专利名称：一种用于多人份诊断的基因芯片载体的制作方法
技术领域：
本发明属于基因技术领域，涉及一种基因芯片，尤其涉及一种用于多人份，多疾病诊断的基因芯片载体。
基因芯片是二十世纪九十年代发展起来的一项前沿生物技术。将大量的靶基因片段有序地、高密度地(点与点之间的距离一般小于500μm)排列在玻璃、硅等载体上，称之为基因芯片。基因芯片从制作上可分为两大类原位合成法(DNAchip)和微矩阵法(DNA mircoarray)，原位合成法由Affymetrix公司的Fodor等发明，他们将半导体中的光蚀刻技术运用到DNA合成化学中，用单核苷酸或其它生物大分子为底物，在玻璃晶片上原位合成寡核苷酸，每次循环都有特定的核苷酸结合上去，直到设定的寡核苷酸长度，每个寡核苷酸片段代表了一种特定的基因，存在于DNA芯片的特定位置上。微矩阵法最早由Stanford大学的P.Brown等发明，将PCR等方法得到的cDNA用针点或喷点的方法直接排列到玻片等介质上，从而制备成芯片。
基因芯片可以用荧光检测和计算机软件进行数据的比较和分析，以达到快速、高效、高通量地分析生物信息的目的。
基因芯片的概念可追溯到southern blot杂交技术，即DNA-DNA之间通过碱基配对机制形成互补链。随后又发展出northern blot杂交和点杂交技术。这三种技术都是将核酸样品固定在滤膜上，样品容易扩散，因此在单位面积上点样的密度受到限制，无法进行大规模、高通量的DNA杂交。同时，由于滤膜面积较大而需较多探针量，检测灵敏度较低。为了提高点样密度和检测灵敏度，降低探针用量，以玻璃、硅等材料为载体的基因芯片技术逐步得到了发展。
美国affymetrix公司于二十世纪八十年代末至90年代初，率先开展了这方面的研究(Fodor,S.P.A.et al.(1991)Science 251,767-773.)。1992年，该公司运用半导体照相平板技术，在1cm2左右的玻片上原位合成寡聚核苷酸片段，诞生了世界上第一块基因芯片(Southern,E.,Maskos,U.&Elder,R.(1992)Genomics 13,1008-1017.)。同时，探针的荧光标记，激光共聚焦扫描(U.S Patent5981965)和计算机分析(U.S Patent 5974164)等技术也随之发展。1995年，第一块以玻璃为载体的基因芯片(微矩阵)在美国Stanford大学诞生(Schena,M.等(1995)Science.270.(20):467-480.)，这标志着基因芯片技术步入了广泛研究和应用的时期。
原位合成寡聚核苷酸芯片具有密集程度高，可合成任意序列的寡聚核苷酸等优点，适用于DNA序列测定、SNP分析等。但其缺点是合成寡聚核苷酸长度有限，因而基因特异性差，而且随长度的增加合成错误率随之增高，作为基因表达谱研究远不如cDNA芯片。cDNA芯片是将微量cDNA片段在玻璃等载体上按矩阵密集排列并固化，也叫微矩阵(Microarray)(DeRisi,J.等(1997)Science 278,680-686.)。基因点样密度虽不及原位合成寡聚核苷酸芯片高，但比用传统载体，如混合纤维素滤膜或尼龙膜的点样密度要高得多，可达到每张载玻片4万个基因。而cDNA芯片最大的优点是靶基因检测特异性非常好，用作表达谱研究结果可靠。目前许多国家实验室和大制药公司都用此类芯片(Baldwin,D等(1999)Curr Opin Plant Biol2(2):96-103.)。
基因芯片最早是由于高通量、大规模研究基因功能的需求而产生的，但随着基因芯片技术的日渐成熟，人们惊喜地发现基因芯片在传染性疾病和遗传病的诊断上有独特的应用前景和巨大的商业市场。感染性病原体诊断芯片就是将待测病原体的特征基因片段(靶基因)固定于玻片上制成芯片，将从病人血清中抽提出病原体的DNA或RNA经扩增标记萤光后与芯片进行杂交，杂交信号由扫描仪扫描，再经计算机分析，判断阴阳性。诊断芯片区别于其他检测手段的优越性在于(1)检测样品为各类致病基因片段，提高了检测效率；(2)因无需机体免疫反应，能及早诊断，且待测样品用量较少；(3)诊断芯片技术是DNA杂交技术和荧光标记技术相结合的分子诊断方法，有极高的灵敏度、特异性和可靠性；(4)自动化程度高，利于大规模推广应用。
在疾病诊断方面，已有一些单一疾病基因诊断芯片产品上市，例如美国的Affymetrix公司已利用基因芯片进行爱滋病病毒(HIV)的研究工作，并有商业化的GeneChip HIV PRT诊断芯片上市，用于爱滋病的早期诊断。
但芯片技术在疾病诊断上的应用尚处于起步阶段，还未大面积推广，原因主要有(1)基因芯片技术是一项全新的技术，对人才、技术、资金的要求很高，目前只有一部分的科研机构和高科技公司完全掌握了该项技术；(2)如果一种芯片只能进行单人份检测，诊断一个被检者可能存在的一种疾病或几种疾病，芯片检测成本较贵，检测效率不高，未充分发挥基因芯片可进行高通量、大规模检测的优势和特点。因此，目前国内外已有多家机构致力于研究开发可用于多人份的基因芯片载体，以真正实现利用基因芯片的技术特征和优势应用于临床诊断的实际应用。
本发明的目的在于提供一种进行多人份诊断的基因芯片载体，在一块芯片上同时存在多个独立的反应单元，各反应单元是一个独立的诊断单元，包括检测监控系统和疾病诊断系统；每一独立反应单元可进行单人份检测，反映一个被检个体的健康状况，所以，一块芯片就能够同时诊断多人份的健康状况，因此一块芯片就能进行多疾病、多人份的诊断。
发明的构思是这样的(1)本发明的一块基因芯片上同时具有多个独立的反应单元，每一反应单元构成一个单人份健康状况检测系统，可对一个被检个体的健康状况进行检测，一块芯片就能同时进行多疾病、多人份的诊断；(2)为形成独立反应单元和避免交叉污染，可在基因芯片载体表面设计下凹的独立反应单元；本发明亦是这样实现的为使诊断芯片符合多疾病、多人份诊断的要求，我们对基因芯片载体进行如下设计所说的基因芯片载体材料可以为玻璃、塑料以及陶瓷，基因芯片载体表面由两个部分组成，第一部分为非点样区，第二部分为点样区。
(1)一块基因芯片有一到两个非点样区，如果有一个非点样区，该点样区位于芯片的一侧，宽度为10～25mm如果有两个非点样区，该非点样区分别位于芯片的两侧，宽度为5～10mm。非点样区表面经磨沙处理，非点样区用于芯片检测时的操作接触。
(2)芯片其他部分为点样区，点样区内有若干数量的点样池，形成独立的反应单元。每个点样池为长度为1mm～6mm，宽度为1mm～8mm，深度为1mm-3mm，在载体表面形成下凹的正方形和长方形反应单元，每个反应单元的实际面积大小与所点点数的多少有关。反应单元在非点样区呈均匀分布。每个反应单元与载体承载面平行的反应表面经特殊处理，表面具有与DNA形成共价键的氨基、巯基等。表面处理为已有技术。
(3)每一反应单元内基因芯片包括两个部分组成，第一部分为检测监控系统，第二部分为疾病诊断系统。
检测监控系统至少有四个对照元素构成，分别为1．点样液，为阴性对照(1)，若杂交后检测无信号，表明正常；若有杂交信号，表明点样液有污染；2．为植物基因a，为阴性对照(2)，若杂交后检测无信号，表明正常；若有杂交信号表明系统有污染；1或2其中之一出现杂交信号，该芯片不能使用；3．为植物基因b，为阳性对照(1)，该植物基因的RNA在抽提血RNA时按一定的比例加入到待检的血清样品中，并随着实验流程进行逆转录。若杂交后该样品有杂交信号为正常；若无杂交信号，表明RNA抽提过程有问题或逆转录不正常；4．为植物基因c，为阳性对照(2)，该植物基因DNA在PCR扩增掺入荧光底物时按一定的比例加入到逆转录的产物中，以检测荧光底物的掺入效率。若杂交后该样品有杂交信号为正常；若无杂交信号，表明标记效果不理想。
所说的点样液为一种包含离子多聚物的缓冲液，可以采用美国Telechem公司生产的、商品名为Micro-Spotting Solution的点样液；所说的为植物基因a的基因序列如下述的植物基因a Sequence a所示植物基因a Sequence a:
Arabidopsis thaliana(拟南芥)SUPERMAN(sup)geneAATTGCCAACAGGATCATGATTATCTTCTAGGGTTTTCATGGCCACCAAGATCCTACACTTGCAGCTTCTGCAAAAGGGAATTCAGATCGGCTCAAGCACTTGGTGGCCACATGAATGTTCACAGAAGAGACAGAGCAAGACTCAGATTACAACAGTCTCCATCATCATCTTCAACACCTTCTCCTCCTTACCCTAA-CCCTAATTACTCTTACTCAACCATGGCAAACTCTCCTCCTCCTCATCATTCTCCTCTAACCCTATTTCCAACCCTTTCTCCTCCATCCTCACCAAGATATAGGGCAGGTTTGATCCGTTCCTTGAGCCCCAAGTCAAAACATACACCAGAAAACGCTTGTAAGACTAAGAAATCATCTCTTTTAGTGGAGGCTGGAGAGGCTACAAGGTTCACCAGTAAAGATGCTTGCAAGATCCTGAGGAATGATGAAATCATCAGCTTGGAGCTTGAGATTGGTTTGATTAACGAATCAGAGCAAGATCTGGATCTAGAACTCCGTTTGGGTTTCGCTTAATTAGATGGTAATAACTTTATCCATAAAGGATTCG--AAGTTCACAATTCTAGAAGATATGATGCTTCTCTAAGGTTAATTAGTTTCATCCATATGAAATTCTCTAAGCTTGCTATTTAGTAGAACG该植物基因a可通过对拟南芥SUPERMAN(sup)gene克隆获得，此为已有技术。所说的为植物基因b的基因序列如下述的植物基因b Sequence b所示植物基因b Sequence b(阴影部分为其PCR扩增引物序列)水稻Usn 5sRNA gene AGGCGAATTGGGTACCGGGCCCCCCCTCGAGAGCGAGCTCAATGGCTACAGGACCAACCTTATCAAAGAGAGCATCAGAATGGGTTACAATGACATTGGTGANGGCTTCTATGCTCATGGCCACCTTTCAGATGCCTTCAAAAGCTACATCCGTACACGTGATTATTGTACCACTTCCAAGCATATAGTTCAGATGTGTATGAATGTGATTCT 该植物基因b可通过对水稻Usn 5sRNA gene克隆获得，此为已有技术。所说的为植物基因c的基因序列如下述的植物基因c Sequence c所示植物基因c Sequence c(阴影部分为其PCR扩增引物序列)水稻Usn 5sRNA gene ACAAAAGCTGGAGCTCCACCGCGGTGGCGGCCGCTCTAGAACTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCGATATCAAGCTTATCGATNNCGTCGACCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTACTAAGAGTTACTATGCATCACAGTACCAGCTCTAAGCATTTATATTTTAAAAAATAGCTTGGCCTCAAATGTGACAGATCGTTCTGTCAAGTCTCTAGATGCTTAAATATCCAGAGCTGTTTACACAGCATCATATTTAAAACCACA 该植物基因c可通过对水稻Usn 5sRNA gene克隆获得，此为已有技术。
每一反应单元的疾病诊断系统将若干种病原体的保守区作为靶基因固定在芯片上，配以相应的靶基因扩增引物，并通过DNA杂交、荧光标记等芯片诊断技术，进行临床疾病的诊断。芯片诊断技术为已有技术。以下将通过实施例对本发明的有关细节作进一步的阐述，但实施例并不限制本发明的保护范围，有关的技术人员完全可以根据本发明的构思和所公开的技术方案，举一反三地制备其它类型的多人份、多疾病诊断芯片，这也在本发明的保护范围之内。
图1是本发明的一个多人份诊断的基因芯片载体的示意图；图2是本发明的另一个多人份诊断的基因芯片载体的示意图；图3所示的是本发明的三种不同反应池的放大示意图。
其中
图1中，所示1为非点样部分，2为点样池；图2中，所示1和2与
图1中相同，3为经表面经磨沙处理过的非点样区；图3是点样池的三种形状A为正方形、B为长方形、C为圆形，其中A还示出了点样池中的点样位点排列示意图。
实施例1将一块长度为约175mm、宽度为约25mm、厚度为约4mm的芯片专用玻片加工成多人份诊断基因芯片。载玻片由两个部分组成，第一部分为非点样区，第二部分为点样区。载玻片有两个非点样区，该非点样区分别位于芯片的两侧，宽度为约10mm。非点样区表面经磨沙处理，非点样区用于芯片检测时的操作接触。载玻片的其他部分为点样区，点样区内有12个点样池，形成独立的反应单元。每个点样池为长度为约6mm，宽度为约6mm，深度为约2mm，在载体表面形成下凹的长方形反应单元。反应单元在非点样区呈均匀分布。每个反应单元与载体承载面平行的反应表面经特殊处理，表面具有与DNA形成共价键的氨基或巯基。表面特殊处理为已有技术。
每一反应单元表面基因芯片包括两个部分组成，第一部分为检测监控系统，第二部分为疾病诊断系统。检测监控系统和疾病诊断系统的设立为已有技术。
权利要求
1．一种疾病诊断用基因芯片载体，其特征在于点样区内有多个呈均匀分布的点样池，其长度为1mm-3mm，宽度为1mm-3mm，深度为1mm-3mm，每个点样池下凹的载体表面构成一个独立的反应单元。
2．如权利要求1所述的基因芯片载体，其特征在于所说的基因芯片载体由两个部分组成，第一部分为经表面经磨沙处理过的非点样区，第二部分为点样区，而且(1)所述非点样区可只位于芯片的一侧或分列于两侧，其总宽度为10-25mm；(2)所述的点样区内是多个呈均匀分布的点样池。
3．如权利要求1或2所述的基因芯片载体，其特征在于所述基因芯片载体的材料可以是玻璃，塑料或陶瓷。
4．如权利要求1或2所述的基因芯片载体，其特征在于，每个反应单元与载体承载面平行的反应表面经特殊处理，表面具有与DNA形成共价键的氨基或巯基。
5．如权利要求1或2所述的基因芯片载体，其特征在于，每一反应单元表面基因芯片包括两个部分组成，第一部分为检测监控系统，第二部分为疾病诊断系统。
6．如权利要求1或2所述的基因芯片载体的用途，其特征在于用于多人份、多疾病诊断。
全文摘要
本发明公开了一种疾病诊断用基因芯片载体,其特征在于点样区内有多个呈均匀分布的点样池,其长度为1mm－3mm,宽度为1mm－3mm,深度为1mm－3mm,每个点样池下凹的载体表面构成一个独立的反应单元。每一反应单元构成一个单人份健康状况检测系统,可对一个被检个体的健康状况进行检测,一块芯片就能同时进行多疾病、多人份的诊断而不会产生交叉污染。
文档编号C12Q1/68GK1314493SQ0011499
公开日2001年9月26日 申请日期2000年3月20日 优先权日2000年3月20日
发明者毛裕民, 谢毅, 肖自力 申请人:上海博道基因开发有限公司