专利名称：建立ApoAI细胞靶标筛药系统及筛选升HDL药的方法
技术领域：
本发明涉及细胞靶标筛药系统，具体涉及一种建立ApoAI细胞靶标筛药系统及筛选升HDL药的方法。
动脉粥样硬化心脑血管疾病(如冠心病，中风)是中国和西方国家致死疾病中的主要杀手。其主要病因是高血清总胆固醇(Gordonet al.1981；Stamler et al.1986；Pooling Project Research Group1978；Anderson etal.1987)。流行病学调查揭示，血清总胆固醇每增加1％，冠心病危险因素增加2％(NCEPR 1991)。临床研究发现，降低血清胆固醇水平可以减少冠心病的发病率，阻滞动脉粥样硬化的发展(LPCP 1984；Frick 1987)。胆固醇不溶于水，不能在血液里转运。它们必需与脂蛋白结合才能在血液里运转。人血液里有四种脂蛋白负责胆固醇的运载。它们是低密度脂蛋白(LDL)，高密度脂蛋白(HDL)，极低密度脂蛋白(VLDL)和中间密度脂蛋白(IDL)。在正常人中，三分之二的总胆固醇由LDL运载。LDL携带内源或外源胆固醇，穿过血管壁，进入内皮下(subendothelium)。在内皮下，LDL胆固醇被氧化成氧化型LDL胆固醇，并通过清道夫受体被巨噬细胞以胆固醇酯的形式在细胞内积聚。大量胆固醇酯积聚在巨噬细胞内形成了泡沫细胞。积聚了大量胆固醇酯的泡沫细胞沉积在血管内皮下，形成了动脉粥样硬化斑块核心。资料表明，由LDL运载的胆固醇是导致动脉粥样硬化冠心病的主要根源(Goldstein1989；Vega 1986；Innerarity 1990；Rauth 1992)。所以LDL胆固醇被称为坏胆固醇。胆固醇引起的动脉粥样硬化不但是冠心病的主要根源，同时也是脑血管疾病，如脑血栓形成，中风的重要病因。此外人脑细胞内积聚的高胆固醇酯还可能和老年性痴呆症的形成有关。体内胆固醇来源有内源和外源。外源胆固醇来自于饮食，内源胆固醇是自体合成的结果。内源胆固醇合成亢进和家族性高胆固醇血症在西方国家较为普遍。这种疾病必须通过药物控制。在美国，40％以上的成年人的LDL胆固醇(坏胆固醇)含量超过正常水平。由于胆固醇在形成心脑血管疾病中的重要作用，近十多年来，美国及欧洲药厂都把其抗动脉粥样硬化药的研究和开发放到降低血清总胆固醇及LDL胆固醇上。这些药中疗效最显著的有Merck药厂的Zocor和Warner-Lambert/Parke-Davis去年上市的Lipitor。这些药的作用机理都是抑制人体胆固醇合成的关键酶HMG-COA-还原酶。虽然HMG-COA-还原酶抑制药能显著的降低血清总胆固醇，防止、阻止及降低动脉粥样硬化和冠心病发病，发展和死亡，但它只能减少内源性胆固醇合成及降低家族性高胆固醇血症引起的冠心病的发展或恶化。对于治疗外源性胆固醇增多引起的动脉粥样硬化，对于消除已进入巨噬细胞内的胆固醇和抑制由此导致的动脉粥样硬化形成，对于去除动脉粥样硬化斑块中积聚的胆固醇，使动脉粥样硬化血管回复正常，则作用不大或无能为力。换句话说，目前欧美市场流行的抑制内源性胆固醇生成药物不能从根本上治疗广义的动脉粥样硬化心脑血管疾病。
医学研究证明，巨噬细胞吞噬和积聚胆固醇，转换成泡沫细胞，沉积在血管壁内皮下是动脉粥样硬化斑块形成的基础。清除积聚在血管壁巨噬细胞/泡沫细胞内的胆固醇，将其转运到肝脏分解，是治疗单纯降血清胆固醇所不能达到的，根治动脉粥样硬化心脑血管疾病的最新的有效手段，清除巨噬细胞/泡沫细胞及动脉粥样硬化斑块内胆固醇的唯一的有效武器是HDL。近年来，西方心血管疾病研究人员及制药公司开始把研究方向放到新一类抗动脉粥样硬化药，升高密度脂蛋白(HDL)药上来。高密度脂蛋白(HDL)是一重要的胆固醇载体，它在运载胆固醇方面的功能与LDL截然相反。HDL可以刺激血管内皮下巨噬细胞内胆固醇酯水解，并将水解的非酯化胆固醇从巨噬细胞内转运至肝脏分解。更为重要的是，HDL能刺激沉积于血管壁和血管壁动脉粥样硬化斑块中巨噬细胞/泡沫细胞内胆固醇酯水解。非酯化胆固醇被HDL从泡沫细胞转运至肝脏分解(Alan et al.1996)。从而去除了动脉粥样硬化赖以形成的基础。所以HDL的重要功能被称为胆固醇逆相转运(ReverseCholesterol Transportation)。胆固醇逆相转运的结果是①抑制胆固醇酯在巨噬细胞内累积，阻止其转化为泡沫细胞，从而防止了动脉粥样硬化的形成；②因为HDL具有独特的转运动脉粥样硬化斑块内泡沫细胞里胆固醇至肝脏分解的作用，从而使动脉粥样硬化血管壁逐步回复正常。HDL的此二项功能一直是西方医学界在治疗动脉粥样硬化病中梦寐以求的效果。此外，HDL含有paraoxonase，可以抑制低密度脂蛋白氧化，防止LDL被巨噬细胞吞噬，产生泡沫细胞。HDL还可以刺激内皮细胞释放前列环素(PI)增加胆固醇酯水解和胆固醇转运出细胞。HDL的作用对象不分内源或外源胆固醇。基础及临床研究证实，每增加1mg/dl HDL胆固醇，冠心病死亡危险即下降2.5％(Alan et al.1996)。低血浆HDL是比高血浆胆固醇更重要的致动脉粥样硬化及冠心病的危险因子(Alan et al.1996)。
提高血浆HDL含量的机理是什么呢？简单地说是激活合成HDL活性成份的有关基因及HDL合成过程中有关酶的基因，使其表达和合成HDL，同时抑制不利HDL合成的因素的活性。与HDL合成及其转运胆固醇功能密切有关的活性成份和酶有载脂蛋白A-I(ApoAI)，卵磷脂乙酰胆固醇转移酶(LCAT)，脂蛋白脂酶(LPL)，胆固醇酯转移蛋白(CETP)，载脂蛋白C-III(apo C-III)。ApoAI的主要功能是①组成HDL最重要的结构成份(Chapman et al.1980；Sastry etal.1988)；②激活HDL合成关键酶，LCAT(Fielding et al.1972；Soutar et al.1975)；③促进细胞内胆固醇外流(Glomset et al.1968；Scampfer et al.1991)。从人ApoAI流动率和灵长类HDL水平的研究认为，ApoAI的合成速率决定了血浆HDL水平(Schaefer etal.1978，1982；Sorci-Thomas et al.1988)。LPL的功能是催化血浆VLDL和乳糜微粒脂解，产生胆固醇和磷脂供合成HDL的关键酶LCAT合成HDL的中心成份，胆固醇酯所用。apo C-III会抑制LPL活力，导致HDL合成原料馈乏。而CETP则催化胆固醇酯从HDL转移到VLDL，并将三酸甘油酯从VLDL转至HDL，使HDL分解，同时导致ApoAI在转移中流失。apo C-III和CETP是HDL合成中的二个负性因子，所以要提高血浆HDL含量，必需升高①ApoAI，②激活LPL和③LCAT，④减少apo C-III和⑤抑制CETP活力。以上五项因素中，最重要一项是ApoAI水平。
流行病和转基因动物实验研究结果证实，血浆ApoAI可以抑制动脉粥样硬化的形成和发展(Castelli et al.1977；Rutin et al.1991)。ApoAI含量降低，动脉粥样硬化发病率升高(Castelli etal.1986；Rutin et al.1991)。升高ApoAI本身对消除动脉粥样硬化斑块，治疗动脉粥样硬化作用显著。所以ApoAI成为一个重要的筛药靶标。
ApoAI细胞靶标筛药系统是筛选新一代抗动脉粥样硬化心脑血管病升高密度脂蛋白(HDL)药中的核心技术工具，本发明的目的在于建立细胞靶标技术及靶标筛药方法。本发明建立的ApoAI细胞靶标是运用分子克隆技术，将控制动脉粥样硬化关键蛋白ApoAI的Promoter基因部分克隆进肝细胞株，获得在基因水平上表达的筛药细胞靶标。通过测定被筛选化合物激发ApoAI Promoter的程度来筛选新一代抗动脉粥样硬化升HDL药。
本发明提供了建立ApoAI Promoter细胞靶标的技术方案，该方案包括下列步骤I人基因组DNA的提取1)取抗凝血2ml，用2倍的生理盐水稀释混匀。
2)在离心管中加入2ml淋巴细胞分离液，在液面上轻轻加入4ml已稀释混匀的血液，室温下离心200g 20分钟，(注此时红细胞沉于管底，白色的淋巴细胞及其它有核细胞分布于上层血浆与下层淋巴细胞分离液的界面)。
3)吸弃上清，小心吸出中间有核细胞层。转入1.5ml Eppendorf管中，用生理盐水洗涤1次。
4)将细胞悬浮于TE缓冲液中，加SDS至终浓度为0.5％，蛋白酶K至终浓度为200μg/ml，50℃水浴3小时，其间振摇2-3次。
5)加入等体积平衡酚混匀，室温离心，10000g离心5分钟。
6)小心吸取上清，并转移至另一Eppendorf管，勿将蛋白层吸出。
7)加入等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)，混匀，离心10000g，5分钟。
8)转移上清至另一Eppendorf管中，加入1/10体积乙酸钠(PH5.2)和2.5倍体积的无水乙醇，混匀，-80℃放置30分钟。
9)离心12000g，15分钟，弃上清，加1ml冷75％乙醇轻洗管壁，10000g5分钟，弃尽上清，37℃静置干燥10分钟。
10)用100μlTE(pH8.0)溶解Genomic DNA。II以人基因组DNA为模板用PCR技术复制获取Apo AI Promoter DNA序列引物上游5’GACTCGAGAGGGGAAGGGGATGAGTG 3’下游5’ATAGATCTCCTGAACCTTGAGCTGGG 3’上下游引物各1μl 浓度为10μmol/L10×PCR反应缓冲液 5μldNTP(2mmol/L) 5μl 浓度为200μmol/LGenomicDNA模板 1μl 总量1μg去离子水 补至50μl混匀后离心15S，加石蜡油30μl于反应表面。97℃变性10分钟，冰浴冷却，加Taq酶(5U/μl)1μl，短暂离心。开始循环变性95℃ 30s退火60℃ 45s延伸72℃ 90s重复30循环。末次循环后，在72℃再延伸10分钟。III Agarose(1％)胶电泳鉴定PCR产物Agarose DNA快速回收(Gibco BRL，Concert Gel Extraction System)准备a.50℃水浴装置b.预热TE缓冲液至65-70℃1)切胶以洁净、锋利刀片切下含DNA片段的Agarose胶，修净边缘。
2)称重胶浓度小于2％，重量小于400mg者，装入1.5ml Eppendorf管中，每10mg胶加入30ml L1(Gel.Solubilization Buffer，见Gibco公司操作手册)。
3)溶解50℃水浴15分钟以上，每隔3分钟混匀一次，溶解后继续水浴5分钟。
4)装柱取一洗脱柱放入一2ml洗涤管中，把“3”中的混和物倒入洗脱柱中，离心12000g 1分钟，弃去洗涤管中液体。
5)洗涤(可选)洗脱柱放回2ml洗涤管中，加500μl L1，室温放置1分钟，离心12000g 1分钟，弃去洗涤管中液体。
6)洗涤洗脱柱放回2ml洗涤管中，加700μl L2(Wash Buffer，含乙醇，见Gibco公司操作手册)，室温放置5分钟，离心12000g 1分钟，弃去洗涤管中液体，重复离心1分钟，弃去洗涤管。7)DNA回收把洗脱柱放入一新的1.5ml Eppendorf管中，加入50μl预热的TE缓冲液，室温放置1分钟，离心12000g 2分钟，可得回收DNA。IV目的基因克隆入pGEM-T Easy Vectors(Promega公司)在一新的0.5ml Eppendorf管中先后加入如下试剂2×Rapid Ligation Buffer 5μlpGEM-T Vector(50ng) 1μlPCR product(胶回收产物) 3μlT4 DNA Ligase(3U/μl)1μl总体积10μl，4℃连接反应过夜。V细菌转化取JM109感受态菌200μl于Eppendorf管中加入上述已连接了目的基因的T载体(pGEM-T/apo)4μl，轻轻混匀，放置冰上30分钟。42℃水浴，热休克90秒，不摇动试管。管中加入无抗生素之LB培养基800μl，37℃温和摇动(150rpm)45分钟。5000g离心30秒，吸去上清约800μl，加入X-gal(5-bromo-4-chloro-3-indoly--D-galactopyranoside)IPTG(isopropyl-β-thiogalactopyranoside)(Promega)混匀后，用无菌涂布器将菌液全部铺于含氨苄青霉素的琼脂平板表面，37℃平放20分钟后倒置培养10-14小时(过夜)。次日挑取白色菌落接种于3ml含氨苄青霉素的液体LB培养基中，37℃摇床摇菌(180rpm)12小时。VI质粒提取取菌液，加入至Eppendorf管中，4℃4000g离心10分钟，弃上清，倒置试管，滴尽残存液体。加入100μl SI，漩涡振荡后完全重悬菌体。加入200μl SII，颠倒Eppendorf管4次。加入150μl SIII，12000g离心10分钟。附①SI50mm葡萄糖，25mmol Tris-Hcl(pH8.0)，10mmolEDTA(pH8.0)，配制200ml。
②SII0.2mol NaOH，1％SDS，配制100ml。
③SIII5mol乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml，双蒸去离子水28.5ml。将上清移到另一Eppendorf管中，加入等体积(450μl)苯酚氯仿异戊醇，混匀后，12000g离心10分钟。小心吸取上层水相，加入冰无水乙醇，混匀后-70℃放置30分钟，12000g离心15分钟。弃上清，加500μl冷75％乙醇轻洗管壁，10000g 5分钟，弃尽上清，37℃静置干燥10分钟。用50μlTER(PH7.4)(50μlTE pH8.0，RnaseA 10mg/ml，5μl)溶解质粒。VII酶切鉴定于一新Eppendorf(EP)管中依次加入以下反应物及试剂ddH2O 6μl10×缓冲液2μl限制酶(Bgl II及Xho I)各1μl质粒DNA10μl总体积20μl，离心混合。37℃水浴1-1.5小时。Agarose凝胶电泳，可见大小约380bp的目的基因片段。用前述快速胶回收法回收此片段。克隆目的基因的pGEM-T/apo质粒载体保存于甘油菌中，并送Genecore公司测序，结果与原设计DNA序列一致，结果如下5’GACTCGAGAGGGGAAGGGGATGAGTGCAGGGAACCCCGACCCCACCCGGGAGACCTGCAAGCCTGCAGACACTCCCCTCCCGCCCCCACTGAACCCTTGACCCCTGCCCTGCAGCCCCCGCAGCTTGCTGTTTGCCCACTCTATTTGCCCAGCCCCAGGGACAGAGCTGATCCTTGAACTCTTAAGTTCCACATTGCCAGGACCAGTGAGCAGCAACAGGGCCGGGGCTGGGCTTATCAGCCTCCCAGCCCAGACCCTGCCTGCAGACATAAATAGGCCCTGCAAGAGCTGGCTGCTTAGAG+1ACTGCGAGAAGGAGGTGCGTCCTGCTGCCTGCCCCGGTCACTCTGGCTCCCCAGCTCAAGGTTCAGGAGATCTAT 3’VIII抗抗菌素G418的neo基因和目的基因克隆进pGL3-B(pGL3-Basic DNA Vector)用于筛选稳定细胞株1)pGK neo+质粒以Xho I酶切可得到约2Kb的含neo的DNA片段。
2)将上述以XhoI酶切得到的neo基因片段克隆入PGL3-B的Sal I酶切位点中pGL3-B质粒以Sal I酶切。
PGL3-B 10μl，10×CIP(小牛肠硷性磷酸酶)Buffer 2μl，CIP1μl，去离子水补足20μl。37℃水浴30分钟。
DNA纯化以一次苯酚/氯仿(1∶1)抽提，一次氯仿抽提，乙醇沉淀，晾干。
3)neo片段与经Sal I酶切后线性化的PGL3-B连接在0.5ml Eppendorf管中目的基因片段0.5μg载体DNA(pGL3-B)0.1μg10×连接Buffer 2μlT4DNA连接酶1μl加去离子双蒸水补至20μl，16℃水浴12-16小时。
4)将重组质粒转化大肠杆菌。制备含neo抗性基因的pGL3-B质粒(pGL3-B/neo)。Apo AI promoter克隆入pGL3-B/neo质粒①将pGL3-B/neo以Xho I酶切反应(5-10μg DNA，10-20U酶，0.1-0.2μg电泳鉴定)；②再以Bgl II作一次酶切反应。
③Agarose电泳并回收酶切片段。
将双酶切后的pGL3-B/neo与*处回收得到的ApoAI promoterDNA作连接反应。酶切鉴定并获得克隆了ApoAI promoter DNA的pGL3-B/neo(Apo-pGL3-B/neo)。Apo-pGL3-B/neo质粒用于转染人HepG2细胞株(ATCC公司)IX PGL3B/Apo-neo质粒转染人HepG2细胞株(转染细胞用Gibco公司的LipofectAmine药盒)转基因前试剂准备工作1)备好无菌的Eppendof管(1.5m)。
2)溶液A将2μg DNA质粒加入100μl不含有血清和抗菌素的MEM培养基。
3)溶液B将12μl lipofectamine加入100μl不含血清和抗生素的MEM培养基。
4)A液和B液小心混合，于室温搁置40分钟。混合物可能会形成雾絮状，这并不妨碍细胞转染。X转基因操作步骤1)转染细胞前一天，HepG2细胞以3×105数进6孔培养板中的每一孔。加入1ml含10％胎牛血清的MEM完全培养液。
2)转染时，先用2ml MEM洗HepG2细胞一次。
3)加0.8ml MEM培养液入A+B混合液，加以混合，将混合液加入细胞上。此时的混合液不包含胎牛血清。
4)细胞与质粒在培养箱中于5％CO2和37℃条件下转染24小时。
5)培养24小时后，将培养液换成正常培养液，即包含1×胎牛血清和抗生素(终浓度青霉素100u/ml，链霉素100μg/ml)的培养液，另培养48小时，形成瞬转染细胞。
6)将瞬转细胞以2000细胞/100mm平皿的细胞分布密度分孔进培养皿，在含800μg/ml G418的MEM培养液(培养液成分同于以上第5步)中于37℃，5％CO2培养箱中培养，进行单克隆细胞株筛选。每二天换液一次。
7)三周后，可见细胞集落形成，用10μl大小的tip挑取单个集落入24孔板扩增培养。
8)待单克隆细胞长满培养板孔后，一部分细胞继续传代培养，一部分细胞测定luciferase表达，luciferase表达达1000/1×105cell以上者则留为后选单克隆。
9)获得的后选单克隆细胞经10代以上传代，luciferase报告基因表达无降低者，即为稳定转染细胞株。XI稳定转基因细胞株luciferase报告基因测定方法(所有检测试剂购之于Promega公司)A配制Luciferase测定试剂将Luciferase Assay Substrate冻干粉全部溶于10ml LuciferaseAssay Buffer II，混匀，即可。LAR反复冻融将降低效价，-70℃可保存一年。故应分装冻存。每次反应需100μl。使用前必须置室温平衡。
B 配制PBS缓冲液C 配制1×CCLR(Cell Culture Lysis Reagent)以4倍体积之双蒸水稀释5×CCLR即得1×CCLR。使用前必须置室温平衡。操作步骤1)吸去细胞培养液，用PBS Buffer(1ml)洗2遍，注意不要移动细胞。
2)加入1×CCLR覆盖细胞。
多孔板 1×PLB6孔板 500μl12孔板 250μl24孔板 100μl48孔板 65μl96孔板 20μl3)充分吹打细胞，将细胞碎片和液体转入离心管，12,000×g离心5秒，将上清转入新管中。如时间来不及，需将之保存于-70℃。
4)将20μl细胞抽提液与100μl的Luciferase Assay Reagent(室温平衡)用枪头混匀。
5)设置Luminometer(型号Turner Designs-2010，Turner DesignsInstrument公司，Sunnyvale，CA)STD模式，2秒delay，10秒检测。
6)将管子放入Luminometer中，按Go开始检测(检测需在10秒内进行，时间过长，光密度会衰变)。
本发明的另一目的提供了应用稳定转染的ApoAI Promoter细胞株筛选抗动脉粥样硬化升HDL药的方法，该方法包括下列步骤1)用稳定转染细胞株取1×104细胞接种于48孔培养板中，每孔含0.5ml成分同于瞬转染细胞培养条件培养24小时。
2)加被筛选物质(不同来源的化合物或混合物)于细胞培养液内和细胞培养24小时。
3)倾去培养液，以PBS缓冲液洗涤细胞二次，待测定。以下测定方法同于转基因细胞Luciferase报告基因测定法一节。
4)中选化合物的选择通过与40μg/ml Gemfibrozil培养后激发的luciferase表达进行比较来达到。被筛化合物其luciferase表达超过Gemfibrozil激发表达一倍以上者则为中选化合物。
图1、发明者设计的ApoAI Promoter DNA序列。
图2、文献报道的ApoAI Promoter DNA序列。
图3、PGL3-Basic Vector质粒图。
图4、克隆了neo基因的PGL3-Basic Vector质粒图。
图5、克隆了neo和ApoAI Promoter的PGL3-Basic Vector质粒图。
图6、含有Renilla Luciferase基因的PRL-TL Vector质粒图。
图7、建立ApoAI Promoter细胞靶标及测定Luciferase路线图。
图8、用PCR方法复制获得的ApoAI Promoter琼脂糖电泳鉴定图谱。
图谱左列为DNA长度标记，右列为ApoAI Promoter电泳条带。
该条带大小为380bp，同于我们设计的DNA长度。
图9、ApoAI Promoter和neo基因共同克隆进PGL3后琼脂糖电泳鉴定图谱。左起第一列为DNA标记，第二列条带显示neo基因(1.5kb)，第三列条带显示同一质粒中的neo基因(1.5kb)和ApoAI Promoter(380bp)。
图10、PGL3/Apo-neo载体稳定转染HepG2细胞株和PGL3/neo载体luciferase表达活性。柱1显示PGL3/Apo-neo载体稳定性转染HepG2细胞luciferase表达活性。柱2显示不含ApoAI，只含neo的PGL3空质粒转染细胞luciferase表达活性。柱3显示没有转染质粒的HepG2细胞luciferase表达活性。
图11、已获得表达最高的HepG2稳定转染细胞株经10代遗传后luciferase表达活性。
图12、ApoAI已知激活剂Gemfibrozil刺激ApoAI Promoter稳定性转染HepG2细胞(黑实心圆圈代表)和未转染质粒的HepG2细胞luciferase表达的活性。
图13、Gemfibrozil浓度和细胞培养时间对细胞靶标luciferase表达的影响。
图14、Fenofibrate刺激稳定性转染靶细胞表达ApoAI Promoter。
实例题目Fenofibrate刺激稳定性转染靶细胞ApoAI Promoter的表达原理Fenofibrate是降血浆甘油三脂药，和gemfibrozil同属fibrate类药。两者都是PPARγ激发剂。ApoAI Promoter是PPARγ的靶基因，已知gemfibrozil可以刺激ApoAI Promoter表达，我们推测同属fibraete也可以刺激ApoAI Promoter表达。本实验将不同浓度的Fenofibrate和稳定转染的ApoAI靶细胞共同培养，观测其对ApoAI Promoter表达的影响。方法(1)1×104细胞接种于48孔培养板中，每孔含0.5ml含10％胎牛血清和抗生素(终浓度青霉素100μ/ml，链霉素100μg/ml)的MEM完全培养液，加溶解于DMSO，浓度为10，40，70，100μg的Fenofibrate于细胞培养液内，和细胞在培养箱中于5％CO2和37℃条件下培养24小时。
(2)倾去培养液，以PBS缓冲液洗涤细胞二次，待测定。
(3)加入65μl 1×CCLR覆盖每孔细胞。
(4)充分吹打细胞，将细胞碎片和液体转入离心管，12000×g离心5秒，将上清转入新管中。如时间来不及，需将之保存于-70℃。
(5)将20μl细胞抽提液与100μl的Luciferase Assay Reagent(室温平衡)用枪头混匀。
(6)设置Luminometer(型号Turner Designs-2010，Turner DesignsInstrument公司，Sunnyvale，CA)STD模式，2秒delay，10秒检测。
(7)将管子放入Luminometer中，按Go开始检测(检测需在10秒内进行，时间过长，光密度会衰变)。结果图14显示，Fenofibrate在10μg/ml可以显著的(P＜0.05，n＝3)升高ApoAI Promoter表达，其表达强度随Fenofibrate浓度而变化。此实验结果证实了我们的推测，即Fenofibrate可以刺激ApoAIPromoter表达。
文献资料显示，目前研究人员还没有用ApoAI Promoter细胞靶标来筛选升HDL药。本发明在国际上首次将稳定转染的细胞株用于此用途。本发明的细胞靶标可用于筛选合成的单个或复合化合物，筛选植物提取的单个化合物或混合物，筛选各种微生物代谢产物中的升高ApoAI的物质从而达到升HDL之目的。
权利要求
1.一种建立ApoAI细胞靶标筛药系统的技术分案，其特征在于I人基因组DNA的提取1)取抗凝血2ml，用2倍的生理盐水稀释混匀，2)在离心管中加入2ml淋巴细胞分离液，在液面上轻轻加入4ml已稀释混匀的血液，室温下离心200g 20分钟，(注此时红细胞沉于管底，白色的淋巴细胞及其它有核细胞分布于上层血浆与下层淋巴细胞分离液的界面)，3)吸弃上清，小心吸出中间有核细胞层，转入1.5ml Eppendorf管中，用生理盐水洗涤1次，4)将细胞悬浮于TE缓冲液中，加SDS至终浓度为0.5％，蛋白酶K至终浓度为200μg/ml，50℃水浴3小时，其间振摇2-3次，5)加入等体积平衡酚混匀，室温离心，10000g离心5分钟，6)小心吸取上清，并转移至另一Eppendorf管，勿将蛋白层吸出，7)加入等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)，混匀，离心10000g，5分钟，8)转移上清至另一Eppendorf管中，加入1/10体积乙酸钠(PH5.2)和2.5倍体积的无水乙醇，混匀，-80℃放置30分钟，9)离心12000g，15分钟，弃上清，加1ml冷75％乙醇轻洗管壁，10000g5分钟，弃尽上清，37℃静置干燥10分钟，10)用100μlTE(pH8.0)溶解Genomic DNA；II以人基因组DNA为模板用PCR技术复制获取Apo AI Promoter DNA序列引物上游5’GACTCGAGAGGGGAAGGGGATGAGTG 3’下游5’ATAGATCTCCTGAACCTTGAGCTGGG 3’上下游引物各 1μl浓度为10μmol/L10×PCR反应缓冲液5μldNTP(2mmol/L) 5μl浓度为200μmol/LGenomicDNA模板 1μl总量1μg去离子水 补至50μl混匀后离心15S，加石蜡油30μl于反应表面，97℃变性10分钟，冰浴冷却，加Taq酶(5U/μl)1μl，短暂离心，开始循环变性95℃ 30s退火60℃ 45s延伸72℃ 90s重复30循环，末次循环后，在72℃再延伸10分钟；III Agarose(1％)胶电泳鉴定PCR产物Agarose DNA快速回收(Gibco BRL，Concert Gel Extraction System)准备a.50℃水浴装置b.预热TE缓冲液至65-70℃1)切胶以洁净、锋利刀片切下含DNA片段的Agarose胶，修净边缘，2)称重胶浓度小于2％，重量小于400mg者，装入1.5ml Eppendorf管中，每10mg胶加入30ml L1(Gel.Solubilization Buffer，见Gibco公司操作手册)，3)溶解50℃水浴15分钟以上，每隔3分钟混匀一次，溶解后继续水浴5分钟，4)装柱取一洗脱柱放入一2ml洗涤管中，把“3”中的混和物倒入洗脱柱中，离心12000g 1分钟，弃去洗涤管中液体，5)洗涤(可选)洗脱柱放回2ml洗涤管中，加500μl L1，室温放置1分钟，离心12000g 1分钟，弃去洗涤管中液体，6)洗涤洗脱柱放回2ml洗涤管中，加700μl L2(Wash Buffer，含乙醇，见Gibco公司操作手册)，室温放置5分钟，离心12000g 1分钟，弃去洗涤管中液体，重复离心1分钟，弃去洗涤管，7)DNA回收把洗脱柱放入一新的1.5mlEppendorf管中，加入50μl预热的TE缓冲液，室温放置1分钟，离心12000g 2分钟，可得回收DNA；IV目的基因克隆入pGEM-T Easy Vectors(Promega公司)在一新的0.5ml Eppendorf管中先后加入如下试剂2×Rapid Ligation Buffer 5μlpGEM-T Vector(50ng)1μlPCR product(胶回收产物)3μlT4 DNA Ligase(3 U/μl) 1μl总体积10μl，4℃连接反应过夜；V细菌转化取JM109感受态菌200μl于Eppendorf管中加入上述已连接了目的基因的T载体(pGEM-T/apo)4μl，轻轻混匀，放置冰上30分钟，42℃水浴，热休克90秒，不摇动试管，管中加入无抗生素之LB培养基800μl，37℃温和摇动(150rpm)45分钟，5000g离心30秒，吸去上清约800μl，加入X-gal(5-bromo-4-chloro-3-indoly--D-galactopyranoside)IPTG(isopropyl-β-thiogalactopyranoside)(Promega)混匀后，用无菌涂布器将菌液全部铺于含氨苄青霉素的琼脂平板表面，37℃平放20分钟后倒置培养10-14小时(过夜)，次日挑取白色菌落接种于3ml含氨苄青霉素的液体LB培养基中，37℃摇床摇菌(180rpm)12小时；VI质粒提取取菌液，加入至Eppendorf管中，4℃ 4000g离心10分钟，弃上清，倒置试管，滴尽残存液体，加入100μl SI，漩涡振荡后完全重悬菌体，加入200μl SII，颠倒Eppendorf管4次，加入150μl SIII，12000g离心10分钟，附①SI50mm葡萄糖，25mmol Tris-Hcl(pH8.0)，10mmolEDTA(pH8.0)，配制200ml，②SII0.2mol NaOH，1％SDS，配制100ml，③SIII5mol乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml，双蒸去离子水28.5ml，将上清移到另一Eppendorf管中，加入等体积(450μl)苯酚氯仿异戊醇，混匀后，12000g离心10分钟，小心吸取上层水相，加入冰无水乙醇，混匀后-70℃放置30分钟，12000g离心15分钟，弃上清，加500μl冷75％乙醇轻洗管壁，10000g 5分钟，弃尽上清，37℃静置干燥10分钟，用50μlTER(PH7.4)(50μlTE pH8.0，RnaseA 10mg/ml，5μl)溶解质粒；VII酶切鉴定于一新Eppendorf(EP)管中依次加入以下反应物及试剂ddH2O 6μl10×缓冲液2μl限制酶(Bgl II及Xho I)各1μl质粒DNA 10μl总体积20μl，离心混合，37℃水浴1-1.5小时，Agarose凝胶电泳，可见大小约380bp的目的基因片段。用前述快速胶回收法回收此片段，克隆目的基因的pGEM-T/apo质粒载体保存于甘油菌中，并送Genecore公司测序，结果与原设计DNA序列一致，结果如下5’GACTCGAGAGGGGAAGGGGATGAGTGCAGGGAACCCCGACCCCACCCGGGAGACCTGCAAGCCTGCAGACACTCCCCTCCCGCCCCCACTGAACCCTTGACCCCTGCCCTGCAGCCCCCGCAGCTTGCTGTTTGCCCACTCTATTTGCCCAGCCCCAGGGACAGAGCTGATCCTTGAACTCTTAAGTTCCACATTGCCAGGACCAGTGAGCAGCAACAGGGCCGGGGCTGGGCTTATCAGCCTCCCAGCCCAGACCCTGCCTGCAGACATAAATAGGCCCTGCAAGAGCTGGCTGCTTAGAG+1ACTGCGAGAAGGAGGTGCGTCCTGCTGCCTGCCCCGGTCACTCTGGCTCCCCAGCTCAAGGTTCAGGAGATCTAT 3’VIII抗抗菌素G418的neo基因和目的基因克隆进pGL3-B(pGL3-Basic DNA Vector)用于筛选稳定细胞株1)pGK neo+质粒以Xho I酶切可得到约2Kb的含neo的DNA片段，2)将上述以XhoI酶切得到的neo基因片段克隆入PGL3-B的Sal I酶切位点中pGL3-B质粒以Sal I酶切，PGL3-B 10μl，10×CIP(小牛肠硷性磷酸酶)Buffer 2μl，CIP1μl，去离子水补足20μl，37℃水浴30分钟，DNA纯化以一次苯酚/氯仿(1∶1)抽提，一次氯仿抽提，乙醇沉淀，晾干，3)neo片段与经Sal I酶切后线性化的PGL3-B连接在0.5ml Eppendorf管中目的基因片段0.5μg载体DNA(pGL3-B)0.1μg10×连接Buffer 2μlT4DNA连接酶1μl加去离子双蒸水补至20μl，16℃水浴12-16小时，4)将重组质粒转化大肠杆菌。制备含neo抗性基因的pGL3-B质粒(pGL3-B/neo)，Apo AI promoter克隆入pGL3-B/neo质粒①将pGL3-B/neo以Xho I酶切反应(5-10μg DNA，10-20U酶，0.1-0.2μg电泳鉴定)；②再以Bgl II作一次酶切反应，③Agarose电泳并回收酶切片段，将双酶切后的pGL3-B/neo与*处回收得到的ApoAI promoterDNA作连接反应。酶切鉴定并获得克隆了ApoAI promoter DNA的pGL3-B/neo(Apo-pGL3-B/neo)，Apo-pGL3-B/neo质粒用于转染人HepG2细胞株(ATCC公司)IX PGL3B/Apo-neo质粒转染人HepG2细胞株(转染细胞用Gibco公司的LipofectAmine药盒)转基因前试剂准备工作1)备好无菌的Eppendorf管(1.5m)，2)溶液A将2μg DNA质粒加入100μl不含有血清和抗菌素的MEM培养基，3)溶液B将12μl lipofectamine加入100μl不含血清和抗生素的MEM培养基，4)A液和B液小心混合，于室温搁置40分钟。混合物可能会形成雾絮状，这并不妨碍细胞转染；X转基因操作步骤1)转染细胞前一天，HepG2细胞以3×105数进6孔培养板中的每一孔，加入1ml含10％胎牛血清的MEM完全培养液。2)转染时，先用2ml MEM洗HepG2细胞一次。3)加0.8ml MEM培养液入A+B混合液，加以混合，将混合液加入细胞上，此时的混合液不包含胎牛血清，4)细胞与质粒在培养箱中于5％CO2和37℃条件下转染24小时，5)培养24小时后，将培养液换成正常培养液，即包含1×胎牛血清和抗生素(终浓度青霉素100u/ml，链霉素100μg/ml)的培养液，另培养48小时，形成瞬转染细胞，6)将瞬转细胞以2000细胞/100m平皿的细胞分布密度分孔进培养皿，在含800μg/ml G418的MEM培养液(培养液成分同于以上第5步)中于37℃，5％CO2培养箱中培养，进行单克隆细胞株筛选，每二天换液一次，7)三周后，可见细胞集落形成，用10μl大小的tip挑取单个集落入24孔板扩增培养，8)待单克隆细胞长满培养板孔后，一部分细胞继续传代培养，一部分细胞测定luciferase表达，luciferase表达达1000/1×105cell以上者则留为后选单克隆，9)获得的后选单克隆细胞经10代以上传代，luciferase报告基因表达无降低者，即为稳定转染细胞株；XI稳定转基因细胞株luciferase报告基因测定方法(所有检测试剂购之于Promega公司)A配制Luciferase测定试剂将Luciferase Assay Substrate冻干粉全部溶于10ml LuciferaseAssay Buffer II，混匀，即可。LAR反复冻融将降低效价，-70℃可保存一年，故应分装冻存，每次反应需100μl，使用前必须置室温平衡，B配制PBS缓冲液C 配制1×CCLR(Cell Culture Lysis Reagent)以4倍体积之双蒸水稀释5×CCLR即得1×CCLR，使用前必须置室温平衡，操作步骤1)吸去细胞培养液，用PBS Buffer(1ml)洗2遍，注意不要移动细胞，2)加入1×CCLR覆盖细胞，多孔板 1×PLB6孔板 500μl12孔板 250μl24孔板 100μl48孔板 65μl96孔板 20μl3)充分吹打细胞，将细胞碎片和液体转入离心管，12,000×g离心5秒，将上清转入新管中，如时间来不及，需将之保存于-70℃，4)将20μl细胞抽提液与100μl的Luciferase Assay Reagent(室温平衡)用枪头混匀，5)设置Luminometer(型号Turner Designs-2010，Turner DesignsInstrument公司，Sunnyvale，CA)STD模式，2秒delay，10秒检测，6)将管子放入Luminometer中，按Go开始检测(检测需在10秒内进行，时间过长，光密度会衰变)。
2.一种应用如权利要求1所述建立的ApoAI细胞株筛选抗动脉粥样硬化升HDL药的方法，其特征在于1)用稳定转染细胞株取1×104细胞接种于48孔培养板中，每孔含0.5ml成分同于瞬转染细胞培养条件培养24小时；2)加被筛选物质(不同来源的化合物或混合物)于细胞培养液内和细胞培养24小时；3)倾去培养液，以PBS缓冲液洗涤细胞二次，待测定。以下测定方法同于转基因细胞Luciferase报告基因测定法一节；4)中选化合物的选择通过与40μg/ml Gemfibrozil培养后激发的luciferase表达进行比较来达到。被筛化合物其luciferase表达超过Gemfibrozil激发表达一倍以上者则为中选化合物。
全文摘要
本发明公开了建立ApoAI细胞靶标筛药系统及筛选升HDL药的方法。本发明建立的ApoAI细胞靶标是运用分子克隆技术,将控制动脉粥样硬化关键蛋白ApoAI的Promoter基因部分克隆进肝细胞株,获得在基因水平上表达的筛药细胞靶标。通过测定被筛选化合物激发ApoAIPromoter的程度来筛选抗动脉粥样硬化升HDL药。
文档编号C12Q1/68GK1350061SQ0012573
公开日2002年5月22日 申请日期2000年10月20日 优先权日2000年10月20日
发明者龚邦强, 陆浩钧 申请人:上海医药(集团)总公司