专利名称：Dna测序方法
技术领域：
本发明是关于多核苷酸序列测定的。
背景技术：
测定多核苷酸序列的能力具有巨大的科学重要性。例如，人类基因组计划是一个雄心勃勃的国际性努力，它致力于测定编码在人类基因组中的30亿碱基序列和绘制其图谱。当该计划完成后，产生的序列数据库对生物医学研究来说将是一个空前有力的工具。成功完成这项计划的主要障碍来自于测序方法中所使用的技术。
在DNA大规模测序中，通常使用的主要方法是反应链终止方法。这种方法最初由Sanger和Coulson发展起来(Sanger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1977；745463-5467)，它依赖于使用四种三磷酸核苷的双脱氧衍生物，这些物质在聚合酶反应中将掺入新生成的多核苷酸链。一旦掺入，双脱氧衍生物就会终止聚合酶反应，用凝胶电泳将产物分离并加以分析，以揭示特定双脱氧衍生物在链中掺入的位置。
尽管这种方法得到广泛应用，而且能产生可靠的结果，但还是被认为速度慢，劳动强度大以及花费高。
在EP-A-0471732中提出了一种替代的序列测定方法，是用光谱学方法来检测核苷酸掺入与目标互补的新生多核苷酸链的情况。这种方法依赖于固定的模板和引物的复合体，该复合体暴露于只含有不同核苷酸中的一种的流体中。然后用光谱学技术测量依赖于时间的信号，该信号是由聚合酶催化的模板拷贝增加引起的。上述的光谱学技术是表面等离子体激元共振(surface plasmon resonance，SPR)光谱法和荧光测量技术，前者是在损耗波场内测量分析物中的变化。但是，人们也认识到了这种方法的局限性；对SPR技术来说，最严重的在于当拷贝链大小增加时，由于链的移动超出了损耗波场，也会引起信号绝对值的增加，从而导致检测增量变得更加困难。荧光测量技术有一个缺点，即由掺入延长中的新生多核苷酸链的荧光团引起的背景干扰增加。随着链的增长，背景“噪音”也增加，检测每个核苷酸掺入情况所需的时间也需要增加。这严重的限制了这种方法在大分子量多核苷酸测序中的应用。
在WO-A-9924797和WO-A-9833939中描述了单片断多核苷酸测序方法，两者都利用荧光检测标记的单核苷酸分子。这些单核苷酸是在核酸外切酶分子的作用下，从被光阱(optical trap)束缚在液流中的模板多核苷酸上切割下来(Jett等人，J.Biomol.Struc.Dyn，1989；7301-309)。接着，这些切割下来的核苷酸在石英流室内往下流，受到激光激活，然后由灵敏的检测系统来检测。但是，人们认识到了这种方法的局限性；这种核酸外切酶技术最严重的缺点是标记的核苷酸严重影响了核酸外切酶的处理能力。这种方法的另外一些局限性包括核苷酸会“粘在”用来固定多核苷酸片断的生物素小珠上，从而导致核苷酸流变成不同步的；初始酶标记过程的低效率和长度限制；以及这四种不同染料分子之间的交叉激活导致的错误率急剧增加。
因此就有必要有一种改进的方法—最好是在单个片断水平上—来测定多核苷酸的序列，这种方法能极大地增加检测多核苷酸的速率以及片断大小，该方法优选由自动化的方法来执行，从而减少现存方法的复杂性和成本。
发明概述本方法基于以下认识目标多核苷酸的序列可以通过测量结合并且沿着目标多核苷酸推移的酶的构象变化来测定。依目标多核苷酸上与酶接触的单个核苷酸的不同，所产生的构象变化的程度也是不同的。
根据本发明的一个方面，测定多核苷酸序列的方法包括以下步骤(i) 在足以诱导酶活性的条件下，让目标多核苷酸与能和目标多核苷酸相互作用并沿着多核苷酸推移的酶反应；和(ii) 当酶沿着多核苷酸推移时，检测该酶的构象变化。
在优选的实施方案中，所用的酶是聚合酶，该酶在延伸互补链的过程中和目标相互作用。该酶通常是固定在固体支持物上以使反应定位在一个限定的区域内。
根据本发明的第二种实施方案，酶含有第一结合可检测标记，该标记的特征能随酶构象的改变而变化。该酶也可以含有第二结合可检测标记，该标记能与第一标记相互作用，其中，相互作用的程度依赖于酶的构象变化。通常，第一标记是能量受体，第二标记是能量供体，通过测量这两个标记之间的能量传输来检测构象变化。
根据本发明的更进一步的实施方案，利用荧光共振能量传递方法(fluorescence resonance energy transfer，FRET)来检测同目标聚合酶相互作用并沿着它推移的酶的构象变化，从而测定多核苷酸的序列。荧光能量共振传递可以在两个结合在酶上的FRET供体和受体标记之间进行。或者，其中的一个标记可以结合在酶上，而另一个标记则结合在多核苷酸上。
进一步的实施方案是能和目标多核苷酸相互作用并沿着其推移的可检测标记的酶在测定多核苷酸的序列中的用途，其中随着该酶沿多核苷酸的推移，它所带的标记能改变可检测的特征。
根据另一个方面，固体支持物至少含有一种能和目标多核苷酸相互作用并沿着其推移的固定化酶，该酶标记有一种或更多可检测的标记。
根据另一个方面，用于测定多核苷酸序列的系统含有如上所述的固体支持物以及检测标记的设备。
本发明提供了几个传统测序技术所没有的优点。一旦聚合酶开始了它的多核苷酸延伸轮回，在从单链上脱离之前，它将聚合几千个核苷酸。另外，某些特定的聚合酶体系能够以环绕模板分子的“滑行夹子”(如聚合酶III)或者部分环绕模板的分子钩(如T7硫氧还蛋白复合体)，来将自己锚定或拴在模板多核苷酸上。
本发明也可以以每秒几百个碱基对的速度，一次性测定几万或更多的碱基。这是对DNA单个片断测定的结果。对DNA单个片断测序的优点是测序速度由所使用的酶体系决定，而不是由无方向的，累计性的反应来决定，因此测定速度也相应更快。测定大片断DNA的能力同高速度一样重要。这将会极大的减少亚克隆量，以及用来组装兆碱基级片断遗传信息所需的重叠序列的数目。单片断方法的另一个优点是消除了处理有毒废物所带来的问题，例如丙烯酰胺，它给当前的测序努力带来了困扰。
图例说明
图1是本发明中所用的共焦显微镜装置的图示；图2描述了荧光共振能量传递后的曲线，每个峰代表检测到特定核苷酸。
发明详述测定多核苷酸序列的本方法，涉及了对酶和目标多核苷酸之间构象变化的分析。
这里所使用的“多核苷酸”一词应有广泛的含义，包括DNA和RNA，既包括修饰过的DNA和RNA，也包括其它一些杂交核酸样分子，例如肽核酸(PNA)。
酶可以是聚合酶，当聚合酶将核苷酸掺入与目标多核苷酸互补的新生链上时，会产生构象变化。已经发现对于不同的核苷酸A，T，G或C，构象变化是不同的，因此通过测量这种变化就能确定掺入了哪种核苷酸。
或者，所用的酶也可以是任何涉及与多核苷酸相互作用的酶，例如解旋酶、引发酶和全酶。当酶沿着多核苷酸推移时，依它所带来与目标接触的核苷酸不同，它的构象会发生变化。
检测酶构象变化的一种方法是测量合适的能量供体标记和能量受体标记之间的共振能量传递。在一种情况下，供体和受体各自结合在酶上，由酶与目标多核苷酸相互作用引起的构象变化改变了标记之间的相对位置。位置的不同由所产生的能量传递反映出来，同时也是与酶接触的特定核苷酸的特性。或者，一个标记可以定位在酶上，而另一个则可以在目标的核苷酸上或是掺入与目标互补的链上的核苷酸上。
利用荧光共振能量传递方法(FRET)是本发明的优选实施方案。这项技术能测量2-8纳米的距离，并依赖于供体荧光团和受体荧光团之间和距离有关的能量传递。该技术不仅具有超强的静态共定位能力，而且也可以提供分子内和分子间FRET过程中两个荧光团之间的距离或方向的动力学变化信息。自从首次测量单一供体和单一受体(单对FRET)之间的能量传递之后(Ha等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1996；96893)，该技术已用来研究配基—受体的共定位(Schutz等人，Biophys.J.，1998；742223)，探察蛋白质结构性波动的平衡和催化过程中酶—底物的相互作用(Ha等人，1999，出处同前)，以及确定溶液中各扩散分子的构象状态和亚群。所有这些可变物都视为在本发明中可适用。
本发明也可以通过使用只需一种标记的测量技术来实现。任何能在单分子水平测量酶所处局部环境变化的系统，都是本发明可接受的实施方案。附着在沿多核苷酸推移的酶上和/或它的底物上的单个荧光探针的多种性质都可以在本发明中用来提供变量的数据，这些变量属于酶体系/分子环境或同它们紧密联系，并且对核苷酸掺入事件是特异性的。这些变量包括，但并不仅限于，分子相互作用，酶活性，反应动力学，构象动力学，分子运动自由度，活性以及化学和静电环境方面的变化。
例如，单个荧光团的吸收和发射转化偶极子可以通过使用偏振激发光，或者分析发射偏振，或者两者的结合使用来测定。刚性附着的或旋转式扩散的缠绕的标记，它的偶极子方向的时间性变化，可以通过大分子系统或其亚单位之一的角运动来报告(Warshaw等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1998；958034)，因此可以在本发明中使用。
本发明中可以使用的标记对本领域技术人员来说是十分明显的。优选的标记是荧光标记，例如Xue等人在Nature，1995；373681中所公开的那些。或者，荧光酶如绿色荧光蛋白(Lu等人，Science，1998；2821877)也可以使用。
但是，本发明的优选实施方案涉及小荧光分子的使用，这些荧光分子共价及位点特异性的结合在沿多核苷酸推移的酶上，例如四甲基罗丹明(TMR)。
如果在本发明中使用荧光标记，由于重复将它们暴露于激发波长下，它们的检测可能会受光漂白的影响。避免这个问题的一个可能方法是进行许多连续的反应，但一次只对其中一些检测荧光信号。利用这种重复的方法，可以确定信号的正确顺序，以及测定多核苷酸的序列。例如，将大量酶固定在固体支持物上，使它们和目标多核苷酸接触，测序反应应该基本在同一时间开始。激发和检测荧光可以只对总反应中的一部分进行一段时间，直到光漂白现象明显。这时，激发和检测可以转移到反应的其它部分来继续测序。由于所有的反应在时相上是相对的，因此正确的序列可通过最小片断序列组装得到。
标记可以通过共价键或其它一些连键附着在酶上。有一些方法可以用来将标记附着在酶上。这些方法包括使用定点诱变和非天然氨基酸诱变(Anthony-Cahil等人，Trends Biochem.Sci.，1989；14400)来为特异正交染料标记蛋白质引入半胱氨酸和酮柄(Cornish等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1994；912910)。
另一种用来标记沿多核苷酸推移的酶的可预见的实施方案是，用本领域内熟知的分子克隆技术将绿色荧光蛋白和移动酶(如聚合酶)融合(Pierce，D.W.等人，Nature，1997；388338)。这种技术被证明在测量构象变化(Miyawaki等人，Nature，1997；388882)和局部pH变化(Llopis等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1998；956803)中是可适用的。
适合用来作为固定酶的支持物，对技术人员来说是很明显的。硅，玻璃和陶瓷材料都可以适用。支持物通常是平面。酶的固定可以用共价结合或其它方法来实现。例如，共价连接分子可以用来附着在适合制备的酶上。附着方法为技术人员所熟知。
可以有一个或更多的酶固定在固相支持物上。在优选的实施方案中，有许多酶附着。这样能允许监测许多单独的反应，也许对解决如上所述的光漂白问题有所帮助。
许多技术都可以用来测量酶的构象变化。共振能量传递可以用表面等离子体激元共振(SPR)技术或荧光表面等离子体激元共振技术来测量。
但是，也可以考虑另外一些通过与“标记”或能量传导器相互作用来测量辐射变化的技术，例如内部全反射荧光光谱法(totalinternal reflectance fluorescence，TIRF)，衰减全反射(attenuated total reflection，ATR)，受抑全反射(frustrated totalreflection，FTR)，布鲁斯特角反射测定法(Brewster anglereflectometry)，scattered total internal reflection(STIR)，荧光寿命成像显微和光谱技术(fluorescence lifetime imagingmicroscopy and spectroscopy)，荧光偏振异向术(fluorescencepolarisation anisotrophy，FPA)，荧光光谱法，损耗波椭圆测量术(evanescent wave ellipsometry).
现在，用下面的实例结合相应图式的参考来进一步说明本发明。
实例本实例使用了共焦荧光装置，如
图1所示。
参考
图1，该装置由一个能在高分辨率下扫描X，Y，Z轴的扫描工作台(1)和盖玻片(2)组成，盖玻片是显微流体室系统(microfluidicflow cell system)的一部分，该显微流体室系统有一个入口(8)和一个出口(7)，入口用来在缓冲液中固定(9)的聚合酶分子(3)上导入引物—模板多核苷酸复合体和核苷酸，出口用来导出废物。从激光源(6)发出的用来提供供体激活作用的入射光通过油镜(5)传递。
蛋白质结合在本实验中，四甲基罗丹明(TMR，供体)和Cy5(受体)作为FRET对使用。这是由于它们具有分离较远的发射波长(＞100nm)和大的福斯特半径(Fster radius)。
使用了从新英格兰生物实验室取得的T7 DNA聚合酶(10000U/ml)。50微升T7在Vivaspin500中经过4次缓冲液交换，每次用500微升200mM pH为4的醋酸钠缓冲液，用来将T7 DNA聚合酶所在的储存液中含有的DTT去除。接着将50微升经缓冲液交换的T7 DNA聚合酶加入100微升pH为4的醋酸钠缓冲液和50微升饱和的2-2-dipyridyl-disulphide水溶液。反应进行110分钟，测量波长343nm的吸收值。最后，样品用如上所述的方法经缓冲液交换到200mMpH为8的Tris溶液中(4次，每次500微升)。
染料附着通过变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳来确定。在相同的标记条件下将Cy5丁二酰亚胺脂(Molecular Probes)缀合在TMR-T7 DNA聚合酶上，并用如上所述的方法纯化和鉴定。
聚合酶固定盖玻片用N-[3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基]乙二胺三乙酸衍生。然后粘成流体室阵列(flow cell arrangement)，以允许缓冲液连续的流过衍生玻片表面。接着向缓冲液中加入标记的聚合酶，允许它们流过盖玻片，从而使蛋白质固定在玻片表面上。
然后将蛋白质以低密度固定在玻片—水界面上，以使任何时候都只有一个分子处于激发激光的光柱下。用扫描台共焦显微镜的外照明装置上的油镜使激光(514nm的氩离子激光，15微瓦，环形偏振)聚焦在0.4微米大小的点上。发射荧光由同一物镜收集，并由二色分光镜(630nm宽带通过)分成两束，再由两个崩光电二极管(AvalanchePhoto Diode，APD)计数装置同时检测。
将一个585nm带通滤光片放在供体检测器前；650nm宽带滤光片放在受体检测器前。由于荧光检测过程中的光谱范围离二色分光镜的波长临界值足够远，因此供体和受体信号检测效率的光偏振依赖性可以忽略不计。已有人证明高近场光圈(near field aperture，NA)物镜造成的偏振混合可以忽略(Ha等人，出处同前)。
为了得到供体和受体的发射时间，使用了如(Ha等人，Appl.Phys.Letter，1997；70；782)中所述的受体信号搜寻条件。这种方法有助于双重标记蛋白质的筛选受体不直接激发，只有经历FRET的蛋白质能显示受体信号。一旦蛋白质在激光点下得到筛选，查找位置并定位，就得到了供体和受体的时间曲线(5毫秒的积分时间)。获得时间持续到所有目标蛋白上的荧光标记都被光漂白。
反应起始用标准的亚磷酰胺化学法合成两段寡核苷酸。名为SEQ ID NO.1的寡核苷酸用作目标多核苷酸，名为SEQ ID NO.2的寡核苷酸用作引物，这两段寡核苷酸在杂交条件下反应形成目标—引物复合体。
CAAGGAGAGGACGCTGTCTGTCGAAGGTAAGGAACGGACGAGAGAAGGGAGAGSEQ ID NO.1CTCTCCCTTCTCTCGTC SEQ ID NO.2接着将引发DNA和所有四种浓度为0.4mM的核苷酸(dGTP，dCTP，dATP，dTTP)注入流体室以引发反应。流体室通过一台改进的帕耳帖(peltier)设备来使温度维持在25摄氏度。
使用了一种除氧体系(50μg/ml葡萄糖氧化酶，10μg/ml过氧化氢酶，18％(重量/重量)葡萄糖，1％(重量/体积)β-巯基乙醇)来延长荧光寿命(Funatsu等人，Nature，1995；374555-559)。
FRET数据分析初始研究已经确定了闪烁现象、光漂白及三重线态峰的起因(Ha等人，Chem.Phy，1999，247107-118)，这三种现象都会干扰由于构象变化引起的荧光团之间的距离变化所致的FRET效率的潜在改变。如Ha等人在1999(出处同前)上所公开的，将从供体和受体时间曲线上减去背景信号后，用具有五点平均值的中间滤片除去三重峰。接着，两检测器上显示由供体闪烁现象引起的同时黑暗计数的点在时间曲线上不予考虑。
受体光漂白后供体信号回收量同该分子的量子产率和它们的总体检测效率有关。
接着得到能量传递时间曲线。图2所示为在目标链SEQ ID NO.1的聚合过程中FRET的效率时间曲线。从图2可以看出，该序列与SECID NO.1的互补序列一致(从右向左读，去掉同引物序列杂交的那部分)。
序列表<110>Medical Biosystems Ltd.<120>DNA测序方法<130>REP06193WO<140>(not yet known)<141>2000-10-06<150>9923644.0<151>1999-10-06<160>2<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>53<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述模板多核苷酸<400>1caaggagagg acgctgtctg tcgaaggtaa ggaacggacg agagaaggga gag53<210>2<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物多核苷酸<400>2ctctcccttc tctcgtc1权利要求
1.测定多核苷酸序列的方法，其包括以下步骤i.在足以诱导酶活性的条件下，使目标多核苷酸与能和多核苷酸相互作用并沿着多核苷酸推移的酶反应；ii.测定当酶沿着多核苷酸推移时酶的构象变化。
2.根据权利要求1所述的方法，其中酶是聚合酶。
3.根据权利要求1所述的方法，其中酶是解旋酶或者引发酶。
4.根据前述任一权利要求所述的方法，其中酶被固定在固体支持物上。
5.根据权利要求4所述的方法，包含有许多酶固定在固体支持物上。
6.根据前述任一权利要求所述的方法，其中酶含有第一结合可检测标记，其特征随着酶构象的改变而改变。
7.根据权利要求6所述的方法，其中酶含有第二结合可检测标记，该标记能与第一标记相作用，其中相互作用的程度依赖于酶的构象变化。
8.根据权利要求6所述的方法，其中第二可检测标记结合在与酶接触的核苷酸上。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其中第一标记是能量受体，第二标记是能量供体，或者相反，并且步骤(ii)通过测量这两个标记之间的能量传递来进行。
10.根据前述任一权利要求所述的方法，其中步骤(ii)通过使用共焦显微术来进行。
11.根据权利要求10所述的方法，其中步骤(ii)通过荧光成像来进行。
12.根据权利要求6所述的方法，其中步骤(ii)通过测量由第一标记的特性改变引起的偏振效应来进行。
13.根据权利要求12所述的方法，其中步骤(ii)通过使用荧光偏振异向术来进行。
14.用荧光共振能量传递方法来检测与目标多核苷酸相互作用并沿其推移的酶的构象变化，从而测定多核苷酸的序列的用途。
15.根据权利要求14所述的用途，其中酶是聚合酶。
16.根据权利要求14或15所述的用途，其中酶是固定在固体支持物上的。
17.用可检测标记的并且能和目标多核苷酸相互作用并沿着其推移的酶，来测定多核苷酸的序列的用途，其中随着酶沿多核苷酸推移，标记会改变它的可检测特性。
18.含有至少一种固定化的、能和目标多核苷酸相互作用并沿其推移的酶的固体支持物，该酶标记有一个或更多的可检测标记。
19.根据权利要求18所述的固体支持物，其中酶是聚合酶。
20.根据权利要求18或19所述的固体支持物，其中标记是荧光团。
21.一种测定多核苷酸序列的系统，其包括权利要求18到21中任一项所述的固体支持物，以及检测标记的设备。
全文摘要
测量多核苷酸序列的方法，该方法依赖于检测与多核苷酸相互作用并沿其推移的酶的构象变化。测量构象变化可以通过测量结合在酶上的荧光团的变化来实现。
文档编号C12Q1/25GK1391615SQ0081378
公开日2003年1月15日 申请日期2000年10月6日 优先权日1999年10月6日
发明者D·H·丹斯哈姆 申请人:医疗生物系统有限公司