菌报道过一些种类（薄蛰龙.昆虫真菌学[M].合肥：安徽科学技术出版 社.1996. 310-313, 519-524)。此外，不少人报道了从该属真菌中筛选到对昆虫有明显杀虫 活性的物质，如T-2毒素、玉米赤霉烯酮和单端孢素等（薄蛰龙.昆虫真菌学[M].合肥： 安徽科学技术出版社.1996. 310-313, 519-524)。因此，这类真菌在农林害虫的生物防治上 有广阔的应用前景。
[0005] 然而，目前为止，还没有涉及镰孢属微生物在植物病害防治方面的研究。
【发明内容】
[0006] 本发明以海洋来源镰孢Fusarium sp. L691为研究对象，对其大米发酵产物进行了 提取、分离、纯化，得到了 2个酯肽类化合物，对这些化合物进行了结构鉴定和生物活性研 究，发现发酵提取物以及这两个化合物具有很好的抗植物病害活性，对多种植物病原真菌 和细菌有明显抑制作用。
[0007] 为此，本发明的第一方面提供一种菌剂，所述菌剂中包含有效量的海洋来源镰孢 Fusarium sp.的发酵液或发酵提取物。所述镰孢Fusarium sp.L691已于2015年01月27 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路 1号院3号，保藏号为CGMCC10326。
[0008] 此外，所述菌剂中还可包括辅料。辅料的作用是使菌剂中的活性成分更好地吸附 或附着于对于所述活性成分来说是惰性的载体上，同时辅料也起到适当稀释菌剂的作用， 以便均匀施加。优选采用对土壤具有改善作用和/或对植物具有肥力的那些物质。所述辅 料可以是如各类作物的秸杆、松壳、稻草、花生皮、动物粪便、草炭等。
[0009] 所述活性成分包括以下化合物1和化合物2 :
[0010]
[0011] 根据本发明的第二方面，提供一种农药，其中包含有效量的上述化合物1和/或化 合物2作为活性成分。
[0012] 所述农药可为溶液、油乳液、水乳液或微乳液形式。形成不同形式的剂型作用是起 到适当稀释活性成分的作用，以便均匀施加。另外各种形式的农药应当能够稳定存放。其 中所用的溶剂优选对土壤和/植物没有不良作用，且无环境污染的那些溶剂。优选地，用于 溶解化合物1和/或化合物2的溶剂，例如，醇类，如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇等；酯类，如乙酸 乙酯、乙酸甲酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯等；芳烃类，如苯、甲苯、二甲苯等；酮类，如丙酮、环己 酮等，但不限上述这些。
[0013] 所述农药还可以包含辅料。所述辅料可以是使所述活性成分更好地吸附或附着于 对于所述活性成分来说是惰性的载体上，同时辅料也优选采用对土壤具有改善作用和/或 对植物具有肥力的那些物质。所述辅料可以是如各类作物的秸杆、松壳、稻草、花生皮、动物 奠便、草炭等。
[0014] 上述菌剂或农药用于预防、抑制和/或杀灭植物真菌和/或细菌病害。
[0015] 其中所述植物真菌和/或细菌病害是指由小麦赤霉菌Wheat Gibberella zeae、小 麦根腐菌Bipolaris sorokiniana、黄瓜立枯丝核菌Rhizoctonia Solani kuhn、稻痕病菌 Pyricularia grisea和/或黄单胞菌Xanthomonas sp.中的一种或多种引起的植物病害。
[0016] 根据本发明的第三方面，提供上述菌剂或农药用于预防、抑制和/或杀灭植物真 菌和/或细菌病害的应用。
[0017] 其中所述植物真菌和/或细菌病害是指由小麦赤霉菌Wheat Gibberella zeae、小 麦根腐菌Bipolaris sorokiniana、黄瓜立枯丝核菌Rhizoctonia Solani kuhn、稻痕病菌 Pyricularia grisea和/或黄单胞菌Xanthomonas sp.中的一种或多种引起的植物病害。
[0018] 本发明的菌剂和农药施加在植物根部附近的土壤中。
[0019] 本发明研究发现上述酯肽类化合物对多种植物病原菌也具有很好的抑制作用，因 此所述化合物以及镰孢Fusarium sp.的发酵液或提取物具有作为农药的广阔用途。
【附图说明】
[0020] 以下附图用于更好地说明本发明。
[0021 ] 图1显示的是根据本发明的镰孢Fusarium sp.发酵粗提物对小麦赤霉菌 Wheat Gibberella zeae (A)、小麦根腐菌 Bipolaris sorokiniana(B)、黄瓜立枯丝核菌 Rhizoctonia Solani kuhn (C)、稻痕病菌Pyricularia grisea (D)和黄单胞菌Xanthomonas sp. (E)增殖的抑制效果。
[0022] 图2显示的是化合物1和化合物2分别对小麦赤霉菌Wheat Gibberella zeae (A)、 小麦根腐菌 Bipolaris sorokiniana (B)、黄瓜立枯丝核菌 Rhizoctonia Solani kuhn (C)、 稻痕病菌Pyricularia grisea(D)和黄单胞菌Xanthomonas sp. (E)增殖的抑制效果。
【具体实施方式】
[0023] 下列实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0024] 下列实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径中得到。
[0025] 下列实施例中所用的小麦赤霉菌Wheat Gibberella zeae，小麦根腐菌Bipolaris sorokiniana，黄瓜立枯丝核菌 Rhizoctonia Solani kuhn，稻痕病菌 Pyricularia grisea 均为中国科学院真菌学国家重点实验室李少杰实验室惠赠。
[0026] 下列实施例中所用的黄单胞菌Xanthomonas sp.为中国科学院植物基因组学国家 重点实验室钱韦实验室保存。
[0027] 实施例1镰孢Fusarium sp.的发酵培养
[0028] 将镰孢Fusarium sp.接种到PDA试管琼脂培养基斜面上，进行预培养。预培养的 条件为：25°C，避光培养7天（PDA培养基组成：土豆200g，葡萄糖20g，琼脂粉16g，蒸馏水 定容至1L)。待菌丝长满整个斜面后，在无菌条件下将菌丝体转接到液体培养基中进行培 养，得到种子培养液。液体培养的条件为：25°C，避光培养7天。液体培养基：葡萄糖4. Og/ L，麦芽提取物（Malt Extract) 10.0 g/L，酵母提取物（Yeast Extract，购自 Oxoid Ltd.，批 号为1074139)4. Og/L，水定容至1L。
[0029] 取10 _升种子培养液接种到经过灭菌的装有固体培养基（固体培养基由80g大 米和100mL水组成）的500毫升三角瓶中，供接种20瓶。在25°C，避光发酵培养30天。 大米发酵产物乙酸乙酯提取，在室温温度条件下超声提取。将提取液蒸馏，得到粗浸膏 (FS) 81. 6g〇
[0030] 实施例2、化合物1和2的提取分离
[0031] HPLC分析仪为Agilent 1200分析型液相色谱仪。HPLC的条件如下：以色谱甲醇 将样品配制为l〇mg/ml的溶液，上样量为每次15ul，色谱柱为Kromasil 10X250mm C18半 制备柱，柱温为25°C，2IOnm波长进行检测。
[0032] 将实施例1中获得的粗浸膏FS通过硅胶柱色谱分离，以正己烷-乙酸乙酯体系 (正己烷：乙酸乙酯的体积比为 100:1、100:2、100:3、100:4、100:5、10:1、9:1、8:2、7:3、 6:4)，二氯甲烷：甲醇体系（二氯甲烷：甲醇的体积比为100:1、100:2、30:1、20:1、10:1、 9:1、8: 2、7:3)依次进行梯度洗脱，每个梯度洗4个保留体积，每个体积750ml。
[0033] 根据薄层层析色谱行为和HPLC分析，保留活性物质较多的洗脱馏分。其中，在正 己烷：乙酸乙酯（体积比为100:0)体系得到馏分FS-I ;在正己烷：乙酸乙酯（体积比为 100:1和100:2)体系得到馏分FS-2 ;在正己烷：乙酸乙酯（体积比为100:3)体系得到馏 分FS-3 ;在正己烷：乙酸乙酯（体积比为100:4)体系得到馏分FS-4 ;在正己烷：乙酸乙酯 (体积比为100:5和10:1)体系得到馏分FS-5 ;在正己烷：乙酸乙酯（体积比为9:1)体系 得到馏分FS-6 ;在正己烷：乙酸乙酯（体积比为8:2)体系得到馏分FS-7 ;在正己烷：乙酸 乙酯（体积比为7:3)体系得到馏分FS-8 ;在正己烷：乙酸乙酯（体积比为6:4)体系得到馏 分FS-9和FS-10 ;在二氯甲烷：甲醇（体积比为100:1，100:2,30:1)中得到馏分FS-Il ;在 二氯甲烷：甲醇（体积比为20:1)中得到馏分FS-12;在二氯甲烷：甲醇（体积比为10:1) 中得到馏分FS-13;在二氯甲烷：甲醇（体积比为9:1和8:2)中得到馏分FS-14。共得到 14个馏分。将各馏分分别除去溶剂，并干燥。
[0034] 其中，将FS-8通过ODS柱色谱分离，以甲醇-水体系（甲醇-水体积百分数为 50 %、60 %、70 %、80 %、90 % )进行梯度洗脱，每个梯度洗4个保留体积，每个体积250ml。根 据薄层层析色谱行为和HPLC分析，在甲醇-水（体积比为50% )得到馏分FS-8-UFS-8-2 和FS-8-3 ;在甲醇-水（体积比为60% )得到馏分FS-8-4 ;在甲醇-水（体积比为70% ) 得到馏分FS-8-5 ;在甲醇-水（体积比为80% )得到馏分FS-8-6和FS-8-7 ;在甲醇-水 (体积比为90%)得到馏分？3-8-8、？3-8-9、？3-8-10和？3-8-11，共11个馏分。将以上馏 分中的FS-8-7通过高效液相色谱用制备柱分离，以69%乙腈-酸水（0.01 %三氟乙酸）洗 脱，分离得到化合物1。
[0035] FS-7通过凝胶柱色谱分离，以70%甲醇-水体系进行等度洗脱，根据薄层层析色 谱行为和 HPLC 分析，共得到 6 个子馏分（FS-7-1、FS-7-2、FS-7-3、FS-7-4、FS-7-5、FS-7-6)。 FS-7-2通过ODS柱色谱分离，以甲醇-水体系（甲醇-水体积比为50 %、60 %、70 %、80 %、 90%)进行梯度洗脱，每个梯度洗4个保留体积，每个体积500ml。根据薄层层析色谱行为 和HPLC分析，在甲醇-水（体积比为50%和60% )得到馏分FS-7-2-1 ;在甲醇-水（体 积比为70% )得到馏分FS-7-2-2、FS-7-2-3和FS-7-2-4 ;在甲醇-水（体积比为80% ) 得到馏分 FS-7-2-5、FS-7-2-6、FS-7-2-7、FS-7-2-8 和 FS-7-2-9 ;在甲醇-水（体积比为 90% )得到馏分FS-7-2-10,共得到10个馏分。将其中得到的FS-7-2-4通过高效液相色谱 的制备柱分离，以67%乙腈-酸水（0. 01 %三氟乙酸）洗脱，分离得到化合物2。
[0036] 实施例3、化合物1和2的确认
[0037] 本实施例中所使用的核磁共振仪为Varian Mercury-500和-600兆赫，红外色谱 仪为NicoletIS5FT-IR，质谱仪为BrukerAPEXIII7·0T和APEXIIFT-ICR。
[0038] 经NMR的碳谱和氢谱鉴定并确认以上实施例提取的化合物1和2分别具有以下结 构。
[0039]
[0042] 实施例4镰孢Fusarium sp.发酵提取物对植物病原真菌/细菌的诘抗作用研究
[0043] 测试用菌株：小麦赤霉菌Wheat Gibberella zeae，小麦根腐菌Bipolaris sorokiniana，黄瓜立枯丝核菌Rhizoctonia Solani kuhn，稻痕病菌Pyricularia grisea， 黄单胞菌 Xanthomonas sp. 〇
[0044] 待测样品溶液：将实施例1中得到的镰孢Fusarium sp.发酵提取的粗浸膏FS溶 于DMSO中配制成500mg/ml的溶液，待用。
[0045] 测定方法：在马铃薯葡萄糖琼脂培养基PDA平板中央接入新鲜的棉花小麦赤 霉菌Wheat Gibberella zeae，小麦根腐菌Bipolaris sorokiniana，黄瓜立枯丝核菌 Rhizoctonia Solani kuhn，稻痕病菌 Pyricularia grisea，或黄单胞菌 Xanthomonas sp.的菌块（打孔器打下5mm左右的菌块进行接种），在平板周边的三个点加上样品溶液， 另一点加上等量DMSO作为阴性对照，放置于培养箱中，28摄氏度恒温倒置对峙培养。7天 后观察，记录对峙情况。
[0046] 结果如图1所示，Fusarium sp.发酵提取物对小麦赤霉菌和小麦根腐菌有很强的 抑制活性，对稻瘟霉、黄瓜立枯丝核菌也有一定的抑制活性；
[0047] Fusarium sp.发酵提取物浸膏对植物病原细菌黄单胞菌有弱活性。
[0048] 实施例5化合物1和化合物2对植物病原菌的拮抗作用研究
[0049] 如实施例2所述菌株。待测样品为实施例2中分离得到的化合物1和化合物2,分 别溶于DMSO中配制成20mM的溶液，待用。测定方法如实施例4所述，分别以蒸馏水和DMSO 作为阴性对照。
[0050] 结果如图2所示，化合物1和2对小麦赤霉菌、黄瓜立枯丝核菌有很好的抗植物病 原真菌的活性，化合物1和2对小麦根腐菌有弱的活性，化合物2对稻瘟霉有弱的活性；化 合物1和2对植物病原细菌黄单胞菌有弱活性。
【主权项】
1. 一种菌剂，包含有效量的海洋来源镶抱化sarium SP.L691的发酵液或发酵提取物， 所述镶抱化sarium SP. L691保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、，保藏 号为 CGMCC 10326。2. 根据权利要求1所述的菌剂，进一步包括选自賴杆、松壳、稻草、花生皮、动物粪便和 草炭中至少一种的辅料。3. 根据权利要求1或2所述的菌剂，其中包含包括W下化合物1和化合物2作为活性 成分：；〇,4. 一种农I O5. 根据权利要求4所述的农药，其中所述农药为溶液、油乳液、水乳液或微乳液形式。6. 根据权利要求4所述的农药，其中所述农药进一步包括选自賴杆、松壳、稻草、花生 皮、动物粪便和草炭中至少一种的辅料。7. 根据权利要求1~3中任一项所述的菌剂或根据权利要求4~6中任一项所述的农 药用于预防、抑制和/或杀灭植物真菌和/或细菌病害的应用。8. 根据权利要求7所述的应用，其中所述植物真菌和/或细菌病害是指由小麦赤 霉菌Wheat Git)berella zeae、小麦根腐菌Bipolaris sorokiniana、黄瓜立枯丝核菌 Rhizoctonia Solani kuhn、稻攝病菌 Pyricularia grisea 和 / 或黄单胞菌 Xanthomonas SP.中的一种或多种引起的植物病害。9. 根据权利要求7所述的应用，其中所述菌剂或所述农药施加在植物根部附近的±壤 中。
【文档编号】A01P3/00GK105981745SQ201510062445
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年2月5日
【发明人】刘宏伟, 李少杰, 钱韦, 张立新
【申请人】中国科学院微生物研究所, 中国大洋矿产资源研究开发协会