专利名称：制备天然活性脱落酸的方法
技术领域：
本发明涉及一种用微生物发酵生产天然活性脱落酸的方法，具体地说，涉及采用批次液体培养基流加补料工艺来制备天然活性脱落酸的方法。
脱落酸(ABA)是目前世界上已发现的五大植物激素之一。天然型的脱落酸由于对农作物的生长发育具有很强的调节活性，能促进果实类、谷类、豆类的成熟发育，能大幅度提高其产量和质量，又能大大增强其耐寒、抗旱和抗盐碱能力，因而具有广阔的应用前景。目前，脱落酸在基础领域的研究已深入到植物细胞与基因工程水平。然而，由于存在于植物体内的天然活性脱落酸光学构型仅为(S)-(+)-脱落酸，单纯的(S)-(+)-脱落酸的生产成本极高，售价昂贵，而人工合成的脱落酸，得到的是外消旋体，活性远小于天然型的脱落酸，因此，脱落酸应用于农业生产几乎是空谈。
为了解决和满足脱落酸应用于农业生产的需要，近二十年来，国外(特别是日本)一直在研究利用微生物发酵法来生产天然活性脱落酸。例如，已知可用真菌灰葡萄孢(Botrytis cinerea)来生产天然活性脱落酸，并公开了例如采用纤维素泡沫作载体的液体发酵，发酵产量有所提高，最高的产量达300毫克/升发酵量(参见，例如JP-A-6-247927、JP-A-6-197775、JP-A-6-133786、JP-A-6-7180、JP-A-2-10988、JP-A-2-60590、JP-A-63-296696、JP-A-58-51895)；另外，CN1182798A公开了一种真菌发酵生产天然活性脱落酸的方法，该方法采用三级发酵，在第三级发酵中采用连续流加补料出料以及菌种固定化，并添加关键底物，使产酸量稳定，脱落酸的最高产量达到1.2克/升发酵液。
但现有技术中的发酵工艺仅局限于固体发酵、液体批次发酵和连续流加补料出料工艺。前两种工艺没有充分利用菌体连续产生脱落酸的特性，菌体在一个固定的培养环境中生长产酸，当底物浓度降低而产物(脱落酸)浓度升高时，产生抑制作用，菌体不再分泌产物，造成产量低，成本高的后果。后一种工艺虽能一定程度上弥补前两种工艺的缺陷，但发酵时间较长，容易造成污染杂菌，造成人力、物资、能耗方面的浪费，生产成本仍较高。
针对现有技术中已知的用微生物发酵生产天然活性脱落酸的工艺中存在的发酵产量低，收率低，生产成本高等的不足，本发明者进行了深入的研究，寻找出一种更简便易行，发酵周期更短，脱落酸产量更高，生产成本更低的改进工艺，从而完成了本发明。
本发明的目的是提供一种“批次液体培养基流加补料工艺”发酵来生产天然活性脱落酸的方法。
本发明的另一目的是提供一种用于产生天然活性脱落酸的新菌株。
本发明的再一目的是提供一种更适用于本发明方法的新的培养基。
更具体地说，本发明提供一种制备天然活性脱落酸的方法，它包含如下步骤将能够产生天然活性脱落酸的真菌在一级液体培养基(例如，下文所述的培养基A)上培养，所述的真菌选自葡萄孢霉属(例如，Botrytis cinerea)、尾孢霉属(例如，Cercospora rosicola)、青霉菌属(Penicillium)，曲霉属(Aspergillus)及上述菌株的遗传改良菌等；将上述培养好的第一级种子液接种于第二级液体培养基(例如，下文所述的培养基B)中培养；将如上得到的第二级种子液接种于第三级液体培养基(例如，下文中所述的培养基C)中培养一段合适的时间后，开始进行第三级液体培养基流加补料发酵培养；从上述发酵培养液中收集所得的脱落酸。
本发明的具体实施方案是，采用产生天然活性脱落酸的葡萄孢霉菌(例如，Botrytis cinerea)、尾孢霉菌(例如，Cercospora rosicola)、曲霉菌(Aspergillus)或其它产生天然活性脱落酸的真菌及其遗传改良菌，在液体培养基上进行三级发酵培养，在每级发酵阶段选用不同的培养基。在第三级发酵中，以适合于第三级发酵的液体培养基，例如下文中描述的培养基C，作为发酵培养基，适合的温度下培养一段时间后，例如，在大约26℃发酵培养12-72小时后，开始液体培养基流加补料。
第三级液体培养基(例如培养基C)流加补料方式可以采用连续(匀速或非匀速)流加和/或间歇式流加方式，间歇流加方式是优选的。
所述的连续(匀速或非匀速)流加方式，是以一定的流加速率(匀速或非匀速)将适合于第三级发酵的液体培养基(例如培养基C)连续流加入第三级发酵罐，直至停止发酵(下罐)前例如大约10小时。
所述的间歇式流加方式，是以间隔一段时间加一次料的方式，间歇式将适合于第三级发酵的液体培养基(例如培养基C)流加入第三级发酵罐。间歇时间优选为每隔8-30小时补料1-5次，更优选为大约间隔10小时补料1次。本领域技术人员也可根据需要，采用其它的适合时间间隔补料。
发酵条件温度23℃-29℃，pH4-7发酵时间8-9天。
采用本发明工艺，在第三级发酵时，液体培养基只流加补料而不用出料。通过调节(升高或降低)结束后将发发酵液溶解氧浓度，控制温度、泡沫等手段降低菌的新陈代谢，提高产酸率。发酵酵培养液中的脱落酸用常规方式回收，例如采用有机溶剂萃取法、离子交换树脂法、大孔吸附树脂法、硅胶柱层析法及活性碳吸附法等提取后，即得白色结晶脱落酸。
在优选的具体实施方案中，本发明还采用例如新菌株以及更适合于菌体生长、产酸的培养基配方等技术方案来进一步提高天然活性落脱酸的产量。
本发明方法可以采用已知的产生天然活性脱落酸的菌株，例如，已知的、或由遗传工程或基因工程学方法获得的产生天然活性脱落酸的葡萄孢霉属菌(例如，Botrytis cinerea)、尾孢霉属菌(例如，Cercospora rosicola)、曲霉属菌(Aspergillus)，或其它产生天然活性脱落酸的真菌及其遗传改良菌。在优选的本发明方法中，使用已知的产生脱落酸的高产菌种，例如Botrytis cinerea TB-3-H8，TBI-9，Ferm P-6156、B.C.FD338等，在最优选的本发明方法中使用新菌株脱落酸高产菌株灰葡萄孢(Botrytis cinerea)TBI-9(于普通微生物中心保藏，保藏日2000年10月26日，保藏号CGMCC No.0500)。该菌株是灰葡萄孢菌TH-5，经原生质体诱变得到的突变菌株TB-H9同曲霉属(Aspergillus)I-2菌经原生质体诱变得到的突变菌株FI-H3进行原生质体融合后得到的。
本发明工艺过程采用三级发酵，采用三级发酵来制备脱落酸是已知的(参见，例如，CN1182798A)。根据三级不同的要求，分别选择三种不同的培养基来进行发酵，这些培养基可以是本领域技术人员已知的适合于此目的的培养基或是本发明中公开的新培养基，使用新培养基是优选的。在优选本发明工艺中，采用下述培养基A、B、C进行三级发酵。在三级发酵中，分别选择三种不同的培养基A、B、C，其具体组成如下
培养基A
培养基B培养基C
本发明优选实施方案的发酵工艺全过程为将活化后的菌种接种于培养基A中，固体培养或三角瓶内23℃-29℃下摇瓶培养24-76小时后，以10％-50％的接种量接种于已加有灭菌培养基B的种子罐中于23℃-29℃下进行发酵培养24-60小时，然后按10％-50％，优选20％-40％，最优选25％-35％的接种量接种于三级发酵罐中进行发酵生产。三级发酵以培养基C作为发酵培养基，在大约26℃发酵培养12-72小时后，开始培养基C流加补料。培养基C流加补料方式有两种一种是连续(匀速或非匀速)流加，一种是间歇式流加，后者是优选的。
采用前一种方式时，以0.01--5L/h的速度连续(匀速或非匀速)流加培养基C，直至停止发酵(下罐)前约10小时。
采用后一种方式时，则间歇式流加培养基C，间歇时间可为每隔8-30小时补料1-5次，优选为大约间隔10小时补料1次，每次补料量为发酵液总体积的0.05％--1.5％，优选0.1％--0.7％。
采用本发明工艺时，底物流加补料不用出料。通过调节(升高或降低)发酵液溶解氧浓度，控制温度、泡沫等手段降低菌的新陈代谢，提高产酸率。发酵结束后将发酵液用有机溶剂萃取法、离子交换树脂法、大孔吸附树脂法、硅胶柱层析法及活性碳吸附法等提取后，即得白色结晶脱落酸。
发酵条件温度23℃-29℃，pH4-7发酵时间8-9天。
本发明的全工艺流程见附
图1。
在最优选的本发明方法中，通过使用产生天然活性脱落酸高产菌株，并进一步选择了有利于菌株产酸和生长的发酵培养基，促进了产物的生成，大幅度提高了脱落酸产量。
采用本发明方法发酵生产天然脱落酸可人为调控发酵体系中碳、氮比例，使菌株以较高的底物转化率和产物合成速率生产脱落酸，从而提高了产量，并使发酵周期缩短至8-9天；由于本发明方法采用补料而不出料的方法，避免了因重复出料而增加杂菌污染机率的缺陷，杂菌污染率可降低20％-50％，大大节约了能耗和原材料，提高了劳动生产效率，降低了生产成本，简化了微生物生产脱落酸的发酵生产工艺。
采用现有工艺与本发明工艺生产脱落酸的比较结果见下文表1
*TB-3-H8(菌种名灰葡萄孢(Botrytis cinerea)，可按文献“谭红等，利用原生质体诱变技术筛选脱落酸高产菌株 应用与环境生物学报1998，4(3)281-285；”方法获得)。
本发明方法采用下文的非限定性实施例作进一步说明。
实施例1用1000mL三角瓶10个，每瓶装300mL培养基A于120℃灭菌，冷却后接种活化后的脱落酸高产菌株灰葡萄孢TBI-9(保藏号CGMCC No.0500)孢子悬液，置于25℃温度下，摇瓶培养24-46小时。将培养好的一级种子液按15％-20％接种量接种于内装50升培养基B的100立升发酵罐中(二级种子罐)，在26℃-28℃温度下通气搅拌培养24-40小时。
用1吨发酵罐做三级罐发酵，罐内装培养基C约500L，用常规高压热蒸汽灭菌法灭菌后，按20％-25％接种量接种二级罐种子液，通气搅拌发酵20-40小时后，间歇式流加补料液培养基C，间歇时间为每隔10-15小时补料1次，每次补料量为发酵液总体积的0.1％--0.5％。发酵温度为27℃，发酵pH 4-7。
发酵时间达到9天时下罐。
下罐发酵液以离子交换树脂法回收产品，并用乙醇洗脱，经重结晶，得白色结晶状脱落酸产品。经检测发酵系统经过9天的稳定发酵，杂菌污染率为10％，产物产量可达1.6克脱落酸/升发酵液。经离子交换法及重结晶回收，产品回收率达82％。
实施例2用1000mL三角瓶10个，每瓶装300mL培养基A于120℃灭菌，冷却后接种活化后的脱落酸高产菌株灰葡萄孢TBI-9(保藏号CGMCC No.0500)孢子悬液，置于25℃温度下，摇瓶培养24-33小时。将培养好的一级种子液按30％-45％接种量接种于内装50升培养基B的100立升发酵罐中(二级种子罐)，在约26℃温度下通气搅拌培养24-30小时。
用1吨发酵罐做三级罐发酵，罐内装培养基C约500L，用常规高压热蒸汽灭菌法灭菌后，按20％-35％接种量接种二级罐种子液，通气搅拌发酵15-24小时后，间歇式流加补料液培养基C，间歇时间为每隔20-28小时补料1-3次，每次补料量为发酵液总体积的0.05％--0.3％。
发酵温度为约27℃，发酵pH4-7。
发酵时间达到9天时下罐。
下罐发酵液以离子交换树脂法回收产品，并用乙醇洗脱，经重结晶，得白色结晶状脱落酸产品。经检测发酵系统经过9天的稳定发酵，杂菌污染率为10％，产物产量可达1.6克脱落酸/升发酵液。经离子交换法及重结晶回收，产品回收率达82％。
实施例3用1000mL三角瓶10个，每瓶装300mL培养基A于120℃灭菌，冷却后接种活化后的脱落酸高产菌株灰葡萄孢TBI-9(保藏号CGMCC No.0500)孢子悬液，置于27℃温度下，摇瓶培养24-33小时。将培养好的一级种子液按30％-45％接种量接种于内装50升培养基B的100立升发酵罐中(二级种子罐)，在约26℃温度下通气搅拌培养24-30小时。
用1吨发酵罐做三级罐发酵，罐内装培养基C约500L，用常规高压热蒸汽灭菌法灭菌后，按20％-35％接种量接种二级罐种子液，通气搅拌发酵15-24小时后，以0.1-5L/h的速度连续流加培养基C，直至停止发酵(下罐)前10小时。
发酵温度为约26℃，发酵pH4-7。
发酵时间达到9天时下罐。
下罐发酵液以离子交换树脂法回收产品，并用乙醇洗脱，经重结晶，得白色结晶状脱落酸产品。经检测发酵系统经过9天的稳定发酵，杂菌污染率为10％，产物产量可达1.6克脱落酸/升发酵液。经离子交换法及重结晶回收，产品回收率达82％。
实施例4用1000mL三角瓶10个，每瓶装300mL培养基A于120℃灭菌，冷却后接种活化后的脱落酸高产菌株TB-3-H8(可按文献“谭红等，利用原生质体诱变技术筛选脱落酸高产菌株应用与环境生物学报 1998，4(3)281-285；”方法获得)。孢子悬液，置于约26℃温度下，摇瓶培养40-56小时。将培养好的一级种子液按15％-20％接种量接种于内装50升培养基B的100立升发酵罐中(二级种子罐)，在26℃-27℃温度下通气搅拌培养24-26小时。
用1吨发酵罐做三级罐发酵，罐内装培养基C约500L，用常规高压热蒸汽灭菌法灭菌后，按15％-20％接种量接种二级罐种子液，通气搅拌发酵20-48小时后，间歇式流加补料液培养基C，间歇时间为每隔15-28小时补料1-2次，每次补料量为发酵液总体积的0.1％--0.5％。
发酵温度为约27℃，发酵pH4-7。
发酵时间达到9天时下罐。
下罐发酵液以离子交换树脂法回收产品，并用乙醇洗脱，经重结晶，得白色结晶状脱落酸产品。经检测发酵系统经过9天的稳定发酵，杂菌污染率为10％，产物产量可达1.4克脱落酸/升发酵液。经离子交换法及重结晶回收，产品回收率达80％。
对比实施例5采用连续流加补料出料工艺。
用1000mL三角瓶10个，每瓶装300mL培养基A于120℃灭菌，冷却后接种活化后的脱落酸高产菌株TB-3-H8(可按文献“谭红等，利用原生质体诱变技术筛选脱落酸高产菌株应用与环境生物学报 1998，4(3)281-285；”方法获得)，孢子悬液，置于约26℃温度下，摇瓶培养40-56小时。将培养好的一级种子液按15％-20％接种量接种于内装50升培养基B的100立升发酵罐中(二级种子罐)，在26℃-27℃温度下通气搅拌培养24-26小时。
用1吨发酵罐做三级罐发酵，罐内装培养基C约500L及微孔陶瓷珠(粒径0.9-160mm3，1.0-5g/L)，用常规高压热蒸汽灭菌法灭菌后，按15％-20％接种量接种二级罐种子液，通气搅拌发酵20-48小时后，然后通入氨将pH控制在4-8，降低发酵温度至10℃-25℃，以0.01-5L/h的速度连续流加培养基C，每隔10小时出料一次。发酵温度为约27℃，发酵pH4-7。
发酵时间达到25天时下罐。
下罐发酵液以离子交换树脂法回收产品，并用乙醇洗脱，经重结晶，得白色结晶状脱落酸产品。经检测发酵系统经过25天的稳定发酵，杂菌污染率为50％，产物产量可达1.0克脱落酸/升发酵液。经离子交换法及重结晶回收，产品回收率达80％。
权利要求
1.一种制备天然活性脱落酸的方法，它包含如下步骤将能够产生天然活性脱落酸的真菌在第一级液体培养基中培养，所述的真菌选自葡萄孢霉属、尾孢霉属、曲霉属，青霉菌属，及上述菌株的遗传改良菌等；将上述培养好的第一级种子液接种于第二级液体培养基上培养；将如上得到的第二级罐种子液接种于第三级液体培养基中培养一段合适的时间后，开始进行三级液体培养基流加补料发酵培养；从上述发酵培养液中收集所得的脱落酸。
2.根据权利要求1的方法，其中，第三级液体培养基的流加补料采用连续(匀速或非匀速)流加和/或间歇式流加方式。
3.根据权利要求2的方法，其中，采用间歇式方式进行流加补料，间隔时间为每隔8-30小时补料1-5次。
4.根据权利要求1的方法，其中，所用的真菌是灰葡萄孢(Botrytiscinerea)。
5.根据权利要求4的方法，其中，所用的真菌是灰葡萄孢(Botrytis cinerea)TBI-9菌株，即CGMCC No.0500菌株。
6.根据权利要求1的方法，其中第二级罐种子液按10％-50％的接种量，接种于第三级发酵罐中进行发酵生产；
7.根据权利要求6的方法，其中接种量为20％-40％。
8.根据权利要求1-5之任一方法，其中，所用的三级培养基的组成分别为培养基A葡萄糖0.2％-3％牛肉膏0.1％-1％麦麸1％-5％蔗糖1％-4％硝酸铵0.1％-2％硫酸镁0.01％-0.1％麦芽糖0.1％-3％；培养基B淀粉1％-5％麦麸1％-5％葡萄糖1％-4％麦芽糖0.1％-3％ 豆饼粉0.1％-2％ 硝酸钠0.1％-5％培养基C糊精 1.0％-30.0％麦麸0.1％-20.0％乙二醇0.01％-10.0％甘油0.1％-20.0％ 脂肪酸0.1％-10.0％ 葡萄糖0.1％-25.0％麦芽糖0.1％-20.0％蔗糖0.1％-30.0％废糖蜜0.1％-50.0％乳糖0.1％-50.0％ 豆饼粉0.0 1％-20.0％硫胺素0.0001％-5.0％磷酸氢钾0.001％-10.0％磷酸二氢钾0.001％-10.0％硫酸镁0.01％-2.0％硫酸锰0.01％-2.0％ 硫酸镍0.001％-2.0％
9.灰葡萄孢(Botrytis cinerea)TBI-9菌株，即CGMCC No.0500菌株。
全文摘要
本发明涉及采用批次液体培养基流加补料工艺来制备天然活性脱落酸的方法以及用于这种方法的新的菌株和液体培养基。
文档编号C12N1/14GK1355318SQ0013202
公开日2002年6月26日 申请日期2000年11月27日 优先权日2000年11月27日
发明者谭红, 雷宝良, 李志东 申请人:中国科学院成都生物研究所