专利名称：抗乙型肝炎病毒双质粒基因疫苗、其制备方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抗乙型肝炎病毒双质粒基因疫苗、其制备方法及其应用。
DNA疫苗技术是将含有编码外源蛋白基因的真核表达质粒DNA直接导入机体，以激发机体产生特异性免疫应答的一种新型的免疫策略，它具有易于构建、制备简单及稳定性好等优点，同时能诱发机体持久的特异性细胞及体液免疫应答，可兼作预防和治疗性疫苗。在Nature,1992,356:152-154中，Tang DC等人公开了DNA疫苗技术。1993年Davis等人把含HBV表面抗原(HBsAg)编码基因的表达质粒经肌肉免疫小鼠，成功地诱发了针对HBsAg的细胞与体液免疫(Davis HL et al,Vaccine,1996,14:910-915)。之后基因疫苗治疗乙型肝炎成为人们争相研究的热点。Mancini M等人在Proc Natl Acad Sci USA,1996,93:12496-12501.中，公开了将HBV DNA疫苗免疫有HBV复制的转基因小鼠发现，小鼠对HBV的免疫耐受状态得以逆转，产生了HBsAg抗体，清除了血液中游离的病毒颗粒，肝内HBV的复制也得以抑制，进一步表明DNA疫苗有可能成为乙型肝炎防治的新手段。
Major ME等人在Viral,1995,69:5798-5805,Davis HL等人在Vaccine,1994；12,1503-1509中，分别公开了将编码不同病原基因的表达载体接种于动物体内，均诱发特异性的体液免疫及细胞免疫应答。Chow YH，等人构建了HBV preS2.S和IL-2的双顺反子载体，有效增强了免疫效果，且可克服与MHC相关的针对HBsAg免疫无反应性(见J Viral,1997,71:169-178)。Geissler M等人检测到的HBsAg特异性CD4+淋巴细胞主要为可分泌干扰素的Th1型淋巴细胞(见Gastroenterology,1997,112:1307-1320)。
DNA疫苗之所以成为治疗性疫苗的重要基础就是它能通过不同的途径诱导细胞毒性T细胞(CTL)的活化，从而有效控制病毒感染，打破机体免疫耐受状态。因而如何有效提高DNA疫苗的免疫效率，增强其诱导机体CTL反应，及其作用机制与安全性研究是使DNA疫苗由动物实验进入临床使用首先要探讨的课题。
我国是全球乙型肝炎病毒(HBV)感染的高发区，大约有三分之一的HBV感染者在长期的病毒携带过程中转变为慢性肝炎、肝硬化或肝癌。如何打破机体慢性感染所形成的免疫耐受状态，是抗HBV治疗研究的重要课题之一。基因疫苗以其独特的体内细胞转染、抗原表达修饰及分泌呈送方式，在诱导机体体液免疫应答的同时，能有效地增强细胞免疫功能，打破某些病毒慢性感染所形成的免疫耐受，有希望成为抗HBV治疗新的有效手段。
本发明的目的在于构建含GM-CSF信号序列的HBV Pre-S2.S基因真核表达载体，以增强DNA疫苗的蛋白表达及免疫原性；同时构建IL-2与IFN-r融合蛋白基因真核表达载体，作为HBV DNA疫苗的免疫佐剂；通过利用双质粒的协同作用，激活抗原递呈细胞，增强CTL特异性免疫反应，以便深入探讨DNA疫苗治疗乙型肝炎病毒感染的可能性。
本发明的另一个目的在于公开上述双质粒基因疫苗的制备方法。
本发明的再一个目的在于探讨上述双质粒基因疫苗在治疗和预防病毒性乙型肝炎方面的用途。
为了实现上述目的，本发明构建了二类真核表达基因疫苗；一种是含GM-CSF信号序列的HBV preS2.S基因的真核表达质粒，转染COS细胞能较高水平地表达HBsAg，另外一种是协同免疫载体IL-2/IFN-r融合蛋白基因质粒，在COS细胞中也表达了相应的产物。用所构建的质粒联合免疫接种小鼠，成功地诱发了小鼠抗人HBsAg特异的体液免疫应答。
本发明采用的技术方案为分别以含HBV基因的pHBVα1及人类细胞基因组DNA为模板，PCR扩增获得目的基因，即HBV中蛋白preS2+S抗原及人白细胞介素IL-2/INF-γ融合蛋白(FP)编码基因，并将其定向克隆于已预先用EcoRⅠ消化的真核表达载体pcDNA3.1(+)中CMV(巨细胞病毒)启动子下游，并分别在目的基因5’、3’端插入分泌性GM-SF及终止性PolyA信号序列，以构建HBV基因疫苗及具有佐剂效果的真核表达质粒，分别命名为pcDNA-HBV与pcDNA-FCK，简称为pS2·S及pFP。质粒的大量提取，PEG法纯化，按常规方法进行。
DNA疫苗对乙型肝炎的治疗性研究在正常动物及HBV转基因小鼠体内虽取得了可喜的成就，但要真正进入临床应用，尚有许多工作要做，其中最重要的研究课题应为如何增强DNA疫苗的免疫效果。针对上述问题，本发明从以下几方面进行了探讨。(1)选择合适的目的基因。HBV基因组含有多种抗原蛋白编码基因，其中p-S1蛋白，p-S2蛋白及S蛋白均含有特定的抗原决定簇，可分别诱导机体产生相应的特异性抗体，其中抗-HBs具有较强的保护力，p-S2抗体可能与病毒清除密切相关，而p-S1则含有HBV与肝细胞膜受体的结合位点。因而我们选择了HBV p-S2与S基因来构建载体，同时，在p-S2基因片段前插入一段GM-CSF的信号序列，使DNA疫苗在体内更高地表达HBS p-S2.S中分子蛋白。(2)质粒载体的选择。本发明所用真核表达质粒pcDNA3.1(+/-)带有pCMV启动子及ployA序列，可保证插入的目的基因用自身起始密码在哺乳细胞内高效表达。(3)构建IL-2/IFN-r融合基因质粒作为免疫佐剂。近年研究表明多种细胞因子对DNA疫苗均具有较好的佐剂效应，能有效增强基因疫苗的免疫原性。Davis等以pRSV-GM-CSF与pCMV-S共注射小鼠，发现抗HBs抗体明显增高，我们构建的IL-2/IFN-r融合基因质粒与HBV pS2.S基因疫苗协同免疫小鼠，抗HBs抗体水平比单独用HBV DNA疫苗免疫提高约3倍。IFN-r可能增强抗原递呈细胞表面MHCⅡ类分子表达，从而激发抗原递呈过程，IL-2可通过增强抗原特异性T淋巴细胞增殖起作用，二者主要激活的均为细胞免疫应答，因而该融合蛋白质粒作为免疫佐剂，有可能调控机体对HBV DNA疫苗的免疫应答类型。
DNA疫苗作为近年发展起来的一种全新疫苗，不仅可诱发抗体保护性抗体，更重要的是可诱导针对病毒抗原的细胞免疫，从而有效打破宿主对病毒的免疫耐受状态。与肽类疫苗不同，DNA疫苗将编码抗原蛋白的质粒DNA注入肌肉或皮内，由宿主合成抗原蛋白，因此它能诱发机体产生抗原特异性CD8+细胞毒性T细胞(CTL)为标志的细胞免疫。Davis等[8]给小鼠肌注编码HBsAg的重组质粒，检测到高水平的抗-HBs抗体和HBsAg特异性的CTL，研究表明，DNA疫苗诱导细胞免疫的机制在于它模拟了病毒的自然感染过程。质粒DNA被肌细胞摄取后，合成的蛋白质被降解为含抗原表位的肽段，进入内质网与MHCⅠ类分子结合，再转运至细胞膜，激活受MHCⅠ类分子限制的CD8+CTL。部分分泌入血的抗原，诱导体液免疫，或被树突状细胞等抗原递呈细胞俘获，经加工并与MHCⅡ分子结合，激活CD4+Th细胞，分泌IFN-r,IL-2等细胞因子，参与免疫调节作用。DNA疫苗的出现为人类完全征服乙型肝炎及其它病毒性疾病带来了希望，其应用和研究前景将极为广阔。
下面结合附图和具体实施例详细描述本发明。
图1为pcDNA-HBV与pcDNA-FCK的构建图；图2 HBV中蛋白及细胞介素融合蛋白真核表达载体结构示意简图；图3为pcDNA-HBV与pcDNA-FCK两重组质粒的基因序列；图4为融合蛋白IL-2/IFN-r表达产物的SDS-PAGE电泳分析；1．标记物；2．pcDNA-FCK；3．pcDNA3.1图5 IL-2/IFN-r的Western印迹；A．IL-2 McAbs探针； 1．标记物， 2,3．pcDNA-FCK， 4．pcDNA3.1B．IFN-r McAbs探针；1．标记物， 2,3．pcDNA-FCK， 4．pcDNA3.1图6不同剂量的基因疫苗诱导血清抗体量及阳性率(％)的产生；图7 pFP对基因疫苗诱导健康鼠抗体产生的影响；Δ血清抗-HBS阳性率(≥10mIu.ml-1)*pS2.S+pcDNA3.1组比较，P＜0.01图8各组质粒接种后不同时间(周)HBV Tg小鼠血清HbsAg及抗-HBs水平变化。
下面是本发明的具体实施例，所述的实施例是用于描述本发明，而不是限制本发明。
实施例中采用的质粒、菌种及试剂如下质粒pcDNA3.1(+)、pcDNA3.1(-)、PUC19(含HBV Pre-S1、Pre-S2与S基因)及COS-7细胞由美国哈佛大学Fusion生物医药公司惠赠，菌株DH5α购于GibcoBRL公司，COS-1与L-6TG细胞株引自上海细胞所。
限制性内切酶、T4DNA连接酶、RNA抽提试剂盒、QIAprep及EndofreePlasmid Mega Kit质粒制备纯化试剂盒，QIAquick凝胶提取试剂盒、LipofectAMINE细胞转染试剂盒，以及其他工具酶与试剂分别购于Promega、Gibco BRL、Boehringer、Amersham及QIAgene公司等，HBsAg与HBsAb检测试剂盒购于华美生物公司，IL-2及IFN-r检测试剂盒购于深圳晶美生物技术公司，卫生部检验中心质检室提供抗-HBs标准品。
实施例11．HBV pS2.S基因真核表达载体的构建以含HBV基因的原核表达质粒PUC19为模板，PCR扩增获得目的基因。正引物内设计含有54mer的GM-CSF信号序列，引物序列为正引物5’-ATGTGGCTGCAGAGCCTGCTGCTCTTGGGCACTGTGGCCT GCAGCATCTCTgcaTCCACA GCTTTTCACC AAGCT-3’，反引物5’-TTAAATGTAT ACCCAAAGACAA-3’，扩增片段长度为888bp。参照Sambrook等的方法将目的基因定向克隆于已预先用EcoRⅠ消化的真核表达载体pcDNA3.1(+)中CMV启动子下游，称之为pcDNA-HBV或p-S2.S。
2．IL-2/IFN-r人细胞介素融合蛋白基因真核表达质粒的构建细胞基因组DNA的提取按Sambrook等的方法进行。为不影响表达的细胞因子各自的空间构象，在二类细胞因子基因片段之间插入24mer的无关序列，扩增IL-2基因的引物序列为正引物P1 5'-ATGTACAGGA TGCAACTCCTA-3’，反引物P2 5’-TGGGTCCTGG CAGTAACAcg aacccccgcc tcctgaccca gcAGTTAGTG TTGAGATGAT-3’；扩增IFN-r基因引物序列为正引物P3 5’-ATCATCTCAA CACTAACTgc tgggtcagga ggcgggggtt cgTGTTACTGCCAGGACCCA-3’，反引物P4 5’-TTACTGGGATGCTCTTCGACCT-3’。取1μg基因组DNA进行PCR扩增，P1+P2与P3+P4的PCR产物经纯化后混合作为融合蛋白基因扩增的模板，用引物P1+P4行PCR扩增，产物为924bP的含中间序列的融合细胞因子基因片段，将其定向克隆于经EcoRⅠ消化的pcDNA3.1(-)载体中，命名为pcDNA-FCK或pFP。
3．重组质粒的制备与纯化重组载体pcDNA-HBV,pcDNA-FCK分别转化大肠杆菌DH5a，筛选阳性克隆，经LB培养基扩增，采用QIA prep和Endofree Plasmid Mega Kit，按操作说明书制备和纯化质粒，溶于无菌无热源的PBS缓冲液中，-20℃贮存备用。
真核表达质粒pcDNA3.1(+/-)内含巨细胞病毒启动子(pCMV)与polyA序列，可保证插入基因用自身起始密码在多种哺乳动物细胞内高效表达。经PCR、酶切、基因重组等技术分别构建了带有粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子GM-CSF信号序列的HBV preS2.S基因及IL-2/IFN-r融合蛋白基因的重组载体pcDNA-HBV与pcDNA-FCK见
图1，结构示意简图见图2。两重组质粒经PCR扩增鉴定，结果均获得特异性目的基因片段，测序结果表明目的基因序列正确并已正向插入到pcDNA3.1中pCMV的下游，二重组质粒分别经xhoⅠ,xbaⅠ,EcoRⅠ,HindⅢ等酶切，结果表明质粒构建正确(图3)。
实施例2重组质粒在细胞内的表达在LipofectAMINE介导下，将已纯化的重组载体pcDNA-HBV,pcDNA-FCK按操作说明书分别转染COS-1,COS-7与L-6TG细胞。转染前24小时将细胞按106/皿接种于35mm培养皿中，转染前4小时换液，每皿加入5μg质粒DNA,G418筛选抗性克隆。培养48小时和72小时分别收集培养上清，采用ELISA方法检测表达产物。
质粒DNA转染细胞后培养48h和72h，收集培养上清液，ELISA方法测定HBsAg,IL-2及IFN-r表达，取平行两皿测定均值。由表1可见表达的产物在COS-1与COS7细胞内表达水平相似，均明显高于在L-6GT细胞中的表达水平(P＜0.01)，细胞培养48h的产物表达水平略高于72h的表达水平，但无显著性差异。
表1*P＜0.01，与cos-1和COS-7细胞比较。
实施例3
融合蛋白IL-2/IFN-r基因表达产物Western印迹鉴定融合蛋白经SDS-PAGE电泳后，进行电转移转膜(500mA,3小时)，转移后的硝酸纤维素膜，分别用IL-2单抗及IFN-r单抗进行显色鉴定。重组载体pcDNA-FCK转染真核细胞COS-7及COS-1，培养48h后取培养上清液，浓缩后SDS-PAGE电泳，可见在30kD左右有一产物带(图4)。表达产物IL-2/IFN-r可与IL-2单抗及IFN-r单抗发生反应，说明该融合蛋白中既有IL-2存在，又有IFN-r存在，结果见图5。
实验例1双质粒HBV DNA疫苗诱导健康及HBV转基因小鼠体液免疫的实验研究实验动物健康C57BL/6小鼠购自中山医科大学动物实验中心，雌性，6-8周龄，属Ⅱ级动物并具合格证书。HBV转基因(Tg)小鼠由第二军医大学实验动物中心提供，品系为C57BL/6小鼠，清洁级，由HBV全基因(adr型)随机转染，传至9-10代，经剪尾，组织DNA提取，PCR检测HBV DNA呈阳性，再以ELISA方法筛选血清HBsAg阳性小鼠9只，实验备用。
免疫接种与实验分组；基因疫苗接种方法采用小鼠双侧胫前肌(TA)直接注射法。用0.5％盐酸布比卡于小鼠双侧TA各注射50μ1，第5日用剂量为75mg.kg的戌巴比钠麻醉小鼠，于双侧TA同一部位各注射总容量为50μ1的PBS质粒溶液。健康C57BL/6小鼠共28只，分为6组(1)pS2.S大剂量(100μg/只)组5只；(2)pS2.S中剂量(50μg/只)组5只；(3)pS2.S小剂量(10μg/只)组5只；(4)pcDNA3.1(100μg/只)对照组3只；(5)pS2.S+pFP(10μg+10μg/只)组5只及(6)pS2.S+pcDNA3.1(10μg+10μg/只)组5只。HBV Tg小鼠共9只，分为4小组，A组pS2.S大剂量(100μg/只)组2只；B组pS2.S+pFP(50μg+50μg)组3只；C组pFP(10μg/只)组2只及D组pcDNA3.1(100μg/只)组2只。采用眼球后静脉丛穿刺法于免疫接种后第2、4、6、8、14周定期采血，分高血清标本，置一20℃贮存，待分批一次性进行血清HBsAg及抗-HBs ELISA法检测。
统计处理采血两样本均数比较的t检验。结果如下1．基因疫苗诱导健康动物体液免疫应答的动态观察血清抗-HBs≥10mIu/ml被认为机体保护性有效浓度。图6结果显示pcDNA3.1接种正常小鼠后于2、4、8、14周血清抗-HBS浓度均小于10mIu.ml-1。与之相比，pS2.S高(100μg/只)、中(50μg/只)、低(10μg/只)，三组剂量一次性免疫小鼠均能在2周诱导抗-HBS产生(＞10mIu.ml-1)，抗体效价随时间延长而增长。三组间比较，抗体浓度及阳性率亦有差别高、中剂量组二周抗体阳性率均为100％，高于低剂量组(60％)；血清抗体浓度比较，高剂量组(82.9±30.010mIu.ml-1)较中(42.2±25.610mIu.ml-1)、低(24.6±7.5)剂量组分别具显著(P＜0.05)及非常显著(P＜0.01)性差异。以后的4、8、14周高、中剂量组间差别缩小，但二者较低剂量组均具非常显著性差异(P＜0.01)。
2．pFP对基因疫苗诱导正常动物抗体产生的影响图7结果显示，低剂量(10μg/只)的pS2.S与pFP联合免疫，于2、4周诱导组内全部(100％)健康小鼠抗体产生，而相同剂量的pS2.S+pcDNA3.1组仅分别为60％及80％。pFP联合免疫组诱导抗体产生水平于2、4周分别为115.4±21.9mIu.ml-1,121.9±35.0mIu.ml-1，较pS2.S+pcDNA3.1组(24.6±27.5mIu.ml-1,33.1±8.9mIu.ml-1)均具非常显著性差异。而于第8、14周，联合pFP免疫组抗-HBS水平明显下降，与联合空白载体组比较无显著性差异(P＞0.05)。
3．基因疫苗诱导HBV转基因(Tg)小鼠抗-HBS产生结果。
高剂量的pS2.S组与中剂量pS2.S联合pFP(50μg/只)组各有一只Tg小鼠发生HBSAg血清转换，其中联合免疫组于2周诱导抗-HBS产生，单独高剂量组产生抗体时间为第4周，且水平(20mIu.ml-1)低于联合免疫组(45mIu.ml-1)；而第8周pS2.S组该只小鼠血清抗体水平升高(400.0mIu.ml-1)，高于同期的pS2.S+pFP组(275.6mIu.ml-1)。四组共9只HBV Tg小鼠于接种前血清HBSAg ELISA检测均为阳性(P/N值≥2.1)，不同质粒免疫后，各只鼠OD值均有下降，第4周pcDNA3.1有一只小鼠反跳性升高。比较第8周血清HBSAg检测结果pS2.S组与pS2.S+pFP组P/N值分别为1.88±0.25、1.50±0.38均明显较pFP(4.38±0.18)及pcDNA3.1(4.25±1.38)组低，见图8。
HBV基因疫苗是将病毒蛋白性抗原编码的S或C区基因通过分子克隆技术构建的真核细胞表达质粒，经肌注等途径转染至缩主细胞进行复制、转录，并表达和分泌病毒抗原，分别通过局部组织抗原递呈细胞(APC)或宿主细胞膜MHCⅡ及Ⅰ类分子进行抗原呈递，整个过程模拟了病毒感染的自然过程，因此基因疫苗免疫在诱导机体体液免疫应答的同时，能更有效地诱导特异性细胞免疫应答，达到抗HBV慢性感染的免疫预防反治疗目的。
与疫苗构建插入的空白载体pcDNA3.1比较，本发明构建的HBV基因疫苗pS2.S具有较强的诱导健康小鼠体液免疫应答效果，并呈一定的剂量依赖关系，为治疗型基因疫苗的进一步研制、质粒构建及筛选提供了可靠的实验依据。本研究一次性免疫接种后动态持续性观察，结果血清抗体水平随时间而不断升高，与国外学者观察结果基本一致。推测与局部淋巴滤泡中的滤泡树突状细胞(follicular dendritic cells)摄取疫苗DNA并长期保存和表达抗原有关。这样，使B-细胞不断将抗原加工后送呈给T细胞，保证了免疫应答的记忆性，基因疫苗在宿主细胞持续表达的抗原成为再次增强免疫原，诱导血清抗-HBS水平的持续升高。
通过现有的直接注射途径，质粒DNA转染到宿主细胞的成功率并不高。如何提高基因疫苗效果，降低质粒剂量，是该项新技术推广应用前必须解决的技术难题之一。白细胞介素-2(IL-2)及γ-干扰素(IFN-γ)均为Th1细胞分泌的重要细胞因子，并能促进T细胞向Th1亚群分化。已有实验证明IFN-γ能促进DC细胞(APC)膜表面MHCⅡ类抗原分子及CD86分子的表达，并增强DC抗原的呈递功能。本发明构建的IL-2与IFN-γ融蛋白编码基因的表达质粒(pFP)，联合基因疫苗免疫，在取得相同的体液免疫效果的同时，可将基因疫苗质粒剂量降到原来的1/10，并能减少同组动物个体问抗体水平差异，提高同组效果的均一性，表明pFP具有较强的佐剂效应。然而，联合疫苗接种第8周血清抗-HBs水平明显降低，至14周低于对照组(pS2.S+pcDNA3.1)。分析其原因，可能与pFP表达的IL-2及INF-γ有关，一方面通过增强局部CTL功能致转染基因疫苗的肌细胞坏死；另方面直接抑制pS2.S在肌细胞抗原表达，从而降低HBSAg的分泌及其免疫原性。
比较相同高剂量pS2.S单独及联合佐剂质粒免疫正常小鼠诱导体液免疫应答结果，pS2.S pS2.S+pFP免疫HBV转基因(Tg)小鼠的二组中仅各有一只Tg小鼠血清抗-HBs阳性，表明Tg小鼠对HBSAg已形成免疫耐受。其中联合佐剂免疫组的一只抗-HBs产生时间(2周)较单独基因疫苗接种组早，而第8周抗体定量检测结果后者较前者高，与健康动物实验结果相符。4组质粒接种后Tg，小鼠血清HBSAg ELISA检测值均降至试剂盒指示的阴性范围，pFP与pcDNA3.1组血清HBsAg的下降可能分别与各自表达细胞介素及载体结构中含氮个抗性基因致细胞免疫功能增强有关。但该二组HBSAg检测结果在第8周明显较pS2.S及pS2.S+PFP组高，且pcDNA3.1组中一只小鼠血清HBsAg于4周有波动并呈阳性。提示基因疫苗及其联合佐剂免疫能诱导针对HBsAg特异性的细胞免疫应答，通过CTL功能的增强及IL-2、INF-γ等细胞介素的释放，更有效地抑制HBV的复制及其蛋白性抗原的表达，使HBsAg发生血清学转换。
目前，国内HBV转基因小鼠品系的建立均采用显微注射随机插入HBV全基因组的方法，故在传代后基因整合的稳定性、基因编码产物的表达及水平等方面存在诸多问题。本研究所用9只HBV Tg小鼠是90只组织HBV DNA阳性Tg小鼠中筛选HBSAg血清阳性者所得。因HBsAg ELISA检测OD值较低，给治疗性基因疫苗效果的评价带来一定困难。但作为初步的实验摸索，结果仍不失一定参考意义。有特fmV转基因动物的成熟建立，我们才能更好地评价基因疫苗诱导细胞免疫、打破免疫耐受、治疗HBy慢性感染的确切疗效。
实验例2DNA疫苗诱导健康小鼠细胞免疫应答及HBV转基因小鼠抗-HBs的产生目的在HBV DNA疫苗成功诱导健康小鼠体液免疫应答的基础上，深入探讨其作为抗-HBV治疗的可行性及作用机理。方法应用基因重组技术，我们构建编码HBV中蛋白(preS2+S)及人白细胞介素融合蛋白基因的真核表达质粒pS2.S及pFP，继经肌注免疫健康Balb/C及HBV转基因(Tg)小鼠并分为三个实验系列1．HBsAg特异性T细胞增殖实验不同质粒接种后2周，取健康Balb/C小鼠脾脏并分离淋巴细胞在体外与不同浓度的HBsAg孵育，分别在培养72小时(hr)及96hr，检测培养液上清细胞因子的释放及T细胞增殖指数；2．树突状细胞(DCs)诱导HBsAg致敏的T细胞增殖实验第2次质粒接种后的第2天，取小鼠局部引流淋巴结(LN)分离提取DCs并分别计数，在体外与HBsAg致敏的同品系小鼠T细胞培养96hr，检测细胞增殖指数；3．HBV转基因(Tg)小鼠血清诱生抗-HBs实验筛选9只血清HBsAg阳性的HBV Tg小鼠(第二军医大学实验动物中心提供)，分为4组pS2.S免疫组2只，100μg/只；pS2.S+pFP组3只，(50+50)μg/只；pFP组2只，100μg/只；空白载体pcDNA3.1组2只，100μg/只。免疫前及免疫后2、4、6、8周分别采血，一次性检测血清HBsAg及抗-HBs水平。结果1．HBV DNA疫苗诱导HBsAg特异性T细胞增殖实验体外HBsAg对DNA疫苗免疫后的T细胞的刺激呈浓度相关，HBsAg30ug.ml-1时刺激pS2.S免疫小鼠脾细胞增殖指数(5.6±0.9)明显较pcDNA3.1组(2.0±0.5)高(表1)。细胞培养上清液细胞因子水平检测结果高剂量(100μg/只)pS2.S免疫组IL-2(226.3±4.1pg.ml-1)及IFN-γ(51.1±7.7pg.ml-1)的分泌水平明显较pcDNA3.1组(69.0±22.1/0.9±0.7pg.ml-1)高；中剂量(50μg/只)pS2.S联合pFP(50μg/只)免疫组IL-2/IFN-γ水平(266.2±61.0/39.6±16.3pg.ml-1)，亦较中剂量pS2.S联合空载质粒pcDNA3.1组(150.1±26.2/10.6±5.6pg.ml-1)高；IL-4水平于各组质粒免疫影响不明显。2．DCs诱导HBsAg致敏的T-细胞增殖实验pS2.S免疫小鼠局部LN DCs诱导HBsAg致敏的T-细胞增殖指数(4.20)较pcDNA3.1组(2.55)高(表2)，同时细胞计数结果表明pS2.S组及pS2.S联合pFP免疫组DCs数目及其占局部引流LN的百分比均明显升高。3．HBV DNA疫苗诱导HBV Tg小鼠抗-HBs产生高剂量的pS2.S组与中剂量pS2.S联合pFP组各有一只Tg小鼠分别于2、4周开始发生HBsAg血清转换，且其抗体水平随时间而增长。4组9只Tg小鼠于接种前血清HBsAg均阳性(ELISA P/N≥2.1)，不同质粒免疫后，各只P/N值均有下降，第4周pcDNA3.1组有一只小鼠反跳性升高，比较第8周血清HBsAg检测结果pS2.S组与pS2.S+pFP组P/N值分别为1.88±0.25,1.50±0.38，均明显较pFP(4.38±0.18)及pcDNA3.1(4.25±1.38)组低(图2)。结论本研究结果表明HBV DNA疫苗能有效诱导HBsAg特异性的细胞免疫应答，提示可能的作用机理是局部引流LN的DCs摄取质粒表达的抗原或质粒本身，通过MHC-Ⅱ或MHC-Ⅰ类抗原递呈途径诱导T细胞增殖并向Th1亚群分化，提高了IL-2/IFN-γ的分泌水平，有效地增强细胞免疫应答以达到抗-HBV的治疗目的；HBV-Tg小鼠的初步实验结果为治疗型HBV DNA疫苗的深入研制提供了实验依据。
权利要求
1．抗乙型肝炎病毒(HBV)双质粒基因疫苗，其特征在于由含粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)信号序列的HBV包膜中蛋白基因真核表达质粒pS2.S，和含无关中间序列的人IL-2与IFN-r融合蛋白基因真核表达载体pFP组成。
2．根据权利要求1所述的抗乙型肝炎病毒双质粒基因疫苗，其特征在于含GM-CSF信号序列真核表达质粒pS2.S的真核表达载体为pcDNA3.1(+)，目的基因为HBV包膜中蛋白(preS2+S)基因片段，并在此基因片断上游插入54mer的GM-CSF信号序列，所得整体目的基因片段长度为888bp，定向克隆于pcDNA3.1(+)载体的CMV启动子下游。
3．根据权利要求1所述的抗乙型肝炎病毒双质粒基因疫苗，其特征在于IL-2与IFN-r融合蛋白基因真核表达质粒pFP的真核表达载体为pcDNA3.1(-)，目的基因为人或其它种属的IL-2及INF-γ融合蛋白基因，为不影响所表达的二类细胞因子各自空间构成及生物活性，在二者之间插入24MER的天关基因序列，所得整体目的基因长度为924bp，定向克隆于pcDNA3.1(-)载体的CMV启动子下游。
4．抗乙型肝炎病毒双质粒基因疫苗的制备方法，其特征在于制备方法包括a．以含HBV基因的原核表达质粒PUC19为模板，PCR扩增获得目的基因，正引物内设计含有54mer的GM-CSF信号序列，引物序列为正引物5’-ATGTGGCTGCAGAGCCTGCTGCTCTTGGGCACTGTGGCCT GCAGCATCTCTGCATCCACA GCTTTTCACC AAGCT-3’，反引物5’-TTAAATGTAT ACCCAAAGACAA-3’，扩增片段长度为888bp；参照Sambrook等的方法将目的基因定向克隆于已预先用EcoRⅠ消化的真核表达载体pcDNA3.1(+)中CMV启动子下游；b．细胞基因组DNA的提取按Sambrook等的方法进行，为不影响表达的细胞因子各自的空间构象，在二类细胞因子基因片段之间插入24mer的无关序列，扩增IL-2基因的引物序列为正引物P1 5’-ATGTACAGGA TGCAACTCCT A-3’，反引物P2 5’-TGGGTCCTGG CAGTAACACG AACCCCCGCC TCCTGACCCAGCAGTTAGTG TTGAGATGAT-3’；扩增IFN-r基因引物序列为正引物P3 5’-ATCATCTCAA CACTAACTGC TGGGTCAGGA GGCGGGGGTT CGTGTTACTGCCAGGACCCA-3’，反引物P4 5’-TTACTGGGATGCTCTTCGACCT-3’；取1μg基因组DNA进行PCR扩增，P1+P2与P3+P4的PCR产物经纯化后混合作为融合蛋白基因扩增的模板，用引物P1+P4行PCR扩增，产物为924bP的含中间序列的融合细胞因子基因片段，将其定向克隆于经EcoRⅠ消化的pcDNA3.1(-)载体中；c．重组载体pcDNA-S2.S,pcDNA-ⅡF分别转化大肠杆菌DH5a，筛选阳性克隆，经LB培养基扩增，采用QIA prep和Endofree Plasmid Mega Kit按操作说明书制备和纯化质粒，溶于无菌无热源的PBS缓冲液中，-20℃贮存备；
5．抗乙型肝炎病毒双质粒基因疫苗的用途，其特征在于用于治疗和预防乙型病毒性肝炎或其它病毒性疾病。
全文摘要
本发明公开了一种抗乙型肝炎病毒双质粒基因疫苗、其制备方法及其应用，双质粒基因疫苗由含粒细胞或巨噬细胞集落刺激因子GM－CSF信号序列的分子蛋白基因真核表达质粒HBV pS
文档编号C12N15/79GK1316518SQ0010785
公开日2001年10月10日 申请日期2000年6月19日 优先权日1999年6月18日
发明者陈光明, 谢宗法, 杨富强, 何晓嫱, 黄英, 吴乐园 申请人:中国人民解放军第四五八医院