油菜双单倍体诱导系规模化创造油菜遗传稳定群体的方法
【专利摘要】本发明油菜双单倍体诱导系规模化创造油菜遗传稳定群体的方法，包括：1）根据研究需求选择目标性状;2)根据目标性状选择具有该目标性状差异较大的两个亲本材料;3）两个亲本材料杂交；4）用油菜双单倍体诱导系给亲本杂交F1代授粉；4)诱导后代遗传稳定性鉴定；5）诱导后代目标性状调查形成遗传稳定的遗传群体。本发明可在油菜3个栽培种（甘蓝型油菜（2n=38）、白菜型油菜(2n=20)、芥菜型油菜（2n=36））中都可运用，可以快速（3代）、规模化获得遗传稳定的DH（Double Haploid）群体，对油菜基础研究特别是遗传作图群体用于基因定位、基因精细定位、QTL分析具有明显的促进作用，降低油菜基础研究的周期和人力、物力投入。
【专利说明】
油菜双单倍体诱导系规模化创造油菜遗传稳定群体的方法
[0001 ]
技术领域： 本发明与农业有关，特别与油菜双单倍体诱导系规模化创造油菜遗传稳定群体即DH 群体的方法有关。
[0002]
【背景技术】： 油菜是我国主要的油料作物，包括3个栽培种，甘蓝型油菜(jSrassica /ja/ws，芸苔(aa， n=10)与甘蓝(cc，n=9)通过自然种间杂交后双二倍化进化而来的一种复合种，根据染色体 来源判断为四倍体，2n=38);白菜型油菜(jSrassia caspesiris 包括原产中国的芸苔和 油白菜。中国又称小白菜、矮油菜、甜油菜等。染色体组为aa，n=10,根据来源染色体组来源 判断为二倍体，2]1=20);芥菜型油菜(1^^88；[03加11063，由芸薹(33，11=10)和黑芥(1313，11=8) 通过自然种间杂交后双二倍化进化而来的一个复合种，根据染色体来源判断为四倍体，2n= 36)0
[0003] 在油菜中开展基础研究，特别是针对目标性状(含油率、油酸、芥酸、株高、生育期、 光叶等性状)进行基因克隆或连锁标记筛选，需要对目标性状进行遗传群体构建，搭建遗传 作图群体，便于基因定位或QTL扫描，因为构建遗传作图群体的需求不同，群体个体数目要 求也不一致，初步定位需要遗传稳定(DH群体)单株200-1000个，精细定位需要2000个以上 的稳定遗传单株。油菜遗传群体构建一般采用DH群体或重组自交系(F2:3家系），DH系依赖 油菜小孢子离体培养技术，更依赖油菜材料的基因型，很多材料基因型不适合大规模小孢 子培养。不适合小孢子培养就选择重组自交系(F2:3家系），先获得F2,然后每个F2单株进行 株系种植，在获得F3，F3再以株系种植，一直选择具有目标性状的株系种植，直到每个株系 稳定遗传不再分离，一般情况下重组自交系群体构建需要8-10年的时间，才能构建起适合 遗传作图的群体。油菜小孢子立体培养也需要3-4年的时间才能建立起来，而且对小孢子培 养技术和实验室研究条件有严格的要求。
[0004]目前，在油菜中还未有诱导系或双单倍体诱导系的报道。所谓"诱导系"是指，用该 植物作为父本用其花粉对同类植株授粉，能诱导同类植株(母本)产生相应的效应，如产生 单倍体、双单倍体(DH系)等。在植物中运用诱导系进行新品种选育最多的是玉米，但玉米中 的诱导系也只是单倍体诱导系。最早出现的玉米单倍体诱导系为stock6,该诱导系只能诱 导玉米产生单倍体，然后单倍体植株再进行人工染色体加倍形成纯合二倍体(双单倍体）， 且诱导效率较低，一般诱导效率在10%以下（以收获种子中获得单倍体数计算）。
【发明内容】
本发明的目的为了提供一种能方便、快速、高效，只需3代(2年或3年)获得稳定的油菜 株系(DH系），提高油菜DH群体构建的效率、降低油菜DH群体构建难度，同时能极大地满足油 菜基础研究的需求的油菜双单体诱导系规模化创造油菜DH群体的方法。
[0005]本发明的目的是这样来实现的： 本发明油菜双单倍体诱导系规模化创造油菜遗传稳定群体(DH群体)的方法，包括如下 步骤： 1) 对具有目标性状(含油率、油酸、芥酸、株高、生育期、光叶等性状1项或多项)差异明 显的2个遗传稳定油菜进行人工去雄杂交，并收获杂交后代Fi种子； 2) 对上述步骤1)中杂交?:植株种植，在现蕾初期进行化学杀雄;根据化学杀雄剂不同 或油菜材料不同提前进行浓度摸索和比较试验，保证化学杀雄彻底，采用化学杀雄剂为苯 磺隆或戊炔草胺，其作用浓度为30-150ppm; 3) 在油菜花期，利用油菜双单倍体诱导系对上述步骤2)中化学杀雄后的杂交Fi植株进 行人工授粉，或将油菜双单倍体诱导系与上述步骤2)化学杀雄杂交h植株种植在一个隔离 网室，采用壁蜂辅助授粉，接受授粉的母体植株至少在100株以上； 4) 对上述步骤3)中油菜双单倍体诱导系授粉后代进行单株种植，苗期利用流式细胞仪 鉴定倍性，淘汰多倍体、单倍体或具有油菜双单倍体诱导系显性性状特征植株，选择正常育 性，正常倍性植株，单株套袋自交，选择套袋自交单株数在5000株以上； 5) 对上述步骤4)中单株自交后代进行株系种植，调查株系形态一致性，并通过分子标 记(SSR或S R A P )鉴定株系一致性及稳定性； 6) 上述步骤5)中所鉴定的所有遗传稳定株系(至少在2000个株系以上)再进行目标性 形状(含油率、油酸、芥酸、株高、生育期、光叶等性状1项或多项）的统计，分析目标性状(含 油率、油酸、芥酸、株高、生育期、光叶等性状1项或多项)是否符合正态分布； 7) 上述步骤6)中所有遗传稳定株系，即DH群体，满足目标性状(含油率、油酸、芥酸、株 高、生育期、光叶等性状1项或多项）正态分布，确定这些DH群体构建合格，用于油菜目标性 状的遗传作图、目标性状基因的定位、QTL分析、以及目标性状与基因的关联分析等； 上述步骤3)中油菜双单倍体诱导系的选育方法如下： (1) 选育具有孤雌生殖遗传特性的早代稳定系： ① 将两个油菜亲本材料杂交Fi代种子在培养基上用染色体加倍诱导剂进行人工染色 体加倍获得加倍后的Fi代植株； ② 加倍后的h代植株进行自交或强制自交获得内代，对F2代进行田间种植观察，并鉴定 每个单株的育性，选择可育后代自交获得F 3代，对F3代进行纯合度鉴定，通过形态、细胞学以 及分子标记鉴定，对后代DNA进行聚合酶链反应扩增，电泳观察每个特异引物扩增下单株的 DNA带型及条带数目，显示每个单株都是两个亲本的杂交后代，每个单株之间分子标记图谱 一致，说明这些单株是纯合系一早代稳定系； ③ 获得的早代稳定系与至少10个油菜常规纯合稳定系进行正反交，Fi代、F2R鉴定早 代稳定系的遗传特性，即是否有孤雌生殖特性;上述正反交，如有Fi分离，^代出现部分稳定 株系，对应的早代稳定系是具有孤雌生殖遗传特性的早代稳定系； (2) 选育携带显性遗传性状、具有孤雌遗传特性且倍性遗传稳定的多倍体油菜： ① 具有孤雌生殖遗传特性的早代稳定系与具有显性性状油菜杂交(如显性矮杆、紫叶、 花叶、黄叶、高芥酸等性状），得到杂交?:代种子，上述杂交FHf种子在培养基上用染色体加 倍诱导剂进行人工染色体加倍，得到加倍后的带显性性状的^植株； ② 对加倍的带显性性状的Fi植株，通过显微观察或流式细胞仪进行染色体倍性鉴定， 选择带显性性状的多倍体的植株，淘汰非正常加倍株、非整倍体植株、以及不带显性性状加 倍植株;带显性性状的多倍体的植株主要是倍性遗传稳定、结实性好、具有孤雌生殖遗传特 性、带显性性状（如显性矮杆、紫叶、花叶、黄叶、高芥酸等性状）的六倍体或八倍体油菜植 株； (3)油菜双单倍体诱导系鉴定及诱导能力测定： ① 倍性遗传稳定、具有孤雌生殖遗传特性、带显性性状的多倍体植株中的显性性状能 去除测交后代中产生的杂交株，如果测交后代中出现显性性状植株、或非整倍体植株，说明 该植株是多倍体植株和母本杂交产生的，去除该植株； ② 上述单株测交后代如果出现全不育、为正常倍性(二倍体或四倍体)油菜、且不带显 性性状，说明该测交后代对应的父本基因未进入测交后代中，显性多倍体植株为油菜双单 倍体诱导系； 本发明油菜DH系或遗传稳定群体，可用于遗传图谱构建、QTL定位或精细定位，利用该 方法可规模化、快速、方便获得稳定遗传的作图或定位群体，保证遗传图谱构建、QTL定位或 精细定位的可靠性。采用本发明获得油菜遗传稳定群体借助了油菜双单倍体诱导系能诱导 母体植株在F1代发生孤雌生殖，在^代形成稳定的双单倍体个体，F 3代进行稳定性、一致性 鉴定，获得稳定遗传后代。
[0006]上述获得油菜双单倍体诱导系是将两个亲本材料杂交FHf种子或具有孤雌生殖 遗传特性的早代稳定系与具有显性性状油菜杂交得到的杂交Fi代种子在培养基上用染色 体加倍诱导剂进行人工染色体加倍，具体方法如下： 1) 用纯度为75%酒精进行种子表面消毒25-40秒，用0.1%升汞消毒12-17分钟，然后用无 菌水将种子表面的升汞冲洗干净，用无菌纸将种子表面的水分吸干，然后将种子接种在第 一培养基上； 2) 让种子在第一培养基上生根发芽，培养条件:温度23-251，白天光照12-16小时，光 照强度2000-3000勒克斯，夜晚暗培养8-12小时，待植株长到1 一2片真叶时，从下胚轴处剪 下植株继续在第二培养基上生长； 3) 将剪下的植株继续插入第二培养基上继续培养，待有侧芽分化后，将侧芽及植株转 入第三培养基中进行生根培养； 4) 生根培养二周后，植株长出粗壮的根后，将植株在室温炼苗3-7天，取出植株将植株 上的培养基用自来水冲洗干净，并在浸泡缓冲液中浸泡15-30分钟后移栽到温室中，温室 温度16 QC-25QC，相对湿度60-80%，能保证移栽成活率在95%以上； 上述的第一培养基由以下配比的组分组成： -MS培养基 1L 6_苄基腺嘌呤 0.5-1.5mg 染色体加倍诱导剂 30-70mg 鹿糖 20-30g 琼脂 8 一10g， 第一培养基的pH=5.8-6.0， 上述的第二培养基由以下配比的组分组成： MS培养基 1L 6_苄基腺嘌呤 0.5-lmg 染色体加倍诱导剂 20-40mg 鹿糖 20-30g 琼脂 8 一10g， 第二培养基的pH=5.8-6.0， 上述的第三培养基由以下配比的组分组成： MS培养基 1L α-蔡乙酸 0.03-0.5mg 染色体加倍诱导剂 5-20mg 鹿糖 20-30g 琼脂 8 一10g， 第三培养基的pH=5.8-6.0， 上述的浸泡缓冲液由以及下配比的组分组成： 水 1L 易保或克露 0.6-1.2g α-萘乙酸 0.5-lmg。
[0007] 油菜双单倍体诱导系能直接诱导油菜产生双单倍体后代，无需进行人工染色体加 倍来获得纯合系;且诱导效率高，最高可达1〇〇%，一般的诱导效率都在50%以上。
[0008] 双单倍体诱导系诱导母体植株产生双单倍体的主要原理是:诱导系能诱导母体植 株，大孢子生殖细胞(卵细胞)产生孤雌生殖效应，且卵细胞能进行染色体加倍，即卵细胞孤 雌生殖产生的后代就双单倍体。本发明可以快速(3代，2年）、高效、规模化(2000个遗传稳定 株系以上)获得DH群体;本发明可在油菜3个栽培种(甘蓝型油菜（2n=38)、白菜型油菜(2n= 20)、芥菜型油菜（2n=36))中都可运用，对油菜基础研究特别是遗传作图群体同于基因定 位、基因精细定位、QTL分析具有明显的促进作用，降低油菜基础研究的周期和人力、物力投 入。
[0009] 上述的染色体加倍诱导剂采用秋水仙素、氟乐灵、氨磺乐灵中的至少一种。
[0010] 本发明方法可以方便、快速、规模化用于油菜遗传稳定群体(DH群体)构建，可以在 2年或3代的时间内、不借助油菜小孢子培养技术体系获得遗传稳定群体(DH群体），大大节 约油菜基础研究的时间周期。
[0011] 本发明具有以下优点： 1、 该方法方便易于掌握，无须繁琐的油菜小孢子离体培养技术； 2、 该方法能快速获得油菜遗传稳定群体(DH系），最快3代(2年)就能获得； 3、 该方法能规模化获得油菜遗传稳定群体(DH系），最少能获得2000个株系以上的稳定 群体，还可根据需要无限扩大； 4、 本发明可以用在3个油菜栽培种遗传稳定群体(DH群体)的构建，降低油菜基础研究 周期，降低人力物力成本、提高效率； 5、 油菜双单倍体诱导系直接诱导母体植株产生双单倍体，诱导甘蓝型油菜、芥菜型油 菜产生纯合四倍体(基因纯合系）、诱导白菜型油菜产生纯合二倍体（基因纯合系）；获得的 遗传稳定群体，无需进行人工染色体加倍，可一步形成稳定群体。
[0012]【附图说明】： 图1为油菜双单倍体诱导系规模化创造油菜遗传稳定群体的流程图。
[0013]图2为油菜双单倍体诱导系选育流程图。
[0014] 图3为获得油菜早代稳定系的方法流程图。
[0015] 图4为油菜双单倍体诱导系Y3560选育流程图。
[0016]图5为油菜双单倍体诱导系Y3380选育流程图。
[0017] 图6为油菜早代稳定系P3-2选育流程图。
[0018] 图7为甘蓝型油菜高含油DH稳定遗传群体构建图。
[0019] 图8为甘蓝型油菜早熟DH稳定遗传群体构建图。
[0020] 图9为P3-2四倍体油菜根尖染色体倍性鉴定图。
[0021 ]图10为为P3-2四倍体油菜流式细胞倍性鉴定图。
[0022]图11为Y3380流式细胞倍性鉴定图。
[0023]图12为为Y3560流式细胞倍性鉴定图。
[0024]【具体实施方式】： 实施例1: 参见图1、图2、图5、图7,为了研究甘蓝型油菜高含油基因及形成机制，需要构建株系群 体在500个株系以上的DH稳定遗传作图群体。采用甘蓝型油菜P3-2(含油率55%以上）与 CY9802(含油率38%左右）杂交形成?!^!植株采用化学杀雄，在F!植株苗后期，现蕾初期（12 月中下旬），用苯磺隆80ppm喷洒植株2次，次年2 - 3月用本
【申请人】获得的油菜双单倍体诱导 系Y3380人工授粉，获得大量诱导后代种子。F2R(诱导后代)进行种植并进行流式细胞检 测、选育性正常、倍性（四倍体)正常、无诱导系显性性状(矮杆)植株单株套袋自交。F 3代株 系进行纯度鉴定，获得648个稳定株系，并对这些稳定株系含油率性状进行了近红外品质测 试，648个群体含油率从35%-56%正态分布，说明构建的含油率DH稳定遗传群体符合基因定 位及作图群体的基本需要。
[0025] 油菜双单倍体诱导系是通过以下方法获得的： 参见图2、图4、图6、图9、图10、图12,由本
【申请人】获得的甘蓝型油菜四倍体早代稳定系 P3-2，与20个纯合甘蓝型四倍体油菜正反交，3个正反交^代出现分离，且这3个组合F2代出 现稳定株系，说明P3-2具有孤雌生殖遗传特性。用P3-2与高芥酸、矮杆油菜4247正反交 (矮杆、高芥酸为显性性状），然后将杂交^代种子进行染色体加倍，加倍后代用流式细胞仪 鉴定或根尖显微镜观察鉴定为显示矮杆八倍体植株，该植株定名为Y3560。
[0026] 参见图2、图5、图6、图9、图10、图11，由本
【申请人】获得的甘蓝型油菜四倍体早代稳 定系P3-2，与20个纯合甘蓝型四倍体油菜正反交，3个正反交^代出现分离，且这3个组合F 2 代出现稳定株系，说明P3-2具有孤雌生殖遗传特性。用P3-2与四倍体甘蓝型矮杆油菜 D3-5正反交(矮杆为显性性状），然后将杂交种子进行染色体加倍，加倍后代用流式细 胞仪鉴定或根尖显微镜观察鉴定为显示矮杆八倍体植株，该植株定名为Y3380。
[0027]本实施例中将P3-2与矮杆油菜D3-5杂交Fi、P3-2与矮杆、高芥酸油菜4247杂交F! 种子在培养基上用秋水仙素进行人工染色体加倍的具体方法如下： 1) 用纯度为75%酒精进行种子表面消毒25秒，用0.1%升汞消毒12分钟，然后用无菌水将 种子表面的升汞冲洗干净，用无菌纸将种子表面的水分吸干，然后将种子接种在第一培养 基(染色体加倍诱导培养基)上； 2) 让种子在第一培养基上生根发芽，培养条件:温度250C，白天光照16小时，光照强度 2000勒克斯，晚上暗培养8小时，待长到1 一2片真叶时，将植株从下胚轴剪下继续在第二培 养基上生长； 3) 将剪下的植株继续插入第二培养基上继续培养，待有侧芽分化后，将侧芽及植株转 入第三培养基(生根培养基）中进行生根培养； 4) 生根培养二周后，植株长出粗壮的根后，将植株在室温炼苗3天后，取出植株将植株 上的培养基冲洗干净，并在浸泡缓冲液中浸泡15分钟后移栽到温室中，温室温度250C，相对 湿度60%，能保证移栽成活率在95%以上； 上述的第一培养基由以下配比的组分组成： -MS培养基 1L 6_苄基腺嘌呤（6BA) 0.5mg 秋水仙素 50mg 鹿糖 20g 琼脂 8g， 第一培养基的pH=5.8-6.0， MS培养基由Murashige和Skoog发明，简写为MS，其配方参见附表1， 上述的第二培养基由以下配比的组分组成： MS培养基 1L 6_苄基腺嘌呤（6BA) 0.5mg 秋水仙素 30mg 鹿糖 30g 琼脂 8g， 第二培养基的pH=5.8-6.0。
[0028]上述的第三培养基由以下配比的组分组成： MS培养基 1L α-萘乙酸 0.03mg 秋水仙素 20mg 鹿糖 20g 琼脂 8g， 第三培养基的pH=5.8-6.0。
[0029] 上述的浸泡缓冲液由以下配比的组分组成： 水 1L 易保或克露 〇.6g α -萘乙酸 0.5mg。
[0030] 参见图2、图3、图5,用Y3380作父本，与甘蓝型油菜细胞质不育系（0464A)测交，测 交后代50株，全为高杆，且全为四倍体油菜，其中49株为全不育，1株半不育，且形态特征与 0464A完全相同。同时用P3-2与矮杆油菜D3-5杂交F!(非加倍株)做父本与0464A测交作为对 照验证，测交后代102株，出现矮杆62株、高杆40株、且育性分离较大，出现全可育73株、半不 育20株、全不育9株。说明Y3380中的基因并未进入测交株，测交后代为0464A孤雌生殖而来， 诱导率98%。用Y3380做父本与甘蓝型油菜3954去雄聚合杂交（3954SFi，由中双11与CAX杂 交而来），聚合杂交后代Fi分离，每个h自交，收获h自交株45个。种植F 2代株系45个，出现稳 定株系45个，稳定株系出现比列100%，诱导率100%。
[0031] 用Y3380做父本与甘蓝型油菜3968去雄聚合杂交(3968SFi，由中双11与1365杂交 而来），聚合杂交后代h分离，每个h自交，收获Fi自交株52个。种植F2代株系52个，出现稳定 株系28个，稳定株系出现比例53.85%，诱导率53.85%。
[0032]用Y3380做父本与甘蓝型油菜中双11(常规品种，纯合系）去雄杂交，获得杂交?:植 株70株，70ftFi形态与中双11完全相同，且每个单株自交后F2代未发生分离，为稳定株系，与 中双11形态也完全相同，说明F!代就为纯系。即Y3380与中双11杂交过程，诱导中双11发生 了孤雌生殖，所产生的FiS孤雌生殖自交，是纯合系，因此Fi稳定、F 2也稳定，且与中双11形 态完全相同，该诱导率100%。
[0033]同样用Y3380做父本与白菜型油菜雅安黄油菜YH(二倍体油菜，2 η =20)去雄杂 交，获得杂交Fi植株98株，97株?1形态与ΥΗ完全相同，且每个单株自交后F2R形态都为二倍 体、外形与YH-致，说明Y3380与YH杂交过程，诱导YH发生了孤雌生殖，所产生的^为孤雌生 殖自交，且与YH形态完全相同，该诱导率98.9%。最终，显性矮杆八倍体植株Y3380确定为油 菜双单倍体诱导系。
[0034]参见图2、图3、图4,用Y3560作父本，与甘蓝型油菜细胞质不育系（0464A)测交，测 交后代80株，全为高杆，且76为四倍体油菜、2株为二倍体、2株为八倍体;其中76株四倍体植 株为全不育，4株半不育，且形态特征与0464A完全相同。同时用P3-2与矮杆、高芥酸油菜 4247杂交F!(非加倍株）做父本与0464A测交作为对照验证，测交后代153株，出现矮杆102 株、高杆51株、且育性分离较大，出现全可育65株、半不育35株、全不育53株。说明Y3560中的 基因并未进入测交株，测交后代为0464A孤雌生殖而来，诱导率95%。
[0035]用Y3560做父本与白菜型油菜雅安黄油菜YH(二倍体油菜，2 η =20)去雄杂交，获 得杂交F:植株145株，143株?1形态与ΥΗ完全相同，且每个单株自交后F2代形态都为二倍体、 外形与YH-致，说明Y3560与YH杂交过程，诱导YH发生了孤雌生殖，所产生的Fi为孤雌生殖 自交，且与YH形态完全相同，该诱导率98.6%。
[0036]同样用Y3560做父本与芥菜型油菜GW(四倍体油菜，2 η = 36)去雄杂交，获得杂 交?:植株124株，123株?:形态与G W完全相同，且每个单株自交后F2代形态都为四倍体、外 形与YH-致，说明Y3560与GW杂交过程，诱导GW发生了孤雌生殖，所产生的FiS孤雌生 殖自交，且与G W形态完全相同，该诱导率99.2%。最终，显性矮杆八倍体植株Y3560确定为 油菜双单倍体诱导系。
[0037] 参见图3、图6、图9、图10,获得早代稳定系P3-2方法如下： 甘蓝型油菜F009(四倍体，染色体2n=38)与白菜型油菜YH(二倍体，雅安黄油菜，染色体 2n=20)剥蕾进行人工去雄杂交获得h代杂交种子。^代杂交种子在培养基上用秋水仙素进 行人工染色体加倍。对加倍后的FHf植株进行自交(或强制自交)获得^代，对F 2代进行田间 种植观察、育性鉴定即通过醋酸洋红对花粉染色，判断花粉育性，出现三种情况（1、单倍体 植株，花粉极少，且育性极低；2、多倍体植株完全不育，花器官发育受阻，不能正常的开花， 无花粉;3、正常可育的植株，花粉量多，花粉育性95%以上）。对? 2代正常可育单株进行自交 获得F3代。对F3代进行纯合度鉴定，种植F3代单株株系，32%的可育株系单株植株整齐一致， 开花结实正常。对整齐一致株系进行细胞学鉴定，染色体条数一致(38条），染色体形态未出 现异常。SSR分子标记，通过DNA聚合酶链反应，电泳观察每个特异引物扩增下单株DNA带型， 显示每个单株都是H)09与YH的杂交后代，且每个单株DNA扩增条带数目及带型一致，可以判 断这些株系为纯合系，即早代稳定系。将其中1个叶片较大、无裂叶、叶片着生紧凑、含油率 55%的甘蓝型(染色体38条)油菜早代稳定系定名为P3-2。
[0038] 本实施例中将F1代杂交种子在培养基上用秋水仙素进行人工染色体加倍的具体 方法如下： 1) 用纯度为75%酒精进行种子表面消毒25秒，用0.1%升汞消毒12分钟，然后用无菌水将 种子表面的升汞冲洗干净，用无菌纸将种子表面的水分吸干，然后将种子接种在第一培养 基(染色体加倍诱导培养基)上； 2) 让种子在第一培养基上生根发芽，培养条件:温度250C，白天光照16小时，光照强度 2000勒克斯，晚上暗培养8小时，待长到1 一2片真叶时，将植株从下胚轴剪下继续在第二培 养基上生长； 3) 将剪下的植株继续插入第二培养基上继续培养，待有侧芽分化后，将侧芽及植株转 入第三培养基(生根培养基）中进行生根培养； 4) 生根培养二周后，植株长出粗壮的根后，将植株在室温炼苗3天后，取出植株将植株 上的培养基冲洗干净，并在浸泡缓冲液中浸泡15分钟后移栽到温室中，温室温度250C，相对 湿度60%，能保证移栽成活率在95%以上； 上述的第一培养基由以下配比的组分组成： -MS培养基 1L 6_苄基腺嘌呤（6BA) 0.5mg 秋水仙素 30mg 鹿糖 20g 琼脂 8g， 第一培养基的pH=5.8-6.0。
[0039] MS培养基由Murashige和Skoog发明，简写为MS，其配方参见附表1。
[0040] 上述的第二培养基由以下配比的组分组成： MS培养基 1L 6_苄基腺嘌呤（6BA) 0.5mg 秋水仙素 20mg 鹿糖 30g 琼脂 8g， 第二培养基的pH=5.8-6.0。
[0041 ]上述的第三培养基由以下配比的组分组成： MS培养基 1L α-萘乙酸 0.03mg 秋水仙素 5mg 鹿糖 20g 琼脂 8g， 第三培养基的pH=5.8-6.0。
[0042] 上述的浸泡缓冲液由以下配比的组分组成： 水 1L 易保或克露 〇.6g α -萘乙酸 0.5mg。
[0043]附表1 MS培养基成分配方
实施例2: 参见图1、图2、图4、图8,为了研究甘蓝型油菜早熟性状，需要构建株系群体在1000个以 上的DH稳定遗传作图群体。采用早熟甘蓝型油菜蓉C2994与蓉B0464(中晚熟油菜)杂交形成 植株采用化学杀雄，在h植株苗后期，现蕾初期（12月中下旬），用戊炔草胺lOOppm喷洒 植株2次，并用本
【申请人】获得的油菜双单倍体诱导系Y3560种植在一个隔离网室内，次年2 - 3月初花期用壁蜂辅助授粉，获得大量诱导后代种子。^代(诱导后代)进行种植并进行流式 细胞检测、选育性正常、倍性（四倍体)正常、无诱导系显性性状(矮杆)植株单株套袋自交。 F3代株系进行纯度鉴定，获得1545个稳定株系，并对这些稳定株系早熟、早花性状进行了调 查，花期及熟期呈正态型分布，说明构建的早熟性状DH稳定遗传群体符合基因定位及作图 群体的基本需要。
[0044] 本实施例2中油菜双单倍体诱导系的选育方法同实施例1。
[0045] 上述实施例是对本发明的上述内容作进一步说明，但不应将此理解为本发明上述 主题的范围仅限于上述实施例。凡基于上述内容所实现的技术均属于本发明的额范围。
【主权项】
1.油菜双单倍体诱导系规模化创造油菜遗传稳定群体的方法，包括以下步骤： 1) 对具有目标性状差异明显的2个遗传稳定油菜进行人工去雄杂交，并收获杂交后代h 种子； 2) 对上述步骤1)中收获的杂交后代植株在现蕾初期进行化学杀雄;根据化学杀雄剂不 同或油菜材料不同提前进行浓度摸索和比较试验，保证化学杀雄彻底，化学杀雄剂的作用 浓度为30-150ppm； 3) 在油菜花期，利用油菜双单倍体诱导系对上述步骤2)中化学杀雄后的杂交Fi植株进 行人工授粉，或将油菜双单倍体诱导系与上述步骤2)化学杀雄杂交h植株种植在一个隔离 网室，采用壁蜂辅助授粉，接受授粉的母体植株至少在100株以上； 4) 对上述步骤3)中用油菜双单倍体诱导系授粉后代进行单株种植，苗期利用流式细胞 仪鉴定倍性，淘汰多倍体、单倍体或具有油菜双单倍体诱导系显性性状特征植株，选择正常 育性，正常倍性植株，单株套袋自交，选择套袋自交单株数在5000株以上； 5) 对上述步骤4)中单株自交后代进行株系种植，调查株系形态一致性，并通过分子标 记鉴定株系一致性及稳定性； 6) 上述步骤5)中所鉴定的株系数至少在2000个以上，并对遗传稳定株系再进行目标性 状统计，分析目标性状是否符合正态分布； 7) 上述步骤6)中所有遗传稳定株系，即DH群体，满足目标性状正态分布，确定这些DH群 体构建合格，用于油菜目标性状的遗传作图、目标性状基因定位、QTL分析、以及目标性状与 基因的关联分析等； 上述步骤3)中油菜双单倍体诱导系的选育方法如下： (1) 选育具有孤雌生殖遗传特性的早代稳定系： ① 将两个油菜亲本材料杂交Fi代种子在培养基上用染色体加倍诱导剂进行人工染色体 加倍获得加倍后的Fi代植株； ② 加倍后的Fi代植株进行自交或强制自交获得内代，对F2代进行田间种植观察，并鉴定 每个单株的育性，选择可育后代自交获得F 3代，对F3代进行纯合度鉴定，通过形态、细胞学以 及分子标记鉴定，对后代DNA进行聚合酶链反应扩增，电泳观察每个特异引物扩增下单株的 DNA带型及条带数目，显示每个单株都是两个亲本的杂交后代，每个单株之间分子标记图谱 一致，说明这些单株是纯合系一早代稳定系； ③ 获得的早代稳定系与至少10个油菜常规纯合稳定系进行正反交，Fi代、F2代鉴定早代 稳定系的遗传特性，即是否有孤雌生殖特性;上述正反交，如有Fi分离，F 2代出现部分稳定株 系，对应的早代稳定系是具有孤雌生殖遗传特性的早代稳定系； (2) 选育携带显性遗传性状、具有孤雌遗传特性且倍性遗传稳定的多倍体油菜： ① 具有孤雌生殖遗传特性的早代稳定系与具有显性性状油菜杂交，得到杂交^代种子， 上述杂交^种子在培养基上用染色体加倍诱导剂进行人工染色体加倍，得到加倍后的带显 性性状的^植株； ② 对加倍的带显性性状的Fi植株，通过显微观察或流式细胞仪进行染色体倍性鉴定，选 择带显性性状的多倍体的植株，淘汰非正常加倍株、非整倍体植株、以及不带显性性状加倍 植株，带显性性状的多倍体的植株主要是倍性遗传稳定、结实性好、具有孤雌生殖遗传特 性、带显性性状的六倍体或八倍体油菜植株； (3)油菜双单倍体诱导系鉴定及诱导能力测定： ① 倍性遗传稳定、具有孤雌生殖遗传特性、带显性性状的多倍体植株中的显性性状能 去除测交后代中产生的杂交株，如果测交后代中出现显性性状植株、或非整倍体植株，说明 该植株是多倍体植株和母本杂交产生的，去除该植株； ② 上述单株测交后代如果出现全不育、为正常倍性油菜即二倍体或四倍体油菜、且不 带显性性状，说明该测交后代对应的父本基因未进入测交后代中，显性多倍体植株为油菜 双单倍体诱导系。2.如权利要求1所述的油菜双单倍体诱导系规模化创造油菜遗传稳定群体的方法，其 特征在于油菜双单倍体诱导系选育是将两个亲本材料杂交?:代种子或具有孤雌生殖遗传 特性的早代稳定系与具有显性性状油菜杂交得到的杂交FiR种子在培养基上用染色体加 倍诱导剂进行人工染色体加倍，具体方法如下： 1) 用纯度为75%酒精进行种子表面消毒25-40秒，用0.1%升汞消毒12-17分钟，然后用 无菌水将种子表面的升汞冲洗干净，用无菌纸将种子表面的水分吸干，然后将种子接种在 第一培养基上； 2) 让种子在第一培养基上生根发芽，培养条件:温度23-25叱，白天光照12-16小时，光 照强度2000-3000勒克斯，夜晚暗培养8-12小时，待植株长到1 一2片真叶时，从下胚轴处 剪下植株继续在第二培养基上生长； 3) 将剪下的植株继续插入第二培养基上继续培养，待有侧芽分化后，将侧芽及植株转 入第三培养基中进行生根培养； 4) 生根培养二周后，植株长出粗壮的根后，将植株在室温炼苗3-7天，取出植株将植株 上的培养基用自来水冲洗干净，并在浸泡缓冲液中浸泡15-30分钟后移栽到温室中，温室 温度16°C 16°C - 25^(:,相对湿度60-80%，能保证移栽成活率在95%以上； 上述的第一培养基由以下配比的组分组成： 一MS培养基 1L 6_苄基腺嘌呤 0.5-1.5mg 染色体加倍诱导剂 30-70mg 鹿糖 20-30g 琼脂 8 一10g， 第一培养基的pH=5.8-6.0， 上述的第二培养基由以下配比的组分组成： MS培养基 1L， 6_苄基腺嘌呤 0.5-lmg， 染色体加倍诱导剂 20-40mg， 鹿糖 20-30g， 琼脂 8 一10g， 第二培养基的pH=5.8-6.0， 上述的第三培养基由以下配比的组分组成： MS培养基 1L， α-蔡乙酸 0.03-0.5mg, 染色体加倍诱导剂 5-20mg， 鹿糖 20-30g， 琼脂 8 一10g， 第三培养基的pH=5.8-6.0， 上述的浸泡缓冲液由以及下配比的组分组成： 水 1L， 易保或克露 0.6-1.2g， α一萘乙酸 0.5-lmg〇3.如权利要求1或2所述的油菜双单倍体诱导系规模化创造油菜遗传稳定群体的方法， 其特征在于染色体加倍诱导剂采用秋水仙素、氟乐灵、氨磺乐灵中的至少一种。
【文档编号】C12Q1/68GK106069719SQ201610458271
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月23日
【发明人】付绍红, 杨进, 王继胜, 李云, 邹琼, 陶兰蓉, 康泽明, 唐蓉, 殷丽琴
【申请人】成都市农林科学院