专利名称：一种发酵法生产阿维菌素的新工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种发酵法生产阿维菌素的新工艺。
阿维菌素(avermectin，AVM)是一种由链霉菌发酵获得的大环内酯类抗生素，它对农业和林业上十多个目的几百种害虫具有良好的杀灭作用，杀虫活性比一般化学农药高出几到几十倍，田间使用剂量仅为每亩0．015到1．5克。该抗生素对大多数种类的有益昆虫安全，在植物中残留时间很短，并且在土壤中很快被微生物分解为无毒物质。由于阿维菌素的这些突出的优点，其被公认为是一种最为安全有效的微生物来源的杀虫剂。
然而，阿维菌素产生菌是在菌细胞生长到一定阶段后才大量合成阿维菌素，而且合成出来的该物质几乎全部积累在菌丝细胞中，不释放到细胞外，回收该物质必须先以板框压滤等方法将成熟的菌丝体收集起来，然后用大量的有机溶剂(如丙酮、乙醇等)抽提。大量地使用有机溶剂不仅增加了生产成本，而且对生产工人的身体健康、劳动安全和环境保护带来不利的影响。
本发明的目的是提供一种有机溶剂用量少生产成本低的发酵法生产阿维菌素的新工艺。
本发明发明人经过深入研究，找到了一些产生阿维菌素的分泌型菌株，从而在发酵过程中使用能够产生阿维菌素并且将阿维菌素分泌到菌丝细胞外的微生物，并借此完成了本发明。
以上所说的微生物属于阿弗麦链霉菌(又称除虫链霉菌)(Streptomyces avermitilis)，是从阿弗麦链霉菌A-9菌株出发，经紫外线和亚硝基胍诱变育种获得的，具体过程如下1、A-9菌株斜面菌种准备配制麦芽粉淀粉无机盐琼脂培养基(配方为大麦芽粉5克、淀粉18克、酵母浸出物2克、硝酸钾1克、磷酸氢二钾0．5克、硫酸镁0．5克、氯化钴0．005克、水1000ml、琼脂20-25g，pH 7．0-7．2)，分装试管和三角瓶。121℃蒸汽灭菌30分钟，待温度降至60℃左右时摆斜面，28-30℃温箱中预培养2-3天，然后划线接种A-9菌株孢子，27-28℃恒温培养5-7天。
2、诱变与筛选2．1紫外线诱变与筛选2．1．1单孢子悬液制备将已经变灰的A-9菌株斜面菌种放入4℃冰箱中，冷藏3-5天后取出，用灭过菌的生理盐水10-12ml将孢子小心地洗下来，转移到一个装有30-40粒玻璃珠的250ml无菌三角瓶中，塞好棉塞后在摇床上振摇30分钟，使孢子充分打散。再加入约20ml无菌生理盐水，混匀。然后以专用的单孢子过滤器过滤得到单孢子悬液。离心收集单孢子，再悬浮于上述无菌生理盐水中，调整孢子浓度3×107个／ml。
2．1．2紫外线诱变处理将上述单孢子悬液分装于5套无菌的小培养皿中(内有磁力搅拌棒)，每皿4-5ml。另外吸取0．5ml菌液稀释后测定活菌数，作为对照。紫外灯功率为15w，菌液距灯管28厘米，分别照射20秒、40秒、60秒、90秒和120秒、全部操作在暗室内红光下进行。照射时开动电磁搅拌器。
2．13涂皿培养将上述5种UV处理后的菌液分别稀释到10-3、10-4、10-5、10-6四种浓度，每种浓度涂布5套麦芽粉无机盐琼脂平板(配方见前面所述，每套平板内加入1ml菌液)。涂布后的平板写好标签，用多层灭过菌的黑布包好，并装入密封铝盒内，于27-28℃温箱中培养7天左右。
2．1．4杀菌率测定按常规方法平行地测定对照和经过紫外线处理的各处菌液中的活孢子数，度计算不同照射剂量紫外线处理的杀菌率。
2．1．5挑单菌落与摇瓶筛选待单菌落正面变灰后，在杀菌率稍低的平板上挑选正面灰色较深、背面深褐、孢子丰满的馒头形菌落，编好号后再转接斜面培养基。经27-28℃，5-7天恒温培养至斜面菌种长好后分别进行摇瓶发酵。以HPLC法测定各菌株发酵液中阿维菌素的效价和分泌到发酵上清液中的阿维菌素的比例。经过初筛、复筛和终筛，最后选定UV-F-106菌株进行亚硝基胍(NTG)诱变育种。
2．2亚硝基胍(NTG)诱变与筛选2．2．1单孢子悬液制备用经过过滤除菌的0．1mol／L Tris与0．1mol／L顺丁烯二酸等量混合之pH为8．0的缓冲液洗下UV-F-106菌株孢子，并将此孢子悬液倒入无菌三角瓶(内装玻璃珠30-40粒)中。在摇床上振摇30分钟左右，通过无菌的单孢子过滤器过滤获得单孢子悬液。离心收集单孢子，重悬浮于上述pH8．0缓冲液中，调整孢了浓度至108个／ml。
2．2．2亚硝基胍(NTG)诱变处理将上述单孢子悬液加入亚硝基胍溶液中，使亚硝基胍的最终浓度为1．0mg／ml。室温下诱变处理60分钟。马上离心除去亚硝基胍，再用无菌水反复离心洗涤孢子3次后离心收集备用。
2．2．3分离和筛选制备麦芽淀粉无机盐琼脂平板。按常规稀释平板法分离单菌落。挑选正面灰色，背面褐色较深，孢子丰满的馒头形菌落转接斜面。待斜面菌种长好后进行摇瓶筛选，挑阿维菌素发酵效价较高并且阿维素分泌率也较高的菌株制成冻干管保藏。
由以上方法得到的阿维菌素总产量和分泌率均高的5株阿弗麦链霉菌为阿弗麦链霉菌LAF-19、LAF-28、LAF-108、LAF-235和LAF-307。
这些菌株能够将其所合成的阿维菌素分泌到细胞外，分泌出来的阿维菌素以一种油(蜡)状物的形式悬浮在发酵液的上层，在油(蜡)状物中阿维菌素的含量约为20％，这非常有利于降低阿维菌素的提炼成本。
阿弗麦链霉菌LAF-108已于2000年9月28日在国家知识产权局指定的保藏单位中国典型培养物保藏中心(武汉)保藏，保藏号为CCTCCNOM200028。
使用本发明的菌株进行分批、半连续或连续发酵可以采用生产阿维菌素的常规培养基，培养和发酵条件可以是常规培养和发酵条件。在现有分批发酵工艺设备的基础上实现本发明的分批、半连续或连续发酵只需对设备进行局部改造。
在使用以上菌株进行的分批发酵中，发酵结束后将上层油(蜡)状物取出，再用少量有机溶剂抽提即可获得高纯度的产品。其中有机溶剂的使用量仅约为现行分批发酵工艺的20-30％。
以上菌株还适合进行半连续或连续发酵，即可以实现不断流加营养物和不断排放油(蜡)状物的连续生产生产方式，以及实现或间歇流加营养物和或间歇排放油(蜡)状物的半连续生产方式。半连续或连续发酵方法已经在一些发酵产品的生产中使用，但还没有在阿维菌素生产中使用的报道，在是因为目前普遍采用的产生菌都是非分泌型的。采用本发明的菌株可以减少传统的分批发酵工艺中的繁杂的准备工作，延长阿维菌素的合成时间，减少能耗，提高生产效率，降低提炼成本。
使用本发明的菌株进行分批、半连续或连续发酵可以大幅度地降低有机溶剂的用量，这样不仅可以降低提炼成本，而且还有利于生产工人的身体健康、劳动安全和环境保护。
可以采用以下过程进行本发明菌株的分批、半连续或连续发酵。
分批发酵在发酵罐圆柱体侧面高约65-75％的地方开一排放孔，并安装相应的管道阀门。保证分泌出的油(蜡)状物排放方便和管道阀门灭菌方便。
按照前面所述的麦芽粉淀粉无机盐琼脂斜面培养基配方配制茄子瓶斜面。预培养后，若未发现杂菌生长则接种上述5株阿弗麦链霉菌中的任意一株。于27-29℃恒温箱中培养5-7天，待孢子成熟后收取，贮存于冰箱中供发酵用。
种子罐投料系数为60-70％。种子培养基成份为淀粉2-4％，豆饼粉0．5-1．0％，花生饼粉0．6-1．2％，活性干酵母粉0．3-0．7％，玉米浆0．3-0．5％，氯化钴0．0003-0．0015％，消泡剂0．02-0．04％，消毒前用氢氧化钠溶液调节pH至7．1-7．3。蒸汽灭菌，待培养基冷却至28℃左右后接种上述杀虫链霉菌的斜面孢子悬浮液。接种量约为每100L种子培养液1个茄子瓶斜面菌种，或者每3．25L培养基1支试管斜面菌种。在通气量1∶0．5-1．0，26-28℃，500-600转／分搅拌培养12-36小时，至外观较稠，镜检菌丝粗壮，多分枝情况下移种至发酵罐(此为2级发酵工艺，若发酵罐体积在50立方米以上，则应再增加一级种子培养(即三级发酵工艺)，培养基的成份和培养条件同上)。
发酵罐中发酵培养基的组成可以是淀粉5-8％，活性干酵母粉1．0-1．4％，玉米粉1％，氯化钾0．2-0．6％，磷酸二氢钾0．03-0．05％，氯化钴4-6μg／ml(终浓度)，硫酸镁0．03-0．05％，碳酸钙0．1-0．3％，耐高温淀粉酶0．004-0．006％，并预先加入含泡敌和植物油的混合消泡剂0．01-0．03％，用自来水定容至所需体积，消前pH6．8-7．0。经蒸汽灭菌后接种，接种量为1-5％，在罐温27-29℃，通气量1∶0．8-1．15，搅拌速度250-350转／分条件下培养9-10天，至pH上升至7．5以上，菌丝明显自溶，阿维菌素之B1a组分达到最高峰值时，打开上排放孔阀门，排出浮在发酵液上层的含素油(蜡)状物。使含素油(蜡)状物直接进入萃取罐，用2-4倍体积甲苯(或乙酸乙酯)萃取，活性碳脱色。脱色液再浓缩，最后加入晶种得到阿维菌素结晶。
半连续发酵同以上分批发酵一样，在发酵罐圆柱体侧面高约65-75％的地方开一排放孔，并安装相应的管道阀门。
斜面菌种准备和种子液制备的过程同以上分批发酵所述。半连续发酵的发酵培养基组成可以是淀粉5-8％，活性干酵母粉1．0-1．4％，玉米粉0．5-1．5％，豆饼粉0．5-2．0％，玉米浆0．2-1．0％，氯化钾0．2-0．6％，磷酸二氢钾0．03-0．06％，氯化钴4-6μg／ml(终浓度)，硫酸镁0．03-0．05％，碳酸钙0．2-0．3％，耐高温淀粉酶0．004-0．006％，并加入泡敌和植物油的混合消泡剂0．01-0．03％，用自来水定容至所需体积，消前pH 6．8-7．0。在130-150℃蒸汽联消灭菌后进入发酵罐接种。接种量为1-5％，在罐温27-28℃，通气量1∶1-1．1 5，搅拌速度250-350转／分条件下发酵培养。发酵进行至120小时后，每隔4-8小时检测一次发酵液中的总糖、还原糖、氨基态氮和阿维菌素B1a组分含量。当还原糖低于0．6％时开始补料。所补充的营养液配方为葡萄糖5-10％，植物油(优选的是豆油和花生油)1-10％，泡敌0．05-0．1％，氯化钴4-6μg／ml(终浓度)，氯化钾0．2-0．5％。从第9天开始每8-12小时取样镜检菌丝衰老与否。若有衰老现象则在流加营养液中增加适量的酵母浸提物，磷酸二氢钾和玉米浆。从第9天开始，每12小时取样一次检查发酵液中上清液部分阿维菌素B1a组分含量，若肉眼可见明显的油(蜡)状物漂浮，或HPLC法测得阿维菌素B1a组分含量高于100μg／ml，则短时间可停止搅拌和通气，同时打开上述上排放孔阀门，排出浮在发酵液上层的含素清液。每次压入的新鲜培养液的量相当于原发酵液体积的2％-8％。
应通过补料，补充新鲜培养基和适当调整发酵条件，尽量延长以上发酵过程，提高阿维菌素总产量。每次从上排放孔排出的含素液直接进入萃取罐，用2到4倍体积的甲苯或乙酸乙酯进行二级错流式萃取。弃去水相，浓缩甲苯或乙酸乙酯相，加入阿维菌素晶种，得到阿维菌素结晶。
经过若干天后，生产菌株均不可避免地出现衰老自溶，如果菌丝明显衰老自溶，则可放罐。连续发酵按照两个或多个等容积(或不同容积)发酵罐串联的连续发酵工艺进行设备改造。在发酵罐圆柱体侧面高约65-75％的地方开一排放孔，并安装相应的管道阀门。2号罐以后各罐上设补料口，在排放孔和补料孔安装相应的管道阀门。罐之间通过相应的管道阀门连接，具体连接方式见说明书附图1。
按照前面所述的麦芽粉淀粉无机盐琼脂斜面培养基配方配制茄子瓶或试管斜面。预培养3天后，若未发现杂菌生长则接种上述5株阿弗麦链霉菌中的任意一株。于27-29℃恒温箱中培养5-7天，待孢子成熟后收取，贮存于4℃冰箱中。上罐前用摇瓶方式进行考种，确证菌种无杂菌污染之后用于发酵生产。
液体种子的培养基配方同分批发酵所述，发酵培养基可以与半连续发酵培养基相同。发酵培养基通过连续灭菌系统灭菌，将温度降至30℃左右后贮存于发酵培养基贮罐内。
连续发酵工艺中采用的稀释度范围为0．01-0．03(l／h)，串联罐数为3或4个，容积比1∶1∶1(或1∶1∶1∶1)。温度1号罐和2号罐为27-28℃，3号罐(或3号罐和4号罐)为25-26℃；pH1号罐为6．4-6．8，2号罐(或2号罐和3号罐)为6．2-6．5，3号罐(或3号罐和4号罐)为6．5-6．8；风量1号罐为1∶1．0-1．5，2号罐(或2号罐和3号罐)为1∶1．0-1．2，3号罐(或3号罐和4号罐)为1∶0．8-1．0。1号罐搅拌常开，2和3号罐(或2和3和4号罐)搅拌时间视溶解氧情况常开或间歇开搅拌。其它发酵条件参照半连续发酵，在适当的时机向罐内流加饴糖、葡萄糖、植物油、酵母浸出物、玉米浆等养料。在最后一个罐，即3或4号罐排料，排料方式可以参照半连续发酵进行。也可以匀速地不间断地排除成熟的发酵液。
发将排出的含素发酵液直接进入萃取罐。萃取溶剂用甲苯或乙酸乙酯，萃取方式为二级错流萃取。通过碟片式离心机离心分离出有机溶剂相，弃去水相和固形沉淀。活性碳脱色，减压浓缩(温度在50-65℃之间)含阿维菌素的有机溶剂相，加入阿维菌素晶种进行结晶，即可获得阿维菌素晶体。
连续发酵若干天后，生产菌的细胞普遍出现老化现象后的处理方法同半连续发酵。
以下是本发明的实施例，这些实施例用来说明本发明，但不构成对本发明的任何限制。实施例1使用阿弗麦链霉菌LAF-108菌株按分批发酵法生产阿维菌素按照前面所述的麦芽粉淀粉无机盐琼脂斜面培养基配方制备斜面。经过3天预培养，若未发现杂菌生长则接种LAF-108(即CCTCC NOM200028)菌株。于28℃恒温箱中培养6天，待孢子成熟后收取，贮存于4℃冰箱中供发酵用。
准备5L种子罐，投料系数65％。种子培养基成份为淀粉3％，豆饼粉0．8％，花生饼粉0．9％，活性干酵母粉0．5％，玉米浆0．4％，氯化钴O．0008％，消泡剂0．03％，消毒前用氢氧化钠溶液调节pH至7．2。121℃蒸汽灭菌30分钟，待培养基冷却至28℃后接种LAF-108菌株的斜面孢子悬浮液。接种量为每罐种子培养基(3．25L)1支试管斜面种子。在通气量1∶0．8，27℃，550转／分搅拌条件下培养24小时，至外观较稠，镜检菌丝粗壮，多分枝，无杂菌污染情况下移种至100L带上排放孔的发酵罐中。
发酵罐中发酵培养基为淀粉7％，活性干酵母粉1．2％，玉米粉1％，氯化钾0．4％，磷酸二氢钾0．04％，氯化钴5μg／ml(终浓度)，硫酸镁0．04％，碳酸钙0．2％，耐高温淀粉酶0．005％，并预先加入含泡敌和植物油的混合消泡剂0．02％，用自来水定容至70L，投料系数70％，消前pH6．9。经灭菌后接种，接种量为3％，在罐温28℃，通气量1∶0．9，搅拌速度300转／分下培养9天，当发酵5天后，发酵液中还原糖含量低于0．6％时，通过补料罐流加葡萄糖使之回升至1．4％。反复补糖。当pH上升至7．5以上，菌丝明显自溶，阿维菌素之B1a组分达到最高峰值时，打开上排放孔阀门，排出浮在发酵液上层的含素油(蜡)状物(1181．0ml)。在油(蜡)状物中阿维菌素的含量为20％。用3300ml甲苯萃取，活性碳脱色。脱色液再浓缩，最后加入晶种得到阿维菌素结晶65．0克，其中B1a组分58．5克。实施例2使用阿弗麦链霉菌LAF-19菌株按分批发酵法生产阿维菌素按照前面所述的麦芽粉淀粉无机盐琼脂斜面培养基配方制备斜面。经过3天预培养，若未发现杂菌生长则接种LAF-19菌株。于29℃恒温箱中培养5天，待孢子成熟后收取，贮存于4℃冰箱中供发酵用。
准备5L种子罐，投料系数65％。种子培养基成份为淀粉2％，豆饼粉1．0％，花生饼粉0．6％，活性干酵母粉0．7％，玉米浆0．3％，氯化钴0．0003％，消泡剂0．02％，消毒前用氢氧化钠溶液调节pH至7．2。121℃蒸汽灭菌30分钟，待培养基冷却至28℃后接种LAF-19菌株的斜面孢子悬浮液。接种量为每种子罐培养基(3．25L)接种一支试管斜面孢子。在通气量1∶0．5，27℃，550转／分搅拌条件下培养36小时，至外观较稠，镜检菌丝粗壮，多分枝，无杂菌污染情况下移种至100L带上排放孔的发酵罐中。
发酵罐中发酵培养基为淀粉8％，活性干酵母粉1．0％，玉米粉1％，氯化钾0．6％，磷酸二氢钾0．03％，氯化钴5μg／ml(终浓度)，硫酸镁0．03％，碳酸钙0．2％，耐高温淀粉酶0．006％。并预先加入含泡敌和植物油的混合消泡剂0．01％，用自来水定容至70L，消前pH7．0。经灭菌后接种，接种量为5％，在罐温28℃，通气量1∶0．8，搅拌速度300转／分条件下培养，当发酵液中还原糖含量低于0．6％时，通过补料罐流加补糖。一共培养10天，至pH上升至7．5以上，菌丝明显自溶，阿维菌素之B1a组分达到最高峰值时，打开上排放孔阀门，排出浮在发酵液上层的含素油(蜡)状物(1127．0L)。在油(蜡)状物中阿维菌素的含量约为20％。用3000ml甲苯萃取，活性碳脱色。脱色液再浓缩，最后加入晶种得到阿维菌素结晶61．5克，其中B1a组分55．3克。实施例3使用阿弗麦链霉菌LAF-28菌株按分批发酵法生产阿维菌素按照前面所述的麦芽粉淀粉无机盐琼脂斜面培养基配方制备斜面。经过3天预培养，若未发现杂菌生长则接种LAF-28菌株。于27℃恒温箱中培养7天，待孢子成熟后收取，贮存于4℃冰箱中供发酵用。
准备5L种子罐，投料系数65％。种子培养基成份为淀粉4％，豆饼粉0．5％，花生饼粉1．2％，活性干酵母粉0．3％，玉米浆0．5％，氯化钴0．0015％，消泡剂0．04％，消毒前用氢氧化钠溶液调节pH至7．2。121℃蒸汽灭菌30分钟，待培养基冷却至28℃后接种LAF-28菌株的斜面孢子悬浮液。接种量为每种子罐培养基(3．25L)接种一支试管斜面孢子。在通气量1∶1．0，27℃，550转／分搅拌培养12小时，至外观较稠，镜检菌丝粗壮，多分枝，无杂菌污染情况下移种至100L带上排放孔的发酵罐中。
发酵罐中发酵培养基为淀粉5％，活性干酵母粉1．4％，玉米粉1％，氯化钾0．2％，磷酸二氢钾0．05％，氯化钴5μg／ml(终浓度)，硫酸镁0．05％，碳酸钙0．2％，耐高温淀粉酶0．004％。并预先加入含泡敌和植物油的混合消泡剂0．03％，用自来水定容至70L，消前pH6．8。经灭菌后接种，接种量为1％，在罐温27℃，通气量1∶1．5，搅拌速度300转／分条件下培养9天，至pH上升至7．5以上，菌丝明显自溶，阿维菌素之B1a组分达到最高峰值时，打开上排放孔阀门，排出浮在发酵液上层的含素油(蜡)状物(1058．0L)。在油(蜡)状物中阿维菌素的含量为21％。用3000ml甲苯萃取，活性碳脱色。脱色液再浓缩，最后加入晶种得到阿维菌素结晶60．6克，其中B1a组分53．4克。补料方法及主要工艺参数见实施例1。实施例4、5、6、7使用LAF-19、LAF-28、LAF-235和LAF-307菌株按分批发酵法生产阿维菌素采用与实施例1完全相同的步骤，只是将LAF-108分别替换为LAF-19、LAF-28、LAF-235和LAF-307菌株，最后得到的阿维菌素的产量为
对比实施例使用A9菌株(非分泌型母体菌株)菌株按分批发酵法生产阿维菌素采用与实施例1相同的培养和发酵条件，将菌株改为A9菌株。所不同的是在阿维菌素之B1a组分达到最高峰值时放罐。板框压滤，收集菌丝体，用轻质碳酸钙调整含水量至适中时进入造粒机造粒。以70L丙酮浸提阿维菌素。浸提液经减压浓缩除尽丙酮，再以7000ml甲苯萃取，活性碳脱色。脱色液再浓缩，最后加入晶种得到阿维菌素结晶57．5克，其中B1a组分52．3克。
在本实施例中，100L发酵罐发酵液放罐体积70L，可以获得湿菌丝体11．7Kg，浸提用去丙酮70L，丙酮回收损失率10％以上，计1罐损失丙酮7L。本实施例中甲苯的使用量也远高于实施例1。可见使用非分泌型菌株之工艺的有机溶剂(丙酮与甲苯)消耗量远远大于使用分泌型菌株之工艺的消耗量，后者提取所需有机溶剂的量仅为前者所需量的23．6％，按照现阶段溶剂价格计算，采用后者溶剂消耗金额仅为前者的10％。实施例8使用阿弗麦链霉菌LAF-108菌株按半连续发酵法生产阿维菌素在100L发酵罐圆柱体侧面罐高约70％的地方开一排放孔，并安装相应的管道阀门。
斜面菌种准备和种子液制备的过程同实施例1。配制半连续发酵的发酵培养基(淀粉7％，活性干酵母粉1．2％，玉米粉1．0％，豆饼粉1．2％，玉米浆0．6％，氯化钾0．4％，磷酸二氢钾0．05％，氯化钴5μg／ml(终浓度)，硫酸镁0．04％，碳酸钙0．3％，耐高温淀粉酶0．005％)，按培养基体积的0．02％加入泡敌和植物油的混合消泡剂，用自来水定容至70L，消前pH6．9。在140℃蒸汽联消灭菌后进入发酵罐接种，接种量为3％，在罐温28℃，通气量1∶1．1，搅拌速度300转／分条件下发酵培养。发酵进行至120小时后，每隔6小时检测一次发酵液中的总糖、还原糖、氨基态氮和阿维菌素B1a组分含量。当还原糖低于0．6％时开始补料。所补充的营养液配方为葡萄糖8％，植物油(豆油)6％，泡敌0．08％，氯化钴5μg／ml(终浓度)，氯化钾0．4％。从第9天开始每10小时取样镜检菌丝衰老与否。若有衰老现象则在流加营养液中增加适量的酵母浸提物，磷酸二氢钾和玉米浆。从第9天开始，每12小时取样一次，检查发酵液上清液部分阿维菌素B1a组分含量，在HPLC法测得阿维菌素B1a组分含量高于100μg／ml时，短时间停止搅拌和通气，同时打开上述排放孔阀门，排出浮在发酵液上层的含素油(蜡)状物，该油(蜡)状物与水共约3000ml。从中分离出油(蜡)状物255ml，其中阿维菌素的含量为18．5％。然后，添加新鲜培养液，重复上述发酵过程11次，共获得含素油(蜡)状物2780ml。18天后菌丝出现明显衰老自溶，此时放罐。每次补进新鲜培养液的量约相当于原发酵液体积的4．5％。使每次从排放孔排出的含素油(蜡)状物直接进入萃取罐，用2．5倍体积的甲苯进行二级错流式萃取。弃去水相，浓缩甲苯相，加入阿维菌素B1a晶种，得到阿维菌素结晶，总共得到阿维菌素140．4克，其中得到阿维菌素B1a组分123．6克。
按本实施例的工艺，100L发酵罐在18天内获得140．4克阿维菌素，较实施例1的9天获得65．0克提高了工作效率。有机溶剂的消耗比率与实施例1相仿。实施例9、10、11、12使用阿弗麦链霉菌LAF-19、LAF-28、LAF-235和LAF-307菌株按半连续发酵法生产阿维菌素采用与实施例8完全相同的步骤，只是将LAF-108分别替换为LAF-19、LAF-28、LAF-235和LAF-307菌株，最后得到的阿维菌素的产量为
实施例13使用阿弗麦链霉菌LAF-108菌株按连续发酵法生产阿维菌素按照前面所述的麦芽粉淀粉无机盐琼脂斜面培养基配方制备茄子瓶斜面。经过3天预培养，若未发现杂菌生长则接种LAF-108菌株。于28℃恒温箱中培养7天，待孢子成熟后收取，贮存于4℃冰箱中。上罐前用摇瓶方式进行考种，考种合格后用于发酵生产。
发酵罐改造同实施例8，在2号和3号发酵罐同一侧的圆柱体部位，高约罐体总高度70％处开一排放孔，并在2号和3号罐上设补料口，在上排放孔和补料口安装相应的管道阀门。3个罐之间的连接方式如附图1所示。
液体种子的培养基配方同实施例1，发酵培养基同半连续发酵培养基(见实施例8)。发酵培养基通过连续灭菌系统灭菌，将温度降至30℃左右后贮存于发酵培养基贮罐内。
本连续发酵工艺中采用的稀释度范围为0．02(l／h)，串联罐数为3个，每个罐的工作容积为100L，容积比为1∶1∶1。温度1号罐和2号罐为28℃，3号罐为26℃；pH1号罐为6．8，2号罐6．5，3号罐为6．8；风量1号罐为1∶1．5，2号罐为1∶1．2，3号罐为1∶1．0。1号罐搅拌常开，2和3号罐搅拌时间视溶解氧情况常开或间歇开，搅拌速度为300转／分。参照实施例8提供的参数在需要补料时向罐内流加饴糖、葡萄糖、植物油、酵母浸出物、玉米粉等养料。在最后一个罐，即3号罐排料，排料方式可以参照实施例8进行，也可以匀速不间断地排出成熟的发酵液。在油(蜡)状物中阿维菌素的含量为19％。如此连续发酵17天后，生产菌的细胞普遍出现老化现象，停止发酵并放罐。
使排出的含素油(蜡)状物与水的混合物经碟片式离心机分离，弃去水相(重液)，保留轻液。使轻液直接进入萃取罐。萃取溶剂为3倍体积的甲苯，萃取方式为二级错流萃取。通过管式离心机分离出甲苯相，弃去固形沉淀。活性碳脱色，减压浓缩(温度≤60℃)含阿维菌素的甲苯相，加入阿维菌素B1a晶种进行结晶，获得阿维菌素晶体。总共得到阿维菌素492．0克，其中阿维菌素B1a组分433．0克。
按本实施例的工艺，3个罐在17天内获得492．0克阿维菌素，较实施例1的1个罐9天获得65．0克进一步提高了工作效率。有机溶剂的消耗比率与实施例1相仿。实施例14、15、16、17使用阿弗麦链霉菌LAF-19、LAF-28、LAF-235和LAF-307菌株按连续发酵法生产阿维菌素采用与实施例13完全相同的步骤，只是将LAF-108分别替换为LAF-19、LAF-28、LAF-235和LAF-307菌株，最后得到的阿维菌素的产量为
图1是本发明的连续发酵工艺中发酵罐连接方式及物料流动的示意图。其中1、接蒸汽总管2、接空气总过滤器3、培养基配制罐4、蒸汽过滤器5、空气预过滤器
6、空气精过滤器7、种子罐8、1号发酵罐9、2号发酵罐10、3号发酵罐11、碟片式离心机12、连消塔13、维持罐14、板式热交换器15、温度降至30℃左右的无菌发酵培养基16、补料罐17、从上排放出的含阿维菌素油(蜡)状物与发酵液之混合液18、接萃取工序
权利要求
1．一种发酵法生产阿维菌素的新工艺，其特征在于在发酵过程中使用能够产生阿维菌素并且将阿维菌素分泌到菌体细胞外的微生物。
2．如权利要求1的工艺，其中所说的微生物是阿弗麦链霉菌(Streptomyces avermitilis)。
3．如权利要求2的工艺，其中所说的微生物是阿弗麦链霉菌CCTCCNOM200028。
4．如权利要求1或2的工艺，其中所说的发酵是分批发酵。
5．如权利要求1或2的工艺，其中所说的发酵是半连续发酵。
6．如权利要求1或2的工艺，其中所说的发酵是连续发酵。
7．能够产生阿维菌素并且将阿维菌素分泌到菌体细胞外的阿弗麦链霉菌。
8．阿弗麦链霉菌CCTCC NOM200028。
9．能够产生阿维菌素并且将阿维菌素分泌到菌体细胞外的阿弗麦链霉菌CCTCC NOM200028的变异体或突变体。
全文摘要
本发明涉及一种发酵法生产阿维菌素的新工艺,其特征是在发酵过程中使用能够产生阿维菌素并且将阿维菌素分泌到菌细胞外的微生物。使用所述微生物不仅可以降低生产成本(降低有机溶剂用量的70—80%),有利于劳动安全和环境保护,而且可以实现阿维菌素的半连续或连续发酵。
文档编号C12P19/00GK1294197SQ0013023
公开日2001年5月9日 申请日期2000年10月30日 优先权日2000年10月30日
发明者林开春, 喻学诗 申请人:武汉绿世纪生物工程有限责任公司