专利名称：生产赤藓糖醇的酵母菌株的制作方法
赤藓糖醇属糖醇类，其甜度为蔗糖的60％至80％，但其热值仅约为蔗糖的1/10，且不会引起龋齿。与很多糖醇不同的是，它不会导致腹泻。另外，赤藓糖醇具有极好的加工特性它是热稳定的；不与氨基基团反应，因此不会导致有机物变为褐色。
赤藓糖醇可见于地衣、长纤维植物叶、菌类植物、发酵食品(如葡萄酒和酱油)和微生物中。可生产赤藓糖醇的微生物包括毕赤氏酵母属、假丝酵母属、球拟酵母属、三角酵母属、Moniliella、短柄霉属和丝孢酵母属的酵母菌株。
本发明涉及能在简单培养基中将葡萄糖转变为赤藓糖醇的新的酵母菌株。
本发明酵母菌株的特征在于缺乏能动孢子或游动孢子(即，具有鞭毛的孢子)；具有有隔菌丝体(即，具有分壁的菌丝体)；无性繁殖(即，不涉及kasogamy和减数分裂的繁殖)；缺乏肾形细胞；分生孢子任选在短的小齿(即，小的齿状突出物)而不是长柄上形成；缺乏掷分生孢子(即，强行释放的分生孢子)；在宽基上非-单极出芽(即，单极突起不产生新细胞的增殖过程)；顶生的芽分生孢子链(即，特征在于在原始细胞被隔片定界之前，可辨认的分生孢子原始细胞显著变大)；深棕色，厚壁的厚壁孢子(即，通过原生质体的收缩，无性1-分室孢子各内源性地和独自地来源自预先存在的细胞的一部分)；有发酵能力(即，半厌氧地发酵至少一种碳源的能力)；能同化蔗糖、甘油和麦芽糖；不能同化乳糖；不能发酵半乳糖；能在25℃，30℃，35℃和36℃生长。任选地，本发明酵母菌株的特征还在于能发酵蔗糖，葡萄糖(即，D-葡萄糖)或麦芽糖；或能或不能同化半乳糖。
根据下文实际的实施例中描述的方法可测定菌株能否发酵或同化特定的碳源，能否在不含维生素的培养基中生长，能否在特定的温度下生长。
本发明的范围中还欲包括具有特征在于上述形态学性状和下表1，2，3，4，5或6中所述生理学性状的酵母菌株。其实例包括但不限于于2000年1月27日保藏于美国典型培养物保藏中心(10801 UniversityBlvd.，Manassas，VA 20110-2209，USA)的6个菌株。保藏菌株的保藏号为PTA-1227，PTA-1228，PTA-1229，PTA-1230，PTA-1231和PTA-1232。衍生自保藏菌株的突变体也在本发明的范围之内。
本发明的酵母菌株与Moniliella acetobuten最接近。实际上，它们的上述形态学性状与M.acetobuten一致。另一方面，它们的生理学特征与M.acetobuten的差别很小。例如，与M.acetobuten不同的是，本发明的菌株不能同化乳糖。另外，它们能在简单培养基(如仅含葡萄糖和酵母浸膏)中，以比M.acetobuten高得多的速率将葡萄糖转变为赤藓糖醇。
从下列详细描述(包括实施例)和所附权利要求书中显而易见本发明的其它特征或优点。
本发明的酵母菌株可分离自天然来源，如具有高糖含量的样品，如蜂蜜，蜜饯和花粉。根据其将葡萄糖转变为赤藓糖醇的能力及其不同的形态学和生理学性状鉴定各菌株。本发明的酵母菌株能将1g葡萄糖转变为至少0.3g赤藓糖醇(即转化率≥30％)。30℃，在50ml烧瓶中，在含有30％葡萄糖和1％酵母浸膏的10ml肉汤中旋转振荡培养菌株6天(最初的细胞密度为1×105个细胞/ml)来测定转化率。20℃，在4％麦芽提取物/0.5％酵母浸膏琼脂中生长10天之后测定形态学性状。参见酵母，分类学研究，Kurtzman等编，第4版，p785，Elsevier，阿姆斯特丹(1998)。另一方面，通过下文实施例中所述的方法测定生理学性状。
本发明的其它酵母菌株可以是衍生自分离于天然来源之菌株的变异体。例如，这些菌株可以是通过UV照射，N-甲基-N′-亚硝基胍处理，甲磺酸乙酯处理，亚硝酸处理，丫啶处理等得到的突变体。它们也可以是利用细胞融合或重组DNA技术经基因工程改造产生的重组菌株。
根据下列仅为了阐明而不是限制其公开内容的具体实施例，本领域技术人员可得到并最大程度地利用本发明的酵母菌株。本文提及的所有出版物都列入本文作为参考。
使用Hewlett Packard H4033A分析仪，在Ion-300层析柱上将温度设置为75℃，以0.1N硫酸作为流动相，以0.4ml/分钟的流速进行HPLC分析。根据Neissner等的方法(Neissner等，1980，赤藓糖醇脂肪酸酯的制造、分析和DC-分离，FETTE’SEIFEN’ANSTRICHMITTEL.8210-16)进行TLC分析。用4％硼酸冲洗Kieselgel 60F254(Merck)之后，使用前还应将凝胶置于105℃的温箱中加热20分钟。扩散溶剂是乙基甲酮∶丙酮∶水(体积比为100∶10∶10)，生色剂是溶于浓硫酸中的KMnO4。
通过萃取进一步纯化经HPLC或TLC纯化自上清液中的赤藓糖醇，然后进行减压干燥。根据Shindou等的方法(Shindou等，1989，通过HPLC和GC-MS鉴定多种果肉中的赤藓糖醇并进行定量测定，农业食品化学杂志，371474-1476)将经进一步纯化的产物和赤藓糖醇标准进行乙酰化。通过GC-MS检测所得样品以测定经再次纯化的产物是否与标准样品相同。
从370个样品中共分离出630株菌，其中22株显示出生产赤藓糖醇的能力。从经加工的蜂蜜、经加工的花粉和糖蜜中得到161株分离物，从中选出6株赤藓糖醇生产菌，其赤藓糖醇转化率为0.5至1.5％。低转化率可能是生产赤藓糖醇的微生物消失所致，因为在采集样品之前，己将其加热和干燥。发现分离自49个蜂蜜样品(大多数未经加工)的26株菌中有3株，即440，441和442可以高转化率(＞30％)地由葡萄糖生产赤藓糖醇。分离自糖厂废水和泥样品的66株菌中无一显示出生产赤藓糖醇的能力。从粗花粉和蜜饯样品中分离出3个优良的赤藓糖醇生产菌株(转化率＞30％)，即166-2，262-1和278-3。
为了研究葡萄糖浓度对赤藓糖醇生产的影响，于30℃，分别在含有1％酵母浸膏和20％、30％和40％葡萄糖的培养基中以150rpm的转速摇瓶培养菌株166-2，262-1和278-3达1至6天(50ml烧瓶，10ml培养基；最初的细胞密度为1×105个细胞/ml)。然后测定所产生的赤藓糖醇的量。结果表明在30％葡萄糖培养基中培养6天的3株菌(测定本发明酵母菌株转化率的标准方法)皆显示出超过30％的转化率。另外，在含有40％葡萄糖的培养基中培养6天后，所有3株菌的转化率皆约为30％。至于葡萄糖的消耗，在含有30％葡萄糖的培养基中培养时，菌株166-2在第5天消耗掉了所有的葡萄糖，菌株262-1和278-3在第6天消耗掉了所有的葡萄糖。
在30％葡萄糖培养基中分别加入0.5、1.0和1.5M的KCl或NaCl所进行的研究表明离子渗透压的增加使所有3株菌的转化率降低。pH分布图的研究表明在pH4.0-7.0，在30％葡萄糖培养基中生长的3株菌的转化率大致相同。pH8时转化率降低。分别于25℃、30℃和35℃在30％培养基中培养菌株166-2、262-1和278-3。所有3株菌在30℃时显示出最高的转化率，在25℃时显示出最低的转化率。
还研究了不同培养基对赤藓糖醇生产的影响。当30％葡萄糖被30％麦芽糖替代时，所有3株菌都不产生赤藓糖醇。用30％麦芽糖糊精替代30％葡萄糖或用6％玉米浸出汁或6％豆粉替代1％酵母浸膏使转化率显著降低。另外，还研究了培养基中不同浓度(0.5％，0.75％和1.0％)的酵母浸膏对赤藓糖醇生产的影响。结果表明转化率随酵母浸膏水平的增加而按比例地增加。另外，加入不同浓度的多种矿物质，即MgSO4·7H2O(0.02％至0.1％)、K2HPO4(0.001％至0.02％)、CaCl2·2H2O(0.1％至0.4％)和CaCO3(0.1％至1％)不会显著影响转化率。
除了按上述在烧瓶中培养之外，也于30℃，在含有2升30％葡萄糖/1％酵母浸膏培养基的5升发酵罐中分别将菌株166-2、262-1和278-3培养6至7天(转速150rpm；通气1vvm或体积/分钟/培养基体积；最初的细胞密度为1×105个细胞/ml)。菌株166-2和262-1在第5天结束时大致完成了葡萄糖至赤藓糖醇的转化。菌株278-3以较慢的速率将葡萄糖转变为赤藓糖醇，直至第7天仍未完成转化。
第7天时，离心收集各培养物的上清液，用活性炭脱色，然后使之通过离子交换树脂(IRA-410∶IRA-120B＝2∶1)以除去杂质。通过蒸发和重结晶浓缩之后，得到白色清亮晶体状的赤藓糖醇。通过1H和13CNMR进一步证实所得赤藓糖醇晶体的结构。
已发现当于30℃，50ml烧瓶中，在10ml含有30％葡萄糖/1％酵母浸膏的培养基中以150rpm的转速各摇瓶培养6天时(最初的细胞密度为1×105个细胞/ml)，发现每升166-2、262-1、278-3、440、441和442菌株分别能生产98.7、104.1、117、99、97.8和102.6g赤藓糖醇。
根据《酵母，分类学研究》(Kreger-van Rij等编，第3版，p76-101，Elsevier，阿姆斯特丹(1994))提供的方法测定166-2、262-1、278-3、440、441和442菌株的生理学性状。
具体地说，在Durham管中在2％(w/v)溶液中检测所有糖的发酵，接种物来自麦芽提取物琼脂48小时培养物，接种后，于25℃在发酵基本培养基中温育细胞，见p78-79。
根据p81-83中“1.液体培养基同化试验”一节中所述的方法进行含碳化合物的需氧利用(同化)试验。更具体地说，用无菌自来水制备细胞悬浮液，接种后，于25℃温育细胞。通过将6.7g Bacto酵母氮基和与葡萄糖等当量的适量含碳化合物(即与5g葡萄糖所含碳的量相同)溶解于100ml去矿物质化的水中来制备10倍浓缩的培养基。为了简单起见，所有阳性反应(即1+，2+和3+)均被表示为“+”。
根据p85-86中“1.液体培养基中的同化”一节中所述的方法进行含氮化合物的需氧利用(同化)试验。为了简单起见，所有阳性反应(即1+，2+和3+)均被表示为“+”。
根据p86-87中“3.在不含维生素的培养基中的生长，维生素需求”一节中所述的方法进行在不含维生素的培养基中的生长试验。为了简单起见，所有阳性反应(即1+，2+和3+)均被表示为“+”。
根据p88-89中“5.在37℃和其它温度下的生长；生长的最大温度”一节中所述的方法进行在多种温度下的生长试验。使用的是固体培养基。
所有试验结果示于下表1至6
表1菌株166-2的生理学特征半厌氧发酵D-葡萄糖+ D-半乳糖 -麦芽糖 + 蔗糖+乳糖 -需氧利用和生长D-葡萄糖+ α，α-海藻糖 -山梨糖 -纤维二糖 +D-核糖 + 熊果苷 +L-阿拉伯糖 W 乳糖 -D-鼠李糖- 松三糖 -麦芽糖 + 淀粉 -甲基α-D-葡糖苷 -赤藓糖醇 +水杨苷 - 木糖醇 -蜜二糖 - D-Glucitol-棉子糖 -半乳糖醇 -菊糖 - D-葡糖酸-1，5-内酯+甘油 + D-葡糖酸盐-核糖醇 -DL-乳酸盐-L-阿拉伯糖醇 - 柠檬酸盐-D-甘露糖醇 + Enthanol+肌醇 - 丁烷 -2-酮-葡糖酸盐 - 蔗糖盐 -半乳糖醛酸盐 - 硝酸盐 +琥珀酸盐+ 乙胺 -甲醇 - 尸胺 +丙烷 - 肌酸酐 -奎尼酸盐- 咪唑 -Galactonate - 亚硝酸盐+D-半乳糖+ 赖氨酸 +葡糖胺 - 肌酸 -木糖 - 葡糖胺 -D-阿拉伯糖 W蔗糖 +生长温度25℃ + 30℃ +35℃ + 36℃ +
表2菌株262-1的生理学特征半厌氧发酵D-葡萄糖 + D-半乳糖 -麦芽糖 + 蔗糖+乳糖-需氧利用和生长D-葡萄糖 + α，α-海藻糖 -山梨糖 - 纤维二糖 +D-核糖 + 熊果苷 +L-阿拉伯糖 W 乳糖-D-鼠李糖 - 松三糖 -麦芽糖 + 淀粉-甲基α-D-葡糖苷 - 赤藓糖醇 +水杨苷 - 木糖醇 -蜜二糖 -D-Glucitol -棉子糖 - 半乳糖醇 -菊糖- D-葡糖酸-1，5-内酯+甘油+ D-葡糖酸盐-核糖醇 - DL-乳酸盐-L-阿拉伯糖醇- 柠檬酸盐-D-甘露糖醇 + Enthanol+肌醇- 丁烷 -2-酮-葡糖酸盐-蔗糖盐 -半乳糖醛酸盐-硝酸盐 +琥珀酸盐 + 乙胺 W甲醇- 尸胺 +丙烷-肌酸酐 -奎尼酸盐 - 咪唑 -Galactonate - 亚硝酸盐+D-半乳糖 -赖氨酸 +葡糖胺 - 肌酸 -木糖-葡糖胺 -D-阿拉伯糖 -蔗糖+生长温度25℃ + 30℃ +35℃ + 36℃ +
表3菌株278-3的生理学特征半厌氧发酵D-葡萄糖 + D-半乳糖 -麦芽糖 + 蔗糖 +乳糖-需氧利用和生长D-葡萄糖 + α，α-海藻糖-山梨糖 - 纤维二糖 +D-核糖 -熊果苷+L-阿拉伯糖 - 乳糖 -D-鼠李糖 -松三糖-麦芽糖 + 淀粉 -甲基α-D-葡糖苷 - 赤藓糖醇 +水杨苷 -木糖醇-蜜二糖 - D-Glucitol -棉子糖 - 半乳糖醇 -菊糖- D-葡糖酸-1，5-内酯 +甘油+ D-葡糖酸盐 -核糖醇 - DL-乳酸盐 -L-阿拉伯糖醇- 柠檬酸盐 -D-甘露糖醇 + Enthanol +肌醇- 丁烷 -2-酮-葡糖酸盐-蔗糖盐-半乳糖醛酸盐-硝酸盐+琥珀酸盐 + 乙胺 -甲醇- 尸胺 +丙烷-肌酸酐-奎尼酸盐 - 咪唑 -Galactonate - 亚硝酸盐 +D-半乳糖 -赖氨酸+葡糖胺 - 肌酸 W木糖-葡糖胺-D-阿拉伯糖 -蔗糖 +生长温度25℃ + 30℃ +35℃ + 36℃ +
表4菌株440的生理学特征半厌氧发酵D-葡萄糖+D-半乳糖 -麦芽糖 + 蔗糖 +乳糖 -需氧利用和生长D-葡萄糖+ D-甘露糖醇 +D-半乳糖+半乳糖醇 -山梨糖 + 肌醇 -D-葡糖胺- D-葡糖酸-1，5-内酯 +D-核糖 + D-葡糖酸盐 -L-阿拉伯糖 - D-葡糖醛酸盐 -D-阿拉伯糖 - D-半乳糖醛酸盐-L-鼠李糖-柠檬酸盐 -蔗糖 +DL-乳酸盐 -麦芽糖 + 琥珀酸盐 +α，α-海藻糖 - 甲醇-甲基α-D-葡糖苷 - 2-酮-葡糖酸盐-纤维二糖+ D-木糖 -水杨苷 - 乙醇+熊果苷 + 丙烷-蜜二糖 - 蔗糖盐 -乳糖 - 丁烷-棉子糖 - 奎尼酸盐 -松三糖 - Galactonate -菊糖 - 硝酸盐 +淀粉 - 亚硝酸盐 +甘油 + 乙胺-赤藓糖醇+ L-赖氨酸 +核糖醇 - 尸胺+木糖醇 - 不含维生素的生长 +L-阿拉伯糖醇 - 含0.01％(w/v)环己酰亚胺 -D-Glucitol - 含0.1％(w/v)环己酰亚胺 -生长温度25℃+30℃ +35℃+36℃ +
表5菌株441的生理学特征半厌氧发酵D-葡萄糖- D-半乳糖-麦芽糖 - 蔗糖 -乳糖 -需氧利用和生长D-葡萄糖+ D-甘露糖醇 +D-半乳糖- 半乳糖醇-山梨糖 + 肌醇 -D-葡糖胺- D-葡糖酸-1，5-内酯 +D-核糖 + D-葡糖酸盐 WL-阿拉伯糖 - D-葡糖醛酸盐 -D-阿拉伯糖 -D-半乳糖醛酸盐 -L-鼠李糖- 柠檬酸盐-蔗糖 + DL-乳酸盐 -麦芽糖 + 琥珀酸盐+α，α-海藻糖 - 甲醇 -甲基α-D-葡糖苷 - 2-酮-葡糖酸盐 -纤维二糖+D-木糖 -水杨苷 - 乙醇 +熊果苷 + 丙烷 -蜜二糖 -蔗糖盐 -乳糖 - 丁烷 -棉子糖 - 奎尼酸盐-松三糖 - Galactonate -菊糖 -硝酸盐 +淀粉 - 亚硝酸盐+甘油 + 乙胺 -赤藓糖醇+ L-赖氨酸+核糖醇 - 尸胺 +木糖醇 - 不含维生素的生长+L-阿拉伯糖醇 -含0.01％(w/v)环己酰亚胺-D-Glucitol - 含0.1％(w/v)环己酰亚胺-生长温度25℃ + 30℃ +35℃ + 36℃ +
表6菌株442的生理学特征半厌氧发酵D-葡萄糖+ D-半乳糖 -麦芽糖 + 蔗糖 +乳糖 -需氧利用和生长D-葡萄糖+ D-甘露糖醇 +D-半乳糖- 半乳糖醇 -山梨糖 + 肌醇 -D-葡糖胺- D-葡糖酸-1，5-内酯 +D-核糖 + D-葡糖酸盐 -L-阿拉伯糖 - D-葡糖醛酸盐 -D-阿拉伯糖 -D-半乳糖醛酸盐-L-鼠李糖-柠檬酸盐 W蔗糖 + DL-乳酸盐 -麦芽糖 +琥珀酸盐 +α，α-海藻糖 - 甲醇-甲基α-D-葡糖苷 - 2-酮-葡糖酸盐-纤维二糖+ D-木糖 -水杨苷 - 乙醇+熊果苷 + 丙烷-蜜二糖 - 蔗糖盐 -乳糖 - 丁烷-棉子糖 +奎尼酸盐 -松三糖 - Galactonate -菊糖 - 硝酸盐 +淀粉 -亚硝酸盐 +甘油 + 乙胺-赤藓糖醇+L-赖氨酸 +核糖醇 - 尸胺+木糖醇 -不含维生素的生长 +L-阿拉伯糖醇 -含0.01％(w/v)环己酰亚胺 -D-Glucitol - 含0.1％(w/v)环己酰亚胺 -生长温度25℃ + 30℃+35℃ + 36℃+
根据以上描述，本领域技术人员可容易地确定本发明的必要技术特征，在不背离本发明的精神和范围的情况下，可对本发明进行多种改变和修饰以使其适应多种用途和条件。例如，尽管所有受试酵母菌株能在仅含有30％葡萄糖和1％酵母浸膏的培养基中生长，但那些仅在添加有一种或多种营养物的培养基中生长的菌株也包括在本发明的范围之内。因此，其它实施方案也包括在权利要求书中。
权利要求
1.能在含有30％葡萄糖和1％酵母浸膏的培养基中将葡萄糖转变为赤藓糖醇的酵母菌株，所述菌株的特征在于缺乏能动孢子；具有有隔菌丝体；无性繁殖；缺乏肾形细胞；分生孢子任选在短的小齿而不是长柄上形成；缺乏掷分生孢子；在宽基上非-单极出芽；顶生的芽分生孢子链；深棕色，厚壁的厚壁孢子；有发酵能力；有同化蔗糖、甘油和麦芽糖的能力；不能同化乳糖；不能发酵半乳糖；能在25℃-36℃生长。
2.权利要求1的酵母菌株，其进一步的特征在于能发酵蔗糖，不能同化半乳糖。
3.权利要求2的酵母菌株，其进一步的特征在于能发酵葡萄糖和麦芽糖。
4.权利要求1的酵母菌株，其进一步的特征在于能发酵蔗糖并能同化半乳糖。
5.权利要求4的酵母菌株，其进一步的特征在于能发酵葡萄糖和麦芽糖。
6.酵母菌株，其特征在于缺乏能动孢子；具有有隔菌丝体；无性繁殖；缺乏肾形细胞；分生孢子任选在短的小齿而不是长柄上形成；缺乏掷分生孢子；在宽基上非-单极出芽；顶生的芽分生孢子链；深棕色，厚壁的厚壁孢子；和具有说明书中表1至6之一所列的生理学性状。
7.权利要求6的酵母菌株，其特征在于具有说明书中表1所列的生理学性状。
8.权利要求6的酵母菌株，其特征在于具有说明书中表2所列的生理学性状。
9.权利要求6的酵母菌株，其特征在于具有说明书中表3所列的生理学性状。
10.权利要求6的酵母菌株，其特征在于具有说明书中表4所列的生理学性状。
11.权利要求6的酵母菌株，其特征在于具有说明书中表5所列的生理学性状。
12.权利要求6的酵母菌株，其特征在于具有说明书中表6所列的生理学性状。
13.权利要求6的酵母菌株，其在美国典型培养物保藏中心的保藏号为PTA-1227，PTA-1228，PTA-1229，PTA-1230，PTA-1231或PTA-1232；或衍生自它们的突变体。
14.权利要求13的酵母菌株，其保藏号为PTA-1227。
15.权利要求13的酵母菌株，其保藏号为PTA-1228。
16.权利要求13的酵母菌株，其保藏号为PTA-1229。
17.权利要求13的酵母菌株，其保藏号为PTA-1230。
18.权利要求13的酵母菌株，其保藏号为PTA-1231。
19.权利要求13的酵母菌株，其保藏号为PTA-1232。
20.权利要求13的酵母菌株，所述菌株为衍生自保藏号为PTA-1227之菌株的突变体。
21.权利要求13的酵母菌株，所述菌株为衍生自保藏号为PTA-1228之菌株的突变体。
22.权利要求13的酵母菌株，所述菌株为衍生自保藏号为PTA-1229之菌株的突变体。
23.权利要求13的酵母菌株，所述菌株为衍生自保藏号为PTA-1230之菌株的突变体。
24.权利要求13的酵母菌株，所述菌株为衍生自保藏号为PTA-1231之菌株的突变体。
25.权利要求13的酵母菌株，所述菌株为衍生自保藏号为PTA-1232之菌株的突变体。
全文摘要
本发明涉及能将葡萄糖转变为赤藓糖醇的酵母菌株,所述菌株具有下列鉴定特征:缺乏能动孢子;有隔菌丝体;无性繁殖;缺乏肾形细胞;分生孢子任选在短的小齿而不是长柄上形成;缺乏掷分生孢子;在宽基上非－单极出芽;顶生的芽分生孢子链;深棕色,厚壁的厚壁孢子;同化蔗糖、甘油和麦芽糖的能力;不能同化乳糖;不能发酵半乳糖;和能在25℃—36℃生长。
文档编号C12P7/02GK1335391SQ0012135
公开日2002年2月13日 申请日期2000年7月21日 优先权日2000年7月21日
发明者林锡杰, 温秋燕, 许文浩, 刘桂郁, 朱文深 申请人:食品工业发展研究所