用硫氧还蛋白减轻空气传播性和接触性变应原的变应原性的制作方法

专利名称：用硫氧还蛋白减轻空气传播性和接触性变应原的变应原性的制作方法
技术领域：
本发明涉及使用硫醇氧化还原蛋白质来还原种子蛋白(如谷物蛋白)，来还原酶抑制物蛋白(如蛇毒蛋白、花粉蛋白)和某些其它蛋白质的分子内二硫键。更具体的，本发明涉及使用硫氧还蛋白和谷氧还蛋白还原麦胶蛋白、麦谷蛋白、清蛋白素和球蛋白，来改进生面团和烘烤食物的特征，并产生新的生面团和还原含半胱氨酸的蛋白质(如淀粉酶和胰蛋白酶抑制物)，来改进食物和谷物产品的质量。另外，本发明涉及分离一种抑制支链淀粉酶的新颖蛋白质和硫醇氧化还原蛋白对该新颖蛋白质的还原。本发明还涉及储油种子特有的2S清蛋白被硫氧还蛋白还原。另外，本发明还涉及在体外灭活蛇神经毒素和某些昆虫和蝎子毒素，并治疗病人相应的中毒。本发明还涉及利用硫氧还蛋白降低食物和花粉变应原的过敏原性，并提高食物和花粉蛋白的蛋白酶水解，以及食物和花粉的消化性。本发明还涉及被硫辛酸或被还原的硫醇氧化还原蛋白、或被硫氧还蛋白联合硫辛酸还原的花粉蛋白质的免疫治疗用途。本发明还涉及用硫醇氧化还原蛋白和硫辛酸治疗和预防过敏和过敏症状。
本发明是在国家科学基金会以资助合同DCB 8825980和DMB 88-15980提供的政府资助下进行的。美国政府对本发明具有一定的权利。
背景技术：
叶绿体含有一种铁氧还蛋白/硫氧还蛋白系统，由铁氧还蛋白、铁氧还蛋白-硫氧还蛋白还原酶和硫氧还蛋白f和m构成，它将光与光合作用的酶调节联系起来(Buchanan，B.B.(1991)“氧的光合作用中CO2同化的调节铁氧还蛋白/硫氧还蛋白系统，关于它的发现，目前状况和未来发展的观点”Arch.Biochem.Biophys.2881-9；Scheibe，R.(1991)，“叶绿体酶的氧化还原调节，独立控制的普通原理”，Plant Physiol.961-3)。几个研究已显示植物也含有一种系统，该系统与动物和大部分微生物所建立的类似，其中硫氧还蛋白(h-型)被NADPH和酶NADP-硫氧还蛋白还原酶(NTR)如下还原(Florencio，F.J.等(1988)，Arch.Biochem.Biophys.266496-507；Johnson，T.C.等(1987)，Plant Physiol.85446-451；Suske，G.等(1979)，Z.Naturforsch.C. 34214-221)。目前的证据提示，NADP/硫氧还蛋白系统广泛分布于植物组织中，并储藏在线粒体、内质网和细胞质中(Bodenstein-Lang，J.等(1989)FEBS Lett.25822-26；Marcus，F.等(1991)，Arch.Biochem.Biophys.287195-198)。
还知道硫氧还蛋白h是糖类代谢、焦磷酸果糖-6-P、1-磷酸转移酶或PFP的还原性激活胞质酶(Kiss，F.等(1991)，Arch.Biochem.Biophys.287337-340)。
种子是植物中NADP/硫氧还蛋白赋予生理活性的唯一组织。另外，已显示硫氧还蛋白h在实验室中能还原硫堇素(thionin)(Johnson，T.C.等(1987)，PlantPhysiol.85446-451)。硫堇素是可溶性的谷物种子蛋白，富含半胱氨酸。在Johnson等的调查中，NADPH通过NADP-硫氧还蛋白还原酶(NTR)和硫氧还蛋白h根据等式2和3实验性还原了小麦嘌呤硫堇素。
(3)嘌呤硫堇素氧化+硫氧还蛋白h还原→嘌呤硫堇素还原+硫氧还蛋白h氧化谷物种子(如小麦、黑麦、大麦、玉米、粟、高粱和稻)含有四种主要的种子蛋白组。这四组是清蛋白、球蛋白、麦胶蛋白和麦谷蛋白或相应的蛋白质。硫堇素属于清蛋白组或成分。目前小麦和黑麦是仅有的两种能形成面筋或生面团的谷物。面筋是一种胶质的弹性和强韧的蛋白质复合物，给予生面团粘性。面筋主要由麦胶蛋白和麦谷蛋白组成。它是在用水洗涤黑麦或小麦生面团时形成的。面筋给予面包生面团弹性质量。其它主要作物谷物大麦、玉米、高粱、燕麦、粟和稻的粉和大豆植物的粉在小麦和黑麦所使用的条件下不产生面筋样的网络。
麦谷蛋白和麦胶蛋白是含有半胱氨酸的种子储藏蛋白，并且是不溶性的。储藏蛋白是种子中在发芽过程中被打碎的蛋白质，并被发芽的幼苗用于生长和发育。醇溶谷蛋白是小麦以外谷物中与麦胶蛋白相应的储藏蛋白，而谷蛋白是小麦以外谷物中与麦谷蛋白对应的储藏蛋白。小麦储藏蛋白占了种子总蛋白质的80％(Kasarda，D.D.等，(1976)，Adv.Cer.Sci.Tech.1158-236；和Osborne，T.B.等(1893)，Amer.Chem.J.15392-471)。认为麦谷蛋白和麦胶蛋白对于生面团的形成和面包的质量是重要的。体外实验已显示种子储藏蛋白质的溶解度随着还原而增加(Shewry，P.R.等(1985)，Adv.Cer.Sci.Tech.71-83)。然而先前，认为麦谷蛋白和麦胶蛋白的还原降低了而不是提高生面团的质量(Dahle，L.K.等(1966)Cereal Chem 43682-688)。这很可能是由于化学还原剂引起的非特异性还原导致生面团变软。
“一次发酵”和“预先发酵”法是制造生面团和随后酵母发酵产生面包产品的两种主要的常规方法。
对于一次发酵法，将面粉、水或其它液体、和其它生面团成分(包括但不限于酵母、谷粒、盐、油酥、糖、酵母营养物、面团质量改进剂和防腐剂)全部混合在一起，形成生面团，并拌和到部分或完全发开。可将得到的面团发酵一段时间，视具体方法或所要的终产物特征而定。
该方法的下一步是将面团机械或手工分成重量足够、大小合适的块，确保在烘烤、冷却和切割后达到目标净重。然后常常使生面团块成圆形，并放置不同长度的时间(中间检验)。这使面团在压片和折叠制备之前“放松”。时间通常在5-15分钟之间，但视具体加工要求和配方变化很大。然后用机械或手工将生面团块擀成合适的形状，然后在烘烤前通常作最终“检验”在预先发酵方法中，将酵母与其它成分混合，使得在最终拌和面包或面包卷的生面团之前发酵不同时间。对于这些系统面包师的术语包括“水酿造”、“液态发酵”、“液态发酵面团”和“发酵面团/生面团”。将一定百分数的面粉(在0-100％之间)与其它成分混合，这些成分可能包括但不限于水、酵母、酵母营养物和面团质量改进剂，并将混合物在受控或环境条件下发酵一段时间。典型时间范围是1-5小时。然后可直接使用发酵物，或冷冻并储藏在贮桶或槽中以后使用。加入其余的成分(面粉、特征成分、其它添加剂、额外的水等)，拌和面团至部分或完全发开。
然后使面团发酵不同时间。通常由于在加入其余成分前已发生了某种程度的发酵，所需该时间很短(即10-20分钟)，然而视设备和产品种类可变化。在第二次发酵步骤之后，可象一次发酵法那样处理生面团。
本文使用的术语“生面团混合物”描述了一种混合物，它至少含有面粉或粗粉和一种液体，如牛奶或水。
本文所用的术语“生面团”描述了一种具有弹性的、柔韧的蛋白质网络混合物，它至少含有面粉或粗面粉和一种液体，如牛奶或水。
本文所用的术语“生面团成分”可能包括但不限于任何下列成分面粉、水或其它液体、谷粒、酵母、发酵面团、盐、油酥、糖、酵母养分、面团质量改进剂和防腐剂。
本文所用的术语“烘烤食品”包括但不限于所有类型的面包，包括酵母发酵和化学发酵的，以及白面包和各种面包和面包卷、英国松饼、蛋糕和曲奇饼、糖果用涂层、克力架、炸面圈和其它甜点商品、攀和意大利馅饼底、椒盐卷饼、皮塔饼和其它扁面包、未发酵的玉米粉饼、面条制品、和冷藏和冷冻面制品。
虽然已用硫氧还蛋白还原面粉中的清蛋白，但还未用硫醇氧化还原蛋白还原麦谷蛋白和麦胶蛋白和其它水不溶性储藏蛋白，也未用其改善生面团和烘烤食品的质量。也未用硫醇氧化还原蛋白改善面筋的质量，从而增强其价值或从大麦、玉米、高粱、燕麦、粟和稻或从大豆粉中制备生面团。
许多谷物种子还含有已显示起外源酶抑制剂作用的蛋白质。已提出这些酶抑制剂可能赋予抵御某些有害生物的保护作用(Garcia-Olmedo，F.等(1987)OxfordSurveys of Plant Molecular and Cell Biology 4275-335；Birk，Y.(1976)Meth.Enzymol.45695-739和Laskowski，M.Jr.等(1980)Ann.Reo.Biochem.49593-626)。这两类酶抑制剂是淀粉酶抑制剂和胰蛋白酶抑制剂。另外，有证据证明大麦蛋白抑制剂(在该研究中未测试)能抑制相同来源的α-淀粉酶(Weselake，R.J.等(1983)，Plant Physiol.72809-812)。不幸的是，该抑制剂蛋白质常常在某些食品中导致不良作用。大豆中的胰蛋白酶抑制蛋白，尤其是Kunitz胰蛋白酶抑制蛋白(KTI)和Bowman-Birk胰蛋白酶抑制蛋白(BBTI)，必需先灭活，然后这些大豆制品才能被人或家畜所消化。已知这两种抑制蛋白在被硼氢化钠化学还原时变得无效(Birk，Y.(1985)Int.J.Peptide Protein Res.25113-131和Birk，Y.(1976)Meth.Enzymol.45695-739)。这些抑制蛋白像抑制蛋白酶的其它蛋白质一样，含有分子内二硫键，而且通常在加热或蛋白水解灭活时是稳定的(Birk(1976)见上；Garcia-Olmedo等(1987)，见上和Ryan(1980))。目前，为了将抑制蛋白引起的不良作用减到最小，可通过高温处理食物来处理动物和人类食品中的这些大豆胰蛋白酶抑制剂和其它胰蛋白酶抑制剂。然而热处理不能完全消除抑制蛋白活性。另外，该方法不仅昂贵，而且它还会破坏许多其它对营养价值很重要的蛋白质。例如，120℃加热30分钟导致大豆粉的BBTI完全失活，原来的KTI活性剩余约20％(Friedman等，1991)。完全灭活抑制蛋白所需的延长或更高温度的处理会导致氨基酸(如半胱氨酸、精氨酸和赖氨酸)破坏(Chae等，1984；Skrede和Krogdahl，1985)。
还有几种工业加工需要α-淀粉酶活性。一个例子是麦芽制造，需要活性的α-淀粉酶。用硫醇氧化还原蛋白还原灭活抑制蛋白，如大麦淀粉酶/枯草杆菌蛋白酶(asi)抑制蛋白和其它谷物中它的等价物，将使α-淀粉酶比现有方法更快成为完全活性，从而缩短了麦芽制造或类似过程的时间。
硫醇氧化还原蛋白先前并未被用于灭活胰蛋白酶或淀粉酶抑制蛋白。还原胰蛋白酶抑制蛋白(如Kunitz和Bowman-Birk抑制蛋白)降低了其抑制作用(Birk，Y.(1985)Int.J.Peptide Protein Res.25113-131)。用于人类或家畜消费的豆制品中抑制蛋白的还原有关的硫醇氧化还原蛋白，不需要加热或只需要比目前蛋白质变性所需热量低的热量，从而减少了变性成本并改善了大豆蛋白的质量。另外，一种生理学上的还原剂，一种所谓的清洁添加剂(即没有视为“有害化学物质”成分的添加剂)是非常理想的，因为食品工业正在寻找化学添加剂的代替品。另外，生理学还原剂(如硫醇氧化还原蛋白)以受控方式选择性还原对面粉质量重要的主要小麦和种子储藏蛋白(如麦胶蛋白和麦谷蛋白)的能力可用在烘烤业中，以改进小麦和黑麦生面团的性能，并从其它谷物粉，如玉米粉或从木薯或大豆粉产生生面团。
作为储油种子(如蓖麻子和巴西果)特征的2S清蛋白家族(Kreis等，1989；Youle和Huang，1981)储藏在种子胚乳或子叶的蛋白质体内(Ashton等1976；Weber等，1980)，通常通过两个分子间二硫键由不同亚基连接而成，一个亚基7-9kDa，另一个3-4kDa。大亚基含有两个分子内二硫键基团，小亚基不含二硫键。2S大亚基的胞内二硫键显示与大豆Bowman-Birk抑制蛋白的同源(Kreis等，1989)，但对于2S蛋白在生理条件下经历还原的能力尚不了解。
这些2S清蛋白富含甲硫氨酸。近来产生了产生巴西果2S蛋白的转基因大豆。这些大豆中2S蛋白的还原可增强大豆蛋白整合入生面团网络中，得到富含甲硫氨酸的大豆面包。另外，这些2S蛋白质常常是变应原。还原2S蛋白可终止其过敏活性。
支链淀粉酶(“脱支链酶”)是一种通过水解切割α-1，6键，破坏谷物种子胚乳淀粉的酶。支链淀粉酶是酿造和烘烤业的一种基本酶。需要支链淀粉酶破坏麦芽制造和某些烘烤过程(在不加蔗糖和其它糖类的条件下进行)中的淀粉。获得足够支链淀粉酶活性尤其在麦芽制造业中是一个问题。一段时间以来已知二硫苏糖醇(DTT，一种硫氧还蛋白的化学还原剂)能激活谷物制品(如大麦、燕麦和稻粉)的支链淀粉酶。一种用生理学可接受的系统充分激活或提高支链淀粉酶活性的方法可能导致更迅速的麦芽制造方法，并由于提高了糖利用率，导致酒精含量提高的酒精饮料，如啤酒。
在许多非洲、亚洲和南美国家中蛇咬导致的死亡和永久伤害是严重的问题，在美国的几个南部和西部地区也受到主要关注。蛇毒的特征是含有位于分子内(链内)半胱氨酸和在某些情况下位于分子间(链间)半胱氨酸的二硫(S-S)键桥的活性蛋白组分(通常几种)。某给定毒素组中半胱氨酸的位置是高度保守的。报道还原这些基团导致蛇毒在小鼠中毒性的丧失证明了这些分子内S-S基团对毒性的重要性(Yang，C.C.(1967)Biochem.Biophys.Ac ta.133.346-355；Howard，B.D.等(1977)Biochemistry 16122-125)。蛇毒的神经毒素是能改变运动神经末梢释放神经递质的蛋白质，可以是突触前也可以是突触后的。在患有蛇毒神经中毒的个体中观察到的共同症状包括肿胀、水肿和疼痛，昏迷或眩晕、发麻或患处麻木、抽搐、肌肉收缩、肾衰竭、以及长期坏死和个体全身虚弱等。
突触前神经毒素分成两组。第一组β-神经毒素包括三类不同的蛋白质，每类都具有磷脂酶A2组分，它显示了高度的保守性。负责磷脂酶A2活性的蛋白质具有6-7个二硫键。β-神经毒素组的成员是单链(如考多毒素(caudotoxin)、虎蛇毒素和腹蛇神经毒素)或多链(如响尾蛇毒素、印度环蛇毒素和蝰属毒素)。β-金环蛇毒素是由两个亚基构成的，属于第三组。这些亚基之一与哺乳动物胰脏的Kunitz-型蛋白酶抑制蛋白同源。多链β-神经毒素的蛋白组分离子性连接，而β-金环蛇毒素的两个亚基通过分子间二硫键共价连接。β-金环蛇毒素的B链亚基与哺乳动物胰脏的Kunitz型蛋白酶抑制蛋白同源，具有3个二硫键。
第二组突触前毒素，强化(facilitatory)神经毒素缺乏酶活性，具有两个亚组。第一亚组树突毒素具有一条57-60个氨基酸的多肽序列，它与哺乳动物胰脏的Kunitz型胰蛋白酶抑制蛋白同源，并能封闭电压敏感的钾通道。第二亚组如束毒素(如束毒素1和束毒素2)是胆碱酯酶抑制蛋白，尚未被深入研究过。
突触后神经毒素分类成长神经毒素和短神经毒素。每一类含有S-S基团，但肽是独特的，不象磷脂酶A2或Kunitz或Kunitz型抑制蛋白。短神经毒素(如埃拉布毒素a和埃拉布毒素b)长60-62个氨基酸残基，具有4个分子内二硫键。长神经毒素(如α-金环蛇毒素和α-眼镜蛇毒素)含有65-74个残基和5个分子内二硫键。另一类毒素，细胞毒素，在突触后起作用，但其中毒患病形式不明确。这些细胞毒素显示模糊不清的药物学作用，如溶血、细胞溶解和肌肉去极化。它们的毒性比神经毒素小。细胞毒素通常含有60个氨基酸和4个分子内二硫键。蛇毒神经毒素都具有多个分子内二硫键。
目前在对病人急救处理后用于治疗毒蛇咬伤的蛇抗毒素主要包括静脉注射以马制备的抗蛇毒血清。虽然不知道蛇咬中毒后多久可以施用抗蛇毒血清，而且是有效的，但推荐使用它直到24小时。抗蛇毒血清治疗通常伴随静脉内输液，如血浆、清蛋白、血小板或特异性凝血因子。另外，常常施用支持药物，例如抗生素、抗组织胺药、抗破伤风药、麻醉药和镇静剂。在某些情况下，采用全身治疗标准来最大程度减少休克、肾衰竭和呼吸衰竭。除了在咬伤处附近施用钙-EDTA和切开咬伤处外，尚不知道可导致毒素中和和防止毒素吸收入血管的局部治疗方法。甚至这些局部治疗也是明显有问题的，而且对于对马血清敏感的人常常是保留的(Russelll，F.E.(1983)Snake Venom Poisoning，Schollum International，Inc.Great Neck，NY)。
本文所用的术语“病人”指动物或人。
目前使用的大多数抗蛇毒血清是有问题的，在于它们可能产生有害的副作用，而且在对马血清敏感的病人(大约5％病人)中产生变态反应。非变应原性反应包括致热原性休克和补体耗竭(Chippaur，J.-P.等(1991)Reptile Venom andToxins，A.T.Tu编，Marcel Dekker，Inc.，529-555页)。
已显示硫氧还蛋白在NADPH和硫氧还蛋白还原酶存在下，能在体外还原细菌神经毒素破伤风毒素和肉毒毒素A(Schiavo，G.等(1990)Infection and Immunity584136-4141；Kistner，A.等(1992)Naunyn-Schmiedeberg’s Arch Pharmacol345227-234)。硫氧还蛋白能还原破伤风毒素的链内二硫键，因而这些被还原的破伤风毒素不再具有神经毒性(Schiavo等，见上)。然而报道用硫氧还蛋白还原肉毒杆菌A毒素的链内二硫键要缓慢得多(Kistner等，见上)。与本发明过程中研究的蛇神经毒素相反，破伤风研究组(Schiavo等，见上)在用破伤风毒素进行的工作中，没有发现还原的硫氧还蛋白还原了毒素链内二硫键的证据。在用肉毒杆菌A进行的实验中也没有证据表明硫氧还蛋白还原了链内二硫键。破伤风和肉毒杆菌A毒素是与蛇神经毒素显著不同的蛋白质，在于后者(1)具有小分子量；(2)富含分子内二硫键；(3)能抵抗胰蛋白酶和其它动物蛋白酶；(4)没有酶修饰，如蛋白酶水解切割也具有活性；(5)在许多情况下显示与动物蛋白质，如磷脂酶A2和Kunitz型蛋白酶同源；(6)在大多数情况下缺乏链间二硫键，和(7)对于热和蛋白酶等因素是稳定的。
在文献中已报道通过将蛇毒素与1％β-巯基乙醇培育6小时，并与8M脲和300mMβ-巯基乙醇培育可体外还原性灭活蛇毒素(Howard，B.D.等(1977)Biochemistry 16122-125；Yang，C.C.(1967)Biochem.Biophys.Acta.133346-355)。然而这些条件不是生理条件。本文所定义的关于毒素蛋白的术语“灭活”意味着毒素在体外不再具有生物活性，即毒素不能与受体连接。本文还使用的“解毒”是术语“灭活”的延伸，意味着毒素在个体内已被中和，如用动物毒性试验测定的。
蜂毒是至少40种独立组分的复杂混合物，它包括主要组分，如蜜蜂毒素和磷脂酶A2，分别占总毒素重量的50％和12％，和小组分如小蛋白和肽、酶、胺和氨基酸。
蜜蜂毒素是一条由26个氨基酸构成的多肽，分子量为2840。它不含二硫键。由于它对脂肪-水界面的高亲和力，该蛋白能渗透细胞膜的磷脂双层，干扰其组织结构。蜜蜂毒素本身不是毒素，但它改变膜结构，从而增加磷脂酶A2的水解作用，后者是毒液中存在的另一种主要组分，也是主要的变应原。
蜜蜂毒液的磷脂酶A2是128个氨基酸的单链多肽，通过4个二硫键交联，并含有糖。蜜蜂毒液的主要毒性作用是由于与蜜蜂毒素关联的磷脂酶A2的强水解活性。
蜜蜂毒液中其它毒素蛋白具有低分子量，并含有至少两个二硫键，它们似乎起着重要的结构作用。包括蛋白酶抑制蛋白(63-65个氨基酸)、MCD或401-肽(22个氨基酸)和蜜蜂神经毒素(18个氨基酸)。
虽然蜂类有几千种，仅蜜蜂(Apis mellifera)是变态反应的主要原因。反应从局部不适到全身性反应，包括可导致死亡的休克、低血压、呼吸困难、知觉丧失、喘鸣和/或胸闷。在这些情况下唯一的治疗方法是注射肾上腺素。
治疗蜂蜇不仅对于具有过敏反应的人很重要。“杀人蜂”或非洲蜂，一种蜜蜂的变种，它比欧洲蜜蜂更具攻击性，在南美和北美都是一种危险。虽然非洲和欧洲蜜蜂毒液的致死率似乎相同(Schumacher，M.I.等(1989)Nature 337413)，但蜂群的行为模式完全不同。报道非洲蜂对群体干扰反应更快，量更大而且蜇得更多(Collins，A.M.等(1982)Science 21872-74)。非洲蜜蜂的大量攻击可在一个人身上制造几千处蜇伤，并导致死亡。“杀人”蜂看来是非洲蜂(Apis melliferascutellata)和欧洲蜂(Apis mellifera mellifera)种间繁殖的结果。非洲蜂最初在1956年被引入巴西，目的是产生更适合热带气候的蜜蜂来提高蜂蜜生产。非洲蜂已从南美传播到了北美，在得克萨斯和佛罗里达已有它们的报道。
在世界某些地方如墨西哥、巴西、北非和中东，蝎子是对人类生命的一种威胁。然而，仅Buthidae科的蝎子(Androctonus、Buthus、Centruroides、Leiurus和Tityus属)对人有毒。蝎子毒液的化学组成不像蛇或蜜蜂毒液那样复杂。蝎子毒液含有粘多糖、少量透明质酸酶和磷脂酶、低分子量分子、蛋白酶抑制蛋白、组胺释放剂和神经毒素，如血清素。神经毒素作用于神经肌肉连接处电压敏感的离子通道。神经毒素是具有3-4个二硫键的碱性多肽，并可分成两组61-70个氨基酸的肽，封闭钠通道，和36-39个氨基酸的肽，封闭钾通道。非生理性还原剂，如DTT或β-巯基乙醇(Watt，D.D.等(1972)Toxicon 10173-181)对该神经毒素二硫键的还原导致其毒性丧失。
动物被毒蝎子蜇后的症状包括兴奋过度、呼吸困难、抽搐、瘫痪和死亡。目前，抗蛇毒血清是仅有的蝎蜇解毒剂。在制造抗蝎毒血清中，获得毒液是主要问题。不像蛇毒液，蝎子毒液非常难收集，因为每只蝎子的毒液产量有限，而且在某些情况下，储藏干燥的毒液导致其毒性改变。制造抗蝎毒血清中的另一个问题是神经毒素是非常弱的抗原。
从未报道过在生理条件下对蛇、蜜蜂和蝎子毒素的还原性灭活，也未提出过硫醇氧化还原剂，如还原的硫辛酸、DTT或还原的硫氧还蛋白可作为这些毒液在个体中的解毒剂。
食物过敏代表了在国家和国际上的一个长期存在的重要问题。在美国人口中高达5％的12岁以下儿童和1％成人受到临床影响(Adverse Reaction to Foods-AAAI and NIAD Report，1984，NIH Pub No.84-2442，pp.2，3)。在某些国家，该数字更高，而且在世界各地，相信该问题正在增加，尤其在婴儿中(T.Matsuda和R.Nakamura 1993 Molecular structure and immunological properties of FoodAllergens，Trend in Food Science & Technology 4，289-293)。该问题延伸到各式各样的食品。作为转基因食品关注的结果，近来食物过敏总体上已成了增长的问题。
牛奶代表了一个显著的问题，尤其在婴儿中。小麦和大豆过敏在接受这些食物的新生人群中变得越来越重要，而且在宠物(尤其是狗)食品中也越来越被关注。牛肉、稻米和鸡蛋也能在许多人中导致严重过敏，关于宠物食品也受到了关注。
上述食品中的许多主要变态原性蛋白具有分子内二硫键(S-S)键，而且迄今商业上已运用了两种处理方法来减少食物过敏(1)加热，和(2)蛋白酶水解。就两种情况而言，仅获得了部分成功。虽然减少了变态原性，热处理即便在最好的情况下也不能消除该问题，因为引起的蛋白通常是热稳定性的。另外，加热通过破坏营养上重要的氨基酸如赖氨酸、半胱氨酸和精氨酸降低了产品质量。酶蛋白水解在减少变应原性上更成功，但常常丧失理想的食物性质，如味道，而且处理是昂贵的。因此一种生理学上安全的系统，它在应用于变应原性食物中时能减少或除去变应原性，而不引起味道和营养的损失将是极端有价值的。
已知某些主要花粉变应原是二硫键蛋白质，它们对温度有高度抗性。在豚草花粉中描述了两种作为主要变应原的花粉蛋白。一种是5kDa的小蛋白，Amb a V，含有4个二硫键(Goodfriend，L.等(1985)，“Ra5G，一种大豚草花粉中的Ra5同源物其分离，HLA-DR相关的活性和氨基酸序列”，Mol.Immunol.22899-906；Metzler，W.J.等(1992)，“用核磁共振光谱测定豚草变应原Amb t V的三维溶液结构”，Biochemistry 315117-5127；Mole，L.E.等(1975)，“豚草花粉变应原Ra5的氨基酸序列”Biochemistry 141216-1220；Metzler，W.J.等(1992)“核磁共振光谱分析豚草变应原Amb a V的质子共振排列和三维溶液结构”Biochemistry318697-8705)。认为该蛋白质在矮和大豚草中都是同源的。矮豚草蛋白质命名为Amb a V，而大豚草现在称为Amb t V，两者先前都称为Ra5，它们之间显示45％的序列相似性。
其它主要变应原代表了一组41kDa蛋白，称为Amb a l.1、Amb a l.2、Amb a1.3和Amb a l.4。虽然未描述过所有的二硫键，这些蛋白含有多个半胱氨酸(Rafnar，T.等(1991)“Amb a I(抗原E)的克隆，矮豚草花粉的主要变应原家族”J.Biol.Chem.2661229-1236；Griffith，I.J.等(1991)，“Amb a I和Amb a II的序列多形性，Ambrosia artemisiifolia(矮豚草)的主要变应原”Int.Arch.Allergy Appl.Immunol.96296-304)。而其它已知的变应原是二硫键蛋白如西方豚草Amb P 5-A和-B，各长8.5kDa，具有三个二硫键(Ghosh，B.等(1994)“Ambrosiapsilostachya(西方豚草)花粉的Amb p V变应原的免疫学和分子特征”J.Immunol.1522882-2889)和矮豚草11.4kDa质体蓝素样蛋白，caUed Ra 3，具有一个二硫键(Klapper，D.G.等(1980)“豚草变应原Ra3的氨基酸序列”Biochemistry 195729-5734)。
5kDa Amb V豚草花粉蛋白具有良好限定的结构，四个链内二硫键的位置是精确已知的(Metzler，W.J.等(1992)Biochemistry 315117-5127和8697-8705)。之前的工作已显示，当被化学试剂(脲加上二硫苏糖醇或β-巯基乙醇)在变性条件下还原时，免疫应答从IgE(变应原性)变到IgG(防御性)，因为增强了IgG的产生(Zhu，X.等(1995)“豚草花粉变应原Ambrosia artemisiifolia(Amb a 5)和Ambrosiatrifida(Amb t 5)的T细胞表位作图和T细胞识别中游离巯基的作用”J.Immunol.1555064-73)。
目前正在用未变性的花粉抽提物常规免疫治疗花粉过敏。然而这些治疗(尤其在儿童中)具有可能致命的过敏反应的危险。因此，需要弱化的花粉蛋白或花粉抽提物用于免疫治疗，以减少或消除过敏反应的可能性。还需要一种生理学上安全的系统，它可测定具体患者的过敏原是否是二硫蛋白。；另外，能减轻过敏症状但少产生副作用的滴眼液、鼻用喷雾、气溶胶或用于蒸发机或加湿器的分散剂，与常规可得的产品相比将是极其有价值的。
发明简述本发明的目的是提供一种减少含非硫堇素半胱氨酸的蛋白质的方法。
本发明的第二个目的是提供如下方法，单独利用硫醇氧化还原蛋白或联用还原剂或还原系统来减少面粉或种子中的麦谷蛋白或麦胶蛋白。
本发明的还有一个目的是提供单独用硫醇氧化还原蛋白或联用还原剂或还原系统来改进生面团强度和烘烤食品的特性，例如更好的面包屑质量、烘烤食品的柔软度和更大的面包体积。
本发明的另一个目的是提供一种含有用于实施这些方法的硫醇氧化还原蛋白的制剂。
本发明的另一个目的是提供一种从稻、玉米、大豆、大麦、燕麦、木薯、高粱或粟面粉制造生面团的方法。
本发明的另一个目的是提供生产改进的面筋或从小麦和黑麦以外的谷物颗粒生产面筋样产品的方法。
本发明的另一个目的是提供一种还原具有二硫键的酶抑制蛋白的方法。
本发明的还有一个目的是提供表达或过度表达硫氧还蛋白的经基因改造的酵母细胞。
本发明的还有一个目的是提供一种表达或过度表达NADP-硫氧还蛋白还原酶的经基因改造的酵母细胞。
本发明的另一个目的是提供一种使用这些经基因工程改造的酵母细胞改进生面团或烘烤食品质量的方法。
本发明的另一个目的是提供一种还原非硫堇素、非叶绿体蛋白(含有一个以上的分子内半胱氨酸)的分子内二硫键的方法，包括在含有含半胱氨酸的蛋白的液体或物质中加入硫醇氧化还原蛋白，还原硫醇氧化还原蛋白并用硫醇氧化还原蛋白还原含半胱氨酸的蛋白。
本发明的另一个目的是提供一种分离的支链淀粉酶抑制蛋白，它具有二硫键，分子量在8-15kDa之间。
本发明的另一个目的是提供一种能增加衍生自大麦或小麦胚乳的支链淀粉酶活性的方法，包括在含支链淀粉酶的液体或物质中加入硫氧还蛋白，并还原硫氧还蛋白，从而提高支链淀粉酶的活性。
本发明的另一个目的是提供一种方法，来还原具有一个或多个分子内半胱氨酸的动物毒液毒性蛋白质，包括使含半胱氨酸的该蛋白与一定量的硫醇氧化还原(SH)剂接触，有效还原该蛋白，并维持接触足够的时间，来还原一个或多个分子内半胱氨酸形成的一个或多个二硫键，从而还原神经毒素蛋白。硫醇氧化还原(SH)剂可以是还原的硫氧还蛋白、硫氧还蛋白存在下的还原的硫辛酸、DTT或硫氧还蛋白存在下的DTT，而蛇神经毒素蛋白可以是突触前或突触后神经毒素。
本发明的另一个目的是提供一种含有蛇神经毒素蛋白和硫醇氧化还原(SH)剂的组合物。
本发明的另一个目的是提供一种还原具有一个或多个分子内半胱氨酸的动物毒液毒素蛋白的方法，包括使该蛋白与一定量的NADP-硫氧还蛋白还原酶、NADPH或NADPH产生系统和硫氧还蛋白接触，有效还原该蛋白，并维持接触足够的时间，来还原一个或多个分子内半胱氨酸形成的一个或多个二硫键，从而还原该蛋白。
本发明的另一个目的是提供一种在体外灭活具有一个或多个半胱氨酸的蛇神经毒素的方法，包括在含有该毒素的液体中加入硫醇氧化还原(SH)剂，其中该试剂的量能有效还原该毒素。
本发明的另一个目的是提供一种治疗个体毒液中毒的方法，包括施给患毒液中毒的个体有效还原或减轻毒液毒性量的硫醇氧化还原(SH)试剂。
根据本发明的目的，提供了改善生面团特性的方法，包括步骤将硫醇氧化还原蛋白与生面团成分混合，形成生面团并烘烤所述生面团。
还根据本发明的目的，提供了一种灭活谷物食品中酶抑制蛋白的方法，包括步骤将硫醇氧化还原蛋白与种子产物混合，用还原剂或还原系统还原硫醇氧化还原蛋白，并用还原的硫醇氧化还原蛋白还原酶抑制蛋白，该酶抑制蛋白的还原灭活了酶抑制蛋白。
本文所用的硫醇氧化还原蛋白可包括硫氧还蛋白和谷氧还蛋白。硫氧还蛋白包括但不限于大肠杆菌硫氧还蛋白、硫氧还蛋白h、f和m以及动物硫氧还蛋白。本文所用的硫氧还蛋白的还原剂可包括硫辛酸或一种还原系统，如NADPH联合NADP硫氧还蛋白还原酶(NTR)。谷氧还蛋白的还原剂可包括还原的谷胱甘肽联合还原系统NADPH和谷胱甘肽还原酶。NADPH可用NADPH产生蛋白或产生蛋白组合物(如由葡萄糖6-磷酸、NADP和酵母等来源的葡萄糖6-磷酸脱氢酶构成的)所替代。在生面团制备过程一开始时加入NADPH产生蛋白以及硫氧还蛋白和NADP-硫氧还蛋白还原酶。
应注意本发明还可用含半胱氨酸的蛋白质实施。可首先氧化半胱氨酸然后用硫醇氧化还原蛋白还原。
还根据本发明的目的，提供了一种降低变应原性食物蛋白质的变应原性的方法，包括步骤将该蛋白与一定量的硫氧还蛋白、NTR和NADPH或一定量的DTT在硫氧还蛋白存在下接触，有效降低该蛋白质的变应原性，并按下列步骤将该接触过的蛋白质给予(a)某动物，从而减少所述动物中的变应原性症状，该症状在该动物接受未处理蛋白时原本会发生。
本发明的另一个目的是提供一种低变应原性的可吸收食品。通过之前用硫氧还蛋白在NTR和NADPH存在下处理，使食物降低变应原性。食物可以是牛肉、牛奶、大豆、鸡蛋、稻或小麦。
本发明的另一个目的是提供一种改进蛋白酶水解的方法，从而改善了食物和变应原性蛋白的可消化性，因而还提供了更加容易消化的许多是变应原性的食物。所制备的食品和变应原在先用硫氧还蛋白在硫氧还蛋白的还原剂(如上文所述的那些)存在下处理后，更易被蛋白酶水解，更容易消化。
合适的食物包括大豆、坚果、牛奶、乳清、牛肉、鸡蛋、面包、其它小麦产品和其它谷物产品。
本发明的另一个目的是提供一种降低变应原性花粉蛋白的变应原性的方法，包括步骤将该蛋白与一定量的还原的硫氧还蛋白接触，有效减少该蛋白的变应原性，并将用硫氧还蛋白还原的蛋白以免疫治疗性剂量施给某动物，从而降低了所述动物的变应原性症状，这些症状在该动物接触未处理的蛋白时原本会发生。
本发明的另一个目的是提供一种降低变应原性的花粉或具有还原的二硫键的花粉蛋白，用于免疫治疗。
本发明的另一个目的是提供一种测定某具体病人的变应原是否是二硫键蛋白的方法，包括对所述病人进行变应原测试，以鉴定所述变应原，用还原的硫氧还蛋白体外处理所述鉴定出的变应原蛋白，并分析所述处理的变应原蛋白二硫键的还原情况。
附图简述


图1是柱状图，显示通过用还原的硫氧还蛋白处理大豆变应原性抽提物，减轻了皮肤测试对大豆变应原性反应。
图2是柱状图，显示通过用还原的硫氧还蛋白处理牛奶变应原性抽提物，减轻了皮肤测试对牛奶变应原性反应。
图3是柱状图，显示通过用还原的硫氧还蛋白处理小麦变应原性抽提物，减轻了皮肤测试对小麦变应原性反应。
图4是柱状图，显示在室温下通过用还原的硫氧还蛋白处理牛肉变应原性抽提物，减轻了皮肤测试对牛肉变应原性反应。
图5是柱状图，显示通过37℃下通过用还原的硫氧还蛋白处理牛肉变应原性抽提物，减轻了皮肤测试对牛肉变应原性反应。
图6是柱状图，显示用还原的硫氧还蛋白处理食物，减轻了对大豆和小麦的胃肠道变应原性反应。
图7是SDS聚丙烯酰胺电泳胶的照片，用荧光和蛋白染色方法显示了硫氧还蛋白相关的和谷胱甘肽相关的还原的程度。
图8是氧化的牛β-乳球蛋白的四级结构图，显示了二硫键和游离的巯基。
图9是一张蛋白染色的SDS聚丙烯酰胺电泳胶照片，显示了与硫氧还蛋白相关的还原对牛β-乳球蛋白的胃蛋白酶消化的影响。
图10A代表了蛋白染色的SDS聚丙烯酰胺电泳胶照片，显示了时间对未处理牛奶消化的作用。
图10B代表了蛋白染色的SDS聚丙烯酰胺电泳胶照片，显示了在55℃经过硫氧还蛋白相关的还原后，时间对牛奶消化的影响。
图10C代表了蛋白染色的SDS聚丙烯酰胺电泳胶照片，显示了在4℃经过硫氧还蛋白相关的还原后，时间对牛奶消化的影响。
图11A是柱状图，显示在对牛奶高度敏感的狗中皮肤测试反应与硫氧还蛋白有关的减轻。
图11B是柱状图，显示在对牛奶轻度敏感的狗中皮肤测试反应与硫氧还蛋白有关的减轻。
图12A是柱状图，显示硫氧还蛋白相关的还原和可消化性对β-乳球蛋白变应原性的影响。
图12B是柱状图，显示硫氧还蛋白相关的还原和可消化性对牛奶变应原性的影响。
图13是氧化的牛β-乳球蛋白四级结构图，显示了小鼠抗体(MAb)的表位。
图14是计算机产生的牛β-乳球蛋白四级结构分子模型，显示在半胱氨酸诱变后，预计的单克隆抗体表位的变化。
图15是SDS聚丙烯酰胺电泳胶的照片，用荧光显示了硫氧还蛋白相关的和谷胱甘肽有关的还原的程度。
图16A是一张蛋白染色的SDS聚丙烯酰胺电泳胶照片，显示了时间对未处理的豚草变应原Amb vt V消化的影响。
图16B是一张蛋白染色的SDS聚丙烯酰胺电泳胶照片，显示了在硫氧还蛋白相关的还原后，时间对豚草变应原Amb vt V消化的影响。
图17A是柱状图，显示了硫氧还蛋白相关的还原和胃蛋白酶对大豚草花粉抽提物的变应原性的影响，该狗对含二硫键的蛋白质敏感。
图17B是柱状图，显示了硫氧还蛋白相关的还原和胃蛋白酶可消化性对大豚草花粉抽提物在狗中的的变应原性的影响，该狗对含二硫键的蛋白不大敏感。
图18A是蛋白染色SDS聚丙烯酰胺电泳胶的照片，显示了在4℃发生硫氧还蛋白相关的还原后，时间对豚草花粉消化的影响。
图18B是蛋白染色SDS聚丙烯酰胺电泳胶的照片，显示了在37℃和55℃发生硫氧还蛋白相关的还原后，时间对豚草花粉消化的影响。
发明详述根据本文的详细描述，下列定义和缩写表示CM -某种面包小麦α-淀粉酶抑制蛋白DSG-从硬粒小麦分离到的某种α-淀粉酶抑制蛋白DTNB -2’5’-二硫二(2-硝基苯甲酸)NTR- -NADP-硫氧还蛋白还原酶
mBBr -一溴二满(monobromobimane)NADP-MDH -NADP-苹果酸脱氢酶FBPase -果糖-1，6-二磷酸酶SDS -十二烷基磺酸钠DTT -二硫苏糖醇谷物 -粟、小麦、燕麦、大麦、稻、高粱或黑麦BBTI -Bowman-Birk大豆胰蛋白酶抑制蛋白KTI -Kunitz大豆胰蛋白酶抑制蛋白PAGE -聚丙烯酰胺凝胶电泳TCA -三氯乙酸酶抑制蛋白实验起始材料材料从实验室储藏获得了面包小麦Triticum aestivum L，cv.Talent和硬粒小麦(Triticun durum.Desf.，cv.Mondur)。
试剂从Sigma Chmical Co.和Biorad laboratories分别购得了用于酶实验和十二烷基磺酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳的化学药品和精制化学药品。一溴二满(mBBR，商品名Thiolite)购自Calbiochem。其它化学药品是商品购得的，并且是可得到的最高质量。
酶大肠杆菌的硫氧还蛋白和NTR购自American Diagnoticsm，Inc.，还从转化过度表达各蛋白的细胞中分离得到。含有重组质粒pFP1的硫氧还蛋白菌株是由Dr.J.-P.Jacquot(de la Motte Guery，F.等(1991)Eur.J.Biochem.196287-294)慷慨赠与的。含有重组质粒pPMR21的NTR菌株是由Dr.Marjorie Russel和PeterModel(Russel，M.等(1988)J.Biol.Chem.2639015-9019)慷慨赠与的。这些蛋白的分离程序如研究中所述，进行了下列改变在Ribi细胞分级器中以25,000psi破碎细胞，如Florencio等(Florencio，F.J.等(1988)Arch.Biochem.Biophys.266496-507)所述纯化NTR，而没有红琼脂糖步骤。用Florencio等开发的，用于菠菜叶的方法分离得到酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(面包师酵母1型)的硫氧还蛋白和NTR，进行了下列改变在Ribi细胞分级器中以40,000psi破碎悬浮细胞[1份细胞5份缓冲液(w/v)]，进行3次。
从麦芽中用菠菜叶的方法(Florencio，F.J.等(1988)Arch.Biochem.Biophys.266496-507)分离得到硫氧还蛋白h和NTR。从玉米(Jacquot，J.-P.等(1981)PlantPhysiol.68300-304)和菠菜(Crawford，N.A.等(1989)Arch.Biochem.Biophys.271223-239)的叶子分别纯化了NADP-苹果酸脱氢酶(NADP-MDH)和果糖-1，6-二磷酸酶(FBPase)。从教授A.Holmgren获得了大肠杆菌谷氧还蛋白和胎牛胸腺硫氧还蛋白。
α-淀粉酶和胰蛋白酶抑制蛋白从面包小麦面粉的清蛋白-谷氧还蛋白组分中，如前所述(Kobrehel，K.等(1991)Cereal Chem.681-6)分离得到CM-1蛋白。还用已发表的方法从硬粒小麦的麦谷蛋白组分中分离了DSG蛋白(DSG-1和DSG-2)(Kobrehel，K.等(1989)J.Sci.Food Agric 48441-452)。在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中CM-1、DSG-1和DSG-2蛋白是同源的。从Sigma Chemical Co.购得胰蛋白酶抑制蛋白，除了来自玉米芯的蛋白是购自Fluca。就所有情况而言，商品制备物显示在SDS-PAGE中如预计泳动的一种蛋白组分(考马斯蓝染色)，但在某些制备物中，条带不明显。
其它蛋白质面包小麦中的嘌呤硫堇素α和硬粒小麦的嘌呤硫堇素α-1和β是Dr.D.D.Kasarda和B.L.Jones分别慷慨赠与的。当用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测时，嘌呤硫堇素α样品含有两个嘌呤硫堇素家族的成员。嘌呤硫堇素α-1和β样品在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中是均一的。
常规方法步骤酶激活实验NADP-MDH、FBPase、NTR和硫氧还蛋白h试验方法按照Florencio，F.J.等(1988)Arch.Biochem.Biophys.266496-507，如标明作了轻微改动。对于酶激活试验，预培养时间是20分钟，除非另外说明。
mBBr荧光标记和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析用Crawford等的方法经改进测定了研究蛋白质的直接还原(Crawford，N.A.等(1989)Arch.Biochem.Biophys.271223-239)。在100mM pH7.1，含有10mMEDTA和16％甘油，最终体积为0.1ml的磷酸钾缓冲液中进行反应。如所示，在含有1mMNADPH和10微克(2-17μM)的靶蛋白的70微升缓冲溶液中，加入0.7微克(0.1μM)NTR和1微克(0.8μM)硫氧还蛋白(都从大肠杆菌常规制备)。当硫氧还蛋白被二硫苏糖醇(DTT，0.5mM)还原时，省略NADPH和NTR。类似用还原的谷胱甘肽进行了试验，但最终浓度是1mM。培育20分钟后，加入100纳摩尔mBBr，继续反应15分钟。为了停止反应并衍生出过量的mBBr，加入10微升10％的SDS和10微升100mMβ-巯基乙醇，然后将样品加到凝胶上。就用谷氧还蛋白还原而言，用1微克(0.8μM)大肠杆菌谷氧还蛋白、1.4微克(0.14μM)从菠菜叶子纯化得到的谷胱甘肽还原酶(Florencio，F.J.等(1988)Arch.Biochem.Biophys.266496-507)替换硫氧还蛋白和NTR，并使用了1.5mM NADPH。
按照Laemmli(Laemmli，U.K.(1970)Nature 227680-685)制备了凝胶(17.5％w/v，1.5mm厚)并在稳定电流(9mA)下电泳16小时。电泳后，将凝胶置于40％甲醇和10％乙酸的溶液中，浸4-6小时，换几次溶液。然后按照Crawford等(Crawford，N.A>等(1989)Arch.Biochem.Biophys.271223-239)用纯紫外光检测凝胶中的荧光条带并拍照(曝光时间25秒)。最后，用考马斯蓝染色并如前脱色(Crawford，N.A.(1989)Arch.Biochem.Biophys.271223-239)。
标记蛋白的定量测定为了获得测试蛋白质被NADP/硫氧还蛋白系统还原程度的定量指标，用修改的Crawford等(Crawford，N.A.(1989)Arch.Biochem.Biophys.271223-239)的方法评估了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中所见的荧光条带的强度。用PharmaciaUltrascan激光密度计扫描了照相底片，并通过与标准曲线比较测定了各蛋白的峰面积。对于后一种测定，在0.5mM DTT存在下100℃加热3分钟，还原了各蛋白(浓度范围在1-5微克之间)。然后如上所述进行mBBr标记，除了用SDS停止反应后，将标准蛋白100℃加热2分钟，并用β-巯基乙醇衍生过量的mBBr。由于荧光条带的强度与加入的蛋白质量成比例，猜想在所用的条件下完成了反应。
实施例1α-淀粉酶抑制蛋白的硫氧还蛋白相关的还原酶激活试验在叶绿体酶激活中替换一种特定的硫氧还蛋白的能力是一种测试，用于测试某给定蛋白质的硫醇基团经受可逆氧化还原变化的能力。尽管在质体外蛋白的情况下不是生理状态，但是该试验已证明在几种研究中是有用的。一个相关的例子是嘌呤硫堇素，当它被硫氧还蛋白h还原时激活叶绿体FBPase(Wada，K.等(1981)FEBS Lett.124237-240和Johnson，T.C.等(1987)Plant Physiol.85446-451)。FBPase(其生理上的激活蛋白是硫氧还蛋白f)不受硫氧还蛋白h的影响。在该实施例中，如前所述测试了富含半胱氨酸的蛋白激活FBPase和NADP-MDH的能力。发现硬粒小麦(DSG-1和DSG-2)的α-淀粉酶抑制蛋白对于酶激活是有效的；然而它们与嘌呤硫堇素的不同之处在于显示对NADP-MDH的特异性，而不是FBPase的特异性(表I)。仅在还原的硫氧还蛋白h存在下α-淀粉酶抑制蛋白才具有活性，而硫氧还蛋白h本身在这些条件下不显著激活NADP-MDH。根据反应顺序(DTT→硫氧还蛋白→DSG→NADP-MDH)，DSG-1和DSG-2在DTT-还原的硫氧还蛋白h存在下激活NADP-苹果酸脱氢酶。包含在200微升100mMTris-HCl缓冲液，pH7.9中用于激活的整个系统是10mMDTT、0.7微克玉米叶NADP-MDH、0.25微克小麦硫氧还蛋白h和10微克DSG-1或DSG-2。在一个研究中使用20mMβ-巯基乙醇(β-MET)代替DTT。预培养后，用分光光度测量法分析了NADP-MDH。
在酶激活试验中，DTT还原了硫氧还蛋白h；如预期的，一硫醇如β-巯基乙醇(β-MET)在这些条件下不以显著的速率还原硫氧还蛋白(Jacquot，J.-P.等(1981)Plant Physiol.68300-304；Nishizawa，A.N.等(1982)“叶绿体分子生物学的方法”，(M.Edelman，R.B.Hallick和N.-H.Chua，编)pp.707-714，ElsevierBiomedical Press，New York，和Crawford，N.A.等(1989)Arch.Biochem.Biophys.271233-239)，不替换DTT。
NADP-MDH活性与加入的DSG-1和DSG-2水平在一恒定的硫氧还蛋白h浓度下成比例。如前述使用相同的DTT计算公式。除了改变DSG-1或DSG-2的浓度，条件与前述相同。当在固定的DSG浓度下测试时，NADP-MDH显示了随着硫氧还蛋白h增加活性增加。除了改变硫氧还蛋白h浓度，条件如上述。
当如表I所示使用20微克CM-1时，CM-1-面包小麦蛋白与DSG蛋白相似，但分子量较低—也激活了NADP-MDH，但不激活FBPase。该结果表明硫氧还蛋白h能还原各种α-淀粉酶抑制蛋白，它们进而按照等式4-6激活NADP-MDH。当在缺乏硫氧还蛋白时加入DTT，这些蛋白在酶激活中是无效的。
(4)DTT还原+硫氧还蛋白h氧化→硫氧还蛋白h还原+DTT氧化(5)α-淀粉酶抑制蛋白氧化+硫氧还蛋白h还原→α-淀粉酶抑制蛋白还原+硫氧还蛋白h氧化(6)α-淀粉酶抑制蛋白还原+NADP-MDH氧化→α-淀粉酶抑制蛋白氧化+NADP-MDH氧化(无活性) (有活性)表I硫氧还蛋白还原的胰蛋白酶抑制蛋白、硫堇素和α-淀粉酶抑制蛋白在激活叶绿体NADP-苹果酸脱氢酶和果糖二磷酸酶中的作用(DTT→硫氧还蛋白→标出的蛋白→目标酶)如上所述在该实施例中进行了NADPH-MDH的激活，除了测试的DSG或其它蛋白的量是20微克。采用标准DTT试验，用1微克大肠杆菌硫氧还蛋白和20微克示出的蛋白测试了FBPase的激活。对于大肠杆菌硫氧还蛋白在这些条件下所见的有限活性纠正上述值。*活性，nkat/mg数值蛋白质 Mr，kDaS-S组NADP-MDH FBPaseα-淀粉酶抑制蛋白**DSG-2 17 52 0**DSG-1 14 52 0 12 5 12 0胰蛋白酶抑制蛋白富含半胱氨酸(植物)玉米芯 12 55 0大豆Bowman-Birk 8 73 0其它种类类卵粘蛋白 28 92 0大豆Kunitz 20 22 0卵抑制蛋白 49 14 1 0牛肺(抑酶肽)7 3痕量 2硫堇素**嘌呤硫堇素-α16 41 39**嘌呤硫堇素-β 6 4痕量 5 嘌呤硫堇素-α 6 40 14*这些值与用菠菜叶绿体硫氧还蛋白m(NADP-MDH)和硫氧还蛋白f获得的相应值40和550分别比较。**来自硬粒小麦 实施例2DTNB还原试验硫醇氧化还原能力的第二个测试是测试催化巯基试剂2’，5’-二硫二(2-硝基苯甲酸)(DTNB)还原的能力，通过412nm处的吸光值增加来测定。此处，分析的蛋白质是由NADPH通过NTR和硫氧还蛋白还原的。证实DTNB试验对硬粒(DSG-1和2)和面包小麦(CM-1)的α-淀粉酶抑制蛋白都是有效的。当被NADP/硫氧还蛋白系统(在这种情况下使用大肠杆菌的NTR和硫氧还蛋白)还原时，DSG-1或DSG-2显著提高了DTNB的还原(NADPH→NTR→硫氧还蛋白→DSG→DTNB)。用10微克硫氧还蛋白和10微克NTR和20微克DSG-1或DSG-2进行了DTNB还原试验。CM-1在DTNB还原试验中也是有效的，而且像用NADPH-MDH激活(表I)那样，可检测到比DSG蛋白更高的活性。CM-1试验的条件与DSG/DTNB试验相同，除了省去DSG蛋白和使用嘌呤硫堇素α20微克或使用20微克CM-1。因此，该结果证实了实施例1中的酶激活试验，并显示可用NADP/硫氧还蛋白系统从生理上还原α-淀粉酶抑制蛋白。在等式7-9中总结了这些条件下α-淀粉酶抑制蛋白在促进DTNB还原中的作用。
(8)硫氧还蛋白还原+α-淀粉酶抑制蛋白氧化→硫氧还蛋白氧化+α-淀粉酶抑制蛋白还原(9)α-淀粉酶抑制蛋白还原+DTNB氧化→α-淀粉酶抑制蛋白氧化+DTNB还原实施例3
蛋白质还原的测定一溴二满(mBBr)的可获得性及其用于植物系统的适应性提供了一种测量植物蛋白的巯基的新技术(Crawford，N.A.等(1989)Arch.Biochem.Biophys.271223-239)。当与SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳联用时，mBBr甚至可用于定量测定复杂混合物中氧化还原活性蛋白的巯基状态的变化。因此将该技术应用于该抑制蛋白质，来证实其被硫氧还蛋白还原的能力。此处，用硫氧还蛋白还原了测试的蛋白质，其中硫氧还蛋白本身先前已用DTT或NADPH和NTR还原。然后制备还原蛋白质的mBBr衍生物，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳与其它组分分开，并用荧光检测了它的还原状态。在下文所述的试验中，发现大肠杆菌的硫氧还蛋白能有效还原各种靶蛋白。平行实验揭示了硫氧还蛋白h和胎牛胸腺硫氧还蛋白分别还原了种子和动物来源的这种蛋白质。
在酶激活和染料还原实验的验证中，在硫氧还蛋白的存在下有效还原了DSG-1。培育后用mBBr衍生得到这些蛋白质，并在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后使荧光显示。单用DTT还原少得多，用GSH不显著。在还原CM-1和DSG-2中(数据未显示)中观察到对硫氧还蛋白的类似要求。虽然使用大肠杆菌的硫氧还蛋白，用小麦硫氧还蛋白h得到了类似结果。当用NADPH和NTR替换DTT(数据未显示)时，也需要硫氧还蛋白。
实施例4富含半胱氨酸的植物胰蛋白酶抑制蛋白与硫氧还蛋白相关的还原当小麦种子的主要可溶性富含半胱氨酸的蛋白以外源性α-淀粉酶抑制蛋白起作用时，大部分其它种子富含半胱氨酸的蛋白缺乏该活性，而且在某些情况下，起着动物来源的胰蛋白酶的特异性抑制蛋白。虽然这些蛋白可用强化学还原剂，如硼氢化钠还原(Birk，Y.(1985)Int.J.Peptide Protein Res.25113-131和Birl，Y.(1976)Meth.Enzymol.45695-7390)还原这些蛋白，但是几乎没有证据证明它们可在生理条件下被还原。因此感兴趣的是测试胰蛋白酶抑制蛋白被硫氧还蛋白还原的能力。测试的富含半胱氨酸的代表包括大豆Bowman-Birk和玉米芯胰蛋白酶抑制蛋白。两种情况的结果都是阳性当在DTT-还原的硫氧还蛋白(表I)存在下加入时，各抑制蛋白激活了NADPH-MDH(但不是FBPase)，每种都在NADPH、NTR和硫氧还蛋白(数据未显示)存在下还原了DTNB。
如同α-淀粉酶抑制蛋白所发现的，可直接通过mBBr/SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术监测富含半胱氨酸的胰蛋白酶抑制蛋白依赖硫氧还蛋白的还原。因此，仅在还原的硫氧还蛋白和Bowman-Birk(BBTI)抑制蛋白(显示高荧光迅速移动条带)和玉米芯(CKTI)胰蛋白酶抑制蛋白(显示在硫氧还蛋白后的高荧光条带迁移)同时存在下，才能观察到DTT的显著还原作用。
实施例5其它胰蛋白酶抑制蛋白和嘌呤硫堇素的硫氧还蛋白相关的还原鉴于发现种子的富含半胱氨酸的胰蛋白酶抑制蛋白能经历硫氧还蛋白的特异性还原，提出了如下问题，即是否其它种类的胰蛋白酶抑制蛋白也具有这种能力。在本研究的过程中，测试了数种这样的抑制蛋白-大豆Kunitz、牛肺抑酶肽、卵清卵蛋白抑制剂和类卵粘蛋白胰蛋白酶抑制蛋白。虽然测试的参数不像上述的富含半胱氨酸的蛋白那样广泛，但发现其它胰蛋白酶抑制蛋白也显示能被硫氧还蛋白特异性还原，如用酶激活和mBBr/SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定的那样。如上述富含半胱氨酸蛋白质的情况而言，在研究该阶段测试的胰蛋白酶抑制蛋白(大豆Kunitz和动物胰蛋白酶抑制蛋白)激活了NADP-MDH而不激活FBPase(表I)。牛肺抑酶肽是一个例外，因为它激活FBPase比激活NADP-MDH更有效。还需注意该抑酶肽与本文研究的某些种子蛋白相似，在于它显示高含量半胱氨酸(约10％)(Kassel，B.等(1965)Biochem.Biophys.Res.Commun.20463-468)。
通过在mBBr/SDS-聚丙烯酰胺电泳胶中高荧光缓慢移动的条带，显示了这些蛋白之一Kunitz抑制蛋白的硫氧还蛋白相关的还原的荧光证据。在其还原形式中，Kunitz抑制蛋白也产生荧光快速移动的条带。该较低分子量物质的性质未知。它在凝胶上的位置提示，它可能代表作为Kunitz制备物中一种污染物的Bowman-Birk抑制蛋白；然而，这种组分在用考马斯蓝染色的SDS胶中不明显。这种动物抑制蛋白产生了预期分子量的一条荧光条带，也显示还原需要硫氧还蛋白(数据未显示)。
在较早期的结果的验证中，硫氧还蛋白还原的嘌呤硫堇素始终激活FBPase，而更早测试的类型嘌呤硫堇素-α不能激活产生了NADP-MDH(表I)(Wada，K.(1981)FEBS Letter 124237-240)。然而，与面包小麦的嘌呤硫堇素-α相反，这两种之前未检测的嘌呤硫堇素(嘌呤硫堇素α-1和β，来自硬粒小麦)以可检测水平激活了NADP-MDH(表I)。两种硬粒小麦嘌呤硫堇素在其激活FBPase的能力上也不同。这些嘌呤硫堇素之间的活性差异在考虑其氨基酸序列(Jones，B.L.等(1977)Cereal Chem.554511-523)及其经历硫氧还蛋白还原的能力上的强烈相似性时是出乎意料的。用SDS-PAGE荧光法观察到嘌呤硫堇素(此处是α型)的还原需要硫氧还蛋白。
实施例6还原的定量测定上述实施例证明了硫氧还蛋白能还原各种蛋白质，包括α-淀粉酶，如CM和DSG抑制蛋白，和种子和动物来源的胰蛋白酶抑制蛋白。虽然在质量意义上是明显的，但是上述结果对于还原程度未给出定量指标。因此，按照Crawford等(Crawford，N.A.等(1989)Arch.Biochem.Biophys.271223-239)的方案进行了实验。
如表II所示，大肠杆菌NADP/硫氧还蛋白系统还原种子抑制蛋白的程度视时间而定，并且视蛋白质而定，在2小时后达到15-48％还原。根据主要蛋白组分发射的荧光，结果表明硫氧还蛋白在α-淀粉酶和胰蛋白酶抑制蛋白的还原中起催化作用。2小时后还原的蛋白与加入的硫氧还蛋白的比率比两种还原最多的蛋白(大豆Bowman-Birk胰蛋白酶抑制蛋白)和最少的蛋白(玉米芯胰蛋白酶抑制蛋白)之一大，即这两种蛋白2小时还原期后比率是7和2。应注意表II中的值是在标准试验条件下获得的，未尝试通过修改这些条件优化还原。
表II用mBBr/SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分析NADP/硫氧还蛋白系统还原种子蛋白的程度使用了下列蛋白浓度(纳摩尔)硫氧还蛋白0.08；嘌呤硫堇素-β1.7；DSG-1，0.7；玉米芯胰蛋白酶抑制蛋白，1.0；Bowman-Birk胰蛋白酶抑制蛋白，1.3；和Kunitz胰蛋白酶抑制蛋白，0.5；除了标出时间差异，其它条件与实施例1-4中相同。
％还原蛋白质 20分钟120分钟嘌呤硫堇素-β 1532DSG-1 2238玉米芯胰蛋白酶抑制蛋白 3 15Bowman-Birk胰蛋白酶抑制蛋白2548Kunitz胰蛋白酶抑制蛋白 1422实施例7作为还原剂的大肠杆菌谷氧还蛋白已知细菌和动物含有一种硫醇氧化还原蛋白，谷氧还蛋白，它能替换在核糖核苷还原等反应中的硫氧还蛋白(Holmgren，A.(1985)Annu.Rev.Biochem.54237-271)如等式10和11所示还原谷氧还蛋白。 (11)2GSH+谷氧还蛋白氧化→GSSG+谷氧还蛋白还原目前没有证据证明谷氧还蛋白与高等植物的蛋白质相互作用。用大肠杆菌的谷氧还蛋白和目前正在研究的种子蛋白测试了该能力。用mBBr/SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法联合密度计扫描监测了还原作用。观察到在前面描述的条件下，谷氧还蛋白能在某些但不是所有情况下替换硫氧还蛋白。因此，发现谷氧还蛋白在下列物质还原中有活性(数据表明相对于大肠杆菌硫氧还蛋白的还原百分数)DSG-1和CM-1α-淀粉酶抑制蛋白(分别是147％和210％)；玉米芯胰蛋白酶抑制蛋白(424％)；和嘌呤硫堇素(对于α、α1和β形式来说，分别是82％、133％和120％)。谷氧还蛋白对于DSG-2α-淀粉酶抑制蛋白和大豆Bowman-Birk和Kunitz胰蛋白酶抑制蛋白无效。动物来源的胰蛋白酶抑制蛋白还显示对谷氧还蛋白的混合的反应。卵清卵抑制蛋白可被有效还原(相对于大肠杆菌硫氧还蛋白还原了55％)，而卵清类卵粘蛋白抑制蛋白和牛肺抑酶肽不受影响。显然如前面所报道的(Wolosiuk，R.A.等(1977)Nature 266565-567)，谷氧还蛋白不能替代硫氧还蛋白，作为叶绿体硫氧还蛋白相关的酶，FBPase和NADP-MDH的激活中的直接还原剂(数据未显示)。
上述实施例显示了一些测试的酶抑制蛋白可被谷氧还蛋白以及硫氧还蛋白所还原。对于硫氧还蛋白特异性的那些包括α-淀粉酶抑制蛋白(DSG-2)和几种胰蛋白酶抑制蛋白(Kunitz，Bowman-Birk，抑酶肽和类卵粘蛋白抑制蛋白)。被硫氧还蛋白或谷氧还蛋白还原的那些蛋白质包括嘌呤硫堇素、两种α-淀粉酶抑制蛋白(DSG-1、CM-1)、一种植物的富含半胱氨酸的胰蛋白酶抑制蛋白(玉米芯抑制蛋白)和动物的胰蛋白酶抑制蛋白(卵清卵抑制蛋白)。这些结果提出了如下问题，即在植物中是否存在谷氧还蛋白。据报道谷氧还蛋白存在于绿藻中(Tsang，M.L.-S.(1981)Plant Physiol.681098-1104)，但不存在于高等植物。
虽然表I显示的NADP-MDH和FBPase靶酶的活性比下面用生理性叶绿体蛋白(硫氧还蛋白m或f)激活后所见到的活性低，但重复发现这些数值因此认为它们是真实的。似乎可能是这些抑制蛋白显示的酶比活力虽然不是生理学上相关的，但是反映了还原所实现的特定结构。仍然要看在种子或动物细胞中这样的还原结构是否与功能相关。
由于靶蛋白的功能尚不清楚，对硫氧还蛋白(或谷氧还蛋白)相关的还原的生理后果引起了相当的兴趣。本结果提供了一种新的可能性。硫氧还蛋白在生理条件下还原各种各样抑制蛋白的发现提示，在不存在区室屏障时，还原可在细胞中发生。
实施例8大豆粕中大豆胰蛋白酶抑制蛋白的灭活本实施例的目的是灭活大豆的Bowman-Birk和Kunitz胰蛋白酶抑制蛋白。对动物饲料制品使用下列方案。在10g大豆粕中加入0.2微克硫氧还蛋白、0.1微克NADP-硫氧还蛋白还原酶和500纳摩尔NADPH与30mMTris-HCl缓冲液，pH7.9，5.25毫升。使上述混合物在室温下保持30分钟。用如前所述的mBBr荧光标记/SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(Kobrehel，K.等(1991)J.Biol.Chem.26616135-16140)测定大豆胰蛋白酶抑制蛋白的直接还原。用改进的胰岛素和BAEE试验(Na-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯)(Schoellmann，G.等(1963)Biochemistry2521963；Gonias，S.L.等(1983)J.Biol.Chem.25814682)进行了处理过的面粉的胰蛋白酶活性的分析。从该分析确定，用NADP/硫氧还蛋白系统处理大豆粕不抑制胰蛋白酶。
实施例9谷物中α-淀粉酶抑制蛋白的灭活在10g大麦麦芽中加入0.2微克硫氧还蛋白、0.1微克NADP-硫氧还蛋白还原酶和500纳摩尔NADPH，以及1M HCl缓冲液，pH7.9，得到5.25毫升30mM的Tris-HCl。上述混合物在室温下放置30分钟。用如前所述的mBBr荧光标记/SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(Kobrehel，K.等(1991)J.Biol.Chem.26616135-16140)测定α-淀粉酶抑制蛋白的直接还原。跟踪淀粉中麦芽糖的释放监测α-淀粉酶的活性(Bernfeld，P.(1955)Method in Enzymol.1149)。从该分析确定用NADP/硫氧还蛋白系统处理大麦不抑制α-淀粉酶。
谷物蛋白的还原材料和方法植物材料Dr.K.Kahn慷慨赠送了硬粒小麦的种子和胚乳粉(Triticum durum，Desf.cv.Monroe)。
小麦种子的发芽将20-30个种子置于塑料培养皿中的3层Whatman#1滤纸上，滤纸用5毫升去离子水湿润。在暗室中室温下发芽4日。
试剂/精制化学药品从Sigma Chmical Co.(St.Louis，MO)获得了生物化学物质和冻干的偶联酶。从American Diagnostica，Inc.(Greenwich，CT)购得大肠杆菌硫氧还蛋白和NTR。按照开发菠菜叶子的方法(Florencio，F.J.等(1988)，Arch.Biochem.Biophys.266496-507)从幼苗中分离出小麦硫氧还蛋白h和NTR。大肠杆菌谷氧还蛋白是A.Holmgren教授慷慨赠与的。从Bio-Rad Laboratories(Richmond，CA)购得SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的试剂。一溴二满(mBBr)或Thiolite从Calbiochem Co.(SanDiego，CA)获得。乳酸铝和甲基绿是Fluka Chmical Co.(Buchs，Switzerland)的产品。
麦胶蛋白和麦谷蛋白为了分离不溶性储藏蛋白，用1毫升下列溶液依次在25℃下，指定时间内抽提胚乳粉(0.2克)(1)50mM Tris-HCl，pH7.5(20分钟)；(2)70％乙醇(2小时)；和(3)0.1M乙酸(2小时)。在萃取时，样品置于电子旋转器上，并用漩涡混合器不时搅拌。在用各溶剂萃取后，离心样品(12,000rpm5分钟)于Eppendorf微量离心管中，并保存上清液组分用于分析。在每次萃取之间，用1毫升水洗涤沉淀，如前用离心收集，丢弃上清液洗涤组分。依照惯例，组分称为(1)清蛋白/球蛋白；(2)麦胶蛋白；和(3)麦谷蛋白。
蛋白质的体外mBBr标记在100mM Tris-HCl缓冲液pH7.9下进行反应。如指出的，在70微升含有1mMNADPH和10微克靶蛋白的该缓冲液中加入0.7微克NTR和1微克硫氧还蛋白(都来自大肠杆菌，除非另外说明)。当硫氧还蛋白被二硫苏糖醇(DTT)还原时，省去NADPH和NTR，将DTT加到0.5mM。类似的用还原的谷胱甘肽进行了试验，但最终浓度是1mM。培育20分钟后，加入100纳摩尔mBBr，反应再继续15分钟。为了终止反应并衍生过量的mBBr，加入10微升10％SDS和10微升100mM β-巯基乙醇，然后在凝胶内加入样品。对于谷氧还蛋白的还原，用1微克大肠杆菌谷氧还蛋白、1.4微克谷胱甘肽还原酶(从菠菜叶子中纯化)和1.5mM NADPH代替硫氧还蛋白和NTR。
蛋白质的体内mBBr标记在指定时间，从培养皿中取下干种子或发芽幼苗(根据相似的根长度选择)，并取下其种胚或已发芽的轴。对每批5个胚乳称重，然后在液氮下，用研钵和捣棒研磨。在最后一点液氮消失时，加入1毫升2.0mM mBBr(溶于100mM Tris-HCl，pH7.9的缓冲溶液)。然后再次研磨融化的混合物一分钟，将其转移到微量离心管中。用合适的mBBr或缓冲溶液将悬液体积调节到1毫升。从胚乳或发芽的幼苗如上所述抽提清蛋白/球蛋白、麦胶蛋白和麦谷蛋白的蛋白组分。将抽提的蛋白组分储藏在-20℃，直到使用。每个时间点包括一缓冲对照。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳在15％凝胶，pH8.5下，如Laemmli，U.K.(1970)Nature 227680-685进行了mBBr衍生样品的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。1.5mm厚的凝胶在9mA恒定电流下电泳16小时。
天然凝胶电泳为了溶解不同类型的麦胶蛋白，在6％凝胶内如Bushuk和Zillman(Bushuk，W.等(1978)Can.J.Plant Sci.58505-515)所述，并根据Sapirstein和Bushuk(Sapirstein，H.D.等(1985)Cereal Chem.62372-377)对于垂直平板凝胶修改，进行天然聚丙烯酰胺凝胶电泳(设计用于将麦胶蛋白分成4类的方法)。最终体积为100毫升的凝胶溶液含有6.0克丙烯酰胺、0.3克双丙烯酰胺、0.024克抗坏血酸、0.2毫克七水硫酸亚铁和0.25克乳酸铝。用乳酸将pH调节到3.1。在冰上对凝胶溶液脱气2小时，然后加入0.5毫升3％过氧化氢作为聚合催化剂。将电泳缓冲液也用乳酸调节到pH3.1，每升含有0.5克乳酸铝。电泳在恒定电流50mA下持续约4小时。当用甲基绿跟踪染料标记的溶剂前沿泳动到离凝胶末端约1厘米时，停止电泳。
mBBr的去除/荧光照片电泳后，将凝胶置于12％(w/v)三氯乙酸中，浸泡4-6小时，更换一次溶液来固定蛋白；然后将凝胶转移到40％甲醇/10％乙酸溶液中8-10小时，以除去过量的mBBr。将凝胶置于配有紫外光源(365nm)的光盒中，显现游离或与蛋白质结合的mBBr荧光。除去过量(游离)的mBBr后，用Polaroid Positive/Negative Landfilm55型胶片，通过黄色Wratten明胶滤片8号(截留值为460nm)(曝光时间在f4.5时是25-60秒)对凝胶进行拍照(Crawford，N.A.等，1989，Arch Biochem.Biophys.271223-239)。
蛋白质染色/脱色/照相用考马斯亮蓝R-250的40％甲醇/10％乙酸溶液染色SDS-凝胶1-2小时，并如前所述脱色过夜(Crawford，N.A.等(1989)，Arch.Biochem.Biophys.271223-239)。在含有0.1克考马斯亮蓝R-250(溶于10毫升95％乙醇)的240毫升12％三氯乙酸过滤过的溶液中染色乳酸铝天然凝胶过夜。在12％三氯乙酸中脱色凝胶过夜(Bushuk，W.等(1978)Can.J.Plant.Sci.58505-515，和Sapirstein，H.D.等(1985)Cereal Chem.62372-377)用Polaroid55型胶片对蛋白质染色的凝胶进行拍照，产生样片和底片。用样片测定条带迁移距离和负荷效率。
用激光显像密度计(Pharmacia-LKB Ultroscan XL)扫描荧光凝胶的Polaroid底片和蛋白染色湿凝胶样片。在用GelScan XL软件拟合后评估峰面积定量测定荧光。
酶试验用前述方法测定了粗抽提物中下列活性己糖激酶(Baldus，B.等(1981)Phytochem.201811-1814)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、6-磷酸葡萄糖酸盐脱氢酶(Schnarrenberger，C.等(1973)Arch.Biochem.Biophys.154438-448)、谷胱甘肽还原酶、NTR和硫氧还蛋白h(Florencio，F.J.等(1988)Arch.Biochem.Biophys.266496-507)。
蛋白质测定根据Bradford法(Bradford，M.(1976)Anal.Biochem.72248-256)，用Bio-Rad试剂和牛血清白蛋白作为标准测定了蛋白质浓度。
亚基分子量测定在SDS-PAGE凝胶上用两套分子量标准(kDa)估计麦胶蛋白和麦谷蛋白的亚基分子量。第一套由BSA(66)、卵清蛋白(45)、大豆胰蛋白酶抑制蛋白(20.1)、肌红蛋白(17)、细胞色素c(12.4)和抑酶肽(6.5)组成。另一套是BioRad预染色的低SDS-PAGE标准磷酸化酶b(110)、BSA(84)、卵清蛋白(47)、碳酸酐酶(33)、大豆胰蛋白酶抑制蛋白(24)和溶菌酶(16)。
实施例10麦胶蛋白的还原作为一个世纪前Osborne和共同工作者先锋贡献的结果，种子蛋白可根据其在水中和有机溶剂中的溶解度而组分分开(20)。就小麦而言，胚乳的制备物(面粉或胚乳粉)在历史上依次用四种溶液抽提，产生指定的蛋白组分(i)水、清蛋白；(ii)盐水，球蛋白；(iii)乙醇/水，麦胶蛋白；和(iv)乙酸/水，麦谷蛋白。大量证据已显示在各组分中富含不同的蛋白质。例如，清蛋白和球蛋白组分含有许多酶，而麦胶蛋白和麦谷蛋白组分在发芽所需的储藏蛋白中。
上文实施例1、4和5描述了许多水溶性种子蛋白(清蛋白/球蛋白，如α-淀粉酶抑制蛋白、富含半胱氨酸的胰蛋白酶抑制蛋白、其它胰蛋白酶抑制蛋白和硫堇素)，它们是NADP/硫氧还蛋白系统还原的，从种子本身或大肠杆菌中获得。下文描述了该系统还原小麦种子的不溶性储藏蛋白，即麦胶蛋白和麦谷蛋白为代表的能力。在与指定的加入剂培育后，用mBBr衍生麦胶蛋白，并在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后用荧光显示。该第一麦胶蛋白凝胶中的泳道如下1.对照无添加。2.GSH/GR/NADPH还原的谷胱甘肽、谷胱甘肽还原酶(来自菠菜叶子)和NADPH。3.NGSNADPH、还原的谷胱甘肽、谷胱甘肽还原酶(来自菠菜叶子)和谷氧还蛋白(来自大肠杆菌)。4.NTSNADPH、NTR和硫氧还蛋白(两种蛋白都来自大肠杆菌)。5.MET/T(Ec)β-巯基乙醇和硫氧还蛋白(大肠杆菌)。6.DTT。7.DTT/T(Ec)DTT和硫氧还蛋白(大肠杆菌)。8.DTT/T(W)和7相同，除了用小麦硫氧还蛋白h。9.NGS，-麦胶蛋白与3相同，除了没有麦胶蛋白组分。10.NTS，-麦胶蛋白与4相同，除了没有麦胶蛋白组分。基于与mBBr的反应性，麦胶蛋白组分已被硫氧还蛋白充分还原。经历还原的主要成员显示了25-45kDa的分子量范围。如实施例1、4和5用种子α-淀粉酶和胰蛋白酶抑制蛋白所见，天然h或大肠杆菌型硫氧还蛋白(二者是同源的)还原了麦胶蛋白；NADPH(和NTR)或DTT可能作为硫氧还蛋白的还原剂。用谷胱甘肽和谷氧还蛋白观察到低得多的还原，这种谷氧还蛋白可代替某些大肠杆菌和哺乳动物酶系统中的硫氧还蛋白，但还不知道是否在高等植物中存在。
麦胶蛋白组分由四种不同蛋白质类型构成，称为α、β、γ和ω，可通过天然聚丙烯酰胺凝胶电泳在酸性条件下分开(Bushuk，W.等(1978)，Can.J.Plant.Sci.58505-515；Kasarda，D.D.等(1976)Adv.Cer.Sci.Tech.1158-236；Sapirstein，H.D.等(1985)Cereal Chem.62372-377；和Tatham，A.S.等(1990)，Adv.Cer.Sci.Tech.101-78)。除了ω麦胶蛋白，每种含有半胱氨酸(S-S)基团，因此能被硫氧还蛋白还原。在该研究中，和指定添加剂培育以后，用mBBr衍生蛋白质，在酸性-聚丙烯酰胺凝胶电泳后使荧光显示。该研究中第二麦胶蛋白凝胶的泳道如下1.对照无添加剂。2.GSH还原的谷胱甘肽。3.GSH/GR/NADPH还原的谷胱甘肽、谷胱甘肽还原酶(来自菠菜叶子)和NADPH。4.NGSNADPH、还原的谷胱甘肽、谷胱甘肽还原酶(来自菠菜叶子)和谷氧还蛋白(来自大肠杆菌)。5.NGS+NTS4和6的组合。6.NTSNADPH、NTR和硫氧还蛋白(二者自大肠杆菌)。7.MET/T(Ec)β-巯基乙醇和硫氧还蛋白(大肠杆菌)。8.DTT/T(Ec)DTT和硫氧还蛋白(大肠杆菌)。9.NTS(-T)和6相同，除了没有硫氧还蛋白。10.NGS+NTS，-麦胶蛋白和5相同，但没有麦胶蛋白成分。当对硫氧还蛋白还原的麦胶蛋白组分进行天然凝胶电泳时，发现这些蛋白可被α组分中回收的硫氧还蛋白最专一的还原。有β和γ麦胶蛋白的活性还原，但是作为表III总结的密度计结果的证据，这些组内的还原是非特异性的，即用谷胱甘肽和谷氧还蛋白也获得了相对高水平的还原。DTT-还原的硫氧还蛋白尤其强的还原γ麦胶蛋白。如预计的，ω麦胶蛋白无还原。证据表明硫氧还蛋白(天然h或大肠杆菌)能特异性还原某些麦胶蛋白，尤其是α型的。
表III
不同类型的麦胶蛋白的还原特异性用NADP/硫氧还蛋白系统还原后α、β、γ和聚集物峰下的面积分别是是4.33、8.60、5.67和0.74吸光度单位乘以毫米。当用DTT在如实施例10中的反应条件还原硫氧还蛋白时，在第二块凝胶中这些合并区域约占观察到的65％。还原剂麦胶蛋白，％相对还原αβγ聚合物*无22.4 30.4 24.3 29.2谷胱甘肽 36.4 68.1 60.6 60.1谷氧还蛋白43.5 83.3 79.7 61.5硫氧还蛋白100.0 100.0 100.0 100.0*未进入凝胶的蛋白质实施例11麦谷蛋白的还原要测试对于硫氧还蛋白的反应的剩余组的种子蛋白-最不可溶于水的麦谷蛋白也许是最令人感兴趣的。麦谷蛋白多年来吸引了注意，因为它们对于面粉和粗面粉的烹调质量很重要(MacRitchie，F.等(1990)，Adv.Cer.Sci.Tech.1079-145)。因此，测试硫氧还蛋白还原该组蛋白的能力是本调查的一个主要目的。
当使用mBBr/SDS-page技术时，硫氧还蛋白特异性还原了几种麦谷蛋白，条件和实施例10中用第一种凝胶的相同。在低分子量范围(30-55kDa)内观察到了最广泛的还原。在高分子量范围内观察到的还原较不明显，但在100kDa区域和以上仍然是明显的。虽然未显示，在130kDa范围内还可能存在还原。像麦胶蛋白一样，某些麦谷蛋白也被谷胱甘肽和谷氧还蛋白相应的还原。
然而在所有情况下，还原反应用硫氧还蛋白较大，而且就某些情况而言，对硫氧还蛋白是特异性的(表IV、注意30-40和60-110kDa范围内的蛋白质)。如用其它测试的小麦蛋白观察到的那样，天然h和大肠杆菌硫氧还蛋白都具有活性，而且能被NADPH和相应的NTR或被DTT还原。因此如麦胶蛋白所发现的，某些麦谷蛋白可在体外被硫氧还蛋白特异性还原，而其它还可被谷胱甘肽和谷氧还蛋白还原，虽然效力较低。
表IV
麦谷蛋白的还原剂特异性如实施例1中的条件，研究了硫氧还蛋白h浓度对NADP-MDH被DSG-1或-2α-淀粉酶抑制蛋白激活作用的影响反应剂麦谷蛋白％相对还原*60-110kDa 40-60kDa 30-40kDa无8 23 16谷胱甘肽 3151 29谷氧还蛋白5072 40硫氧还蛋白100 100 100*用NADP/硫氧还蛋白系统还原后，三类分子量(从高到低)下的面积分别是1. 5、5.67和5.04吸光度单位乘以毫米。
实施例12体内还原实验上述实施例证明了当在体外测试时，硫氧还蛋白特异性还原了小麦麦胶蛋白和麦谷蛋白组分的成分。然而结果并未表明发芽时这些蛋白在体内是否被还原—这是我们的知识中以前尚未提出的一个问题(Shutov，A.D.等(1987)Phytochem.261557-1566)。
为了回答这个问题，应用mBBr.SDS-PAGE技术监测发芽种子中的蛋白质还原状态、我们观察到Osborne组分中成分的还原随时间进行性增加，并在2-3日发芽后达到峰值。观察到的还原增加麦胶蛋白是2倍，清蛋白/球蛋白是3倍和麦谷蛋白是5倍。结果提示虽然在发芽过程中主要小麦蛋白质组的代表被还原，对于麦谷蛋白净氧化还原变化最大。
虽然提供了新证据，证明种子储藏蛋白在发芽过程中经历了还原，结果并未标明还原是如何完成的，即由谷氧还蛋白或硫氧还蛋白完成。为了获得该点的信息，将原来硫氧还蛋白相关的麦胶蛋白(30-50kDa)和麦谷蛋白(30-40、40-60kDa)的体内还原水平与体外量度(比较表IV)测定的还原相比较。为此，计算了发芽过程中体内和体外用合适的酶还原系统观察到的的荧光与考马斯染色蛋白的比率。结果(主要的与硫氧还蛋白相关的麦胶蛋白分子量范围在25-45kDa之间，麦谷蛋白分子量范围在30-60kDa之间)提示，虽然谷胱甘肽可能占麦胶蛋白组分体内还原的主要部分(达90％)，但这和麦谷蛋白不同，麦谷蛋白的还原似乎需要硫氧还蛋白。可能归因于谷胱甘肽(或谷氧还蛋白)的还原水平不足以说明发芽种子中测得的还原的麦谷蛋白水平。
实施例13酶测量还调查了与NTR相关的硫氧还蛋白h还原所需的NADPH来源。分析了粗面粉的酶，这些酶在其它系统(注意氧化性磷酸途径的脱氢酶)的NADPH中产生中起作用。表V总结的结果证实了较早的证据，即胚乳抽提物含有从葡萄糖通过该途径产生NADPH所需的酶己糖激酶、葡萄糖6-磷酸脱氢酶和6-磷酸葡萄糖酸盐脱氢酶(Tatham，A.S.等(1990)Adv.Cer.Sci.Tech.101-78)。值得注意的是在表V中所见的葡萄糖6-磷酸脱氢酶活性对于还原的硫氧还蛋白不敏感(数据未显示)。在这方面，胚乳酶与其胞质形式相似，而不是与叶子的叶绿体对应部分相似(Fickenscher，K.等(1986)Arch.Biochem.Biophys.247393-402；Buchanan，B.B.(1991)Arch.Biochem.Biophys.2881-9；Scheibe，R.等(1990)Arch.Biochem.Biophys.274290-297)。
如用面粉的早期研究所预测的那样(Johnson，T.C.等(1987)Planta 171321-331；Suske，G.等(1979)Z.Naturforsch.C 34214-221)，粗面粉还含有硫氧还蛋白h和NTR(表V)。令人感兴趣的是，基于活性测量，NTR看来是所检测的农作物制品中的限速组分。
表V影响粗面粉中硫氧还蛋白h还原的酶的活性(葡萄糖→Glu-6-P→6-P-葡萄糖酸→NADP→硫氧还蛋白h)蛋白质活性(nkat/mg蛋白)己糖激酶 0.28葡萄糖-6-P脱氢酶 0.456-P-葡萄糖酸脱氢酶0.39NTR 0.06硫氧还蛋白h 0.35
本结果提示硫氧还蛋白h的功能是一种增强与小麦种子发芽有关的代谢过程的信号。在其被NTR和NADPH(通过氧化性戊糖磷酸途径产生)还原后，硫氧还蛋白h看来不仅激活酶，而且还在储藏蛋白迁移中起作用。
实施例14生面团质量的改善通过用NADP/硫氧还蛋白系统还原面粉蛋白质，改善了生面团质量。还原的硫氧还蛋白特异性的打断硫-硫键，硫-硫键将蛋白质的不同部分交联起来，并稳定其折叠构象。当这些交联被切断时，蛋白质可展开并与面包中的其它蛋白质连接，产生联锁网格，形成生面团的弹性网络。由于在发酵过程中网络捕获酵母产生的二氧化碳，生面团膨胀。提出还原的硫氧还蛋白激活了面粉中的麦胶蛋白和麦谷蛋白，使它们以强化生面团的方式重组。还原的硫氧还蛋白强化了发面过程中形成的蛋白质网络。对于这些测试(用10克从Montpellier，France的当地磨坊获得的中等质量的小麦面粉，或从Montpellier，France的当地磨坊获得的低质量小麦，该低质量小麦主要是Apollo作物)，加入0.2微克大肠杆菌硫氧还蛋白、0.1微克大肠杆菌NADP-硫氧还蛋白还原酶和500纳摩尔NADPH，以及1M Tris-HCl，pH7.9缓冲液，得到5.25毫升，30mM Tris-HCl酶系统混合物。通过在微量淀粉测定记录仪中，30℃下将该酶系统混合物与10克面粉混合，进行反应。得到的淀粉测定值显示加入NADP/硫氧还蛋白系统增强了生面团。用低质量面粉，在该还原系统存在下形成生面团后，淀粉记录读数至少稳定了4分钟，而在未加入这些物质的对照中，生面团形成后读数立即下降。该改进效果是持久的，而且在整个运行过程中保持。换言之，低质量小麦对照(未加入酶系统)在面团形成7分钟后的微量淀粉记录读数是375布拉班德尔面团稠度单位，相对而言用NADP/硫氧还蛋白系统(NADPH、硫氧还蛋白和NADP-硫氧还蛋白还原酶)的组分处理过的同样低质量小麦是450布拉班德尔面团稠度单位。
如上用10克Apollo面粉进行了另一淀粉记录研究，仅用500微摩尔NADPH浓度代替纳摩尔。淀粉记录仪的测量值显示该量的NADPH也使得生面团的质量显著改善。
生面团更高的淀粉记录仪测量值对应于改善的生面团强度和改善的烘烤品特征，如更好的面包屑质量、改善的质地和更大的面包体积。另外，根据分离的蛋白质的体内分析，天然小麦种子NADP/硫氧还蛋白系统在强化生面团中也是有效的。
为了本发明的烘烤和其它方面，在每10克面粉中加入0.1-3.0微克硫氧还蛋白(优选大肠杆菌或硫氧还蛋白h)和0.1-2.0微克还原酶和约30-500纳摩尔NADPH。硫氧还蛋白和还原酶的最佳水平视面粉质量而定。一般说，面粉质量越高，所需的硫氧还蛋白水平和还原酶水平越高。还可用硫辛酸代替NADPH/NADP-硫氧还蛋白还原酶还原系统来还原硫氧还蛋白。然后加入其它生面团成分，如牛奶或水。然而，可首先在NTR/硫氧还蛋白系统中加入液体，然后加到面粉中。
优选在还原的硫氧还蛋白有机会还原储藏蛋白后加入用于发酵的酵母。然后将生面团作为常规生面团发酵、成型等，并烘烤。
可在该实施例和下面的实施例中用NADPH产生系统(如由酵母等来源的100μM葡萄糖6-磷酸、100μM NADP和0.05单位(0.2微克)葡萄糖6-磷酸脱氢酶组成的)代替NADPH。在生面团制备过程的一开始加入NADPH产生系统和硫氧还蛋白及NADP-硫氧还蛋白还原酶。
当10克Apollo作物(CV)小麦与包含在4.25毫升水和0.90毫升Tris-HCl(30mM，pH7.9)中的20微升NADP(25mM)、20微升G6P(25mM)、0.25微克G6PDase、0.1微克NTR和0.2微克硫氧还蛋白h反应时获得了较高的淀粉记录仪测量值。当10克Apollo小麦与相同的反应混合物反应，但没有任何NTR或硫氧还蛋白时，获得了更高的淀粉记录仪测量值。
实施例15小麦面包烘烤研究用计算机监控的松下烘烤机进行了该烘烤试验。
面包组分对照 面粉* 200克(干)水 70％水合盐(NaCl) 5.3克酵母4.8克(酿酒酵母SafInstant)(干酵母粉)*从具有对比烘烤质量的纯面包小麦作物中获得面粉样品(包括动物饲料级别和其它级别，具有低到高烘烤质量)。
试验该试验的生面团含有全部对照组分，加上示出的不同量的NADP硫氧还蛋白系统(NTS)和/或NADP产生系统。
实验条件--称量和混合面粉与盐--将达到水合70％所需体积的水放在烤盘中。
--将面粉和盐的混合物加到水中，起动计算机监控的烘烤程序。程序完成需要3小时9分钟7秒。
--就该试验而言，将酶系统组分在加入面粉-盐混合物之前先加到水中。
--在混合20分3秒后自动加入酵母。
监控松下设备的程序是混合区段持续时间条件 加热混合000003 T1 关混合000500 T2 关混合000500 T1 关休息001000 T0 关混合001700 T2 关混合000700 T1 关休息003000 T0 达到32℃混合000004 T1 32℃休息011500 T0 32℃烘烤001400 T0 达到180℃烘烤002600 T0 180℃混合条件T0＝无混合(马达停止)T1＝正常混合T2＝3秒钟混合，3秒钟休息交替在烘烤结束后，当面包条达到室温时测定面包体积。
作物THESEE试验法国小麦作物THESEE被分类为具有良好面包制备质量。下文表IV列出了该试验的结果。
表VI面包体积NADPH NTR Th 相对单位(微摩尔) (微克)(微克) (cm3)对照 0 0 0 1690100样品 6.0 3060 18101076.0 300 17251026.0 0 60 17201026.0 0 0 1550920 3060 1800107*NADPH 3060 162096产生系统*NADPH 3060 163096产生系统加ATP、葡萄糖NTR和Th 6.0 9.4 20 1750104来自酵母*NADPH产生系统、ATP和葡萄糖的组合物。
加入体积NADP，25mM 700微升(17.5微摩尔)葡萄糖-6-磷酸，25mM700微升(17.5微摩尔)葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(50微克/毫升) 175微升(8.75微克)ATP，25mM 700微升(17.5微摩尔)葡萄糖，25mM 700微升(17.5微摩尔)如表VI所示，当用浓度为6.0微摩尔NADPH、30微克NTR和60微克Th的完整NTS以本实施例所述的量和条件烘烤200克Thesee面粉的面包时，获得了增大的面包体积。除非另外说明，NTR和硫氧还蛋白(th)来自大肠杆菌。当用该产生系统或当省略NTR或Th时，未发生类似的增大。当该系统中各组分量是上述量的一半或更少时，对面包体积也无显著影响。
作物Apollo试验该法国小麦作物被分类为具有不良的面包制备质量。该试验中使用的NTR和硫氧还蛋白来自大肠杆菌。下文表VII列出了该试验用200克Apollo面粉的结果。除非另外说明，量和条件和本实施例开始时所述相同。
表VII面包体积NADPH NTR Th(cm3) 相对单位(微摩尔) (微克)(微克)对照 0 0 0 1400 100样品 6.0 30601475 105*NADPH 30601530 109产生系统加ATP、葡萄糖*NADPH 0 0 1430 102产生系统加ATP、葡萄糖*NADPH 6 0 1430 102产生系统*NADPH 6 7 1440 103产生系统*产生系统、ATP和葡萄糖的组成如表VI。
作物ARBON试验法国小麦作物ARBON用于饲料并被分类成不适合制造面包。下文的表VIII和IX显示了用NTS或NADPH和NTR，以及实施例开始描述的生面团组分和条件。可从Arbon获得改善的面包体积。在表VIII和IX中列出了该试验中所用的NTR、硫氧还蛋白、NADPH和NADPH产生系统成分的量。当和对照比较时，可清楚的看到用如表IX中列出的用完整NTS对Arbon面包质量的改进。
表VIII面包体积NADPH NTRTh(微摩尔) (微克) 微克 (cm3)对照 0 0 0 1350样品 0.1-0.63-43-4 比对照高达20％＞2.0 ＞20 ＞20 比对照低表IX面包体积(cm3) 相对单位处理完整NTS 1650 122减去硫氧还蛋白 1690 125减去NTR 1520 113减去硫氧还蛋白、NTR 1540 114减去NADPH 1440 107减去NADPH，加上*NADPH 1560 116产生系统减去NTS(对照) 1350 100NADPH，0.6微摩尔硫氧还蛋白，3.5微克NTR，3微克*产生系统3.5微摩尔NADP3.5微摩尔葡萄糖-6-磷酸1.75微克葡萄糖-6-磷酸脱氢酶实施例16
黑小麦面包烘烤研究黑小麦是一种小麦/黑麦杂交品种，通常用于鸡饲料。它比小麦更营养，但通常认为不适合用于制作面包，尤其在许多发达国家中。因此研究了NTS系统及其变化对用黑小麦面粉烘烤的面包的作用。除非另外说明，烘烤条件和生面团成分如实施例15中小麦面粉所述。如表X所示，当黑小麦生面团含有该表所列量的硫氧还蛋白、NTR和NADPH产生系统时，面包体积有改善。然而，当使用NTS(即硫氧还蛋白、NTR和NADPH)时，未观察到相应的改善。当使用表X所列出的NTR、Th和NADPH产生系统时，面包质地得到改善，使其更具粘合性和稳定。
表XNADP/硫氧还蛋白系统(NTS)对用黑小麦面粉(cv.Juan)烘烤的面包的影响面包体积(cm3) 相对单位处理完整NTS1230 94减去NTS(对照) 1310 100减去NADPH，加上*NADPH 1390 106NADPH，0.6微摩尔硫氧还蛋白，3.5微克NTR，3.0微克产生系统4.5微摩尔NADP4.5微摩尔葡萄糖-6-磷酸4.5微克葡萄糖-6-磷酸脱氢酶实施例17还测定了NADPH/硫氧还蛋白系统对高粱、玉米和稻的面粉的作用。烘烤条件如实施例15中对小麦面粉所述。该试验中使用的NTS组分的量如下8微摩尔NADPH、40.5微克NTR和54微克硫氧还蛋白。硫氧还蛋白和NTR都来自大肠杆菌。该试验中含有NTS，特别是玉米和高粱的面包显示改善的质地和稳定性。
实施例18黑小麦、黑麦、大麦、燕麦、稻、高粱、玉米和埃塞俄比亚画眉草的乙醇可溶性和肉豆蔻盐可溶性储藏蛋白的还原除非另外说明，本实施例中使用的材料和方法按照上文标题为“谷物蛋白质的还原，材料和方法”部分中列出的那些。
黑小麦、黑麦、大麦、燕麦和埃塞俄比亚画眉草反应在30mM Tris-HCl缓冲液，pH7.9中进行。如所示的，在70微升含有1mMNADPH和25-30微克抽提的储藏蛋白的缓冲液中加入0.7微克NTR、1微克大肠杆菌硫氧还蛋白或2微克酵母硫氧还蛋白。对每10克面粉使用50毫升70％乙醇，并抽提2小时，获得乙醇抽提的储藏蛋白。就埃塞俄比亚画眉草而言，抽提了200毫克磨碎的种子。用8毫克肉豆蔻酸钠溶于5毫升蒸馏水，抽提1克面粉2小时，获得了肉豆蔻酸盐抽提的蛋白。NADPH、NTR和硫氧还蛋白的组合称为NADP/硫氧还蛋白系统(NTS)。如指出的，在不存在(GSH)或存在1.5mM NADPH和1.4微克菠菜叶子谷胱甘肽还原酶(GR/GSH/NADPH)。在培养20分钟后，加入100纳摩尔mBBr，继续反应15分钟。为了终止反应并衍生过量的mBBr，加入10微升10％SDS和10微升100mM 2-巯基乙醇，然后将样品加到凝胶上。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法如N.A.Crawford等(1989 Arch.Biochem.Biophys.271.223-239)。
稻、高粱和玉米反应在30mM Tris-HCl缓冲液，pH7.9中进行。当蛋白质被硫氧还蛋白还原时，在70微升缓冲液中加入下列1.2mM NADPH、10-30微克终止蛋白组分、0.5微克大肠杆菌NTR和1微克大肠杆菌硫氧还蛋白。为了用谷胱甘肽还原，用2.5mM还原的谷胱甘肽和1微克谷胱甘肽还原酶(面包酵母，Sigma Chemical Co.)替换硫氧还蛋白和NTR。为了用二硫苏糖醇还原，省去了NADPH、硫氧还蛋白和NTR，加入0.5mM二硫苏糖醇。在所有情况下，培育时间是20分钟。然后加入10微升10mM mBBr溶液，反应继续15分钟。为了终止反应并衍生过量的mBBr，加入10微升10％SDS和10微升100mM 2-巯基乙醇，然后将样品加到凝胶上。在每种情况下，为了获得抽提的蛋白，用8毫克肉豆蔻酸钠的5毫升蒸馏水溶液抽提1克磨碎的种子。除了测定蛋白质的起始氧化还原状态外，22℃抽提样品2小时，然后16,000rpm离心20分钟，然后加入mBBr。一边测定最初氧化还原状态，一边在氮气下加入mBBr和肉豆蔻酸盐，然后抽提。
分别制备了燕麦、黑小麦、黑麦、大麦和埃塞俄比亚画眉草面粉的肉豆蔻酸盐抽提的蛋白质还原研究的SDSS-聚丙烯酰胺电泳凝胶。还制备了一块凝胶显示埃塞俄比亚画眉草硫氧还蛋白相关缓冲液和乙醇抽提的蛋白质的含量。在所有燕麦、黑小麦、黑麦、大麦、埃塞俄比亚/肉豆蔻酸盐抽提物研究中，首先用缓冲液50mMTris-HCl，pH7.5抽提面粉20分钟，然后用70％乙醇抽提2小时。另外，制备了玉米、高粱和稻的肉豆蔻酸盐抽提的蛋白质凝胶。对于玉米、高粱和稻，仅用肉豆蔻酸盐抽提磨碎的种子。因此，玉米、高粱和稻，肉豆蔻酸盐抽提物代表了总蛋白质，而燕麦、黑小麦、黑麦、大麦和埃塞俄比亚画眉草，肉豆蔻酸盐抽提物仅代表麦胶蛋白等价物组分，因为这些面粉先前已用缓冲液和乙醇抽提过。凝胶描述的结果显示，燕麦、黑小麦、黑麦、大麦和埃塞俄比亚画眉草肉豆蔻酸盐抽提(麦胶蛋白-等价)的蛋白与GSH或GSH/GR/NADPH相比较，NTS是最有效的。NTS对于稻的总蛋白质也是最有效的。还原的谷胱甘肽对于玉米和高粱的总蛋白质较有效。
玉米、高粱和稻的结论第一块凝胶与NTS相对于谷胱甘肽还原酶对肉豆蔻酸盐抽提的蛋白质的还原状态的影响有关，处理方法(1)中，在mBBr存在下，在氮气下用肉豆蔻酸盐进行抽提；处理方法(2)中，在肉豆蔻酸盐抽提的蛋白质中加入mBBr，事先不还原蛋白质；在处理方法(3)中，用NADP/硫氧还蛋白系统(NTS)还原肉豆蔻酸盐抽提的蛋白质；在处理方法(4)中，用NADPH、谷胱甘肽和谷胱甘肽还原酶还原肉豆蔻酸盐抽提的蛋白质。在第二块与肉豆蔻酸盐抽提的蛋白质的体内还原状态和硫氧还蛋白相关的体外还原有关的凝胶中，处理方法(1)类似第一块凝胶中的处理方法(2)；处理方法(2)中，在mBBr存在下在氮气下用肉豆蔻酸盐抽提种子；在处理方法(3)中，用肉豆蔻酸盐抽提种子，并用NTS还原，然后加入mBBr在处理方法(4)中条件与(3)相同，除了用DTT还原蛋白质。第一块凝胶中的处理方法(1)和第二块凝胶中的处理方法(2)显示了谷物中蛋白质的最初氧化还原状态。对于所有三种谷物，种子中的蛋白质被高度还原。如果在空气中抽提，蛋白质会被氧化，尤其是高粱和稻的蛋白。在所有情况下氧化的蛋白质可用NTS最大程度的重新还原。对于稻，还原对硫氧还蛋白是相对特异性；对于玉米，谷胱甘肽与硫氧还蛋白一样有效，对于高粱，谷胱甘肽比硫氧还蛋白稍有效一些。二硫苏糖醇作为还原剂，显示了不同的效力。这些实验证明这些谷物的储藏蛋白比小麦的特异性小，并提示当尝试构建生面团网络时，应同时测试存在和不存在谷胱甘肽情况下的硫氧还蛋白。
还分别制备了酵母NADP/硫氧还蛋白系统还原小麦麦谷蛋白和麦胶蛋白的研究得到的凝胶。每10克面粉用50毫升0.1M乙酸，并抽提2小时获得了麦谷蛋白。每10克面粉用50毫升70％的乙醇，并抽提2小时，获得了麦胶蛋白。凝胶显示酵母系统在还原这两种主要的小麦储藏蛋白中具有高度活性。
还分别制备了黑小麦、黑麦、燕麦和大麦面粉中还原乙醇抽提蛋白质的凝胶。结果显示NTS对于黑小麦、黑麦和燕麦的乙醇抽提蛋白质最有效。在对照中还原了乙醇抽提的大麦蛋白质，而硫氧还蛋白或谷胱甘肽几乎没有作用。
实施例19硫氧还蛋白相关的还原对Kunitz和Bowman-Birk大豆胰蛋白酶抑制蛋白的活性和稳定性的影响材料和方法植物材料Dr.K.Kahn慷慨赠与了硬粒小麦(Triticum durum，Desf.cv.Monroe)。从Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)获得了麦芽。
化学药品和酶从Bio-Rad laboratories(Richmond，CA)获得了十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的试剂，并从Boehringer MannheimBiochemicals(Indianapolis，IN)获得了DTT。L-1-甲苯磺酰基酰氨基-2-苯基乙基氯甲基酮(TPCK)-处理的胰蛋白酶(XIII型，T8640)、枯草杆菌蛋白酶(VIII型细菌枯草杆菌蛋白酶Carbsberg，P5380)、KTI(T9003)、BBTI(T9777)、偶氮酪蛋白和其它化学药品购自Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)。大肠杆菌硫氧还蛋白和NTR分离自转化成过度表达各种蛋白质的细胞。含有重组质粒pFPI的硫氧还蛋白菌株是由Dr.J.-P.Jacquot(de La Motte-Guery等，1991)慷慨提供的。含有重组质粒pPMR21的NTR菌株是由Dr.Marjorie Russel和Peter Model(Russel和Model，1988)慷慨提供的。这些蛋白质所用的分离方法如研究中所述，作了以下变化在Ribi细胞分级器中以25,000psi破碎细胞，如Florencio等(1988)描述的方法纯化，但不经红色琼脂糖步骤。大肠杆菌硫氧还蛋白和NTR用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分别是100％和90％纯。如前所述(Johnson等，1987)纯化小麦硫氧还蛋白h。
小麦种子的发芽将小麦种子浸泡在50％(v/v)的Generic Bleach中室温灭菌1小时，然后用蒸馏水充分洗涤。将无菌种子置于塑料培养皿中的两层用含100微克/毫升氯霉素的蒸馏水润湿的Whatman滤纸上。继续在室温暗室中发芽达5日。
小麦蛋白酶的制备切下根和芽，从发芽5日的小麦种子上分离胚乳(10-15克鲜重)，并在4℃用5体积含有10mMβ-巯基乙醇的200mM乙酸钠，pH4.6抽提30分钟。4℃48,000g离心匀浆20分钟。丢弃沉淀，用30-70％硫酸铵组分上清液。将代表蛋白酶制备物的该组分重新悬浮在最小体积的含10mM β-巯基乙醇的20mM乙酸钠，pH4.6中，并以该缓冲液4℃透析过夜。当用偶氮酪蛋白作为底物分析时，该蛋白酶制备物的最佳pH是约4.6，在4℃至少稳定1星期。
胰蛋白酶抑制蛋白的还原和蛋白酶水解易感性除非指明，胰蛋白酶抑制蛋白(0.4mg/ml)的还原在含有10mM EDTA的0.1毫升20mM磷酸钠缓冲液，pH7.9中，30℃进行2小时。硫氧还蛋白、NTR和NADPH的浓度分别是0.024mg/ml、0.02mg/ml和0.25mM。当用DTT作为还原剂时，省去EDTA和NADP/硫氧还蛋白系统的组分。还原后，回收抑制剂混合物的等份，用于测定胰蛋白酶抑制蛋白活性或蛋白酶水解易感性。在枯草杆菌蛋白酶测试中，直接将抑制蛋白混合物(50微升)与枯草杆菌蛋白酶混合，并在室温下培育1小时。对于小麦蛋白酶制备，首先通过混合35微升200mM的乙酸钠，pH4.6，将抑制蛋白混合物(50微升)的pH调节到4.7；然后加入10微升小麦蛋白酶制备物，并在37℃继续培育2小时。为了停止枯草杆菌蛋白酶的消化，在该消化混合物中加入2微升100mM苯基甲基磺酰氟(PMSF)和10微升10％SDS。对于植物蛋白酶制备物，加入等体积的SDS样品缓冲液
停止消化。用12％或16％SDS聚丙烯酰胺平板凝胶(Laemmli，1970)电泳分析蛋白酶水解产物。用激光密度计(Pharmacia-LKB Ultrascan XL)扫描干燥的平板胶，并通过用Pharmacia GelScanXL软件程序拟合，计算获得KTI或BBTI蛋白条带的峰面积。
试验如前所述，用Florencio等(1988)描述的方法分析了硫氧还蛋白和NTR。在50mM Tris-HCl，pH7.9中，通过用N-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯作为底物跟踪253nm处吸光度的增加(Mundy等，1984)，或偶氮染料从偶氮酪蛋白底物释放入三氯乙酸(TCA)可溶性组分(见下文)，测量了胰蛋白酶的活性。对于胰蛋白酶抑制试验，在室温下，在50mM Tris-HCl，pH7.9中用合适量的KTI或BBTI预先培育胰蛋白酶(5-10微克)5分钟，然后测定蛋白酶水解活性。虽然这两种底物得到相似的数据，结果仅用一种底物表示。
在pH4.7时跟踪偶氮染料从偶氮酪蛋白底物释放入TCA溶液测量了小麦蛋白酶活性。在50微升20mM乙酸钠，pH4.6和100微升2％偶氮酪蛋白(于20mM磷酸钠，pH7.0的溶液中)中加入50微升小麦蛋白酶的20mM乙酸钠，pH4.6的溶液。37℃培育1小时后，加入1毫升10％TCA并使混合物在室温下放置10分钟。在微量离心机(8000g)中离心5分钟后，抽吸1毫升上清液溶液，与1毫升1N NaOH混合。阅读440纳米处的吸光度。用Bio-Rad试剂测定蛋白质浓度，用牛血清清蛋白作为标准(Bradford，1976)。
结果胰蛋白酶抑制蛋白活性大豆的20kDaKunitz和8kD Bowman-Birk胰蛋白酶抑制蛋白分别含有2和7个二硫键(Birk，1976；Wilson，1988)。虽然它们的生理学功能尚未确定，由于这两类抑制蛋白在荚果种子中的广泛研究，及其导致营养紊乱(如肥大和胰脏相关的机能紊乱)的性质，受到了广泛的研究。如表I和II所示，和前面实施例中所述，KTI和BBTI特异性的被大肠杆菌或植物的NADP/硫氧还蛋白系统所还原。谷胱甘肽和谷氧还蛋白(一种硫醇蛋白，能在某些动物和细菌系统中代替硫氧还蛋白，但不知道是否存在于植物中(Holmgren，1985))的还原形式没有作用。
为了确定硫氧还蛋白还原的后果，比较了KTI和BBTI的氧化和还原形式的胰蛋白酶抑制蛋白活性。如表XI所示，NADP/硫氧还蛋白系统(NTS)在30℃预培育2小时导致胰蛋白酶抑制蛋白活性基本丧失(即相对于未受抑制的对照胰蛋白酶活性增加)。更具体的说，NADP/硫氧还蛋白系统使得KTI和BBTI的胰蛋白酶活性分别增加了3-和6-倍。用DTT(一种硫氧还蛋白的非生理性代替品)和用硫辛酸(一种天然存在的二硫醇)还原的硫氧还蛋白也获得类似的结果。继续单独与DTT培育(室温过夜)导致两种抑制蛋白完全或几乎完全被灭活(数据未显示)。不像DTT，硫辛酸在不存在硫氧还蛋白的条件下不显著还原(灭活)KTI和BBTI。
表XI用NADP/硫氧还蛋白系统、DTT或还原的硫辛酸改变大豆胰蛋白酶抑制蛋白抑制胰蛋白酶的能力
*未受抑制的对照胰蛋白酶的比活性是0.018ΔA253nm/微克/分钟，用N-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯作为底物。
1大肠杆菌NTS(NADP/硫氧还蛋白系统)的还原在30℃进行2小时。
2DTT(1mM)的还原在30℃进行1小时。
3硫辛酸(LA，0.4mM)和小麦硫氧还蛋白h(Trxh)的还原在30℃进行1小时。在硫辛酸单独(0.4mM)存在下，胰蛋白酶活性对于KTI是20.0％，对于BBTI是12.5％。
Friedman和同事观察到，在硫还原剂(硫化钠、N-乙酰基-L-半胱氨酸、还原的谷胱甘肽或L-半胱氨酸)存在下加热大豆面粉，灭活胰蛋白酶抑制蛋白，可能是还原二硫键或与大豆面粉中的其它蛋白质交换二硫键的结果(Friedman和Gumbmann，1986；Friedman等，1982，1984)。这些还原剂灭活胰蛋白酶抑制蛋白改善了面粉在测试大鼠中的可消化性和营养价值(Friedman和Gumbman，1986)。与这些早期观察合起来，目前的发现证明作为硫氧还蛋白目标的KTI和BBTI的二硫键对于维持胰蛋白酶抑制蛋白活性都是重要的。
热稳定性蛋白酶抑制蛋白通常对于灭活处理，如加热，是稳定的。该稳定性至少一部分归因于二硫键的交联(Birk，1976；Ryan，1981)。已知还原打断二硫键可降低热稳定性(Friedman等，1982)。从而产生了问题，例如硫氧还蛋白还原是否能产生相似的结果。
表XII显示的结果提供了对该问题的一个肯定的答案。当80℃加热15分钟时，KTI硫氧还蛋白还原的形式完全丧失其抑制胰蛋白酶的活性，而其对应的氧化形式仍保留原活性的一半(表XII)。氧化的BBTI甚至更稳定，100℃加热25分钟后仍保留其全部的胰蛋白酶抑制活性。更有甚者，和KTI相似，BBTI的还原形式完全被热灭活(表XII)。这些结果与之前的观察一致(i)KTI和BBTI在还原后显示对热的敏感度提高；和(ii)溶液中纯的BBTI比溶液中纯的KTI更加热稳定。对于面粉，反过来是这样(即KTI比BBTI更加热稳定(Friedman等，1982和1991；和DiPietro和Liener，1989))。
表XIIKunitz和Bowman-Birk胰蛋白酶抑制蛋白的热稳定性氧化的和用大肠杆菌NADP/硫氧还蛋白系统还原后
*胰蛋白酶的比活性是0.319ΔA440nm/毫克/分钟，用偶氮酪蛋白作为底物。在我们的条件下用来显示胰蛋白酶抑制蛋白的热稳定性的初始实验中测定灭活所用的温度。
1nd未测定。
蛋白酶易感性为了测试KTI和BBTI的还原形式是否显示对于除了胰蛋白酶以外的蛋白酶的稳定性降低，将KTI和BBTI的还原和氧化形式同时与小麦蛋白酶制备物或枯草杆菌蛋白酶一起培育，并用SDS-PAGE分析蛋白酶水解产物。通过在SDS凝胶上用激光密度计测量完整蛋白质的丰度，测定了蛋白酶水解的程度。当测试发芽5日的小麦种子的蛋白酶制备物时，Kunitz抑制蛋白的氧化形式对消化几乎有完全的抗性，而硫氧还蛋白还原的形式对蛋白酶是敏感的。如表XIII中所示，约80％KTI在依赖于NADP/硫氧还蛋白系统(NTS)所有组分的反应中被降解。BBTI显示同样的模式，除了氧化的蛋白质显示相对于KTI更大的蛋白酶水解易感性。当以枯草杆菌蛋白酶代替植物蛋白酶制备物时，观察到类似作用(数据未显示)。未研究蛋白酶水解反应的性质，但注意到在SDS凝胶上检测不到肽产物。
表XIII硫氧还蛋白相关的还原对Kunitz和Bowman-Birk胰蛋白酶抑制蛋白对植物蛋白酶制备物的蛋白水解的易感性的影响1
1用大肠杆菌硫氧还蛋白系统在30℃还原2小时后，加入200mM乙酸钠，pH4.6，将pH调节到4.7。然后加入小麦蛋白酶制备物，并在37℃培育2小时。然后用SDS-PAGE分析。
2激光密度计的测定3NTSNADP/硫氧还蛋白系统4nd未测定。
本实施例显示硫氧还蛋白或二硫苏糖醇(DTT)的还原导致两种蛋白质都灭活，并提高其热和蛋白酶易感性。该结果表明抑制蛋白的硫氧还蛋白相关还原与其工业加工和种子发芽都有关。
这些结果证实了二硫键对于KTI和BBTI的胰蛋白酶抑制蛋白活性是必须的(Birk，1985；Friedman和Gumbmann，1986；Friedman等，1982，1984)。这些研究还显示还原(灭活)可在生理条件(即低温，用NADPH还原的硫氧还蛋白)下发生。在较低温度灭活胰蛋白酶抑制蛋白的能力提供了一种可能的方法，来完全灭活两种胰蛋白酶抑制蛋白，从而改善大豆产品的质量并节约能量。需要一种完全灭活KTI的方法，这是非常明显的，因为在BBTI被完全灭活的条件下，其活性的20％仍稳定的保留在大豆粉中(Friedman等，1991)。
该结果还对KTI和BBTI的蛋白酶敏感性增加了新的信息。它们在还原后蛋白酶易感性的增加提示，如果在种子发芽时与蛋白酶抑制蛋白接触，NADP/硫氧还蛋白系统可起作用，机制是通过改变(灭活)、并最终降解这些抑制蛋白(Baumgartner和Chrispeels，1976；Chrispeels和Baumagartner，1978；Orf等，1977；Wilson，1988；Yoshikawa等，1979)。如前所述，有证据证明NADP-硫氧还蛋白系统在小麦种子的发芽过程中的蛋白质运动中起到了相似的作用。
实施例20硫氧还蛋白对蓖麻子2S清蛋白的还原下列对于巯基试剂还原蓖麻子2S清蛋白的研究结果(Sharief和Li，1982；Youle和Huang，1978)显示，硫氧还蛋白活跃的还原2S大亚基的分子内二硫键，但不还原连接两个亚基的分子间二硫键。
材料和方法材料从Bothwell Enterprises，Plainview，TX获得了蓖麻(Ricinus communis L.var Hale)种子。从Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)获得了生物化学药品。从过度表达各种蛋白的转化细胞中分离得到了大肠杆菌硫氧还蛋白和NTR。含有重组质粒pFPI的硫氧还蛋白菌株是由Dr.J.-P.Jacquot(de La Motte-Guery等，1991)慷慨提供的。含有重组质粒pPMR21的NTR菌株是由Dr.Marjorie Russel和PeterModel(Russel和Model，1988)慷慨提供的。硫氧还蛋白和NTR分别是用de LaMott-Guery等(1991)和Florencio等(1988)的方法纯化的。从Bio-Radlaboratories(Richmond，CA)购得了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的试剂。从Calbiochem(San Diego，CA)购得了一溴二满(mBBr)或Thiolite。商品购得其它化学药品，并且是可得到的最高质量。从玉米叶子(Jacquot等，1981)和菠菜叶子(Nishizawa等，1982)分别纯化了NADP-苹果酸脱氢酶和果糖-1，6-二磷酸酶。按照菠菜蛋白(Florencio等，1988)所设计的方法从小麦种子中分离得到硫氧还蛋白h。从菠菜叶子制备了谷胱甘肽还原酶(Florencio等，1988)。
蛋白质体的分离用非水方法(Yatsu和Jacks，1968)分离了蛋白质体。将去壳干蓖麻子15克与40毫升甘油在组织捣碎机中混合30秒。混合物滤过4层尼龙布。在BeckmanJ2-21M离心机中用JS-20转头以272xg离心粗抽提物5分钟。离心后，收集上清液组分，并以41,400xg离心20分钟。将含有蛋白质体的沉淀重新悬浮于10毫升甘油中，并如前离心(41,400xg20分钟)，收集沉淀。重复该洗涤步骤2次。通过用3毫升100mMTris-HCl缓冲液(pH8.5)抽提沉淀，获得可溶性(“基质”)组分。用3毫升含6M脲的100mMTris-HCl缓冲液(pH8.5)抽提如前离心收集的剩余不溶性(“结晶状”)组分。
2S蛋白质纯化法用Tully和Beevers(1976)的改良方法制备了2S蛋白。将该基质蛋白组分加到DEAE-纤维素(DE-52)柱上，用5mM Tris-HCl缓冲液，pH8.5(缓冲液A)平衡，并用0-300mM NaCl梯度的缓冲液A洗脱。合并含有2S蛋白质的组分，并冻干浓缩。将浓缩组分加到Pharmacia FPLC Superose-12(HR 10/30)柱上，用含有150mMNaCl的缓冲液A平衡。将Superose-12柱的含有2S蛋白的组分加到用缓冲液A平衡的FPLC Mono Q HR 5/5柱上。依次用3毫升缓冲液A，20毫升线性梯度的0-300mMNaCl的缓冲液A，最终用含1M NaCl的缓冲液A洗脱该柱。用该方法纯化的2S蛋白在用考马斯蓝染色的SDS聚丙烯酰胺凝胶中无污染物(Kobrehel等，1991)。
分析方法用Crawford等(1989)的一溴二满(mBBr)/SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法监测蛋白质的还原。如前面在“谷物蛋白的还原，材料和方法”一节中所述，定量测定了标记的蛋白。用Bradford(1976)的方法测定蛋白。
酶试验/还原实验用Wada等，1981的方法分析了硫氧还蛋白和2S蛋白存在下的NADP-苹果酸脱氢酶和果糖1，6-二磷酸酶。进行试验的条件是加入的硫氧还蛋白量足够还原蓖麻2S蛋白，但不足以明显激活靶酶。所有试验在25℃下进行。除非另外说明，所用的硫氧还蛋白和NTR来自大肠杆菌。纯化过程中在它被二硫苏糖醇和大肠杆菌硫氧还蛋白还原后用mBBr/SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳监测2S蛋白(Crawford等，1989；Kobrehel等，1991)。
用mBBr/SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定了蓖麻种子基质和晶状蛋白的还原。凝胶(未显示)的泳道如下1和7，对照未添加；2和8，GSH/GR/NADPH还原的谷胱甘肽，菠菜叶谷胱甘肽还原酶和NADPH；3和9，NGSNADPH，还原的谷胱甘肽，谷胱甘肽还原酶(菠菜叶子)和大肠杆菌谷氧还蛋白；4和10，NTSNADPH，NTR和硫氧还蛋白(二蛋白都来自大肠杆菌)；5和11，NADPH；6和12，NADPH和大肠杆菌NTR。还原在100mM Tris-HCl缓冲液，pH7.8中进行。如所表明的，0.7微克NTR和1微克硫氧还蛋白加到70微升含有1mM NADPH和靶蛋白的该缓冲液中对于处理方法1-6，为8微克基质蛋白，对于处理方法7-12，为10微克晶状蛋白。用谷胱甘肽类似进行了试验，但最终浓度是2mM、1.4微克谷胱甘肽还原酶、1微克谷氧还蛋白、和1.5mMNADPH。反应时间20分钟。
还用mBBr/SDS-Page技术测定了硫氧还蛋白还原蓖麻子2S蛋白的二硫键的特异性。凝胶(未显示)泳道如下(1)对照(未添加)；(2)对照+NTS(与基质和晶状蛋白相同条件)；(3)对照(100℃加热3分钟)；(4)对照+2mM DTT(100℃加热3分钟)。将含有5微克2S蛋白和指示出的添加剂的样品在30mM Tris-HCl(pH7.8)中培育20分钟，然后加入80纳摩尔mBBr，继续反应15分钟，然后用mBBr/SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法分析。
结果可将蓖麻储藏蛋白(在种子成熟时保持在蛋白质体中)根据其溶解性分成两种组分。可溶性较高的蛋白质储藏在蛋白质体的外部(“基质”)，可溶性较差的储藏在内部(“晶状”)。在本研究中，分离出基质和晶状组分以测定其经受细胞硫醇，即谷胱甘肽、谷氧还蛋白和硫氧还蛋白的还原的能力。谷氧还蛋白，一种具有催化活性的硫醇基团的12kDa蛋白质可在细菌和动物的某些酶反应中代替硫氧还蛋白(Holmgren等，1985)，但不知道植物中是否存在。
结果显示，虽然许多蓖麻子的储藏蛋白被测试的硫醇还原，仅有一种对应于基质2S蛋白大亚基的低分子量蛋白显示对硫氧还蛋白的严格特异性。某些晶状组分的高分子量蛋白经过了还原，但在这些情况下在谷氧还蛋白和硫氧还蛋白之间几乎没有差别。因此，蓖麻子2S大亚基看来与前面在经历硫氧还蛋白特异性还原中所讨论的含半胱氨酸的蛋白相似。设计这些实验确证了该特异性并阐明了该还原蛋白质的某些性质。如预计的那样，由于缺乏二硫键，用任何测试的还原剂2S小亚基显示，不与mBBr反应。
当用激光密度计监测到其荧光条带时，发现蓖麻子2S大亚基的还原依赖于NADP/硫氧还蛋白系统(NADPH、NTR和硫氧还蛋白)的所有组分(表XIV)。如对于其它硫氧还蛋白相关的蛋白质(包括叶绿体酶)那样，在2S大亚基还原中活跃的硫氧还蛋白可用二硫苏糖醇(DTT)化学还原，或用NADPH和NTR酶促还原。NADP硫氧还蛋白系统、DTT单独、和DTT+硫氧还蛋白的还原程度在25℃20分钟后分别是84％、67％和90％。类似的，虽然上文讨论的二硫蛋白观察到总的广泛的还原(Johnson等，1987)。如同其它种子蛋白，可在2S蛋白的DTT还原中互换性使用天然小麦硫氧还蛋白h和大肠杆菌硫氧还蛋白(数据未显示)。
表XIV不同巯基还原剂还原蓖麻子2S蛋白的程度。反应条件与基质和晶状蛋白测定的相同。100％还原相应于当2S在2％SDS和2.5％β-巯基乙醇存在下加热3分钟得到的。NTSNADPH、NTR和硫氧还蛋白(来自大肠杆菌)；GSH/GR/NADPH还原的谷胱甘肽、谷氧还蛋白还原酶(来自菠菜叶子)和NADPH；NGSNADPH，还原的谷胱甘肽，谷胱甘肽还原酶(来自菠菜叶子)和谷氧还蛋白(来自大肠杆菌)。
在酶激活试验中硫氧还蛋白还原蓖麻子2S蛋白的能力也是明显的。在此，用硫氧还蛋白靶向的蛋白(在此是2S)激活叶绿体的硫氧还蛋白相关的酶，NADP-苹果酸脱氢酶或果糖1，6-二磷酸酶。如同迄今所测试的大部分蛋白，2S蛋白更有效的激活了NADP-苹果酸脱氢酶，并显示对果糖二磷酸酶几乎无活性(2.6对0.0纳摩尔/分钟/毫克蛋白)。
蓖麻子2S蛋白含有分子间和分子内二硫键。因此2S蛋白提供了测定硫氧还蛋白对这两类键的特异性的机会。为此，用(i)NADP/硫氧还蛋白系统在室温下酶促还原，和(ii)用DTT在100℃化学还原了蓖麻子2S蛋白。与mBBr反应后，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析还原的蛋白质，不加其它巯基试剂。结果表明虽然硫氧还蛋白活跃的还原分子内二硫键，但它对分子间二硫键效果差得多。
本结果将硫氧还蛋白的作用延伸到还原蓖麻子(一种产油作物)的2S蛋白。硫氧还蛋白特异性的还原了2S蛋白大亚基的分子内二硫键，并显示对于连接大小亚基的分子间二硫键几乎无活性。根据大豆胰蛋白酶抑制蛋白的结果，清楚的是硫氧还蛋白对分子内二硫键的还原显著增加了二硫蛋白对蛋白酶水解的敏感性(Jiao等，1992a)。然而尚待观察2S蛋白的还原是否发生在其蛋白酶水解前(Youle和Huang，1978)，如小麦的主要储藏蛋白的情况那样。本工作提出了一个相关问题是蓖麻子的2S蛋白以及其它产油植物如巴西果(Altenbach等1987；Ampe等，1986)是否具有除了储藏蛋白质之外的功能。
实施例21灭活特异性抑制蛋白对谷物支链淀粉酶的硫氧还蛋白依赖性去抑制支链淀粉酶试验1.麦芽三糖的标准曲线在微量离心管中制备了一系列浓度麦芽三糖(0-2毫克)的0.1-0.2毫升水或缓冲液溶液。在其中加入0.2毫升二硝基水杨环酸(DA)试剂(将1克DA，30克酒石酸钾钠，和20毫升2N NaOH与水混合，最终体积为100毫升)。将试剂溶于温水浴中。将混合物100℃加热5分钟，并在水浴中冷却(室温)。将各样品转移到含有2毫升水的玻璃试管中。读取相对于水的A493。ΔA493[含有麦芽三糖的样品A493是减去空白(无麦芽三糖)的A493]对麦芽三糖浓度作图。
2.支链淀粉酶活性试验测量底物支链淀粉还原性糖的释放作为支链淀粉酶活性。通常将10-100微升支链淀粉酶样品(在20mM Tris-HCl，pH7.5或5-20乙酸-NA，pH4.6中)与25-100微升200mM乙酸-NA，pH5.5(该缓冲液使试验最终pH为5.5)和10-20微升2％(w/v)支链淀粉混合。混合物在37℃培育30-120分钟，视支链淀粉酶活性而定。加入200微升DA试剂停止反应。然后如上测定还原性糖。
注意1.透析从透析过的30-60％硫酸铵组分获得的粗抽提物或支链淀粉酶，获得了支链淀粉酶的粗抽提物，当将其用作支链淀粉酶来源时，它必须在试验前彻底透析，因为在粗抽提物中有还原的糖。换言之来自透析的粗抽提物或透析的30-60％硫酸铵的粗支链淀粉酶样品的背景很高。为此，如下制备了空白先加入200微升DA试剂，然后加入酶样品、支链淀粉和缓冲液。
2.当DTT(或β-巯基乙醇(MET)或GSH)的最终浓度在试验混合物中高于2mM时，OD493值比减去DTT(MET、GSH)的样品高。应在空白和在试验中没有DTT的样品中在反应结束时加入DTT(MET、GSH)。应注意确保试验混合物中DTT的最终浓度低于2mM。
支链淀粉酶抑制蛋白抽提物的纯化和硫酸铵组分的纯化将200克大麦芽用电动咖啡磨磨成细粉，并用600毫升5％(w/v)NaCl在30℃抽提3小时。30,000g，4℃离心25分钟后，用固体硫酸铵沉淀组分上清液。将30％和60％饱和硫酸铵之间沉淀的蛋白溶于最小体积的20mM Tris HCl，pH7.5中，并以该缓冲液4℃透析过夜。
DE52层析离心透析的样品，除去不溶性物质，并将上清液用2N甲酸调节到pH4.6。沉淀酸变性的蛋白后，将上清液用NH4OH重新调节到pH7.5，并加到DE52柱(2.5×26cm)上(已用20毫升pH7.5的Tris-HCl平衡)上。用上述缓冲液80毫升洗涤后，用线性0-500mM Tris-HCl，pH7.5洗脱柱。收集6.7毫升的各组分。约325mM NaCl时洗脱出支链淀粉酶，在100mM NaCl时洗脱出其抑制蛋白。支链淀粉酶进一步纯化通过CM32(20mM乙酸钠，pH4.6)和Sephacryl-200 HR(300mM Tris-HCl，pH7.5，含有200mM NaCl和1mM EDTA)层析。如下纯化了支链淀粉酶抑制蛋白。
CM32层析将DE52步骤的支链淀粉酶抑制蛋白样品(约90毫升)置于150毫升烧杯中，在70℃的温水浴中温育20分钟。离心后，将澄清的样品用2N甲酸调节到pH4.6，并以20mM乙酸钠，pH4.6透析。通过离心除去透析过程中形成的沉淀，并在用20mM乙酸钠，pH4.6平衡的CM32柱(2.5×6cm)上层析上清液。用线性0-0.4M NaCl的200毫升20mM乙酸钠，pH4.6洗脱蛋白质。合并含有支链淀粉酶抑制蛋白活性的组分(5.0毫升/组分)，透析并重新加在CM32柱(2.5×6cm)上，用200毫升20mM乙酸钠，pH4.0配的线性0.2-1M NaCl梯度层析。
Sephadex G-75过滤将第二次CM32层析步骤的支链淀粉酶抑制蛋白组分装在透析袋中以固体蔗糖浓缩，然后用Sephadex G-75柱(2.5×85cm)分离，该柱用含有200mM NaCl和1mMEDTA的30mM Tris-HCl，pH7.5平衡。合并显示支链淀粉酶抑制蛋白活性的组分(3.6毫升/组分)，以固体蔗糖透析浓缩，然后以10mM Tris-HCl，pH7.5透析。
支链淀粉酶抑制蛋白的鉴定和纯化在发芽中，淀粉被α-、β-淀粉酶和支链淀粉酶(也称为去分支酶，R-酶)转化成葡萄糖。虽然已对淀粉酶的调节进行了广泛的研究，但对于种子中支链淀粉酶的调节知之甚少。Yamada(Yamada，J.(1981)Carbohydrate Research 90153-157)报道将谷物面粉与还原剂(如DTT)或蛋白酶(如胰蛋白酶)一起培育导致激活支链淀粉酶活性，提出还原或蛋白酶水解可能是在发芽时支链淀粉酶被激活的机制。和稻米粉中一样，发芽小麦种子或大麦芽的支链淀粉酶抽提物显示较低的活性，但通过与DTT预培育20-30分钟被激活，活性提高了3-5倍。然而，阴离子或阳离子交换树脂纯化粗抽提物(30-60％硫酸铵组分的透析产物)后，支链淀粉酶总活性比不与DTT预培育而测定时加到柱上的样品，增加了2-3倍。DTT对于支链淀粉酶没有或几乎没有作用。一种可能性是支链淀粉酶可能在纯化过程中因蛋白酶水解而激活，因为发芽的小麦种子或大麦芽显示出高蛋白酶活性。如果是这样，加入蛋白酶抑制蛋白混合物将防止纯化时支链淀粉酶被活化。与该观点相反，用蛋白酶抑制蛋白的许多实验不能证实该观点。另一个可能性是，存在一种可被硫酸铵沉淀，并抑制支链淀粉酶的蛋白酶抑制蛋白。DTT的作用是还原并灭活该蛋白抑制物，导致支链淀粉酶的活化。沿这条线索，将大麦芽的30-60％硫酸铵组分加到DE52柱(2.5×26cm)(已用20mM Tris-HCl，pH7.5平衡)。用线性盐梯度洗脱后，鉴定到“去除抑制的”(“激活的”)支链淀粉酶是325mM NaCl处(组分号44-60)洗脱下来的蛋白峰。对50微升峰支链淀粉酶活性组分(组分号45)与50微升其它蛋白组分组成的预培育混合物测定支链淀粉酶活性，表明一个显示有支链淀粉酶抑制活性的蛋白峰是用约100mM NaCl，在组分号8-25之间从DE52柱上洗脱下来。
通过两次连续阳离子交换树脂层析步骤，才用CM32于pH4.6和4.0，和SephdexG-75过滤进一步纯化了支链淀粉酶抑制蛋白样品。
支链淀粉酶抑制蛋白的性质初步实验显示，支链淀粉酶抑制蛋白对于70℃处理10分钟和pH4.0有抗性。根据Sephadex G-75凝胶过滤和SDS-PAGE图谱，支链淀粉酶抑制蛋白分子量在8-15kDa±2kDa之间。研究进一步显示，该蛋白质含有硫氧还蛋白-可还原的(S-S)键。
这些研究如表XV中所示，发现普遍存在的二硫醇蛋白(硫氧还蛋白)，起着先前未知的能抑制大麦和小麦胚乳支链淀粉酶的含二硫键的蛋白质的特异性还原剂作用。
表XV支链淀粉酶抑制蛋白在NADP/硫氧还蛋白系统还原后活性的改变
该抑制蛋白的还原清除了其抑制支链淀粉酶的活性，从而使支链淀粉酶变得活跃。表XV中所示的这些研究说明，可以用生理学系统(包括NADPH、NADP-硫氧还蛋白还原酶(NTR)和硫氧还蛋白(NADP/硫氧还蛋白系统)以及硫氧还蛋白(Trx)和二硫苏糖醇)使支链淀粉酶活化。这些发现还阐明了支链淀粉酶的还原性活化如何发生(即特异性(先前不知道的)抑制蛋白被还原，从而被灭活，因此酶变得活跃)。可从几种来源，如大肠杆菌或种子胚乳(硫氧还蛋白h)获得该反应中的活性硫氧还蛋白。等式1和2给出了硫氧还蛋白在还原性灭活抑制蛋白(I)和去除对支链淀粉酶(E)的抑制中的作用。
(2)硫氧还蛋白氧化+[E失活∶I氧化]→硫氧还蛋白氧化+E活化+I还原总之，可用柱层析法组分粗胚乳抽提物。这些步骤为将支链淀粉酶与蛋白抑制物分开服务。然后通过几个步骤高度纯化了该抑制蛋白。通过使用mBBr/SDS-PAGE法，确定了该新蛋白质的二硫基团已被硫氧还蛋白特异性还原，而且该还原的蛋白丧失其抑制支链淀粉酶的活性。与种子的其它二硫蛋白(如大豆的Kunitz和Bowman-Birk胰蛋白酶抑制蛋白)一样，支链淀粉酶抑制蛋白显示活化叶绿体NADP-苹果酸脱氢酶的能力。在这些实验中，用二硫苏糖醇还原硫氧还蛋白，进而还原抑制蛋白，并因此激活脱氢酶。
实施例22过度表达硫氧还蛋白和NADP-硫氧还蛋白还原酶的酵母细胞的基因工程构建将两种酿酒酵母硫氧还蛋白基因(Muller，E.G.D.(1991)J.Biol.Chem.2669194-9202)TRX1和TRX2克隆入高拷贝数目的附加型载体中，一个例子是YEp24，在强组成型启动子元件的控制下，该元件的例子是甘油醛-3-P脱氢酶、烯醇酶或磷酸甘油酸激酶基因的糖酵解启动子。通过定量的Wetern印迹方法，用抗硫氧还蛋白兔抗血清(Muller，E.G.D.等(1989)J. Biol.Chem.2644008-4014)评估了重组构建物的硫氧还蛋白的过度表达，来选择硫氧还蛋白基因和启动子元件的最佳组合。采用具有最佳硫氧还蛋白过度表达系统的细胞作为硫氧还蛋白的来源，用于生面团改进。
制备自其氨基末端序列推断出来的寡核苷酸探针，克隆了NADP-硫氧还蛋白还原酶基因。按照设计用于菠菜叶子(Florencio，F.J.等(1988)，Arch.Biochem.Biophys.266496-507)的方法修改后，从酵母细胞制备了该酶。用自动化Exman降解法和Applied Biosystems气相蛋白质测序仪微量测序，确定该纯还原酶的氨基末端。根据该序列，并根据酵母中的密码子用途，制备了20个碱基的24倍简并DNA探针。使该探针与用EcoRI和PstI切开的分离的酵母DNA杂交作DNA印迹分析。从琼脂糖凝胶中抽提出该最活跃的区域，并引入pUC19质粒载体中(Szekeres，M.等(1991)，J.Bacteriol.173.1821-1823)。转化后，用标记的寡核苷酸探针通过菌落杂交筛选含质粒的大肠杆菌菌落(Vogeli，G.等(1987)MethodEnzymol.152407-415)。如Szekers等上文给出的方法对DNA测序，鉴定得到携带NADP-硫氧还蛋白还原酶基因的克隆。一旦鉴定到，使NADP-硫氧还蛋白还原酶基因如上面TRX1和TRX2酵母硫氧还蛋白基因所述在酵母中过度表达。用过度表达NADP-硫氧还蛋白还原酶的酵母细胞作为还原酶来源，以改进生面团质量。
实施例23用基因工程改造的酵母细胞改进生面团质量工程改造酿酒酵母细胞，使其过度表达两种酵母硫氧还蛋白。用已建立的方法，如超声然后冻干等裂解酵母产生NADP-硫氧还蛋白还原酶。合并过度表达硫氧还蛋白的培养物的干燥细胞与NADP-硫氧还蛋白还原酶，然后加到面粉中，改善其面团质量。在1M Tris-HCl缓冲液，pH7.9中加入2/10克合并的裂解干燥细胞，以及约300-500纳摩尔NADPH，得到5.25毫升30mM Tris-HCl。反应在微量淀粉测定记录仪中30℃，如实施例14所述进行。观察到生面团质量的改善，与实施例14所示的改善相似。
实施例24面筋的改善NADP/硫氧还蛋白系统对生面团质量的正效应提出了在制备面筋时在面粉中加入该系统的选择。目的是改变面筋的产量和性质，从而增强其技术价值(1)通过获得更强的面筋(提高的弹性，改进的延展性)；(2)通过在蛋白质网络中捕获被NADP-硫氧还蛋白系统还原的可溶性蛋白质增加面筋产量，从而防止它们在生产面筋的过程中被洗去。在该方法(使用10克面粉)中，加入0.2微克大肠杆菌硫氧还蛋白、0.1微克大肠杆菌NADP-硫氧还蛋白还原酶和300-500纳摩尔NADPH和1MTris-HCl，pH7.9缓冲液，得到5.25毫升30mM Tris-HCl。根据常规浸出法在室温下制造面筋。称量确定面筋产量，并用经典手工拉伸法确定面筋强度。用该处理方法与NADP/硫氧还蛋白系统获得的面筋产物被用作面粉或其它谷物的添加剂。
实施例25从非小麦或黑麦粉产生面团的方法对于该试验(用10克磨碎的玉米、稻或高粱粉)，在1M Tris-HCl，pH7.9的缓冲液中加入0.2微克大肠杆菌硫氧还蛋白、0.1微克大肠杆菌NADP-硫氧还蛋白还原酶和500纳摩尔NADPH，得到5.25毫升30mM Tris-HCl。将10克磨碎的粉与该酶系统在微量淀粉测定记录仪中30℃混合，进行反应。淀粉测定记录仪的测量值显示，加入NADP-硫氧还蛋白系统与小麦相似的生面团特征。在没有酶系统的对照中，不可能有微量淀粉测定记录仪的读数，因为混合物不能形成生面团。形成的生面团是持久的，其坚韧性在操作过程中保持。最终产物与小麦的生面团形成的网络相似。
动物毒素的还原本发明提供了一种用化学方法还原蜜蜂、蝎子和蛇毒液中引起中毒的蛋白质，并从而改变毒液的生物学活性，以及在硫氧还蛋白或DTT存在下，用硫醇氧化还原(SH)试剂，即还原的硫氧还蛋白、还原的硫辛酸还原动物毒素(尤其是蛇神经毒素)的方法。硫氧还蛋白的还原主要优选通过NADP-硫氧还蛋白系统(NTS)发生。如前所述，NTS包括NADPH、NADP-硫氧还蛋白还原酶(NTR)和硫氧还蛋白。
术语“硫醇氧化还原试剂”已在文献中用了一段时间，指一种试剂存在于非还原状态和还原或巯基(SH)状态。如本文所限定的，术语“硫醇氧化还原(SH)试剂”表示还原的硫醇氧化还原蛋白质，或合成制备的试剂，如DTT。
神经毒素的还原可在液态(如血液、淋巴液或缓冲液)介质中发生，或在固态介质(如细胞或其它活组织)中发生。本文所用的术语“液态”本身不指存在于个体中的生物液。
推测硫醇氧化还原(SH)试剂在体外灭活毒液，和在个体内对毒液解毒的能力依赖于本发明的试剂还原导致中毒的毒液组分中分子内二硫键的能力。
本发明的硫醇氧化还原(SH)试剂可还原并至少可部分在体外灭活所有蛇神经毒素(突触前和突触后的)。根据本发明在体外灭活的蛇神经毒素被用作制备抗蛇毒素的抗原。优选通过与硫醇氧化还原(SH)试剂在合适的缓冲液中一起培育来灭活神经毒素。优选的缓冲液是Tris-HCl缓冲液，但可用其它缓冲液如磷酸缓冲液。优选硫醇氧化还原(SH)试剂是一种还原的硫氧还蛋白。
灭活蛇神经毒素的有效量范围是对于每10微克蛇神经毒素(体积为100微升)约0.1-5.0微克，优选约0.5-1.0微克的还原的硫氧还蛋白；约1-20纳摩尔，优选5-15纳摩尔的还原的硫辛酸(在约1.0微克的硫氧还蛋白存在下)；和约10-200纳摩尔，优选50-100纳摩尔的还原的DTT(优选在约1.0微克硫氧还蛋白的存在下)。
用NADP-硫氧还蛋白系统中的组分灭活蛇神经毒素的有效量对于每10微克蛇神经毒素(体积为100微升)，约0.1-5.0微克，优选约0.5-1.0微克的还原的硫氧还蛋白；约0.1-20微克，优选0.2-1.0微克的NTR和约0.05-0.5微摩尔，优选约0.1-0.25微摩尔的NADPH。
在灭活后，可将含有灭活的神经毒素和硫醇氧化还原(SH)试剂等的缓冲液注射入动物(如马)，产生抗蛇毒素或在注射前可加热或用甲醛进一步处理。
还可用本发明的硫醇氧化还原(SH)试剂治疗因毒蛇咬伤导致神经中毒的病人。给予病人硫醇氧化还原(SH)试剂的优选方法是在蛇咬伤周围多处皮下注射。
当然在病人中用来解除神经毒素毒性的硫醇氧化还原(SH)试剂的正确用量将根据病人实际从咬伤接受的毒素量来决定。然而，小鼠中解除或还原蛇神经毒素毒性的有效用量常常是每克小鼠体重约0.01-0.3微克，优选0.02-0.05微克的还原的硫氧还蛋白；0.1纳摩尔-3.0纳摩尔，优选0.2-1.0纳摩尔的还原的硫辛酸(在约0.05微克硫氧还蛋白存在下)；约1.0-30纳摩尔，优选2.0-5.0纳摩尔的DTT(优选在0.05微克硫氧还蛋白的存在下)。
用NADP-硫氧还蛋白系统的组分在小鼠中解除蛇神经毒素的有效用量对于每克小鼠体重为0.01-0.3微克，优选约0.02-0.05微克的硫氧还蛋白；约0.005-0.12微克，优选0.01-0.025微克的NTR，和约5-30纳摩尔，优选10-15纳摩尔的NADPH。
给予病人NTS的优选方法也是多处皮下注射。人用的优选硫醇氧化还原试剂是人硫氧还蛋白，通过NADP-硫氧还蛋白系统或与硫辛酸或DTT一起施用。
产生可用本发明的方法灭活或解毒的神经毒素的毒蛇的部分名单出现在Chippaur，J.-P.等(1991)Reptile Venoms and Toxins，A.T.Tu编Marcel Dekker Inc.的529-555页上，纳入本文以供参考。
下列实施例将明确本发明灭活和解除毒液毒性上的其它特征和优点。
实施例26蜜蜂、蝎子和蛇毒液的还原研究与mBBr标记用50微克毒液(最终体积100微升)的30mM Tris-HCl缓冲液，pH7.9进行反应，该缓冲液含有下列蛋白酶抑制物苯基甲基磺酰氟(PMSF)、亮抑肽酶和胃酶抑素(试验中使用的最终浓度分别是100μM、1μM和1μM)。NADPH作为还原剂时，混合物还含有4微克硫氧还蛋白、3.5微克NTR(都来自大肠杆菌)和12.5mM NADPH。当DTT还原硫氧还蛋白(4微克，大肠杆菌或人)时，省去NADPH和NTR，将DTT加到0.5mM。类似进行了用GSH的试验，但最终浓度为5mM，在1.5微克谷胱甘肽还原酶和12.5mM NADPH的存在下。混合物在室温下培育20分钟，然后将mBBr加到1.5mM，反应在室温下继续15分钟。停止反应，加入10微升100mM β-巯基乙醇、5微升20％SDS和10微升50％甘油来衍生过量的mBBr。然后用如前所述的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析样品。
不加蛋白酶抑制物，用NADP-硫氧还蛋白系统进行了相同实验。
在蛋白酶抑制物的存在下样品与不同还原剂室温培育20分钟后，用mBBr衍生样品，并用电泳分离，测定荧光。显示在所有情况下硫氧还蛋白(大肠杆菌或人)特异性的还原了毒液组分。凝胶也显示当反应在蛋白酶抑制物不存在的情况下进行时，硫氧还蛋白以类似方式还原了毒液组分。
用SDS-聚丙烯酰胺凝胶mBBr法显示了NADP/硫氧还蛋白系统在有和没有蛋白酶抑制物的情况下还原了蜜蜂、蝎子和蛇毒液。室温下将样品与NTS在存在或不存在任何蛋白酶抑制物的情况下培育20分钟后，用mBBr衍生样品，电泳分离，如前所述测定荧光。
材料毒液Apis mellifera的蜜蜂毒液，Androctonus australis的蝎子毒液和银环蛇(Bungarus multicinctus)的蛇毒液购自Sigma Chmical Co.(St.Louis，MO)。
蛋白酶抑制物苯基甲基磺酰氟(PMSF)、Leupeptin和Pepstatin购自SigmaChmical Co.(St.Louis，MO)。
毒液毒性解除皮下注射入小鼠测定蜜蜂、蝎子和蛇毒液毒性的解除。试验重复三次。注射前，将毒液稀释于磷酸盐缓冲液(0.15M NaCl于10mM Na2H2PO4/NaH2PO4pH7.2)，浓度范围为LD50两倍(每克小鼠)Apis mellifera的蜜蜂毒液2.8微克；Androctonus australis的蝎子毒液0.32微克；银环蛇的蛇毒液0.16微克。注射后5，10，30，60分钟和4，12和24小时，静脉内(1)和皮下(2)(在最初注射位点周围多处局部注射)注射受攻击的各组小鼠。用(1)大肠杆菌NADP-硫氧还蛋白系统(0.08微克硫氧还蛋白、0.07微克NTR和25纳摩尔NADPH)；(2)用DTT还原的硫氧还蛋白或还原的硫辛酸(0.08微克大肠杆菌或人硫氧还蛋白，加到1纳摩尔二硫苏糖醇或1纳摩尔还原的硫辛酸中来还原硫氧还蛋白)。浓度是以每微克注射入动物的毒液计；所有溶液以磷酸盐-盐水缓冲液制备。
硫氧还蛋白对解毒的作用可通过(1)与没有硫氧还蛋白的对照组比较LD50，和(2)根据局部反应程度，如坏死、肿胀和动物普遍不适来确定。
还原蛇神经毒素的还原研究-材料和方法毒素猪胰磷脂酶A2、半环扁尾蛇毒素b和β-银环蛇毒素购自Sigma Chmical Co.(St.Louis，MO)。由于磷脂酶A2以3.2MpH5.5的(NH4)2SO4溶液提供，故用30mM pH7.9的Tris-HCl缓冲液，使用Centricon 3kDa截留的膜透析。α-银环蛇毒素和α-银环蛇毒素125I由Shalla Verrall博士慷慨赠与。
试剂和精制化学药品DL-α-硫辛酸、大豆的L-α-磷酪酰胆碱、NADPH和β-巯基乙醇购自SigmaChmical Co.(St.Louis，MO)，一溴二满(mBBr，商品名thiolite)购自Calbiochem(San Diego，CA)。十二烷基磺酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳购自Bio-Rad Laboratories(Richmond，CA)。
蛋白质和酶如Jiao等(1992)Ag.Food.Chem.(出版中)所述纯化了大肠杆菌的硫氧还蛋白和NTR。硫氧还蛋白h纯化自小麦胚芽(Florencio，F.J.等(1988)，Arch.Biochem.Biophys.266496-507)，硫氧还蛋白f和m来自菠菜叶(Florencio，F.J.等(1988)见上)。人硫氧还蛋白是Dr.Emanuelle Wollman慷慨赠与的。NADP-苹果酸脱氢酶纯化自玉米叶(Jacquot，J.-P.等(1981)Plant Physiol.68300-304)，谷胱甘肽还原酶来自菠菜叶子(Florencio，F.J.等，见上)。大肠杆菌谷氧还蛋白是A.Holmgren教授慷慨赠与的。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳在10-20％梯度，1.5毫米厚度的凝胶中进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，在40毫安的稳定电流下电泳3小时。电泳后，将凝胶在12％(重量/体积)三氯乙酸中浸泡2小时，然后转移到40％甲醇和10％乙酸的溶液中，浸泡12小时除去过量mBBr。将凝胶置于装置有紫外光源(365纳米)的光盒中，测定蛋白质-结合的mBBr的荧光。用Polaroid正片/负片Landfilm55型通过黄色Wratten明胶膜8号(截留＝460纳米)对凝胶拍照(曝光时间40秒，f4.5)。用0.125％(重量/体积)考马斯蓝R-250的10％乙酸和40％甲醇溶液染色凝胶中的蛋白质1小时。以省去了考马斯蓝的相同溶液脱色凝胶。
用激光密度计(Pharmacia-LKB Ultroscan XL)扫描荧光凝胶的Polaroid负片和干燥的染色凝胶。用Gelscan XL软件评估峰面积或高度定量测定各条带。
实施例27毒素的还原和mBBr标记用10微克靶毒素，最终体积为100微升的30mM Tris-HCl缓冲液，pH7.9的溶液和0.8微克硫氧还蛋白、0.7微克NTR(都来自大肠杆菌)和2.5mM NADPH进行反应。当DTT还原硫氧还蛋白时，省去NADPH和NTR，加入DTT至0.5mM。类似的用GSH进行试验，只是最终浓度为1mM。对于谷氧还蛋白的还原，用1微克大肠杆菌谷氧还蛋白、0.38微克谷胱甘肽还原酶(以菠菜叶子部分纯化)、1mM GSH和2.5mM NADPH(这四种组分的组合称为NADP/谷氧还蛋白系统)替换硫氧还蛋白和NTR。体积为100微升的溶液中用硫辛酸的还原形式还原，浓度为100μM和200μM，单独或和0.8微克硫氧还蛋白。对于半环扁尾蛇毒素b和α-银环蛇毒素而言，37℃温育混合物2小时，对β-银环蛇毒素室温温育1小时，对磷脂酶A2室温温育20分钟。温育后将mBBr加到1.5mM，反应在室温下继续15分钟。停止反应，加入10微升100mM的β-巯基乙醇、5微升20％SDS和10微升50％甘油衍生过量mBBr。然后用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析样品。
在2mM DTT中煮沸样品3分钟，完成了全部毒素的还原。冷却后，用mBBr标记样品，如前处理，除了在加到凝胶上之前，将所有样品再煮沸2分钟。二硫苏糖醇(DTT)和硫氧还蛋白的还原形式以及硫辛酸是二硫醇还原剂，与一硫醇还原剂，如2-巯基乙醇和谷胱甘肽相反。DTT是合成制备的化学试剂，而硫氧还蛋白和硫辛酸存在于细胞内。半环扁尾蛇毒素b被NTS、DTT和硫氧还蛋白、还原的硫辛酸和硫氧还蛋白显著还原。与半环扁尾蛇毒素b一起，显示硫辛酸是比二硫苏糖醇特异性更高的还原剂。
没有硫氧还蛋白时，二硫苏糖醇部分还原了该毒素，而还原的硫辛酸不这样(泳道8)。结果还显示NTS或DTT加硫氧还蛋白是α-银环蛇毒素和β-半环扁尾蛇毒素的特异性还原剂。
实施例28NADP-苹果酸脱氢酶的活化用限定的硫氧还蛋白浓度与5微克蛇毒素一起预培育(用硫氧还蛋白限制该酶的活化)测试了蛇毒素活化叶绿体NADP-苹果酸脱氢酶的能力大肠杆菌硫氧还蛋白0.25微克；人0.9微克、小麦1.15微克；菠菜f和m分别是0.375和0.125微克。如所示，在含有100mM Tris-HCl，pH7.9的硫氧还蛋白和10mM DTT的溶液(最终体积0.2毫升)中加入1.4微克纯化的玉米NADP-苹果酸脱氢酶。25分钟后，将160微升预培育的混合物注射到含有100mM Tris-HCl，pH7.9和0.25mM NADPH的1毫升溶剂(0.79毫升)的1厘米比色杯中。加入50微升50mM草乙酸开始反应。然后用配备有四通管变换器的Beckman分光光度计监测340纳米处的吸光度改变，跟踪NADPH的氧化。该实验的结果显示，半环扁尾蛇毒素b的不同的还原硫氧还蛋白的还原作用显著改变了毒素的生物学活性，激活了NADP-苹果酸脱氢酶。该结果证明虽然效力不同，所有测试的硫氧还蛋白在某种程度上起到了限制毒素作用的功能。
实施例29半环扁尾蛇毒素b的蛋白酶水解试验使半环扁尾蛇毒素b10微克与用30mM Tris-HCl缓冲液pH7.9(总体积100微升)37℃温育2小时。如所示的，在缓冲液中添加0.8微克硫氧还蛋白、0.7微克NTR和2.5mM NADPH。当用DTT还原硫氧还蛋白时，省去NTR和NADPH，加入DTT至0.5mM。温育后，用0.4和2微克胰蛋白酶37℃消化样品10分钟。加入DTT(4.8微升的50mM溶液)、5微升20％SDS和10微升50％甘油，煮沸样品3分钟，然后进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。用考马斯蓝染色凝胶，用上述密度计扫描定量测定各蛋白质条带。下文表XVI显示了该试验结果。这些结果显示蛇神经毒素的还原使得毒素对蛋白酶水解更敏感。该结论的引申将表明，施用还原的硫氧还蛋白作为解毒剂应有助于破坏毒素，因为毒液的蛋白酶的蛋白酶水解灭活增加。
表XVI半环扁尾蛇毒素b的氧化和还原形式对胰蛋白酶的敏感性
在30mM Tris-HCl缓冲液，pH7.9中预培育10微克半环扁尾蛇b37℃2小时，如下对照，无添加；用大肠杆菌NADP/硫氧还蛋白系统(NTS)还原，硫氧还蛋白、NTR和NADPH；被DTT还原，DTT；和被DTT+硫氧还蛋白还原，DTT(添加大肠杆菌硫氧还蛋白)。预培育后，加入指定的0.4微克和2微克胰蛋白酶，然后用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。
实施例30磷脂酶A2试验用分光光度计测定β-银环蛇毒素的磷脂酶A2组分的氧化和还原形式的活性，如Lobo de Araujo等(1987)Toxicon 251181-1188所述跟踪活性变化。对于还原实验，使10微克毒素与含有0.8微克硫氧还蛋白、0.7微克NTR和7mM NADPH的30mM pH7.9的Tris-HCl缓冲液(最终体积35微升)一起培育。室温温育1小时后，在含有1毫升试验溶液(调节到pH7.6)的1厘米比色杯中加入20微升该反应混合物，试验溶液含有10mM CaCl2、100mM NaCl、4mM胆酸钠、175μM大豆磷酯酰胆碱和55μM酚红。在Beckman Du2400型分光光度计中，测量558纳米处的吸光度变化，跟踪该反应。该实验结果证明当被硫氧还蛋白还原后，β银环蛇毒素丧失了其大部分磷脂酶活性。结果和结论一致，即在蛇咬伤后给予还原的硫氧还蛋白可通过消除磷脂酶A2活性帮助解毒。
实施例31与乙酰胆碱受体结合的α-银环蛇毒素用放射性标记的毒素(Gu，Y.等(1985)J.Neurosci.51909-1916)测试了α-银环蛇毒素与培养的小鼠细胞的结合。如Gu等(Gu，Y.等，见上)所述培养小鼠细胞系C2，并置于24孔塑料组织培养板(Falcon)中，密度为每孔3000细胞。48小时后用融合培养基替换生长培养基，96小时后再次替换。再培养2日后用培养物进行试验。
测定了α-银环蛇毒素与细胞的结合，进行三种不同处理[A]37℃在200微升磷酸盐-缓冲液(0.15M NaCl的10mM Na2HPO4/Na2HPO4pH7.2)中将10nMα-银环蛇毒素125I(262Ci/毫摩尔)与4微克硫氧还蛋白、3.5微克NTR(都来自大肠杆菌)和6.25mM NADPH一起温育2小时。在某些情况下，用1.25mM DTT替换NTR和NADPH。2小时培育后，将混合物转移到含有小鼠细胞的孔中，用磷酸盐-盐水洗涤2次，37℃温育2小时。[B]用磷酸盐水缓冲液洗涤细胞2次后，在每孔中加入10nMα-银环蛇125I(于200微升磷酸盐水中)。37℃温育2小时后，用磷酸盐-缓冲液洗涤细胞，除去未结合毒素。如所示，在孔中加入添加了0.68mM CaCl2、0.49mM MgCl2、4微克硫氧还蛋白、3.5微克NTR和6.25mM NADPH的200微升盐水。37℃温育培养平板2小时。用加入1.25mMDTT处理时，省去NTR和NADPH。[C]用磷酸盐缓冲液洗涤细胞2次后，在各孔中加入含有4微克硫氧还蛋白、3.5微克NTR和6.25mMNADPH的200微升溶液。在某些情况下，用1.25mM DTT替换NTR和NADPH。37℃培育平板2小时。然后用磷酸盐缓冲液洗涤细胞2次，除去加入的还原剂。在各孔中加入含有0.68mM CaCl2和0.49mM MgCl2和10nMα-银环蛇毒素125I的200微升磷酸盐缓冲液。37℃继续培育2小时。表XVII显示了该试验的结果。该实验显示，当被硫氧还蛋白还原时，β-银环蛇毒素不再与乙酰胆碱受体结合。当延伸到动物时，硫氧还蛋白相关的还原机制将通过消除毒素与其靶受体的结合导致解毒。进行了一式三份的各α-银环蛇毒素结合试验。通过向培育混合物中加入过量100倍的未标记α-银环蛇毒素，测量了非特异性结合。培育期后，用磷酸盐洗涤所有情况下的细胞，除去未结合的毒素。将细胞溶于0.1M NaOH，在γ计数器中测量放射活性测定了结合的毒素量。
表XVIIα-银环蛇毒素与小鼠细胞乙酰胆碱受体的结合
大肠杆菌NTS硫氧还蛋白、NTR和NADPH实施例32动物中解毒的例子通过皮下注射小鼠测定蛇神经毒素的解毒。一式三份进行试验。注射前，用磷酸盐缓冲液(0.15M NaCl的10mM Na2HPO4/NaH2PO4pH7.2)稀释毒素，浓度范围在LD50剂量的两倍。(LD50定义为杀死给定组50％的动物的剂量)。对于毒性试验，下列神经毒素浓度对应于LD50(每克小鼠)半环扁尾蛇毒素b，0.05微克-0.15微克；α-银环蛇毒素，0.3微克；和β-银环蛇毒素，0.089微克。在注射后5、10、30、60分钟和4、12和24小时，(1)静脉内注射和(2)皮下注射(在最初注射位点周围多处局部注射)各组受攻击的小鼠。用(1)大肠杆菌NADP-硫氧还蛋白系统，采用0.08微克硫氧还蛋白、0.07微克NTR和25纳摩尔NADPH；(2)硫氧还蛋白加1-2纳摩尔还原的硫辛酸，用0.08微克大肠杆菌或0.20微克人硫氧还蛋白和5纳摩尔二硫苏糖醇(浓度为每微克注射入动物的毒素；所有溶液以磷酸盐缓冲液配制)还原硫氧还蛋白。
通过(1)与没有硫氧还蛋白的对照组比较LD50(2)跟踪局部反应的程度，如坏死、肿胀和动物的普遍不适所证明的；(3)跟踪肌酸激酶血清水平，它是组织损伤的指标。作为肌肉细胞破碎的结果，肌酸激酶被释放入血液，这用从SigmaChmical Co.(St.Louis，MO)获得的标准试验试剂盒监测。该蛇咬的症状是多样的，而且依赖于各种因素。结果，它们因病人与病人而不同。但是不管怎样，硫氧还蛋白处理应减轻人中毒的常见症状。特别是，硫氧还蛋白处理应减轻蛇咬导致的神经毒素和相关作用有关的症状，包括肿胀和水肿、咬伤周围的疼痛和风块的减少；正常脉搏速率的恢复；坏死限于咬伤区域；受影响部分最小化。这些症状的最小化进而改善病人的总体健康和状态。
食物和花粉蛋白和过敏原的还原本发明提供了一种方法，用化学方法还原主要过敏原蛋白，尤其是食物和花粉过敏原蛋白中的二硫键，以减少或消除当摄取含有这些蛋白质的食物，或吸入、摄取或粘膜接触含有这些蛋白质的花粉时发生的变态反应。
一种减少或消除过敏反应的的方法涉及用不同剂量的已被还原的硫氧还蛋白还原的变应原对动物进行一段时间的免疫治疗。变应原可以是花粉蛋白或在植物(如有毒栎)或动物(如尘螨)中发现的变应原蛋白。
本发明还提供了一种方法，用于增加变应原蛋白及其食物，和花粉等可被吞下或吸入的蛋白质的可消化性。这些蛋白质的二硫键被硫氧还蛋白还原成巯基(SH)基。其它主要的细胞硫醇还原剂谷胱甘肽没有该能力。这些蛋白质在氧化(S-S)状态时具有变应原活性；当用还原的硫氧还蛋白处理时，它们被还原(SH状态)并丧失变应原性。当被NADPH通过酶NADP-硫氧还蛋白还原酶(生理性还原系统)或二硫苏糖醇(DTT)(一种合成的化学还原剂)，或硫辛酸(一种生理性还原剂)活化(还原)时，硫氧还蛋白实现了该还原。虽然使用BADPH作为还原剂通常在几乎所有的情况下是优选的，也可使用生理可接受的硫辛酸，DTT对于某些蛋白质的处理也是可接受的。如果变应原含有硫氧还蛋白，在某些情况下可用NADPH/NTR或硫辛酸，而不加入硫氧还蛋白。
推测还原的硫氧还蛋白降低或消除食物引起的过敏的能力依赖于还原的硫氧还蛋白还原食物中变应原性蛋白的分子内二硫键的能力。另外，分子内二硫键已被硫氧还蛋白还原的变应原将较少引致变应原性(即它将为低变应原性)，但仍将保留作为有效免疫治疗剂的能力。
当用硫氧还蛋白在有效温度处理食物一段有效时间时，可用还原的硫氧还蛋白还原具有分子内二硫键的的食物蛋白，并可至少减少含有这些蛋白的食物的变应原性，提高其可消化性。温育食物的有效温度是约4℃-55℃，但任何可还原二硫键的有效温度都是可接受的。温育的有效时间是约20分钟-2小时，但任何使得二硫键还原，但不显著降低食物质量的时间都是可接受的。例如，蛋白质还可被还原，并在4℃温育48小时，保持还原。
在用还原的硫氧还蛋白处理后显示变应原性降低，可消化性增加的食物的例子是牛肉、牛奶、大豆、鸡蛋、稻、小麦和坚果。
降低哺乳动物摄取的食物的变应原性，提高可消化性的优选方法是用NADP-硫氧还蛋白系统(NTS)的组分预处理或温育食物。总的说，这些组分的有效量范围是食物中每1.0克蛋白约0.01毫克-4.0毫克，优选约0.10毫克-2毫克的硫氧还蛋白；约0.01毫克-4毫克，优选约0.20毫克-2毫克的NTR和约1微摩尔-250微摩尔，优选约25微摩尔-100微摩尔的NADPH。当然，各组分的有效用量将根据其它组分量，温育的时间和温度，以及具体食物和该食物中先天的硫氧还蛋白及其还原剂量变化。例如，上述硫氧还蛋白量是基于每克食物蛋白使用1毫克NTR和100微摩尔NADPH确定的。NADPH范围是基于使用1毫克NTR和1毫克硫氧还蛋白确定的。合适的组分用量还可能受食物的先前处理和动物种类及其情况的影响。
NADP/硫氧还蛋白系统还能还原空气携带的变应原(如豚草和禾草花粉)和皮肤接触变应原(如尘螨)中的二硫键变应原，从而减轻当动物全身性接受这些还原的变应原时，对这些变应原的IgE应答。
用NADP/硫氧还蛋白系统处理变应原(如花粉变应原)的有效温度是约4℃-55℃，但任何能使得二硫键还原的温度都是可接受的。温育的有效时间与处理食物(约20分钟-1小时)的时间相似，但是任何能还原二硫键但不显著降解蛋白质的时间都是可接受的。例如，还可还原蛋白质，并在4℃温育4小时，保持其还原。
用还原的硫氧还蛋白处理后，显示降低的变应原性和提高的可消化性的变应原的例子包括含二硫键的变应原性蛋白，如豚草花粉、禾草花粉、有毒栎和长春藤变应原和尘螨变应原蛋白。
一种降低变应原性，减轻哺乳动物对变应原的IgE应答的优选方法是用NADP-硫氧还蛋白系统(NTS)中的组分预处理或温育变应原。总的说，对于空气携带和接触变应原(如食物)组分的有效用量范围是每1克变应原蛋白约0.1-6.0毫克，优选约0.1毫克-4.0毫克硫氧还蛋白；约0.1-8.0毫克，优选约0.2-7.0毫克的NTR，和约1-500微摩尔，优选约25-400微摩尔的NADPH。同样，各种组分的有效用量将根据其它组分的量，温育的时间和温度，以及具体变应原蛋白或变应原抽提物和该变应原抽提物中先天的硫氧还蛋白及其还原剂的量而不同。上述硫氧还蛋白量是基于每克变应原蛋白使用1毫克NTR和100微摩尔NADPH确定的。NADPH范围是基于每1.0克花粉蛋白使用1.0微克NTR和1.0微克硫氧还蛋白确定的。
然后在一段预定的时间内将不同剂量的用硫氧还蛋白还原的变应原抽提物注射入动物体内。
变应原的预先处理，具体变应原和动物类型及其状态也可能影响组分的合适用量。
下面的实施例将确定本发明的降低特定变应原的变应原性和增加其可消化性的其它特征和优点。
实施例33用硫氧还蛋白处理牛奶、大豆、小麦和牛肉对于该研究，制备了牛奶变应原抽提物(目录号3390JG，Miles，Inc.，Elkhart，Indiana)储液的1-5生理盐水(PBS)稀释液，1∶20重量/体积；大豆变应原抽提物(目录号3597ED，Miles，Inc.，Elkhart，Indiana)储液的1-10PBS稀释液，1∶10重量/体积；小麦变应原抽提物(目录号3708ED，Miles，Inc.，Elkhart，Indiana)储液的1-5PBS稀释液，1∶10重量/体积。还制备了商品牛肉变应原抽提物(目录号3078JF，Miles Inc.，Elkhart，Indiana)的1-5 PBS稀释液，1∶10重量/体积。
就牛奶而言，用NADP/硫氧还蛋白系统(NTS)处理0.1毫升稀释液，包括培育该变应原与4.8微克硫氧还蛋白、4.2微克NTR和1mM NADPH(最终体积0.2毫升)。还用0.1毫升稀释的牛奶变应原与1.5mM DTT和4.8微克硫氧还蛋白(最终体积0.2)制备了第二样品。在所有的变应原研究中，包括本实施例的研究和下文的研究，如前面对已转化而过度生产那些蛋白质的大肠杆菌所述的那样，纯化了硫氧还蛋白和NTR(de La Motte-Guery，F.等(1991)Eur.J.Biochem.196287-294，和Russel，M.等(1988)J.Biol.Chem.2639015-9019)。对于大豆和小麦，将0.05毫升稀释液与2.4微克硫氧还蛋白、2.1微克NTR和1mM NADPH一起培育。另外，制备了相同处理的PBS对照样品。还用0.05毫升分离的变应原稀释液与1.5mM DTT和2.4微克硫氧还蛋白一起培育，制备了DTT处理的大豆和小麦样品。对照和所有大豆和小麦样品的最终体积是0.1毫升。室温培育牛奶和小麦制备物25分钟，37℃培育大豆制备物1小时25分钟。对于牛肉，用0.05毫升稀释液与2.4微克硫氧还蛋白、2.1微克NTR和1mM NADPH(最终体积0.1毫升)一起37℃温育25分钟。用相同方法但在室温下处理另一0.05毫升样品。温育后，对于每种处理过的食物抽提物，制备了1毫升1×103-1×106或1×103-1×107的稀释液。在30分钟内用稀释的样品测试。
实施例34用mBBr荧光标记/SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定NADP/硫氧还蛋白系统还原食物变应原和提高蛋白酶水解方法对于该研究，分别制备了实施例33所述的储藏的牛奶、牛肉和小麦抽提物的1-2.5、1-5和1-1.5倍PBS稀释液。在50微升这些稀释液中加入2.4微克硫氧还蛋白、2.1微克NTR和1mM NADPH(最终体积0.1毫升)。对照由50微升稀释的具体抽提物和50微升PBS组成。将制备物在室温和37℃温育25分钟。温育后，加入8微升80mM mBBr，继续在室温下反应15分钟。停止反应，加入10微升100mMβ-巯基乙醇、10微升20％SDS和10微升50％甘油衍生过量mBBr。用先前所述的mBBr/SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术分析样品。结果显示NTS在室温和37℃下都能有效还原变应原抽提物中的蛋白质。在另一个研究中，用NTS类似处理了实施例33中所述的大豆抽提物储液的PBS稀释液，用mBBr标记/SDS-PAGE法的分析显示，硫氧还蛋白也还原了大豆蛋白。然而当大豆、牛奶、小麦、鸡蛋和牛肉变应原蛋白与谷胱甘肽、谷胱甘肽还原酶和NADPH共同培育时，这些被处理的变应原蛋白极少或无还原。
类似的将商品稻变应原抽提物(目录号3549ED，Miles INc.，Elkhart，Indiana)的PBS稀释液与NTS-起培育，并用mBBr/SDS-PAGE技术分析，显示还原的硫氧还蛋白能还原稻变应原蛋白。
在一独立的研究中，还观察到实施例33中所述的，已被NTS还原，并与胰蛋白酶进一步培育的商品抽提物中的食物变应原蛋白对蛋白酶水解的敏感性提高，高于未用NTS处理的对照。用mBBr/SDS-PAGE技术进行还原分析。进一步在该研究中，当用2微克胰蛋白酶处理10微克NTS还原的纯化的牛奶变应原蛋白β-乳球蛋白(Sigma Chemical Co.)时，蛋白酶水解是100％，与之相比用相同胰蛋白酶处理的氧化的β-乳球蛋白仅50％。当用2微克胰蛋白酶类似处理10微克另一种纯化的牛奶变应原，氧化的α-乳清蛋白(Sigma Chemical Co.)时，无可注意的蛋白酶水解。然而，用NTS还原的10微克纯化的α-乳清蛋白被胰蛋白酶水解了80％。另外用0.8微克硫氧还蛋白和0.5mM DTT还原的10微克α-乳清蛋白被2微克胰蛋白酶100％水解。
实施例35卵清蛋白的还原从Sigma Chemical Co.购得干燥的鸡卵清。鸡卵清中总蛋白质的约80％是变应原。将20毫克/毫升卵清溶液重新悬浮于PBS。由于不是所有的物质都溶解，在14,000RPM离心2分钟。将溶解的卵清蛋白质用于用mBBr荧光标记和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析的还原研究。所用的处理是对照(无还原剂)NTS、DTT加硫氧还蛋白、还原的谷胱甘肽(GSH)和还原的谷胱甘肽/谷胱甘肽还原酶/NADPH。在PBS中用23微升20mg/ml卵清悬液的可溶性蛋白进行反应，最终体积为100微升。在NTS中，使用了7.5mM NADPH、2.4微克硫氧还蛋白和2.1微克NTR。当用DTT还原硫氧还蛋白时，省去NADPH和NTR，将DTT加到1.5mM。所用的GSH浓度是3mM。对于GSH/GR/NADPH系统的还原，使用了3mM GSH、4微克GR和7.5mMNADPH。混合物在室温下培育1小时。培育后，加入7微升80mM mBBr，反应在室温下继续15分钟。停止反应，加入10微升100mM的巯基乙醇、10微升20％SDS和10微升50％甘油衍生过量的mBBr。然后用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析样品。该实验的结果显示，NTS和DTT加硫氧还蛋白对于卵清蛋白(80％变应原)的还原非常有效。GSH或GSH/GR/NADPH显示与对照相同水平的还原，因此是一种卵清蛋白的无效还原剂。
实施例36变应原性研究中动物的致敏本研究中所用的动物是特异质犬，出身于产生高IgE的西班牙猎犬的近亲交配群体的不同对同窝出生幼仔。
一只由其兄弟受精的近交IgE反应性母狗生下了一窝9只幼仔(4只雄性，5只雌性)。在出生1日，对于牛奶、大豆和稻研究，将9只幼仔分成两组5只幼仔的组I在右侧腋窝皮下(SQ)注射1微克实施例33中所述的商品大豆抽提物的0.2毫升明矾溶液；4只幼仔的组II在右侧腋窝SQ注射1微克商品干燥牛奶抽提物(实施例33所述)的0.2毫升盐水和0.2毫升明矾溶液。全部9只幼仔在左侧腋窝SQ接受了1微克储液1∶10w/v稻变应原抽提物(目录号3549ED，Miles，Inc.Elkhart，Indiana)的0.2毫升明矾。
在3、7和11周龄，用0.5毫升活的减毒犬热病-肝炎疫苗(Pitman-Moore，Washington’s Crossing，PA)在肩部SQ接种全部幼仔。接种2日和9日后，给予幼仔在新生期接受过的相同食物抗原，组I的5只犬接受1微克大豆抽提物溶于2毫升明矾，组II的4只犬接受1微克牛奶溶于0.2毫升明矾，全部9只犬分别在右侧和左侧腋窝SQ接受1微克稻抽提物溶于0.2毫升明矾。
在RAST试验中使用了125I-标记的家兔抗-犬IgE血清(Frick，O.L.等(1983)Am.J.Vet.Res.44440-445)。如在标准RAST方案中，使溴化氰活化的滤纸片与100微克大豆、牛奶或稻抗原反应(Wide，L.等(1967)Lancet21105-1107)。用非特异质杂种幼犬的新生犬脐带血清的合并物作为阴性对照或基线cpm。
抚育幼犬6周，并断奶供应常规Puppy Chow(Ralston-Purina Company，St.Louis，MO)，它包括致敏蛋白质、大豆粕、干乳清和稻壳；它们每日喂食一次，无限制供应水，在University of California，Davis，Animal Resources Services，School of Veterinary Medicine的兽医学看护和监督下。6个月后，用常规Field& Farm Dog Chow喂养。
在3-4月龄之间，当发现幼犬对具体的食物抗原产生IgE抗体时，对一窝全部9只幼犬在清晨给予双盲的，240毫升大豆或牛奶婴儿配方，豆腐、稻米粥或香草味的Vivonex蛋白质水解物(Norwich-Eaton Co.，Norwich，CT)。攻击前和该日每隔2小时测量肚脐水平的周长。由兽医专家密切观察它们瘙痒或皮疹和呕吐的临床症状、粪便的频率和特征，咳嗽或呼吸困难和鼻涕。监测它们的这些反应症状4日。7日后再次给予攻击食物。
该窝的全部9只幼犬体重增加并正常发育，没有医学问题。它们无腹泻或其它胃肠道症状，除非用已致敏的食物攻击它们。也未发生皮肤或呼吸道异常。对于接种或免疫也无不利的反应。
每两周取静脉血样跟踪针对这3种食物蛋白的犬IgE-RAST。
对应的牛奶(当在4个月加强攻击时，p＜0.5)和大豆(前3个月p＜0.0005)免疫的动物比对照产生了显著更多的IgE-抗-食物抗体。IgE-抗-食物抗体的平均滴度在5-10周时升高，达到平台，然后在20-30周龄再次急剧升高。当分别在食物中加入了大豆和牛奶时，大豆和牛奶免疫的动物中出现了有统计学意义的腹泻和腹部肿胀反应。
以类似上述方法的方法培养了另一组8只对牛奶、大豆、小麦和牛肉过敏的犬。产生高IgE的西班牙猎犬的所述近交群中另一窝的4只同窝幼犬右侧腋窝SQ注射1微克实施例33中所述的各储藏牛奶、大豆、小麦和牛肉变应原抽提物。同窝的4只幼犬作为对照。还对全部8只幼犬左侧腋窝皮下注射了1微克稻抽提物的0.2毫升明矾。如上所述接种幼犬，每次接种后2和9日后给予它们新生期接受的相同量的相同食物抗原。如上，以相同的时间表喂给它们含有合适致敏性蛋白的食物(如牛奶、大豆、牛肉和小麦)。对原先对大豆和牛奶过敏的动物，这些免疫接种的犬比对照产生显著更多的抗-特异性食物IgE抗体(包括小麦和牛肉抗体)。当用含有小麦、牛肉、大豆或牛奶的食物攻击时，免疫的动物中出现了有统计学意义的腹泻和腹部肿胀反应。
实施例37用还原的硫氧还蛋白处理的食物变应原中变应原性降低的皮试确定在实施例36所述的合适致敏犬(如用牛奶稀释液注射的牛奶致敏犬)的腹部皮肤上，透皮注射实施例33中所述的硫氧还蛋白处理的食物变应原稀释液的各100毫升稀释液。变应原稀释液注射前，用4毫升0.5％Evan蓝染料注射入犬前肢静脉。显示变态反应的犬在变应原注射区域出现蓝色的丘疹。出现10分钟后测量丘疹的大小(长度和宽度)。用各变应原制剂一定浓度范围注射后观察到的丘疹大小和稀释终点作为变应原性指标。发现硫氧还蛋白处理对于大豆的1×105稀释液产生50％保护，对于牛奶3×104稀释液和对于小麦1×106稀释液产生完全保护，对于牛肉1×105稀释液产生至少一部分保护(分别见
图1、2、3、4和5)。
实施例38用还原的硫氧还蛋白处理的食物变应原的变应原性的喂食试验确定喂食前一周，用前面实施例中所述的商品变应原性抽提物，如实施例36用合适的食物变应原透皮皮肤测试了以实施例36所述方法致敏的犬。根据这些结果，将动物分成“对照”和“硫氧还蛋白处理的”组。各组由具有互补敏感性的代表构成，即对于各组选择了相等数目的强、中和弱反应者。除非另外说明，各组由3只动物(每次实验6只动物)组成。对于喂食攻击3日前和5日后，使犬维持Hill’s处方饮食犬d/d饮食(Hill’s Division of Colgate Palmolive Co.，Topeka，Kansas)。观察这段时间内犬的临床症状，如干呕和呕吐。另外，监测粪便并评分，作为对测试食物的变应性反应的指标。在变应原性饮食攻击3日前和3日后计数犬粪便次数，并将其坚松度用数字表示1＝坚硬，2＝柔软，3＝过稀。然后将粪便次数与坚松度因子相乘，计算出粪便的评分。作为对测试的食物变态反应的指标，将变应原性饮食攻击后得到的每日平均粪便评分减去攻击之前的计算出各组(对照或硫氧还蛋白处理的)每日平均最终净粪便评分。每日较高的平均净粪便评分代表了更强的变态性反应。
下文给出了制备和施给该饮食的方法。除非另外说明，在室温下进行反应。
大豆将商品大豆配方(添加了铁的Isomil，Ross Laboratories，Columbus，Ohio)1.026公斤溶于3升水中。将溶液分成1.925升的两批，一批用作对照，另一批用NADP/硫氧还蛋白系统(NTS)如下处理。预培育含有45微摩尔NADPH、564微克的NADP-硫氧还蛋白还原酶(NTR)和1.125毫克硫氧还蛋白(全部溶于30mMTris-HCl缓冲液，pH7.9中)的混合物5分钟，然后加到1.925升配方之一(因此称为“硫氧还蛋白-处理的”批)中加入硫氧还蛋白系统后，恒定搅拌，继续培育1小时。在对照批中加入等量缓冲液。培育后，将600毫升配方喂给指定组的3只犬。喂给动物的部分等于培育前25.0克大豆蛋白。
小麦将未漂白的面粉1.5公斤加到一加仑的Waring搅拌器中的3升水中加热到37℃。混合1分钟后，将面粉悬液均分成两批，一批用作对照，另一批用NADP/硫氧还蛋白系统(NTS)如下处理预培育含有45微摩尔NADPH、564微克(NTR)和1.125毫克硫氧还蛋白(全部溶于30mM Tris-HCl缓冲液，pH7.9中)的混合物5分钟，然后加到一批中(因此称为“硫氧还蛋白-处理的”批)。将等量的缓冲液加到对照批中。两批制剂都频繁搅拌，37℃培育1小时。从各制剂中取出600毫升，与一份犬(15-3/4盎司)d/d，无小麦、基于稻/羊肉的狗食混合，并喂给指定批的3只犬。该部分相当于25.0克小麦蛋白。在用8只犬的实验中，面粉增加到2.0公斤，方法中使用量相应增加。
牛奶类似的将已用水重建的干燥CARNATION制剂与NADP/硫氧还蛋白系统一起培育。如前，3只犬接受未处理的牛奶，3只犬接受处理过的牛奶。犬接受的最终部分等价于10克牛奶蛋白。
结果所用的NADP/硫氧还蛋白系统各组分的水平显著高于实施例15中所述生面团研究中的。在该喂食研究中，初步试验表明需要更高水平的这些化合物来还原变应原性蛋白，如mBBr/SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法体外测定的那样。下文表明了该饲料试验中，相对于烘烤试验中所用的量，对于各犬每克蛋白所用的NADP/硫氧还蛋白系统各组分的量
*标出的量是相对于上述烘烤试验中使用的量，其中在每克面粉蛋白中加入了3微克硫氧还蛋白、1.5微克NTR和0.3微摩尔NADPH。在烘烤试验中，用约200克面粉或大约20克面粉蛋白烘烤面包。对于这些饲料实验，将食品制备物与NADP/硫氧还蛋白系统的组分在室温下(牛奶和大豆)或37℃(小麦)一起培育1小时。
根据“床边症状”(呕吐和干呕)和“粪便评分”(见图6)，发现硫氧还蛋白处理降低了犬对大豆和小麦配方的变态性反应。用NTS处理也降低了牛奶配方的变应原性。应注意虽然所用的硫氧还蛋白和NTR来自大肠杆菌，也可用其它来源，如酵母的硫氧还蛋白和硫氧还蛋白h和m。
实施例39测定硫氧还蛋白处理的牛奶蛋白和Raw Cow’s牛奶提高的可消化性和下降的变应原性几种蛋白质-α-乳清蛋白、血清白蛋白、酪蛋白，特别是β-乳球蛋白(BLG)导致牛奶过敏。
该实施例显示，硫氧还蛋白选择性和特异性的还原牛奶蛋白质和变应原的二硫键。一旦被还原，这些变应原中最活跃的(BLG)不仅显示变应原性降低，还显示可消化性惊人的提高。在硫氧还蛋白还原后，其它牛奶二硫键蛋白对胃蛋白酶的敏感性也在某种程度上增加了。
材料和方法变应原来源从University of California at Davis的实验性农场获得了未加工的牛奶。从Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO购得了纯β-乳球蛋白A和B，以及这两种形式的80％混合物。
动物使同一窝实施例36-38中使用的近交高IgE-产生特异质犬的犬致敏，并在School of Veterinary Medicine，University of California，Davis的AnimalResources Service中喂养。挑选出生时就致敏的对过敏有遗传倾向的犬，它们具有15年历史的食物和花粉超敏反应性。
化学药品和酶从Sigma，Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN和Biorad Laboratories，Hercules，CA获得了十二烷基磺酸钠/聚丙烯酰胺(SDS/PAGE)试剂。DTT购自Boehringer Mannheim，一溴二满(mBBr)购自Calbiochem，San Diego，CA。从过度表达该蛋白的大肠杆菌菌株纯化了硫氧还蛋白和NTR。用对于菠菜NTR所用的相同方法纯化了菠菜叶子的谷胱甘肽还原酶。猪胃粘膜的胃蛋白酶、NADPH和其它生物化学试剂购自Sigma。
特异质犬的食物致敏在第1日，用1微克各小麦、牛奶和牛肉抽提物(Miles，Inc.，Elkhart，Indiana，如实施例33所述)的0.2毫升明矾皮下注射两窝特异质犬，称为CGB和GCb的新生幼犬。用大豆抽提物(Miles Inc.如实施例33所述)加上这些相同的变应原注射第三窝，称为CBB。幼犬的致敏、测试和养护方法基本上和实施例36中描述的相同。
皮试皮试3分钟前，各犬通过头静脉接受4-5毫升过滤的0.5％Evans蓝染料溶液(等价于每公斤体重0.2毫升0.5％Evans蓝染料)，来增强皮肤IgE抗体的评估。在腹部皮肤上透皮注射100微升各样品的系列稀释液建立滴度。15-20分钟后，通过测量蓝色丘疹反应的大小(最大长度和宽度)，来测定过敏反应。测试的各动物包括一合适阴性对照(生理盐水稀释的缓冲液)。用硫氧还蛋白、NTR、NADPH和胃蛋白酶单独重复测试始终是阴性。
蛋白质试验用Bradford法，使用牛γ球蛋白作为标准品测定了蛋白质浓度。用计算的16800的摩尔消光系数通过其278纳米处的吸光度测定了纯BLG的浓度(Gill，S.C.等(1989)Anal.Biochem.182319-326)。
蛋白质建模
Brookhaven National Laboratory的蛋白质数据库提供了一个由Brownlow等以1.8埃分辨率确定的BLG结构模型。(Brownlow，S.等(1997)“牛β-乳球蛋白在1.8分辨率-仍为谜样的脂质运载蛋白(lipocalcin)”Structure 5481-495)。Swiss-Model程序建立了一个具有单突变C160S(部分还原)和双突变C160S-C160S(完全还原)的蛋白质模型(Peitsch，M.C.(1996)，“ProMod和Swiss-模型自动化比较性蛋白质建模的基于国际互联网的工具”，Biochem.Soc.Trans.24274-279)。用RasMol程序v2.6显现了BLG的三维模型。
蛋白质还原在100微升体积中用(i)NADP/硫氧还蛋白系统(NTS)，含有5微升25mMNADPH、8微升0.3mg/ml大肠杆菌硫氧还蛋白(即2.4微克总硫氧还蛋白)和7微升O.3mg/ml大肠杆菌NTR；或(ii)NADP/谷胱甘肽系统(NGS)，含有5微升25mMNADPH、10微升30mM还原的谷胱甘肽(GSH)和15微升0.1mg/ml谷胱甘肽还原酶进行了蛋白质二硫键的还原。反应在含有10微克纯靶蛋白或50微克未加工过的牛奶的生理缓冲盐水溶液(PBS；即10mM Na2HPO4、1.8mM KH2PO4、2.7mM KCl和137mMNaCl，pH7.4)中进行。4℃过夜或37℃和55℃45分钟培育反应混合物。为了完成还原，在含有5微升1OOmM DTT的PBS中培育样品，并煮沸5分钟。还原的蛋白在凝胶上通过mBBr标记和凝胶电泳而显现。扫描凝胶确定还原程度。
胃蛋白酶试验在上述条件下，在4℃(得到完全还原形式)或55℃(得到部分还原形式)将BLG640微克或牛奶1毫克蛋白质(如约30微升)和或不和硫氧还蛋白系统(NTS)一起培育。然后在Astwood，J.D.等(1996)，“食物变应原对体外消化的稳定性”，Nature Biotechnol.141269-1273所述的200微升模拟的胃液(SGF)中处理BLG320微克或牛奶500微克蛋白。SGF由0.32％胃蛋白酶(w/v)和30mM NaCl构成，用HCl调节到pH1.2(Board of Trustees(编)1995，人工胃液，TS.，2053页，于UnitedStates Pharmacopeia 23 The National Formulary 18，United StatesPharmacopeial convention，Inc.Rockville，MD)。37℃温育反应混合物，并在温育0、0.25、1、2、4、8、15、30和60分钟后加入O.375倍体积的160mM Na2CO3(约pH7)中止反应。然后对该蛋白质混合物进行SDS-PAGE(15％凝胶)，并用考马斯蓝如下染色。如指出的，用皮试分析测定消化的样品的变应原性。
喂食攻击对于每只犬，在100毫升水中进行80％纯BLG(一种A和B形式的混合物)的还原。加入104毫克NADPH、1毫克大肠杆菌硫氧还蛋白和1毫克大肠杆菌NTR的水相混合物，处理每克BLG。反应在125rpm的振荡器中37℃进行45分钟。样品4℃储藏过夜。次日，将未处理(对照)或处理的BLG2.5克与一罐12盎司的P/D食物(Hills)混合，并喂给犬。未受攻击的动物接受没有BLG的狗食，而对照动物接受具有未处理BLG的狗食。最初喂给犬1/4罐未处理的食物，引起胃酸流出。15分钟后，分3次，每隔15分钟喂给犬已混合了2.5克未处理或硫氧还蛋白处理的BLG的1/3罐狗食。在这些间隔中监测犬，并评估其GI反应。然后在下5个小时内观察犬，并每隔1小时记录其反应。
数据分析对喂食引起的呕吐的时间、呕吐量和流体性指定数字，来评估上述食物攻击的犬的消化反应。流体性无呕吐＝0，固态呕吐物＝1，液态呕吐物＝2，液体和血液或胆汁呕吐物＝3。体积无呕吐物＝0，小量呕吐物＝1，大量呕吐物＝2。计时延迟呕吐＝1，立即呕吐＝2。
蛋白质的mBBr标记和分析巯基可以其荧光mBBr衍生物而观察到。在各蛋白质样品中加入10微升100mM溶液。培育20分钟后，加入10微升100mM 2-巯基乙醇、10微升20％SDS和20微升含有80％(v/v)甘油的SDS/PAGE样品缓冲液和0.005％溴酚蓝停止反应。然后用SDS/PAGE(10-20％丙烯酰胺梯度)如下分离蛋白质。电泳后，将凝胶置于12％三氯乙酸中固定1小时，然后在40％(v/v)甲醇和10％(v/v)乙酸中浸泡过夜或更长，换液几次除去过量mBBr。然后将脱色凝胶置于365纳米紫外光下，目测荧光条带。用(i)Polaroid照片(正片/负片Landfilm，55型)通过黄色Wratten明胶滤光片8号，曝光时间45秒，f4.5或(ii)NucleoTech Corporation的Nucleovision系统拍摄照片。
SDS/PAGE按照Laemmli，U.K.(1970)“在噬菌体T4头装配期间结构蛋白的切割”，Nature227680-685制备了凝胶(10-20％丙烯酰胺梯度，1.5毫米厚度或15％丙烯酰胺，0.75毫米厚度)。电泳后，用0.01％考马斯亮蓝R-250的40％甲醇和10％乙酸溶液染色凝胶1小时，然后用20％乙醇和10％乙酸溶液脱色过夜。在脱色后用(i)Polaroid照相(曝光时间1/15秒，f7)或(ii)NucleoTech Corporation的Nucleovision系统拍照。
序列分析用SDS-PAGE(10-20％丙烯酰胺梯度，1.5mm厚度或15％丙烯酰胺，0.75mm厚度)分离作为mBBr衍生物的不同形式的BLG(氧化物，部分或全部还原的，10微克)。用凝胶内消化法获得含有cys残基的肽，它将确定结构特征(Hwang，B.J.等(1996)“从聚丙烯酰胺凝胶洗脱出的蛋白质的内部序列分析”，J.Chromatogr.B.Biomed.Appl.686165-175)。用作起始材料的干燥凝胶置于水中，使膨胀，并除去赛璐玢层。然后从重建的凝胶中切割下合适的BLG条带。将各蛋白质条带切成1-2毫米小块。简单说，将凝胶块在速度蒸发器中脱水，重新以0.1M pH9的Tris缓冲液和pH9.0的0.05％SDS(含有0.03-0.05微克Lys-C内肽酶(Wako))水合，并在30℃温育过夜。用水抽提凝胶2小时2次，用70％乙腈/0.1％三氟乙酸(TFA)抽提2小时2次，洗脱肽。干燥合并的抽提物，溶于最小体积6M的胍HCl-Tris，pH8.2中。然后用二硫苏糖醇(DTT)还原抽提的肽，并用碘乙酰胺烷基化。反应后，将混合物用水稀释4-X，并通过离心除去还原的十二烷基磺酸胍沉淀。用胰蛋白酶在稀释的反应混合物中进行溶液内消化，以完全消化。用C18微孔柱(1mm×15cm，VYDAC)，使用Applied Biosystems 172HPLC系统纯化了肽。在样品注入后，用95％溶剂A(0.1％TFA溶于水)/5％溶剂B(70乙腈/0/075％TFA)洗涤该柱10分钟，流速为80微升/分钟。用5-70％溶剂B梯度以90分钟洗脱得到肽。用ABI 477或470A测序仪和串联HPLC鉴定乙内酰苯硫脲(thenylthiohydratoin，PTH)氨基酸对纯化的肽进行测序。如下所示的分离了含有Cys160或Cys190的肽。完全氧化的蛋白质的二硫键对应于Cys106-Cys119和Cys60-Cys160。为了鉴定与部分或完全还原形式有关的二硫键，分离了对各形式独特的胰蛋白酶肽。部分和完全还原的形式都显示以下肽-Leu149-Ser-Phe-Asn-Pro-Thr-Gln-Leu-Glu-Glu-Gln-Cys160-His-Ile162。完全还原的蛋白质还显示了以下的肽-Tyr102-Leu-Leu-Phe-Cys106-Met-Glu-Asn-Ser-Ala-Glu-Pro-Glu-Gln-Ser-Leu-Ala-Cys119-Gln-Cys121-Leu-Val-。
结果硫氧还蛋白系统对牛奶蛋白质的还原硫氧还蛋白对于牛奶中最多的二硫键蛋白，即BLG的还原是有效的。为此，在用含有NADPH、NTR和硫氧还蛋白的NADP/硫氧还蛋白系统(NTS)处理后，监测纯BLG(A和B形式)的氧化还原状态。如上所述，将样品与NTS一起温育，然后用一溴二满(mBBr)/SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)法分析。在此，如前所述，用mBBr衍生并用SDS-PAGE分离的靶蛋白还原(-SH)形式，当用紫外光观察时呈现一条荧光条带。发现如前面实施例中用含有分子内二硫键的蛋白质广谱所看到的那样，纯BLG的A和B形式被硫氧还蛋白活跃的还原。当用于牛奶时，硫氧还蛋白不仅还原BLG还还原几种其它蛋白质，包括α-乳清蛋白，如图7凝胶所用的SDS/PAGE/mBBr标记法所测定。对于该凝胶，在所有泳道中加入50微克未加工过的牛奶的PBS溶液。其它各泳道的变量是泳道1对照，4℃，无添加；泳道2，NTS，55℃；泳道3，NTS，4℃；泳道4，NGS，55℃；泳道5，NGS，4℃；泳道6，5mM DTT，100℃，5分钟；泳道7与泳道6相同，除了用考马斯蓝染色。注意过量的NADPH、NTR和硫氧还蛋白将靶牛奶蛋白在整个实验中维持于还原状态中。在主要(24kDa)酪蛋白组分(α和β)前面泳动的小条带是κ-酪蛋白。
发现温度对还原有一种有趣而且有用的作用。当如图7所示在55℃处理(45分钟)时，BLG被还原但它在凝胶中的迁移率仅轻微改变。相反，当在4℃温育(17小时)时，大多数BLG的迁移率显著下降，呈现一种新的蛋白质形式(泳道3，图7)。凝胶扫描对还原程度的评估揭示，BLG在55℃时被部分还原，在4℃时被完全还原。将BLG的已知结构与部分和完全还原形式的胰蛋白酶水解肽的氨基酸序列比较，得到关于该还原性质的进一步信息。
已知BLG含有两个二硫键，两者都是分子内(见图8)一个在表面上可清楚的接触，位于靠近C-末端(Cys66-Cys160)，而另一个靠近核心，位于两个β-折叠之间(Cys160-Cys119或可能是Cys106-Cys121)。序列分析证实暴露的二硫键(Cys66-Cys160)在55℃被还原(部分还原形式)，这个二硫键和隐藏的二硫键(Cys160-Cys119或Cys106-Cys121)都在4℃被还原(完全还原形式)(见材料和方法)。改变pH也能实现BLG的不同还原。pH6.8时还原仅产生部分还原形式，而在pH8.0时观察到部分和完全还原形式的混合物(都在37℃)(数据未显示)。该结果证实了他人的发现，即显示BLG在高于中性的pH值时是不稳定的(Tanford，C.等(1959)“β-乳球蛋白在pH7.5时的转化”Biochemistry 814032-4036)并在高于40℃的温度上经历构象转换(Qi，X.L.等(1997)，“温度对β-乳球蛋白在pH6.7时的二级结构的作用，用CD和IR光谱测定熔球假说的一种试验”Biochem.J.324341-346)。显然，当仅在不含缓冲液的未处理牛奶中加入NADP/硫氧还蛋白系统的组分时，可获得如图7所示的BLG的相同还原结果。另外，当在空气中储藏在4℃时，该不含缓冲液的处理过的牛奶中的BLG在2天内保持还原。
如图7凝胶的泳道4和5中可见，被NADPH和谷胱甘肽还原酶维持在还原态的一硫醇谷胱甘肽也还原了BLG，并在某种程度上还原了其它牛奶蛋白，但效力比NTS低。其它二硫键还原剂，二硫苏糖醇和硫辛酸也是有效的，但如前面实施例对于毒液神经毒素所述的那样仅当与硫氧还蛋白联合时才有效(数据未显示)。
用胃蛋白酶和胰蛋白酶消化牛奶蛋白如实施例19和29所示，含有分子内二硫键的小蛋白质(如胰蛋白酶抑制蛋白、毒液神经毒素)的胰蛋白酶敏感性在被硫氧还蛋白还原后急剧提高。类似的，观察到BLG符合该模式，即硫氧还蛋白还原的BLG对胰蛋白酶消化高度敏感，而氧化的BLG(即纯的、未处理的)有抗性(见实施例34)。在该实施例中用纯BLG和经过人工胃液处理的牛奶(如Astwood，J.D.等，见上)获得了相似结果。当用SDS-PAGE分离并用考马斯蓝染色时，发现BLG被胃蛋白酶消化，但仅在被硫氧还蛋白还原后(见图9)。图9显示了用微型SDS/PAGE和考马斯蓝染色测定的氧化的和还原的BLG的消化。所有均与SGF一起37℃培育。图9中凝胶的其它变量是泳道1，BLG，SGF，0分钟；泳道2，BLG，SGF，60分钟；泳道3，55℃NTS还原的BLG，SGF，0分钟；泳道4，55℃被NTS还原的BLG，SGF，60分钟；泳道5，还原的BLG，4℃，SGF，0分钟；泳道6，还原的BLG，55℃，SGF，60分钟；泳道7，SGF；泳道8，BLG。如图9所见，敏感性的差异是惊人的。
发现牛奶中氧化的BLG对消化至少能抵抗60分钟，而硫氧还蛋白还原形式在60秒钟内被消化(见
图10A-10C)。
图10A、10B和10C描述了用微型SDS/PAGE和考马斯亮蓝染色测定的，时间对硫氧还蛋白还原后用PBS缓冲的牛奶消化的作用。样品2-10含有13.5微升人工胃液混合物，而样品3-10含有50微克牛奶蛋白。培育0、0.25、1、2、4、8、15、30、60分钟后通过中和停止消化，将等份加到
图10A、10B和10C中凝胶的各合适泳道中。
图10A凝胶的其它变量是缓冲牛奶对照；
图10B凝胶是缓冲牛奶，NTS，55℃；
图10C凝胶是缓冲牛奶，NTS，4℃。单个二硫键的还原是充分的。BLG的部分(55℃)和完全(4℃)形式显示在胃蛋白酶敏感性上没有差异(比较
图10B和10C)。显然，即使被硫氧还蛋白部分还原，谷胱甘肽处理的样品对于人工胃液的消化是不敏感的(数据未显示)。虽然硫氧还蛋白还原在某种程度上提高了α-乳清蛋白和κ-酪蛋白的敏感性，发现不论是纯的还是在牛奶中的BLG是唯一的不经硫氧还蛋白还原就不被消化的蛋白质(见图7、9和10A-10C)。
还原和消化的牛奶蛋白的变应原状态用犬模型皮肤试验比较牛奶主要蛋白质(酪蛋白、α-乳清蛋白、BSA、BLG)的变应原性揭示，BLG是牛奶的主要变应原，负责产生80％丘疹的活性。另外，当用硫氧还蛋白系统处理时，牛奶和BLG都显示引起变态反应的能力下降。因此，与测试变应原性的前述实施例的结果相似，经处理，牛奶的变应原性下降了10-300倍，这取决于测试的犬的敏感性(见
图11A和11B)。
图11A和11B中的图比较了两只敏感性不同的犬对未处理牛奶变应原皮肤测试反应与硫氧还蛋白相关的变化。如
图11A和11B中所示，透皮注射100微升牛奶的PBS溶液，通过所引起的丘疹面积(平方毫米)确定发生了I型超敏反应。该溶液用NADP/硫氧还蛋白系统(NTS，4℃)预处理或未处理(对照)。显示了两只犬的反应，说明尽管敏感性不同，硫氧还蛋白处理在两种情况下都改变了变应原性(即轻微(
图11B)和高度(11A)敏感动物)。发现PBS/甘油对照和NTS对于各犬都是阴性的。另外，用显示不同敏感性的许多犬进行的试验揭示，纯的或牛奶中的BLG的部分和完全还原形式的变应原性中没有一致性差异(数据未显示)。因此，该皮肤试验数据显示硫氧还蛋白的还原改变了表位可接近性，从而降低了BLG和可能的其它牛奶蛋白的变应原性。
纯BLG显示与牛奶相似的变态反应(与
图12A和12B中的氧化和还原的0时刻样品比较)。在
图12A和12B中，氧化的“0”分钟和还原的“0”分钟直方图代表消化处理前的样品，氧化60分钟和还原60分钟的直方图代表用含胃蛋白酶的SGF处理后的样品。透皮注射100微升用NADP/硫氧还蛋白系统(NTS)(还原的)预处理的或未处理(氧化的对照)的经消化并中和的BLG(
图12A)或牛奶(
图12B)，通过所引起的皮肤丘疹面积(平方毫米)观察到发生了I型超敏反应。发现对所有测试的犬中和的SGF对照均是阴性。另外，皮肤试验显示纯的BLG A和B形式在硫氧还蛋白对变应原性的作用上无差异(数据未显示)。
用BLG和牛奶进行的皮肤试验揭示，胃蛋白酶消化几乎完全消除了这两种制备物的变应原性(见
图12A和12B)。根据皮肤试验，当消化与还原联合时，变态反应下降了300-1000倍。另外，消化样品的变应原性在高度和中度敏感的犬中下降到边缘水平。
这些结果与硫氧还蛋白的还原(1)改变完整蛋白质表位的可接近性，从而在大部分动物中降低了其变应原性，和(2)赋予稳定的变应原对胃蛋白酶消化的敏感性，如BLG，从而几乎完全丧失其变应原性的结论一致(见
图13和14)。
最后，还发现当被NTS系统还原时，α-乳清蛋白和BLG可被胰蛋白酶消化(见实施例34)。这些结果与本实施例用胃蛋白酶获得的结果相结合，证实了硫氧还蛋白使BLG对蛋白酶敏感的能力。
特异质犬的喂食试验导致呕吐和腹泻的胃肠道不适是伴随摄取食物变应原和食物蛋白不消化性的症状。另外，这些症状的严重性提供了变应原强度的量度，它补充了皮肤试验。为了获得胃肠道反应的证据，给过敏性犬的食物添加BLG。如下文表VII列出的结果所示，摄取了含有2.5克还原BLG(2.5克BLG对应于3/4升牛奶)的食物的狗显示呕吐程度显著降低。重复喂食试验表明，平均约70％的胃反流消失。很明显，在一组用处理过或未处理的BLG喂食的犬中观察到该模式。在每罐喂给每只犬的食物中，将BLG从表VIII中使用的2.5克减少到1.25克，观察到有关的胃肠道不适反应呈类似的减轻(数据未显示)。这些观察补充了上文讨论的皮肤试验结果，显示粘膜淋巴组织对变应原的识别因硫氧还蛋白处理而改变。
表XVIII用未处理或硫氧还蛋白处理的β-乳球蛋白喂食的犬的变态反应
*引起呕吐的质量和流动性的量度用硫氧还蛋白处理的或未处理的(对照)BLG2.5克，与一罐狗食混合测量上胃肠道指标。在两次独立的喂食实验A和B后进行指标计算。上胃肠道指标引用为无呕吐物＝0、少量呕吐物＝1、大量呕吐物＝2、固态呕吐物＝1、液态呕吐物＝2、具有血液和胆汁的液态呕吐物＝3，延迟的呕吐＝1和立即呕吐＝2。
讨论在该实施例中，发现硫氧还蛋白可特异性还原BLG(一种主要牛奶变应原)中的分子内二硫键。根据情况而定，NADPH和NTR还原的硫氧还蛋白，不论用纯的蛋白或牛奶分析，还原了BLG的一个或两个二硫键。在结构模型的分子水平上可见通过皮肤试验和喂食攻击实验性揭示了表位分布的改变(Peitsch，M.C.(1996)见上)。当用计算机模型通过定点诱变打断BLG(Cys66-Cys160)的暴露二硫键时，125Thr-135Lys表位(Kaminogawa，S.等(1989)，“作为监测牛β-乳球蛋白变性过程的探针的单克隆抗体”，Biochemica et Biophisica Acta 99850-56)不改变，它的位置附近发生改变，而该表位距两个二硫键(8Lys-19Trp)有一定距离(见
图13和14)。诱变埋藏的二硫键(Cys106-Cys119或可能是Cys106-Cys121)不会导致进一步改变该表位的位置。用人BLG表位制备的模型进行了类似观察(Ball，G.等(1994)“人IgE结合识别的牛β-乳球蛋白的主要连续性变应原性表位”，Clinicaland Experimental Allergy 24758-764)。本结果提示，硫氧还蛋白的还原以两种方法降低了靶蛋白变应原的变应原性。还原导致蛋白质结构改变，限制了表位的可接近性并提高了可消化性。用这种方法，降低了变应原的强度，另外还能更迅速的在胃肠道中被消除。
实施例40胃蛋白酶和胰蛋白酶对还原的麦胶蛋白的消化调查了如实施例9和10所述的小麦面粉乙醇抽提物中麦胶蛋白组分的蛋白酶敏感性。如前面实施例10中所示，麦胶蛋白含有可被硫氧还蛋白特异性还原的分子内二硫键。麦胶蛋白也是小麦中的主要食物变应原。Buchanan，B.B.等，(1997)，“对小麦变态反应的硫氧还蛋白相关的改变”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA945372-5377。硫氧还蛋白本身可被NADPH和NADP-硫氧还蛋白还原酶酶促还原，或被二硫苏糖醇(DTT)化学还原。对于该例子，将分离的麦胶蛋白(1.04mg/ml)的等份(50微升)与或不与硫氧还蛋白(1.0微克)一起培育，在存在或不存在1mM DTT下，pH7.5的Tris-HCl缓冲液中还原1小时。在培育结束时，在各样品中加入5微升Sigma的胰蛋白酶(1毫克/毫升)，使样品30℃再消化1小时。用PMSF(苯甲基磺酰氟(2微升，100mM))终止各样品的消化。与SDS(10微升10％)和甘油(15微升50％)混合后，用SDS-PAGE分析样品。电泳后，用考马斯蓝染色15％凝胶，并用甲醇和乙酸脱色。蛋白质条带的分析证明，麦胶蛋白在氧化(未处理)状态下对消化是稳定的，但在硫氧还蛋白还原后则被降解成低分子量组分。当处理麦胶蛋白等份，并用胃蛋白酶代替实施例39中的胰蛋白酶消化时，获得相似结果。
该实施例和实施例34和39显示，硫氧还蛋白还原变应原的结果是对蛋白酶敏感性的惊人提高。因此，虽然麦胶蛋白和BLG的氧化形式对于胃蛋白酶有抗性，其还原形式则是高度敏感并可被轻易消化。小麦面粉中天然硫氧还蛋白的平均浓度是约0.01％(Johnson，T.C.等(1987)，“小麦种子硫氧还蛋白系统对嘌呤硫堇素的还原和在氧化还原控制中作为第二硫醇信使的可能功能”，Plant Physiol.85446-451)。这是每公斤面粉或面包100毫克-200毫克，每100克面粉约2毫克硫氧还蛋白。然而，面粉中天然存在的硫氧还蛋白上限可能是每克食物蛋白约2毫克。例如，含有更高浓度的已用硫氧还蛋白还原剂处理的硫氧还蛋白的面包将是变应原性较低，而且更易消化的面包。用硫氧还蛋白和硫氧还蛋白还原剂处理的食物蛋白对胃蛋白酶敏感性提高(也通过BLG建模在分子水平上观察到)，可能导致摄入的BLG在胃肠道中更迅速的被加工。如果延伸到全体动物，预计用硫氧还蛋白系统处理牛奶、小麦和其它食物产品，将减弱变应原性和不可消化性的长期作用—显著的水肿和腹泻。
可通过在巴氏消毒法(即55℃45分钟，或4℃至少10小时)之前或之后用NTS处理牛奶，实现与牛奶有关的硫氧还蛋白技术的商业化。这些应用可包括以下1.将液体形式的硫氧还蛋白系统加到未加工的牛奶或乳清中，并将还原与巴氏消毒法相联合。
2.使未加工的或巴氏消毒牛奶通过结合有还原的硫氧还蛋白的柱。可在加牛奶前用NADPH和NTR还原硫氧还蛋白。也可能采用二硫苏糖醇还原硫氧还蛋白，二硫苏糖醇在加牛奶前可通过洗涤柱而除去。
3.在非氧化条件下储藏NTS处理的牛奶，通过使用例如完全或真空容器来提高其有效期。
4.巴氏消毒后在牛奶中加入硫氧还蛋白和NTR，并在使用前加入固体形式的NADPH。
5.用硫氧还蛋白处理后，用酶(如胰蛋白酶)对牛奶进行有限的蛋白酶水解消化。该产品可用于在对牛奶敏感的人中诱导耐受。
实施例41测定硫氧还蛋白处理的豚草花粉蛋白降低的变应原性和提高的可消化性硫氧还蛋白系统还原花粉蛋白用Bradford试验，采用牛γ-球蛋白作为标准品分析了购自Bayer Inc.的大豚草变应原抽提物(Wong，J.H.等(1995)“硫氧还蛋白和种子蛋白”，MethordsEnzymol 252228-240)。用1.25mM NADPH、1.7微克大肠杆菌NADP/硫氧还蛋白还原酶(NTR)和1.7微克大肠杆菌硫氧还蛋白(Trx)37℃在30mM生理缓冲盐水(PBS，10mM Na2HPO4、1.8mM KH2PO4、2.7mM KCl和137mM NaCl，pH7.4)中(最终体积为100微升)培育45分钟，还原了该蛋白质100微克。用如上所述和Wong等(ibid.)所述的SDS-PAGE/一溴二满法确定了还原程度。在紫外光下观察凝胶。
皮肤试验。用变应性剂量皮肤试验来测量I型超敏反应的方法基本上与前述的(见实施例36、37和39)方法相同。简单说，在皮肤测试5分钟前静脉注射0.5％Evans蓝染料(0.2毫升/公斤)。以半对数稀释度在侧腹皮肤上透皮注射0.1毫升等份的花粉变应原抽提液。让同一有经验的不知情观察者对每个蓝色斑点的垂直直径评分，盲法对皮肤测试读数。对于各测试的动物包括合适的阴性对照(用PBS稀释)。
人工胃液对花粉蛋白的消化。使花粉蛋白650微克或纯Amb t V100微克在100微升PBS缓冲液中，在37℃与或不与2.4微克Trx、4.2微克NTR和2.5mM NADPH的混合物一起培育。然后，在100微升如Astwood等所述的(Astwood，J.D.等(1996)“食物变应原对体外消化的稳定性”，Nature Biotechnology 141269-1273)人工胃液(SGF)中消化含有325微克花粉蛋白或50微克Amb t V的50微升各反应混合物。SGF含有0.32％猪胃蛋白酶(w/v)和30mM NaCl，用HCl调节到pH1.2。37℃培育该消化混合物，在0、0.25、1、2、4、8、15或60分钟用0.375体积的160mMNa2CO3停止，得到中性的pH。用SDS-PAGE。并用指定的皮肤试验分析蛋白质。
Amb t V纯化。通过改进Roebber等1985的方法(Roebber，M.等(1985)“Amb.t.V(Ra5G)，一种大豚草花粉Ra5同源物的免疫化学和遗传学研究”，J.Immunol.1343062-9)实现了纯化。简单说，将100克未脱脂花粉(GreerLaboratories)悬浮在1升缓冲液[50mM Tris-HCl pH7.4，含1μM苯甲基磺酰氟(PMSF)和1mM EDTA-Na]中，室温温和搅拌30分钟。然后将该混合物4C 3,840xg离心15分钟。将收集的上清液组分滤过玻璃棉，然后滤过Whatman定量滤纸两次。不再使用含有花粉颗粒的沉淀。通过用等体积的石油醚抽提，并11,300xg离心10分钟除去过滤的上清液组分中大量的脂肪。石油醚步骤重复4次。通过Amicon YM-3膜浓缩得到的澄清溶液，并在Sephadex G-50F凝胶过滤柱(2.1×90cm)上分离，该柱用20mM Tris-HCl pH7.5(补充了200mM NaCl)平衡并洗脱。用15％SDS-PAGE分析含有5kDa蛋白质的组分，合并这些组分并用YM-3膜浓缩。在浓缩蛋白中加入硫酸铵，使最终浓度为2.6M。然后将该蛋白混合物在1毫升HiTrap苯基琼脂糖柱(Pharmacia)上级分，用200mM pH7.0的磷酸缓冲液平衡，并用50毫升含递减梯度2.5-0M的硫酸铵的相同缓冲液洗脱。在大约0.8M的单峰中回收到纯Amb t V。最后，以5mM磷酸钾缓冲液pH7.0透析该纯蛋白质，并储藏在-70℃进一步实验。用摩尔消光系数5800定量蛋白质浓度。
数据分析。用配对的单尾t-检验测定了显示与硫氧还蛋白相关的花粉变应原缓解的皮肤试验结果的统计学显著性。针对另一个假设，即处理导致变态反应减弱，测试了零假设，其假定未处理的花粉蛋白引起的丘疹面积与硫氧还蛋白处理的引起的无差异。完成了各稀释系列(0.07-219纳克变应原)的t检验，所有敏感犬(df≈8)均在0.05显著水平。
结果和讨论花粉蛋白的还原。如
图15所示，硫氧还蛋白活跃的还原了几种蛋白质，即5kDa的Amb t V，和12、14和35kDa的未鉴定蛋白质。另外还原程度随反应温度而变化。如
图15所示，还原在37℃或更高温度最有效。就Amb t V而言，结果表明多个二硫键(可能全部4个)在37℃和55℃被还原，而在4℃还原的数目较少。平行的，还观察到硫氧还蛋白的还原惊人的影响到所述的Amb t V的高热稳定性(Baer，H.等(1980)，“矮豚草花粉抽提物的热稳定性和皮肤反应中各变应原的重要性”，J.Allergy Clin.Immunol.66281-5)。在硫氧还蛋白还原后发现蛋白质沉淀(数据未显示)。
硫氧还蛋白还原对变应原性的减弱。如下面的表XIX所示，硫氧还蛋白还原有效减弱了皮试反应。虽然比用牛奶发现的不明显(见实施例39)，花粉粗抽提物的变应原性与硫氧还蛋白相关的下降范围在3-33倍之间。另外，根据t检验分析，这种减弱是统计学显著的。
表XIX对硫氧还蛋白减弱对花粉变应原的皮肤试验反应的统计学评估。配对一尾t检验意味着P值等于或小于0.05。
硫氧还蛋白还原对花粉蛋白对胃蛋白酶敏感性的作用。为了测定硫氧还蛋白的还原是否提高了花粉变应原的可消化性，用SGF(Astwood，J.D.等(1996)“食物变应原对体外消化的稳定性”，Nature Biotechnology 141269-1273，12)处理纯化的Amb t V蛋白的氧化和还原形式。首先，发现与β-乳球蛋白一样，Amb t V仅在被硫氧还蛋白系统还原时才被消化。氧化的该蛋白能抵抗胃蛋白酶达60分钟，与其在
图16A中显示的变应原性质一致(Astwood，J.D.(1996)，见上)。相反，如
图16B所示，硫氧还蛋白还原的蛋白质在2分钟后几乎完全消失。通过用8只狗，用粗花粉抽提物获得的皮肤试验数据验证了对胃蛋白酶的这种敏感性。观察到氧化的花粉抽提物引起的皮试反应在这些狗的4只中消化后仍保留(代表的是称为6CGB1的狗，见实施例39“特异质犬的食物致敏”)，表明如
图17A中所示，这些变应原是胃蛋白酶抗性的。相反，当制备物被硫氧还蛋白还原时，在这些犬中变态反应显著下降。这肯定了变应原是二硫键蛋白，并与蛋白质被消化的凝胶资料相一致。另4只狗(代表的是
图17B中称为5CBB3的狗)显示当氧化(未处理)的蛋白质被SGF消化时，反应显著下降-即从一开始活性最高的变应原就被消化。该发现表明第二组对二硫蛋白较不敏感。
图18中的数据提供了证据，即未处理的和硫氧还蛋白处理的制备物的这种不同反应在于具体动物对二硫键蛋白变应原的敏感性。如
图17A和17B中纯Amb tV所见，粗制备物中二硫蛋白(包括Amb t V)对胃蛋白酶具有强烈抗性，除非被NADP-硫氧还蛋白系统还原(
图18A和18B)。另外，还原温度是重要的；随着还原温度从4℃上升到37℃，到55℃，消化逐渐增加。没有还原时，5-20kDa范围内的蛋白质在与SGF温育60分钟后也不被消化。
上述结果与牛奶中主要变应原β-乳球蛋白是二硫蛋白(del Val，G.等(1999)，“硫氧还蛋白处理提高了牛奶的可消化性并降低了变应原性”，J.of Allergy Clin.Immunol.出版中)的结论相反，与豚草花粉含有复杂的变应原混合物，含有或不含二硫键的蛋白的结论一致。
这些结果显示NADP/硫氧还蛋白系统减弱了对花粉的变态反应。还显示可通过比较氧化的和硫氧还蛋白还原的样品的胃蛋白酶敏感性来评估活性二硫蛋白对变应原的复杂混合物的重要性。二硫键蛋白对变态反应越重要，硫氧还蛋白对减弱该反应就越有效。
实施例42硫氧还蛋白处理的豚草花粉变应原在免疫治疗中的用途吸入特定量的豚草花粉蛋白Amb t V的气溶胶后，显示打喷嚏和咳嗽(支气管痉挛)的动物是该研究的对象。气溶胶中的Amb t V蛋白未用任何还原剂处理过。皮下注射递增量的含有67微克/cc的Amb t V(已经纯化，并实施例41中所述与硫氧还蛋白、NADPH和NTR一起培育)的临床溶液。这些皮下注射是为了确定对处理过的Amb t V发生局部变态反应的最接近剂量或终点。观察到在用10纳克(ng)的0.15cc溶液时注射位点发生约5毫米的丘疹。确定10纳克为终点，接着在3日后用比该终点小一个log的Amb t V量(在此是1纳克)皮下注射动物。该剂量对应于下表列出的注射时间表的第一剂量。
表XX稀释液IV(蓝) 1∶10,000 稀释液II(黄) 1∶100第一剂量-0.15cc 第11剂量-0.15cc第2剂量-0.30cc 第12剂量-0.25cc第3剂量-0.60cc 第13剂量-0.35cc第4剂量-1.00cc 第14剂量-0.50cc第15剂量-0.75cc稀释液III(绿) 1∶1,000 第16剂量-1.00cc第5剂量-0.15cc第6剂量-0.25cc 稀释液I(红)浓度1∶10第7剂量-0.35cc 第17剂量-0.10cc+0.10cc盐水第8剂量-0.50cc 第18剂量-0.15cc+0.15cc盐水第9剂量-0.75cc 第19剂量-0.20cc+0.20cc盐水第10剂量-1.00cc 第20剂量-0.25cc+0.25cc盐水第21剂量-0.30cc+0.30cc盐水因此，第一剂注射了0.15cc1∶10,000稀释的Amb t V67微克/cc溶液。观察对象的局部反应。由于注射第一剂后未观察到反应，给动物第二次注射0.30cc1∶10,000稀释液或2纳克。3日后，皮下施用第3剂0.60cc的1∶10,000稀释液。然后按照注射时间表，每3日注射1次，直到动物达到最大剂量耐受。大的局部皮肤反应，即大于一个硬币的丘疹和/或全身性症状如荨麻疹(风团)、打喷嚏、呕吐或血压下降表明该最大剂量。该动物的最大剂量是第21剂量，但是对于另一只动物可以是第11剂量、第15剂量、或第18剂量等。观察到最大剂量后，降低1或2剂量，将该降低的剂量作为新的最大剂量。随后每3周到4周用新的最大剂量皮下注射动物。每隔3-4周接受新的最大剂量约6个月后，动物吸入原先导致打喷嚏的相同量的Amb t V气溶胶。作为该吸入的结果，观察不到或观察到有限的打喷嚏或咳嗽。动物继续规律性间隔接受新的最大剂量，并在再次吸入未还原的Amb t V时仍然没有或基本没有打喷嚏和任何其它变态反应。
实施例43
硫氧还蛋白处理的花粉蛋白与未处理的花粉蛋白免疫治疗有效性的比较在吸入特定量的未还原变应原Amb t V后，显示打喷嚏和其它变态反应的一组同品种的10只动物，是本研究的主题。为了确定变应原性终点，将动物分成两组，每组5只。测试动物抗体水平，然后用递增量的未还原Amb t V注射组A，用递增量的与硫氧还蛋白、NADPH和NTR保温的Amb t V如实施例42中所述注射组B。基于全部10只动物体重的mg/kg剂量是相同的，即使给予每只动物的绝对剂量可能不同。确定了组中每只动物的终点剂量。组A基于mg/kg体重的平均终点剂量低于组B的。然后按照实施例42中列出的方法和注射时间表注射动物。测定了各组中每只动物最大剂量。组B动物的最大剂量比组A动物的最大剂量一致更高，而且观察到的局部或全身性症状较少。然后如实施例42中所述的方法，为动物指定新的最大剂量，然后如实施例42，每隔3-4周用该新的最大剂量注射。这样注射约6周后，组A动物显示在吸入特定量的非还原变应原时，在某种程度上变态反应下降，而组B的动物显示非常有限的变态反应或不明显。另外，组B的动物能对高得多剂量的变应原剂量耐受，在某些情况下达10-100倍。在处理过的动物中测定抗体水平的试验显示，免疫治疗后，组B动物的IgG抗体滴度更高，而IgE滴度随时间下降。免疫治疗后组A的IgG抗体滴度有点高，但比组B动物的IgG滴度平均低得多。
这些结果显示·豚草花粉的硫氧还蛋白还原减弱了变态反应。
·硫氧还蛋白还原显著提高了二硫花粉变应原的可消化性。
·硫氧还蛋白(和可能的其它二硫还原剂，如硫辛酸)可用于降低花粉提取物的变应原性并通过增强IgG产生而不是IgE抗体产生用于免疫治疗花粉过敏病人，并改进治疗的安全性。
本发明的实施例可包括用眼药水或鼻喷雾治疗花粉过敏，包括-硫辛酸，-NADP/硫氧还蛋白系统-硫辛酸和NADP/硫氧还蛋白系统本发明通过用NADP/硫氧还蛋白或硫辛酸如上所述预处理二硫蛋白可用于治疗和预防许多类型的由于二硫蛋白引起的过敏(如食物、花粉、尘螨)。
结论性评述从上面本发明的一般描述和说明用途的具体实施例中可见，本发明具有多种和广泛的重要性。本发明基本上提供了新的生面团和面团混合物，以及产生新面团和改进面团和烘烤食品质量的新方法，以及灭活谷物产品中酶抑制蛋白的新方法。本发明还提供了改变动物毒素的生物活性和灭活，消除或降低几种变应原，即花粉和食品(小麦、鸡蛋、牛奶、乳清、大豆、坚果和牛肉)的变应原性的新方法。本发明还提供了一种提高花粉和食物变应原，尤其是牛奶、乳清及其产物和小麦产品的蛋白酶水解和可消化性的方法。另外，本发明提供了一种新的蛋白，它是一种支链淀粉酶抑制蛋白，和一种其灭活的方法。
虽然已结合某些具体实施例描述了本发明，应认识到对于本发明涉及的领域的技术人员来说，可以明白可作各种修改，但这些修改也在权利要求书所限定的本发明的范围内。
权利要求
1.一种低变应原性的花粉蛋白，其特征在于，该花粉蛋白已用硫氧还蛋白、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸-硫氧还蛋白还原酶和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸处理过。
2.如权利要求1所述的低变应原性蛋白质，其特征在于，该蛋白质是Amb t V。
3.如权利要求1所述的蛋白质，其特征在于，每1克纯蛋白质中硫氧还蛋白的量是0.01-24毫克，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸-硫氧还蛋白还原酶是约0.01-48毫克，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸约1.0微摩尔-2,500微摩尔。
4.一种还原的花粉蛋白抽提物，其特征在于，所述抽提物已用硫氧还蛋白、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸-硫氧还蛋白还原酶和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸处理过。
5.如权利要求4所述的花粉蛋白抽提物，其特征在于，所述抽提物是一种大豚草花粉蛋白抽提物。
6.如权利要求4所述的还原的花粉蛋白抽提物，其特征在于，每1克花粉蛋白中硫氧还蛋白量是约0.01-6.0毫克，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸-硫氧还蛋白还原酶是约0.01-8.0毫克，还原的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸是约1.0-500微摩尔。
7.一种可吸收的花粉蛋白质，其特征在于，所述花粉蛋白已用硫氧还蛋白、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸-硫氧还蛋白还原酶和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸处理过。
8.如权利要求7所述的可吸收的花粉蛋白质，其特征在于，所述蛋白质是Ambt V。
9.一种可吸收的花粉抽提物，其特征在于，所述抽提物已用硫氧还蛋白、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸-硫氧还蛋白还原酶和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸处理过。
10.一种低变应原性蛋白质，其特征在于，该蛋白质是一种已用硫氧还蛋白、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸-硫氧还蛋白还原酶和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸处理过的蛋白质。
11.还原的花粉蛋白在免疫治疗中降低或消除动物的变态反应的用途，所述动物对未还原状态的所述花粉蛋白过敏，其特征在于，所述还原的花粉蛋白质已被有效量的硫氧还蛋白、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸-硫氧还蛋白还原酶和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸所还原。
12.一种提高花粉蛋白质可消化性的方法，其特征在于，该方法包括(a)用一定量的、能有效提高所述蛋白质可消化性的硫氧还蛋白、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸-硫氧还蛋白还原酶和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸处理所述花粉蛋白；和(b)将步骤(a)中处理过的蛋白质施给动物，从而提高所述蛋白质的消化性，所述的可消化性是通过所述动物与对照比较所显示的症状后测得的。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，每1克蛋白中硫氧还蛋白的量是约0.01-6.0毫克，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸-硫氧还蛋白还原酶是约0.01-8.0毫克，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸是约1.0-500微摩尔。
14.如权利要求12所述的方法，其特征在于，每克蛋白中硫氧还蛋白的量是约0.1-4.0毫克，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸-硫氧还蛋白还原酶是约0.1-7.0毫克，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸是约25-500微摩尔。
15.如权利要求12所述的方法，其特征在于，每克蛋白中硫氧还蛋白的量至少是约0.01毫克，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸-硫氧还蛋白还原酶至少是约0.01毫克，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸至少是约1.0微摩尔。
16.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述蛋白是花粉蛋白。
17.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述花粉蛋白是Amb t V。
18.一种减少动物对特定量的具有二硫键的特定变应原性蛋白的变应原性的方法，其特征在于，该方法包括(a)通过用硫氧还蛋白、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸-硫氧还蛋白还原酶和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸处理所述蛋白，还原所述特定蛋白的二硫键；和(b)对所述过敏动物在一段时间内以一定间隔施用步骤(a)的蛋白质的递增的免疫治疗剂量，所述蛋白质的所述给药可有效降低或消除所述动物对所述特定量的所述特定变应原蛋白质的所述变态反应。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，每克蛋白质中硫氧还蛋白的量是0.01-6.0毫克，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸-硫氧还蛋白还原酶是约0.01-8.0毫克，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸是约1.0-500微摩尔。
20.如权利要求18所述的方法，其特征在于，每克蛋白质中硫氧还蛋白的量是0.1-4.0毫克，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸-硫氧还蛋白还原酶是约0.1-7.0毫克，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸是约25-500微摩尔。
21.如权利要求18所述的方法，其特征在于，每克蛋白质中硫氧还蛋白的量至少是0.01毫克，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸-硫氧还蛋白还原酶至少是约0.01毫克，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸至少是约1.0微摩尔。
22.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述蛋白质是花粉蛋白。
23.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述蛋白质是Amb t V。
24.一种测定特定变应原蛋白中存在的二硫键的方法，其特征在于，该方法包括(a)将所述变应原蛋白质与一定量的能有效还原蛋白质二硫键的硫氧还蛋白、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸-硫氧还蛋白还原酶一起培育，和(b)分析步骤(a)中所述培育的蛋白质的二硫键还原。
25.一种减少含有二硫键的花粉蛋白变应原性的方法，其特征在于，该方法包括(a)将所述花粉蛋白和一定量的硫氧还蛋白、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸-硫氧还蛋白还原酶一起培育，来还原所述蛋白的二硫键，和(b)给予动物步骤(a)中培育的蛋白质，从而降低了所述蛋白质的变应原性，所述变应原性是通过所述动物与对照比较所显示的过敏症状后测得的。
全文摘要
硫氧还蛋白(一种小型二巯基蛋白)是变应原蛋白,特别是存在于花粉和动物和植物来源的变应原性蛋白质的一种特异性还原剂。其所有靶向的蛋白质含有二硫(S－S)键,它被硫氧还蛋白还原到巯基(SH)水平。其靶向的蛋白质具有变应原活性,而且在氧化(S－S)状态较不易被消化,当被还原(SH态)时,它们丧失其变应原性,和/或变得更可消化。当被NADPH通过NADP－硫氧还蛋白还原酶(生理条件)或通过硫辛酸化学还原剂激活(还原)时,硫氧还蛋白实现这种还原作用。过敏的狗进行的皮肤试验显示,在注射前用还原的硫氧还蛋白处理花粉消除了或降低了花粉的变应原性。研究显示被硫氧还蛋白还原后,花粉蛋白的消化提高。已被硫氧还蛋白还原的花粉蛋白是有效和安全的免疫治疗剂,可用于降低或消除动物在接触非还原花粉蛋白质时会发生的过敏反应。
文档编号A23J3/18GK1350547SQ00804968
公开日2002年5月22日 申请日期2000年1月25日 优先权日1999年1月27日
发明者B·B·布坎南, G·德瓦尔, R·M·洛萨诺, J·H·翁, B·C·伊, O·L·弗里克 申请人:加利福尼亚大学董事会