专利名称：HMG－CoA还原酶抑制剂的制备方法
技术领域：
本发明涉及具有抑制羟甲基戊二酸单酰CoA(HMG-CoA)还原酶、降低血清胆固醇作用的化合物的制备方法。
而且，上述放线菌和丝状菌都具有形成孢子的能力。由于孢子比菌体容易飞散得多，而且具有在营养细胞易于死亡的条件下也能够生存的能力，所以容易成为培养、精制步骤中的微生物污染源。
本发明人考虑到如果可以通过具有氢氧化活性，而且不具有孢子形成能力及不繁殖成菌丝状的微生物进行化合物(V-a)或(V-b)的氢氧化，则可以避免由于孢子飞散引起的制造工艺中的微生物污染和菌丝形成引起培养液不均匀造成的反应效率低下等不良情况，有利于工业生产，并进行了悉心的研究，从而完成了本发明。
也就是说，本发明涉及下述(1)～(9)。
以下，只要没有特别说明，通式中的R1表示氢原子、取代或未取代的烷基或碱金属，R2表示取代或未取代的烷基或者取代或未取代的芳基。
(1)化合物(II-a)或化合物(II-b)的制备方法，其特征在于，使用具有由通式(I-a)表示的化合物〔以下称为化合物(I-a)〕或者通式(I-b)表示的化合物(I-a)的内酯体〔以下称为化合物(I-b)〕生成通式(II-a)表示的化合物〔以下称为化合物(II-a)〕或者通式(II-b)表示的化合物(II-a)的内酯体〔以下称为化合物(II-b)〕的活性，而且不具有孢子形成能力及不繁殖成菌丝状的微生物、该微生物的培养物或该培养物的处理物作为酶源，使化合物(I-a)或化合物(I-b)存在于水性介质中，在该水性介质中生成、蓄积化合物(II-a)或化合物(II-b)，并由该水性介质提取化合物(II-a)或化合物(II-b)。
(2)根据上述(1)的制备方法，其中化合物(I-a)为通式(III-a)表示的化合物〔以下称为化合物(III-a)〕，化合物(I-b)为通式(III-b)表示的化合物〔以下称为化合物(III-b)〕，化合物(II-a)为通式(IV-a)表示的化合物〔以下称为化合物(IV-a)〕，化合物(II-b)为通式(IV-b)表示的化合物〔以下称为化合物(IV-b)〕。
(3)根据上述(1)的制备方法，其中化合物(I-a)为通式(V-a)表示的化合物〔以下称为化合物(V-a)〕，化合物(I-b)为通式(V-b)表示的化合物〔以下称为化合物(V-b)〕，化合物(II-a)为通式(VI-a)表示的化合物〔以下称为化合物(VI-a)〕，化合物(II-b)为通式(VI-b)表示的化合物〔以下称为化合物(VI-b)〕。 (4)根据上述(1)的制备方法，其中化合物(I-a)为通式(VII-a)表示的化合物〔以下称为化合物(VII-a)〕，化合物(I-b)为通式(VII-b)表示的化合物〔以下称为化合物(VII-b)〕，化合物(II-a)为通式(VIII-a)表示的化合物〔以下称为化合物(VIII-a)〕，化合物(II-b)为通式(VIII-b)表示的化合物〔以下称为化合物(VIII-b)〕。 (5)根据上述(1)的制备方法，其中微生物培养物的处理物是从培养菌体、该菌体的干燥物、该菌体的冷冻干燥物、该菌体的表面活性剂处理物、该菌体的酶处理物、该菌体的超声波处理物、该菌体的机械粉碎物、该菌体的溶剂处理物等菌体处理物，菌体的蛋白分离物，菌体和菌体处理物的固化物中选择的处理物。
(6)根据上述(1)的制备方法，其中微生物是选自分枝杆菌属(Mycobacterium)、棒杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、红球菌属(Rhodococcus)、戈登氏菌属(Gordona)、节杆菌属(Arthrobacter)、微球菌属(micrococcus)、纤维单胞菌属(Cellulomonas)和鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)的微生物。
(7)根据上述(1)的制备方法，其中微生物是选自草分枝杆菌(Mycobacterium phlei)、耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis)、抗热分枝杆菌(Mycobacterium thermoresistibile)、新金色分枝杆菌(Mycobacterium neoaurum)、副偶然分枝杆菌(Mycobacterium parafortuitum)、浅黄色分枝杆菌(Mycobacteriumgilvum)、圆红球菌(Rhodococcus globerulus)、马红球菌(Rhodococcus equi)、红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)、紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)、椿象红球菌(Rhodococcusrhodnii)、赤红球菌(Rhodococcus ruber)、嗜粪红球菌(Rhodococcuscoprophilus)、藤黄红球菌(Rhodococcus fascians)、沟戈登氏菌(Gordona amarae)、暗红戈登氏菌(Gordona rubropertinctus)、支气管戈登氏菌(Gordona bronchialis)、痰戈登氏菌(Gordonasputi)、爱知戈登氏菌(Gordona aichiensis)、土生戈登氏菌(Gordona terrae)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、类真菌棒杆菌(Corynebacterium mycetoides)、变异棒杆菌(Corynebacterium variabilis)、产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、成晶节杆菌(Arthrobactercrystallopoietes)、肠肿节杆菌(Arthrobacter duodecadis)、分枝节杆菌(Arthrobacter ramosus)、硫磺节杆菌(Arthrobactersulfureus)、金黄节杆菌(Arthrobacter aurescens)、柠檬节杆菌(Arthrobacter citreus)、球形节杆菌(Arthrobacterglobiformis)、乙酰短杆菌(Brevibacterium acetylicum)、扩展短杆菌(Brevibacterium linens)、未定短杆菌(Brevibacteriumincertum)、碘短杆菌(Brevibacterium iodinum)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、玫瑰色微球菌(Micrococcus roseus)、纤维化纤维单胞菌(Cellulomonas cellulans)、强壮纤维单胞菌(Cellulomonas cartae)、少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonaspaucimobilis)、粘连鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas adhaesiva)和土生鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas terrae)的微生物。
(8)根据上述(1)的制备方法，其中微生物是选自草分枝杆菌(Mycobacterium phlei)JCM5865、耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis)JCM5866、抗热分枝杆菌(Mycobacteriumthermoresistibile)JCM6362、新金色分枝杆菌(Mycobacteriumneoaurum)JCM6365、副偶然分枝杆菌(Mycobacteriumparafortuitum)JCM6367、浅黄色分枝杆菌(Mycobacterium gilvum)JCM6395、圆红球菌(Rhodococcus globerulus)ATCC25714、马红球菌(Rhodococcus equi)ATCC21387、马红球菌(Rhodococcus equi)ATCC7005、红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)ATCC4277、紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)ATCC2 1430、紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)ATCC13808、椿象红球菌(Rhodococcusrhodnii)ATCC35071、赤红球菌(Rhodococcus ruber)JCM3205、嗜粪红球菌(Rhodococcus coprophilus)ATCC29080、藤黄红球菌(Rhodococcus fascians)ATCC12974、藤黄红球菌(Rhodococcusfascians)ATCC35014、沟戈登氏菌(Gordona amarae)ATCC27808、暗红戈登氏菌(Gordona rubropertinctus)IFM-33、暗红戈登氏菌(Gordona rubropertinctus)ATCC14352、支气管戈登氏菌(Gordonabronchialis)ATCC25592、痰戈登氏菌(Gordona sputi)ATCC29627、爱知戈登氏菌(Gordona aichiensis)ATCC33611、土生戈登氏菌(Gordona terrae)ATCC25594、谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)ATCC13032、谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)ATCC14020、谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)ATCC19240、类真菌棒杆菌(Corynebacteriummycetoides)ATCC21134、变异棒杆菌(Corynebacteriumvariabilis)ATCC15753、产氨棒杆菌(Corynebacteriumammoniagenes)ATCC6872、成晶节杆菌(Arthrobactercrystallopoietes)ATCC15481、肠肿节杆菌(Arthrobacterduodecadis)ATCC13347、分枝节杆菌(Arthrobacter ramosus)ATCC13727、硫磺节杆菌(Arthrobacter sulfureus)ATCC19098、金黄节杆菌(Arthrobacter aurescens)ATCC13344、柠檬节杆菌(Arthrobacter citreus)ATCC11624、球形节杆菌(Arthrobacterglobiformis)ATCC8010、乙酰短杆菌(Brevibacteriumacetylicum)ATCC953、扩展短杆菌(Brevibacterium linens)ATCC19391、扩展短杆菌(Brevibacterium linens)ATCC9172、未定短杆菌(Brevibacterium incertum)ATCC8363、碘短杆菌(Brevibacterium iodinum)IF03558、藤黄微球菌(Micrococcusluteus)ATCC4698、玫瑰色微球菌(Micrococcus roseus)ATCC186、纤维化纤维单胞菌(Cellulomonas cellulans)ATCC15921、强壮纤维单胞菌(Cellulomonas cartae)ATCC21681、少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)ATCC29837、粘连鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas adhaesiva)JCM7370和土生鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas terrae)ATCC15098的微生物。
(9)根据上述(1)的制备方法，其中微生物是戈登氏菌属(Gordona sp.)ATCC19067。以下详细说明本发明。
本发明中使用的酶源例如具有由上述化合物(I-a)或上述化合物(I-b)生成上述化合物(II-a)或上述化合物(II-b)的活性，而且不具有孢子形成能力及不繁殖成菌丝状的微生物、该微生物的培养物、该培养物的处理物。
烷基是直链或支链状的碳原子数为1～10，优选1～6的烷基，如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、新戊基、己基、异己基、庚基、4，4-二甲基戊基、辛基、2，2，4-三甲基戊基、壬基、癸基、它们的各种支链异构体等。
芳基如苯基、萘基等。
取代烷基中的取代基如相同或不同的1～3个卤素、羟基、氨基、烷氧基、芳基等。
取代芳基中的取代基如相同或不同的1～3个卤素、羟基、氨基、烷基、烷氧基等。
烷氧基中的烷基部分与上述烷基定义相同。
碱金属表示锂、钠、钾、铷、铯、钫各元素。
上述微生物例如选自分枝杆菌属(Mycobacterium)、棒杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、红球菌属(Rhodococcus)、戈登氏菌属(Gordona)、节杆菌属(Arthrobacter)、微球菌属(Micrococcus)、纤维单胞菌属(Cellulomonas)和鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)的微生物。
具体例如选自草分枝杆菌(Mycobacterium phlei)、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)、抗热分枝杆菌(Mycobacteriumthermoresistibile)、新金色分枝杆菌(Mycobacterium neoaurum)、副偶然分枝杆菌(Mycobacterium parafortuitum)、浅黄色分枝杆菌(Mycobacterium gilyum)、圆红球菌(Rhodococcus globerulus)、马红球菌(Rhodococcus equi)、红串红球菌(Rhodococcuserythropolis)、紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)、椿象红球菌(Rhodococcus rhodnii)、赤红球菌(Rhodococcus ruber)、嗜粪红球菌(Rhodococcus coprophilus)、藤黄红球菌(Rhodococcusfascians)、沟戈登氏菌(Gordona amarae)、暗红戈登氏菌(Gordonarubropertinctus)、支气管戈登氏菌(Gordona bronchialis)、痰戈登氏菌(Gordona sputi)、爱知戈登氏菌(Gordonaaichiensis)、土生戈登氏菌(Gordona terrae)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、类真菌棒杆菌(Corynebacteriummycetoides)、变异棒杆菌(Corynebacterium variabilis)、产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、成晶节杆菌(Arthrobacter crystallopoietes)、肠肿节杆菌(Arthrobacterduodecadis)、分枝节杆菌(Arthrobacter ramosus)、硫磺节杆菌(Arthrobacter sulfureus)、金黄节杆菌(Arthrobacteraurescens)、柠檬节杆菌(Arthrobacter citreus)、球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)、乙酰短杆菌(Brevibacteriumacetylicum)、扩展短杆菌(Brevibacterium linens)、未定短杆菌(Brevibacterium incertum)、碘短杆菌(Brevibacteriumiodinum)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、玫瑰色微球菌(Micrococcus roseus)、纤维化纤维单胞菌(Cellulomonascellulans)、强壮纤维单胞菌(Cellulomonas cartae)、少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)、粘连鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas adhaesiva)和土生鞘氨醇单胞菌(Sphingomonasterrae)的微生物。
更具体地说，例如草分枝杆菌(Mycobacterium phlei)JCM5865、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)JCM5866、抗热分枝杆菌(Mycobacterium thermoresistibile)JCM6362、新金色分枝杆菌(Mycobacterium neoaurum)JCM6365、副偶然分枝杆菌(Mycobacterium parafortuitum)JCM6367、浅黄色分枝杆菌(Mycobacterium gilvum)JCM6395、圆红球菌(Rhodococcusgloberulus)ATCC25714、马红球菌(Rhodococcus equi)ATCC21387、马红球菌(Rhodococcus equi)ATCC7005、红串红球菌(Rhodococcuserythropolis)ATCC4277、紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)ATCC21430、紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)ATCCl3808、椿象红球菌(Rhodococcus rhodnii)ATCC35071、赤红球菌(Rhodococcus ruber)JCM3205、嗜粪红球菌(Rhodococcuscoprophilus)ATCC29080、藤黄红球菌(Rhodococcus fascians)ATCC12974、藤黄红球菌(Rhodococcus fascians)ATCC35014、沟戈登氏菌(Gordona amarae)ATCC27808、暗红戈登氏菌(Gordonarubropertinctus)IFM-33、暗红戈登氏菌(Gordonarubropertinctus)ATCC14352、支气管戈登氏菌(Gordonabronchialis)ATCC25592、痰戈登氏菌(Gordona sputi)ATCC29627、爱知戈登氏菌(Gordona aichiensis)ATCC33611、土生戈登氏菌(Gordona terrae)ATCC25594、戈登氏菌属ATCC 19067、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC14020、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC19240、类真菌棒杆菌(Corynebacterium mycetoides)ATCC21134、变异棒杆菌(Corynebacterium variabilis)ATCC15753、产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)ATCC6872、成晶节杆菌(Arthrobacter crystallopoietes)ATCC15481、肠肿节杆菌(Arthrobacter duodecadis)ATCC13347、分枝节杆菌(Arthrobacter ramosus)ATCC13727、硫磺节杆菌(Arthrobactersulfureus)ATCC19098、金黄节杆菌(Arthrobacter aurescens)ATCC13344、柠檬节杆菌(Arthrobacter citreus)ATCC11624、球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)ATCC8010、乙酰短杆菌(Brevibacterium acetylicum)ATCC953、扩展短杆菌(Brevibacterium linens)ATCC19391、扩展短杆菌(Brevibacterium linens)ATCC9172、未定短杆菌(Brevibacteriumincertum)ATCC8363、碘短杆菌(Brevibacterium iodinum)IF03558、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)ATCC4698、玫瑰色微球菌(Micrococcus roseus)ATCC186、纤维化纤维单胞菌(Cellulomonas cellulans)ATCC15921、强壮纤维单胞菌(Cellulomonas cartae)ATCC21681、少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)ATCC29837、粘连鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas adhaesiva)JCM7370和土生鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas terrae)ATCC15098和戈登氏菌属(Gordona sp.)ATCC 19069等。
另外，也可以使用这些微生物的继代培养体、突变体或诱变体、通过基因重组技术制备的重组体等。
用于培养本发明中所用微生物的培养基如果是含有本发明的微生物能够利用的碳源、氮源、无机盐类等，并可以有效进行本发明微生物的培养的培养基即可，天然培养基、合成培养基均可以使用。
作为培养基中的碳源的具体实例，如葡萄糖、果糖、甘油、麦芽糖、淀粉、蔗糖等碳水化合物，醋酸、枸橼酸等有机酸，糖蜜等。
作为氮源的具体实例，如氨，氯化铵、硫酸铵、醋酸铵、硝酸铵、磷酸铵等各种无机酸或有机酸的铵盐，胨、肉汁、玉米浆、酪蛋白水解产物、大豆粉、棉籽粕、鱼粉、各种发酵菌体及其消化物等。
作为无机物的具体实例，如磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜、碳酸钙等。
另外，根据需要也可以添加硫胺素、生物素等维生素，谷氨酸、天冬氨酸等氨基酸，腺嘌呤、鸟嘌呤等与核酸有关的物质。
本发明中所用微生物的培养优选在振荡培养、通气搅拌培养等有氧条件下进行。通气搅拌培养的情况下，为了防止发泡，优选适量添加消泡剂。培养通常在20～50℃，优选25～40℃下进行6～120小时。培养中pH保持在5.0～10.0，优选6.0～8.5。pH调节使用无机酸或有机酸、碱溶液、尿素、碳酸钙、氨等进行。
作为这样得到的微生物培养物的处理物，如培养菌体、该菌体的干燥物、该菌体的冷冻干燥物、该菌体的表面活性剂处理物、该菌体的酶处理物、该菌体的超声波处理物、该菌体的机械粉碎物、该菌体的溶剂处理物等菌体处理物，菌体的蛋白级分物，菌体和菌体处理物的固化物等。
由化合物(I-a)或化合物(I-b)转变为化合物(II-a)或化合物(II-b)的方法可以采用预先在培养微生物的培养基中添加化合物(I-a)或化合物(I-b)的方法，也可以采用在培养过程中添加化合物(I-a)或化合物(I-b)的方法。另外，也可以采用使酶源在水性介质中作用于化合物(I-a)或(I-b)的方法。
在培养微生物的培养基中添加化合物(I-a)或化合物(I-b)时，在培养开始或过程中每1ml培养基添加化合物(I-a)或化合物(I-b)0.1～10mg，优选0.2～1mg。添加化合物(I-a)或化合物(I-b)时，也可以将化合物(I-a)或化合物(I-b)溶解于甲醇、乙醇等溶剂中再添加。
采用使酶源在水性介质中作用于化合物(I-a)或化合物(I-b)的方法时，使用的酶的量根据该酶源的比活性等有所不同。例如使用微生物的培养物或该培养物的处理物作为酶源时，每1mg化合物(I-a)或化合物(I-b)添加酶源5～1000mg，优选10～400mg。反应优选在水性介质中20～50℃下进行，特别优选在25～40℃下进行。反应时间根据使用的酶源的量和比活性等有所不同，通常为0.5～150小时，优选1～72小时。
水性介质例如水、磷酸缓冲液、HEPES(N-二羟乙基哌嗪-N-乙磺酸)缓冲液、Tris〔三(羟甲基)氨基甲烷〕盐酸缓冲液等缓冲液。只要不阻碍反应，也可以在该缓冲液中添加有机溶剂。有机溶剂例如丙酮、乙酸乙酯、二甲基亚砜、二甲苯、甲醇、乙醇、丁醇等。有机溶剂和水性介质的混合液优选在使用化合物(I-b)时使用。
采用上述制备方法可以由化合物(I-a)得到化合物(II-a)或化合物(II-a)和化合物(II-b)的混合物。
同样，可以由化合物(I-b)得到化合物(II-b)或化合物(II-a)和化合物(II-b)的混合物。
而且，也可以由化合物(I-a)和化合物(I-b)的混合物得到化合物(II-a)和化合物(II-b)的混合物。
化合物(I-b)和化合物(II-b)可以按照下述举例说明的内酯的开环方法分别容易地转变成化合物(I-a)和化合物(II-a)。另外，化合物(I-a)和化合物(II-a)可以按照下述举例说明的内酯的生成方法分别容易地转变成化合物(I-b)或化合物(II-b)。
内酯的开环方法例如将化合物(I-b)或化合物(II-b)溶解于水性介质中，添加酸或碱的方法。水性介质例如水、磷酸缓冲液、Tris缓冲液等含有不阻碍反应的盐类的水溶液。该水溶液中也可以含有不阻碍反应的浓度的甲醇、乙醇、乙酸乙酯等有机溶剂。酸例如醋酸、盐酸、硫酸等酸，碱例如氢氧化钠、氢氧化钾、氨等。
内酯的生成方法例如将化合物(I-a)或化合物(II-a)溶解于非水系的溶剂中，添加酸或碱催化剂的方法。作为非水系的溶剂，只要是实质上不含水的有机溶剂，并且可以溶解化合物(I-a)或化合物(II-a)，任何一种溶剂均可使用。
非水系的溶剂例如二氯甲烷、乙酸乙酯等。作为催化剂，只要可以催化内酯化反应，并且不对基质和反应产物发生内酯化以外的作用，可以使用任何一种物质。该催化剂例如三氟醋酸或对甲苯磺酸等。反应温度没有特别的限定，优选0～100℃，特别优选20～80℃。
从反应结束后的上述溶液中收集化合物(II-a)或化合物(II-b)可以采用通常有机合成化学中采用的方法，例如用有机溶剂萃取、结晶、薄层色谱法、高效液相色谱法等进行。
本发明得到的化合物(II-a)或化合物(II-b)的确认或定量方法只要是可以确认或定量化合物(II-a)和/或化合物(II-b)的方法，可以采用任何一种方法。例如，可以采用13C-NMR光谱、1H-NMR光谱、质谱、高效液相色谱法(HPLC)等方法进行。
本发明中，有时化合物(I-a)、化合物(I-b)、化合物(II-a)和化合物(II-b)中可以存在光学异构体等立体异构体，本发明包括连同这些立体异构体在内的所有可能的异构体及其混合物。
化合物(I-a)优选化合物(III-a)，更优选化合物(V-a)，特别优选化合物(VII-a)。
化合物(I-b)优选化合物(III-b)，更优选化合物(V-b)，特别优选化合物(VII-b)。
化合物(II-a)优选化合物(IV-a)，更优选化合物(VI-a)，特别优选化合物(VIII-a)。
化合物(II-b)优选化合物(IV-b)，更优选化合物(VI-b)，特别优选化合物(VIII-b)。
以下给出本发明的实施例，但是本发明并不受这些实施例的限定。发明的最佳实施方式实施例1将化合物(VII-b)(Sigma公司生产)100mg溶解于9.5ml的甲醇中后，加入1mol/l氢氧化钠0.5ml，室温下振荡1小时。将得到的反应液干燥固化后，加入去离子水5ml溶解，用1mol/l盐酸约0.1ml将pH调节至约6.5～7.5，再加入去离子水4.9ml，得到最终浓度为10mg/ml的化合物(VII-a)〔通式(VII-a)中R1为钠的化合物〕10ml。
将表1和表2所示的各种微生物分别涂覆在琼脂培养基上〔胨(极东制药工业生产)1％、肉汁(极东制药工业生产)0.7％、NaCl 0.3％、酵母浸出物(日本制药社生产)0.2％、Bacto琼脂(Difuco公司生产)2％，用1mol/l氢氧化钠调节为pH7.2〕，在表1和表2所示的各温度下培养3天。将琼脂培养基上生长的菌株各一铂环分别接种在含有3mlLB培养基〔Bacto胰胨(Difuco公司生产)1％、Bacto酵母浸出物束(Difuco公司生产)0.5％，用1mol/l氢氧化钠调节为pH7.2〕的试管中，在表1和表2所示的各温度下振荡培养24小时。将培养后的培养液0.25ml接种到含有5ml TB培养基〔Bacto胰胨(Difuco公司生产)1.4％、Bacto酵母浸出物束(Difuco公司生产)2.4％、KH2PO40.231％、K2HPO41.251％，用1mol/l氢氧化钠调节为pH7.4〕的试管中，在表1和表2所示的各温度下振荡培养24小时。24小时后，将上述得到的化合物(VII-a)分别添加到试管中使终浓度达到0.4mg/ml，再在表1和表2所示的各温度下振荡48小时进行反应。
反应结束后，用醋酸将反应液调节为pH3.5。向该反应液0.5ml中加入乙酸乙酯1ml，振荡1小时。振荡后，以3000rpm的速度离心分离5分钟，将反应液分为2层，回收上清的乙酸乙酯层，在离心蒸发器中除去溶剂后，将残渣溶解在甲醇0.5ml中。使用该甲醇溶液的一部分进行HPLC分析〔柱Inertsil ODS-2(5μm，4×250mm，凝胶科学公司生产)；柱温度60℃；流动相乙腈∶水∶磷酸＝55∶45∶0.05；流速0.9ml/分；检测波长237nm〕，对化合物(VIII-a)〔通式(VIII-a)中R1为钠的化合物〕进行检测、定量。结果如表1和表2所示。
表1
表2
实施例2将浅黄色分枝杆菌(Mycobacterium gilvum)JCM6395株涂覆在与实施例1同样的琼脂培养基上，37℃下培养3天，将琼脂培养基上生长的菌株接种在含有LB培养基3ml的4只试管中，37℃下振荡培养24小时。分别将该培养液1.25ml接种在8个含有25ml TB培养基的300ml锥形瓶中，37℃下振荡培养。24小时后添加与实施例1同样制备的化合物(VII-a)〔通式(VII-a)中R1为钠的化合物〕使终浓度达到0.4mg/l，在37℃下振荡培养48小时。反应结束后，在4℃下，以3000rpm的速度离心分离10分钟，分离得到上清液。用醋酸将上清液的pH调节为3.5，加入400ml的乙酸乙酯，在30℃下振荡1小时后静置，收回上清液。对于下层的水层也进行同样的操作，将得到的乙酸乙酯层与前面的上清液混合。在该乙酸乙酯层中添加饱和食盐水100ml振荡后，回收上清液。
其次，在该上清液中添加5g无水Na2SO4，在室温下放置15分钟后，减压蒸发乙酸乙酯，干燥固化。将得到的残渣溶解于去离子水5ml中，用氢氧化钠将pH调节为9.0，在50ml的HP-20柱上进行过柱。(25×100mm，三菱化学公司生产)。用150ml去离子水洗涤柱子后，用丙酮含量为20％、30％、40％的丙酮水溶液100ml分级洗脱。对分离得到的部分进行与实施例1同样的HPLC分析，回收含有化合物(VIII-a)的组分。减压条件下从该组分中除去乙腈，用lmol/l盐酸将溶液的pH调节为3.0。在该溶液中加入360ml的乙酸乙酯振荡，静置后回收上清液。在该上清液中添加饱和食盐水90ml，振荡，静置后回收上清液。
其次，向该上清液中添加4.5g无水Na2SO4，室温下放置15分钟后，减压干燥固化。将得到的干燥固化物溶解在二氯甲烷中，加入1％三氟乙酸，使之内酯化。使用分离用TLC〔硅胶板No.1.05744(200×200mm，0.5mm厚)MERCK公司制；展开溶剂乙酸乙酯；显色剂12.5％磷钼酸·1％铈/10％硫酸溶液〕分离该反应物，得到0.8mg化合物(VIII-b)。得到的化合物(VIII-b)的质谱和1H-NMR光谱的分析结果如下所示。
质谱使用日本电子生产的JMS-HX/HX110A质谱仪，使用间硝基苯甲醇作为基质采用正向模式进行测定。结果在m/z 407处出现准分子离子峰(〔M+H〕+)，与根据化合物(VII-b)的结构和分子量(406)期待的数值一致。
1H-NMR光谱使用日本电子制的JNM-α400型光谱仪，在重氯仿中，使用TMS作为内标，在400MHz下测定。其结果如下所示。该光谱数据与化合物(VIII-b)的已知数据〔三共研究所年报，37，147(1985)〕一致。
δppm(CDCl3)6.01(1H，d，J＝9.5Hz)，5.89(1H，dd，J＝9.5，5.9Hz)，5.58(1H，m)，5.41(1H，m)，4.60(1H，ddd，J＝10.6，7.3，5.4，2.8Hz)，4.40(1H，m)，4.38(1H，m)，2.74(1H，dd，J＝13.1，6.0，4.8，1.5Hz)，2.40(1H，m)，2.36(1H，m)，2.34(1H，m)，1.95(1H，dddd，J＝14.4，3.7，2.9，1.7Hz)，1.86(1H，dddd，J＝12.5，12.3，7.3，4.3Hz)，1.69(1H，m)，1.68(1H，m)，1.64(1H，m)，1.57(1H，m)，1.5～1.4(2H，m)，1.43(1h，m)，1.30(1H，m)，1.12(3H，d，J＝6.8Hz)，0.91(3H，d，J＝7.1Hz)，0.89(3H，t，J＝7.4Hz)工业实用性按照本发明能够高效率地制备具有抑制HMG-CoA还原酶、降低血清胆固醇等作用的化合物。
权利要求
1.化合物(II-a)或化合物(II-b)的制备方法，其特征在于，使用具有由通式(I-a)表示的化合物〔以下称为化合物(I-a)〕或者通式(I-b)表示的化合物(I-a)的内酯体〔以下称为化合物(I-b)〕生成通式(II-a)表示的化合物〔以下称为化合物(II-a)〕或者通式(II-b)表示的化合物(II-a)的内酯体〔以下称为化合物(V-b)〕的活性，而且不具有孢子形成能力及不繁殖成菌丝状的微生物、该微生物的培养物或该培养物的处理物作为酶源，使化合物(I-a)或化合物(I-b)存在于水性介质中，在该水性介质中生成、蓄积化合物(II-a)或化合物(II-b)，并由该水性介质收集化合物(II-a)或化合物(II-b)， 式中，R1表示氢原子、取代或未取代的烷基或碱金属，R2表示取代或未取代的烷基或者取代或未取代的芳基， 式中，R2与上述定义相同， 式中，R1和R2与上述定义相同， 式中，R2与上述定义相同。
2.根据权利要求1的制备方法，其中化合物(I-a)为通式(III-a)表示的化合物〔以下称为化合物(III-a)〕，化合物(I-b)为通式(III-b)表示的化合物〔以下称为化合物(III-b)〕，化合物(II-a)为通式(IV-a)表示的化合物〔以下称为化合物(IV-a)〕，化合物(II-b)为通式(IV-b)表示的化合物〔以下称为化合物(IV-b)〕， 式中，R1表示氢原子，取代或非取代的烷基或碱金属，R2表示取代或未取代的烷基或取代或未取代的芳基， 式中，R2与上述定义相同， 式中，R1和R2与上述定义相同， 式中，R2与上述定义相同。
3.根据权利要求1的制备方法，其中化合物(I-a)为通式(V-a)表示的化合物〔以下称为化合物(V-a)〕，化合物(I-b)为通式(V-b)表示的化合物〔以下称为化合物(V-b)〕，化合物(II-a)为通式(VI-a)表示的化合物〔以下称为化合物(VI-a)〕，化合物(II-b)为通式(VI-b)表示的化合物〔以下称为化合物(VI-b)〕， 式中，R1表示氢原子，取代或未取代的烷基或碱金属， 式中，R1与上述定义相同，
4.根据权利要求1的制备方法，其中化合物(I-a)为通式(VII-a)表示的化合物〔以下称为化合物(VII-a)〕，化合物(I-b)为通式(VII-b)表示的化合物〔以下称为化合物(VII-b)〕，化合物(II-a)为通式(VIII-a)表示的化合物〔以下称为化合物(VIII-a)〕，化合物(II-b)为通式(VIII-b)表示的化合物〔以下称为化合物(VIII-b)〕， 式中，R1表示氢原子，取代或未取代的烷基或碱金属， 式中，R1与上述定义相同，
5.根据权利要求1的制备方法，其中微生物培养物的处理物是从培养菌体、该菌体的干燥物、该菌体的冷冻干燥物、该菌体的表面活性剂处理物、该菌体的酶处理物、该菌体的超声波处理物、该菌体的机械粉碎物、该菌体的溶剂处理物等菌体处理物，菌体的蛋白级分物，菌体和菌体处理物的固化物中选择的处理物。
6.根据权利要求1的制备方法，其中微生物是选自分枝杆菌属、棒杆菌属、短杆菌属、红球菌属、戈登氏菌属、节杆菌属、微球菌属、纤维单胞菌属和鞘氨醇单胞菌属的微生物。
7.根据权利要求1的制备方法，其中微生物是选自草分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、抗热分枝杆菌、新金色分枝杆菌、副偶然分枝杆菌、浅黄色分枝杆菌、圆红球菌、马红球菌、红串红球菌、紫红红球菌、椿象红球菌、赤红球菌、嗜粪红球菌、藤黄红球菌、沟戈登氏菌、暗红戈登氏菌、支气管戈登氏菌、痰戈登氏菌、爱知戈登氏菌、土生戈登氏菌、谷氨酸棒杆菌、类真菌棒杆菌、变异棒杆菌、产氨棒杆菌、成晶节杆菌、肠肿节杆菌、分枝节杆菌、硫磺节杆菌、金黄节杆菌、柠檬节杆菌、球形节杆菌、乙酰短杆菌、扩展短杆菌、未定短杆菌、碘短杆菌、藤黄微球菌、玫瑰色微球菌、纤维化纤维单胞菌、强壮纤维单胞菌、少动鞘氨醇单胞菌、粘连鞘氨醇单胞菌和土生鞘氨醇单胞菌的微生物。
8.根据权利要求1的制备方法，其中微生物是选自草分枝杆菌JCM5865、耻垢分枝杆菌JCM5866、抗热分枝杆菌JCM6362、新金色分枝杆菌JCM6365、副偶然分枝杆菌JCM6367、浅黄色分枝杆菌JCM6395、圆红球菌ATCC25714、马红球菌ATCC21387、马红球菌ATCC7005、红串红球菌ATCC4277、紫红红球菌ATCC21430、紫红红球菌ATCC13808、椿象红球菌ATCC35071、赤红球菌JCM3205、嗜粪红球菌ATCC29080、藤黄红球菌ATCC12974、藤黄红球菌ATCC35014、沟戈登氏菌ATCC27808、暗红戈登氏菌IFM-33、暗红戈登氏菌ATCC14352、支气管戈登氏菌ATCC25592、痰戈登氏菌ATCC29627、爱知戈登氏菌ATCC33611、土生戈登氏菌ATCC25594、谷氨酸棒杆菌ATCC13032、谷氨酸棒杆菌ATCC14020、谷氨酸棒杆菌ATCC19240、类真菌棒杆菌ATCC21134、变异棒杆菌ATCC15753、产氨棒杆菌ATCC6872、成晶节杆菌ATCC15481、肠肿节杆菌ATCC13347、分枝节杆菌ATCC13727、硫磺节杆菌ATCC19098、金黄节杆菌ATCC13344、柠檬节杆菌ATCC11624、球形节杆菌ATCC8010、乙酰短杆菌ATCC953、扩展短杆菌ATCC19391、扩展短杆菌ATCC9172、未定短杆菌ATCC8363、碘短杆菌IF03558、藤黄微球菌ATCC4698、玫瑰色微球菌ATCC186、纤维化纤维单胞菌ATCC15921、强壮纤维单胞菌ATCC21681、少动鞘氨醇单胞菌ATCC29837、粘连鞘氨醇单胞菌JCM7370和土生鞘氨醇单胞菌ATCC15098的微生物。
9.根据权利要求1的制备方法，其中微生物是戈登氏菌属ATCC19067。
全文摘要
本发明涉及化合物(II－a)或化合物(II－b)的制备方法,其特征在于,使用具有将通式(I－a)表示的化合物[以下称为化合物(I－a)]或者其封闭内酯体[以下称为化合物(I－b)]氢氧化的活性,而且不具有孢子形成能力及不繁殖成菌丝状的微生物、该微生物的培养物或该培养物的处理物作为酶源,使之在水性介质中对化合物(I－a)或化合物(I－b)作用,并由该水性介质收集化合物(I－a)或化合物(I－b)的氢氧化物[以上称为化合物(II－a)或化合物(II－b)]。(式中,R
文档编号C12P17/06GK1344328SQ00805212
公开日2002年4月10日 申请日期2000年1月20日 优先权日1999年1月20日
发明者桥本信一, 米谷良之, 尾崎明夫 申请人:协和发酵工业株式会社