专利名称：耐冻酵母选育方法及其发酵生产工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及用微生物处理面团的制备方法，或面包酵母的繁殖，具体是发酵面团冷冻储存中具有抗冷冻性的一种耐冻酵母选育方法及其发酵生产工艺。
背景技术：
主食品工业化的程度标志着一个国家或地区生活水平的高低，我国主食品工业化所生产的产品、半成品较低，与发达国家相比差距很大。
冷冻面团技术是当今世界比较先进的面制品加工新技术，国外已成功应用。它利用具有超强抗冻能力的特殊酵母菌进行发酵，从工艺上把面团制作和产品的烘烤或蒸制两个环节分开，即由较大的面团中央工厂将已经搅拌，发酵，整形后的面团快速冷冻，然后将此冷冻面团销往各个连锁店，快餐店，面包房，超市或直接进入家庭，储存在冰箱中，经营者随时可将冷冻面团从冰箱中取出，然后烘烤或蒸制即成为新鲜食品。可广泛应用于各类面包、速冻包子、馒头、门丁等。
目前国内生产的用于发酵面制品的酵母均为不耐冻酵母，即普通酵母，此酵母只能用于一般馒头、面包、包子等发酵面制品的最终成品销售，而不能实现发酵后与蒸制前半成品(即含有活酵母菌的半成品)的冻藏。
中国专利1187107公开了一种“抗冰冷冻面团”，包括一种制作面包面团的方法，该面团在低至0(-18℃)的温度下仍保持不冻，并且当在冷冻温度下贮存后焙烤时，具有与由未经贮存的非冷冻面团焙烤的面包基本上相同的比容和风味。本发明亦包括一种被赋予改进的贮存稳定性的预醒发成型的，未熟化的面团。以密封包装的形式面团并在小于45(7℃)的温度下贮存，如果包装容器含有顶部空间，其中大部气体与膨松气体，即二氧化碳相同，面团亦含有多元醇。
中国专利1309911公开的“抗冷冻面团改良剂”，其是将5～12％的改性卵磷脂，20～30％的蔗糖脂，10-20％的硬脂乳酸钙或硬脂酰乳酸钠，15-20％的二乙酰洒石酸单酸甘油脂，5-10％的单甘酯，2-3％的葡萄糖氧化酶，1.5-2.5％的半纤维素酶加至淀粉至百分之百，按一定比例加入面粉中制成冷冻面团，可以在零下-23℃贮存12周后加工成品，其色泽、弹性、口感、比体积都与未冷冻面团加工出的成品相近。
中国专利1382210公开的是“新的面包酵母和含有该酵母的面团”，该面包酵母在面包制作方法如直接面团法，发面团法和/或冷冻法中，在含盐和各种面包制作所需组份的高渗透压面团中具有很强的发酵能力，而且使用该酵母可以产生优质的比容积大的面包。该发明提供的面包酵母对面包制作方法例如，直接面团法和/或发面团法中的渗透压和冷冻过程具有耐性。
中国专利1423524公开了一种“制作一种冷藏生面团的方法”该方法包括将谷类面粉和水与一种蛋白质混合，该蛋白质能减少或者防止谷类面粉中阿糖基木聚糖的酶促降解。
中国专利1118007公开的“低温失活的工业用面包酵母”，首先将具有Lti特性的单倍体酿酒酵母菌株与至少具有一个活化的受分解代谢抑制的MAL等位基因的单倍体酿酒酵母菌株进行杂交，然后在第二阶段，将分离子代进行杂交，最后选出Lti表现型活化的但受分解代谢抑制的MaI表现型，和在分批补料方法中具生长能力的原养型二倍体菌株。
发明内容
本发明就是为了解决现有技术中存在的缺乏耐冻酵母，以及不能实现发酵后与蒸制前半成品(即含有活酵母菌的半成品)的冻藏问题，而提供一种耐冻酵母选育方法及其发酵生产工艺。
本发明是按以下技术方案实现的。
一种耐冻酵母选育方法，a.酵母菌株分别经紫外线和化学诱变剂诱变后，在5-10％葡萄糖溶液中培养60～120min，取其100ml在56℃热处理15～35min，在耐冻酵母培养基上涂布培养40～60h，挑选菌株进行4Be麦芽汁斜面28℃培养40～60h，获得选育的酵母菌株；b.将选育的酵母菌株和面团在28℃条件下进行前发酵50～100min，再于-18～-25℃进行冷冻24h，而后25～30℃解冻1h；冷冻、解冻交替进行20～60次，至大多数酵母死亡，从存活的菌株中分离、筛选，转接10～15代为转代菌株；c.取转代菌株经两次活化，加入到5％葡萄糖浓度溶液中，使酵母菌浓度为105～106cfu/ml，振荡、摇匀后分装，-15～-25℃冷冻，8周后解冻，将菌株用麦芽汁斜面保存即为耐冻酵母。
所述的耐冻酵母选育方法，其耐冻酵母菌株冷冻速率控制在-1℃/min，冷冻贮藏8周后28℃、30min解冻，测定冷冻前后的酵母活菌数，冷冻存活率75％～90％的菌株视为耐冻性良好的菌株。
所述的耐冻酵母选育方法，其化学诱变剂是硫酸二乙酯。
所述的耐冻酵母选育方法，其面团在-28℃冷冻8周，酵母存活率75％～90％；面团冷冻前后发酵力不低于60％为良好的菌株。
一种耐冻酵母的发酵生产工艺，a.工业发酵用糖蜜加水稀释30-35Bix，离心澄清除胶质为流加糖蜜液，进入配料罐后加入营养辅料，一并溶于水中，在121℃灭菌20min，作为流加添加液备用；b.从4Be麦芽汁斜面培养基中接种耐冻酵母至含有灭菌12Bix离心澄清除胶质后的工业发酵用糖蜜的三角瓶中，180rpm/min，28℃培养24小时后，按5％液体接种量扩大转接到其它工业发酵用糖蜜三角瓶中，同样条件培养24小时，足够量的酵母被转接到贮有工业发酵用糖蜜和营养辅料的种子发酵罐中，培养18-22小时后，将酵母种子送到主发酵罐；c.主发酵糖浓度控制在6-10Brix，培养温度28-30℃，转速180-200rpm/min发酵24-30小时，酵母菌体量达到以26％鲜酵母计的25-35g/L，残糖浓度控制在0.3％以下为种子；流加培养周期15-20小时、发酵液中后期采用氮饥饿、增加渗透压和提高温度的方法来刺激海藻糖的积累，酵母菌形体镜检大小均一，出芽率接近于零；d.酵母菌经高速离心分离、洗涤、真空吸滤脱水、酵母乳的乳化和成型干燥。
所述耐冻酵母的发酵生产工艺，其工业发酵用糖蜜是甘蔗糖蜜，或甜菜糖蜜。
所述耐冻酵母的发酵生产工艺，其营养辅料是每生成100g鲜酵母需添加尿素3-5g、磷酸二氢铵1-2g、硫酸镁0.5-1g、硫酸锌0.05-0.1g、生物素0.01-0.1g。
所述耐冻酵母的发酵生产工艺，其增加渗透压是向发酵液中一次性加入Nacl 20g/L。
所述耐冻酵母的发酵生产工艺，其发酵液中可发酵性糖控制在0.1-0.2％、pH从开始4.0.到结束7.0、温度从开始28℃到结束36℃、酵母对糖得率45％以上、酵母收获量为130g/L以上、海藻糖含量15-22％、含氮量为6.5-7.0％培养所需要的氮源、磷源。
本发明具有如下有点1.由于冷冻面团在中央工厂一次完成，面包房在加工过程中省却了配料、调粉、整型等工序，所以人员数量、占地、工作量及成本都大幅度降低；统一原料供应，统一生产工艺，统一产品质量标准。由于产品质量的稳定，将有利于面包店连锁经营模式的发展和面包作为主食在中国的普及。
2.有助于面食品工业化安全监督体系的建立与健全，从而在根本上解决了滥用各种食品添加剂和弄虚作假现象，保证广大消费者食品安全与身心健康。实现发酵面制品半成品的冷冻储藏，用于冷链销售，使消费者可以随时吃到最新鲜的面食品。
3.本发明专利技术选育出的耐冻酵母在-20℃下冷冻8周其酵母存活率大于90％，发酵活力大于1000ml。耐冻酵母已成功应用在冷冻面团如面包、馒头、速冻包子中。
附图是耐冻活性干酵母制备工艺流程图。
具体实施例方式
实施例1耐冻酵母育种方法本发明采用以面包酵母为出发菌株并进行紫外线和化学诱变剂进行诱变同时结合-25℃-30℃的温度变化反复冲击方法筛选耐冻酵母。
(1)耐冷冻面包酵母的菌种选育出发菌株经紫外线(UV)和化学诱变剂硫酸二乙酯(DES)进行诱变后，在5％葡萄糖溶液中培养90min，其每份100ml菌液在56℃热处理30min，在耐冻培养基上涂布培养48h，挑选菌落较大的菌株进行4Be麦芽汁斜面28℃培养48h备用；将选育的酵母菌株和面团在28℃条件下进行前发酵90min，而后于-20℃进行冷冻24h后，再于28℃解冻处理1h，冷冻、解冻交替进行50次，直至绝大多数酵母已死亡，从存活的菌株中分离筛选耐冻酵母菌株，检测酵母耐冻后发酵活力，耐冻酵母转接15代以检验遗传稳定性，并淘汰突变恢复菌株。
(2)耐冻酵母分离筛选通过诱变菌株进行冷冻、解冻处理的方法选育耐冻性酵母菌株，取待测菌株在4Be麦芽汁斜面28℃培养48h，转接两次后将活化好的的酵母菌适量加入到不同浓度的葡萄糖5％溶液中，并使酵母菌浓度控制在106cfu/ml充分振荡、摇匀后分别装入无菌空试管放入冷冻箱中冷冻，冷冻速率控制在-1℃/min，-20℃冷冻贮藏八周后，28℃，30min解冻，以活菌计数法(GB/T4789-94)测定冷冻前后的酵母活菌数，将冷冻存活率大于80％的菌株视为耐冻性良好的菌株，同时检测耐冻后酵母菌产气能力，将菌株用麦芽汁斜面保存。
耐冻酵母发酵生产工艺(1)工业发酵原料预处理首先把甘蔗糖蜜或甜菜糖蜜加水预处理，离心分离去除胶体粘性物质，然后成35-40Bix浓糖蜜液，在121℃灭菌30min，作为流加糖蜜液备用。再加入营养辅料，发酵液中每生成100g含干固物26％的鲜酵母需要添加营养辅料尿素3.5g、磷酸二氢铵1.1g、硫酸镁0.6g、硫酸锌0.06g、生物素0.03g、一起溶于水中，在121℃灭菌20min，作为流加添加液备用。
(2)耐冻酵母种子的制备从4Be麦芽汁斜面培养基中接种耐冻酵母至含有灭菌12Bix糖蜜的三角瓶中，180rpm/min，28℃培养24小时后，按5％液体接种量扩大转接到其它糖蜜三角瓶，同样条件培养24小时，足够量的酵母被转接到贮有糖蜜和营养辅料的种子发酵罐中，培养大约20小时后，酵母被送到主发.酵罐。
(3)酵母主发酵酵母主发酵为两段法加糖蜜流加工艺两段法即前期主发酵糖蜜浓度控制在8Brix，培养温度28℃，转速180rpm/min发酵24小时为发酵液，酵母菌体量达到30g/L(以26％鲜酵母计)以上，残糖浓度控制在0.3％以下，开始进行上述配制的糖蜜及营养辅料的流加培养。
糖蜜流加培养工艺流加培养周期20小时、发酵液中可发酵性蔗糖控制在0.2％、pH从开始4.0.到结束7.0、温度从开始28℃到结束36℃、酵母对糖得率45％以上、酵母收获量以26％鲜酵母计为130g/L以上、酵母海藻糖干固物含量20％、酵母含氮量为6.8％，培养所需要的氮源、磷源在培养的前10h内流加完毕，中后期采用氮饥饿(不补充氮源)和增加渗透压向发酵液中一次性加入Nac1 20g/L，以及提高温度至36℃等方法来刺激海藻糖的积累，酵母菌形体镜检大小均一，出芽率接近于零。发酵液中可发酵性糖还可以是葡萄糖，或麦芽糖。
(4)酵母分离、乳化从主发酵罐出来酵母经过5000rpm/min高速离心机分离，清水洗涤数次，将残留的糖蜜及发酵液洗净，进一步浓缩为含20％固形物的酵母乳，该工序采用的大型自动清洗的高速离心机；酵母乳的乳化过程是酵母脱水后加入乳化剂，如单甘酯0.2％。
(5)真空连续过滤酵母的进一步脱水是通过酵母乳加食盐0.5％真空吸滤机来达到30％固形物的。
(6)干燥真空吸滤脱水的酵母通过一个成型板，被连续地挤出，再通过搅龙送入连续式一级沸腾床干燥机和二级流化床干燥机。
(7)包装包装高活性干酵母干燥的酵母经过混合贮存，再经真空自动包装成型，装袋和密封，成为产品。
实施例2耐冻酵母育种方法本发明采用以面包酵母为出发菌株，并进行紫外线和化学诱变剂硫酸二乙酯(DES)诱变，同时结合-25℃-30℃的温度变化，反复冲击方法筛选耐冻酵母。
(1)耐冷冻面包酵母的菌种选育出发菌株经紫外线(UV)和化学诱变剂硫酸二乙酯(DES)进行诱变后，酵母在8％葡萄糖溶液中培养90min，其每份100ml在56℃热处理20min，在耐冻酵母培养基上涂布培养50h，挑选菌落较大的菌株进行4Be麦芽汁斜面28℃培养48h培养；将耐冻酵母和面团28℃前发酵60min，-18℃冷冻24h，30℃解冻1h处理三个循环共30次，直到绝大多数酵母已死亡，从存活的菌株中分离筛选耐冻酵母菌株，检测酵母发酵活力，耐冻酵母转接20代以检验遗传稳定性，并淘汰突变恢复菌株。
(2)耐冻酵母分离筛选通过诱变菌株进行冷冻、解冻处理的方法选育耐冻性酵母菌株，取待测菌株4Be麦芽汁斜面28℃培养48h进行两次活化，将活化好的的菌液适量加入到5％葡萄糖溶液中，并使酵母菌浓度控制在107cfu/ml，充分震荡、摇匀后分别装入无菌空试管放入冷冻箱中冷冻，冷冻速率控制在-1℃/min，-18℃冷冻贮藏八周后，28℃，30min解冻，以活菌计数法(GB/T4789-94)测定冷冻前后的酵母活菌数，将冷冻存活率大于80％的菌株视为耐冻性良好的菌株，同时检测耐冻后酵母菌产气能力，将菌株用麦芽汁斜面保存。
耐冻酵母发酵生产工艺(1)工业发酵原料预处理甘蔗糖蜜或甜菜糖蜜加水预处理，离心分离去除胶体粘性物质，然后35-40Bix浓糖蜜液，在121℃灭菌30min，作为流加糖蜜液备用。每生成100g含26％鲜酵母(干固物)需要添加含有尿素4.0g、磷酸二氢铵1.5g、硫酸镁0.8g、硫酸锌0.08g、生物素0.08g的营养辅料，并一起溶于水中，在121℃灭菌20min，作为流加添加液备用。
(2)耐冻酵母种子的制备首先从4Be麦芽汁斜面培养基中接种耐冻酵母至含有灭菌12Bix糖蜜的三角瓶中，180rpm/min，28℃培养24小时后，按5％液体接种量扩大转接到其它糖蜜三角瓶，同样条件培养24小时，足够量的酵母被转接到贮有糖蜜和营养辅料的种子发酵罐中，培养大约20小时后，酵母被送到主发酵罐。
(3)酵母主发酵酵母主发酵为两段法加糖蜜流加工艺两段法即前期主发酵糖浓度控制在7Brix，发酵28小时为发酵液，酵母菌体量达到25g/L，(以鲜酵母计)残糖浓度控制在0.1％以下，开始进行糖蜜流加培养。
糖蜜流加培养工艺流加培养周期16小时、发酵液中可发酵性蔗糖控制在0.1％、pH从开始4.0.到结束7.0、温度从开始28℃到结束36℃、酵母对糖得率45％以上、酵母收获量以26％鲜酵母计为120g/L以上、海藻糖干固物含量18％、含氮量为6.8％培养所需要的氮源、磷源在培养的前10h内流加完毕，中后期采用氮饥饿(不补充氮源)和增加渗透压向发酵液中一次性加入Nacl 20g/L，以及提高温度至36℃等方法来刺激海藻糖的积累，酵母菌形体镜检大小均一，出芽率接近于零。发酵液中可发酵性糖还可以是葡萄糖，或麦芽糖。
(4)酵母分离、乳化从主发酵罐出来酵母经过5000rpm/min高速离心机分离，洗涤数次，将残留的糖蜜及发酵液洗净，进一步浓缩为含20％固形物的酵母乳，该工序采用的大型自动清洗的高速离心机；酵母乳的乳化过程是酵母脱水后加入乳化剂，山犁聚糖硬脂酸甘油酸酯0.1％。
(5)真空连续过滤酵母的进一步脱水是通过酵母乳加0.5％食盐真空吸滤机来达到30％固形物。
(6)干燥真空吸滤脱水的酵母通过一个成型板，被连续地挤出，再通过搅龙送入连续式一级沸腾床干燥机和二级流化床干燥机。
(7)包装包装高活性干酵母干燥的酵母经过混合贮存，再经真空自动包装成型，装袋和密封，成为产品。
权利要求
1.一种耐冻酵母选育方法，其特征在于a.酵母菌株分别经紫外线和化学诱变剂诱变后，在5-10％葡萄糖溶液中培养60～120min，取其100ml在56℃热处理15～35min，在耐冻酵母培养基上涂布培养40～60h，挑选菌株进行4Be麦芽汁斜面28℃培养40～60h，获得选育的酵母菌株；b.将选育的酵母菌株和面团在28℃条件下进行前发酵50～100min，再于-18～-25℃进行冷冻24h，而后25～30℃解冻1h；冷冻、解冻交替进行20～60次，至大多数酵母死亡，从存活的菌株中分离、筛选，转接10～15代为转代菌株；c.取转代菌株经两次活化，加入到5％葡萄糖浓度溶液中，使酵母菌浓度为105～109cfu/ml，振荡、摇匀后分装，-15～-25℃冷冻，8周后解冻，将菌株用麦芽汁斜面保存即为耐冻酵母。
2.根据权利要求1所述的耐冻酵母选育方法，其特征在于耐冻酵母菌株冷冻速率控制在-1℃/min，冷冻贮藏8周后28℃、30min解冻，测定冷冻前后的酵母活菌数，冷冻存活率75％～90％的菌株视为耐冻性良好的菌株。
3.根据权利要求1所述的耐冻酵母选育方法，其特征在于化学诱变剂是硫酸二乙酯。
4.根据权利要求1所述的耐冻酵母选育方法，其特征在于面团在-28℃冷冻8周，酵母存活率75％～90％；面团冷冻前后发酵力不低于60％为良好的菌株。
5.一种耐冻酵母的发酵生产工艺，其特征在于a.工业发酵用糖蜜加水稀释30-35Bix，离心澄清除胶质为流加糖蜜液，进入配料罐后加入营养辅料，一并溶于水中，在121℃灭菌20min，作为流加添加液备用；b.从4Be麦芽汁斜面培养基中接种耐冻酵母至含有灭菌12Bix离心澄清除胶质后的工业发酵用糖蜜的三角瓶中，180rpm/min，28℃培养24小时后，按5％液体接种量扩大转接到其它工业发酵用糖蜜三角瓶中，同样条件培养24小时，足够量的酵母被转接到贮有工业发酵用糖蜜和营养辅料的种子发酵罐中，培养18-22小时后，将酵母种子送到主发酵罐；c.主发酵糖浓度控制在6-10Brix，培养温度28-30℃，转速180-200rpm/min发酵24-30小时为发酵液，酵母菌体量达到以26％鲜酵母计的25-35g/L，残糖浓度控制在0.3％以下为种子；流加培养周期15-20小时，发酵液中后期采用氮饥饿、增加渗透压和提高温度的方法来刺激海藻糖的积累，酵母菌形体镜检大小均一，出芽率接近于零；d.酵母菌经高速离心分离、洗涤、真空吸滤脱水、酵母乳的乳化和成型干燥。
6.根据权利要求5所述耐冻酵母的发酵生产工艺，其特征在于工业发酵用糖蜜是甘蔗糖蜜，或甜菜原糖蜜。
7.根据权利要求5所述耐冻酵母的发酵生产工艺，其特征在于营养辅料是每生成100g鲜酵母中需添加尿素3-5g、磷酸二氢铵1-2g、硫酸镁0.5-1g、硫酸锌0.05-0.1g、生物素0.01-0.1g。
8.根据权利要求5所述耐冻酵母的发酵生产工艺，其特征在于增加渗透压是向发酵液中一次性加入Nacl20g/L。
9.根据权利要求5所述耐冻酵母的发酵生产工艺，其特征在于发酵液中可发酵性糖控制在0.1-0.2％、pII从开始4.0.到结束7.0、温度从开始28℃到结束36℃、酵母对糖得率45％以上、酵母收获量为130g/L以上、海藻糖含量15-22％、含氮量为6.5-7.0％培养所需要的氮源、磷源。
全文摘要
本发明公开了一种耐冻酵母选育方法及其发酵生产工艺，属于用微生物处理面团的制备方法，或面包酵母的繁殖。本发明将酵母菌株经理化诱变后，在5－10％葡萄糖溶液中培养和处理后，经耐冻酵母培养基培养，挑选菌株进行4Be麦芽汁斜面培养，获得选育的酵母菌株；含有该菌株的面团发酵后，交替进行冷冻、解冻，再从存活的菌株中分离、筛选，转接；转代菌株经活化，加入到5％葡萄糖浓度溶液中振荡摇匀分装，复经冷冻、解冻处理，将菌株用麦芽汁斜面保存即为耐冻酵母。这样，含耐冻酵母的面团在中央工厂一次完成，使面包加工成本大幅度降低；并实现原料供应、生产工艺和产品质量标准的统一，有助于面食品工业化安全监督体系的建立与健全。
文档编号C12N15/01GK1982436SQ200510122370
公开日2007年6月20日 申请日期2005年12月16日 优先权日2005年12月16日
发明者奚震, 张刚, 叶樱, 李楠, 孙凤雄 申请人:天津市工业微生物研究所