专利名称：：多肽的制作方法
技术领域：
：本发明涉及到一种多肽，更具体地，本发明涉及到一种具有葡萄糖淀粉酶活性的多肽，该多肽可用于对生物物质进行有价值的利用。本发明还涉及到一种基因，该基因可用于通过遗传工程产生所述的多肽。背景领域已知有两种酶，葡聚糖1，4-α-葡萄糖苷酶和α-葡萄糖苷酶，它们均具有释放在非还原末端通过一种α-1，4键连接的D-葡萄糖活性。葡聚糖1，4-α-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.3)亦称为1，4-α-D-葡聚糖葡萄糖水解酶或者葡萄糖淀粉酶。它是一种作用于通过α-1，4键连接的D-吡喃葡萄糖多聚物的非还原末端以释放β-D-葡萄糖的酶。产自以下来源的葡聚糖1，4-α-葡萄糖苷酶是目前已知的真菌，如曲霉属、毛霉菌属、根霉属、piricularia属、茶毒菌属(thermomyce)和木霉属的真菌；酵母，如内孢霉属、酵母属的酵母；以及梭菌属的细菌。同α-淀粉酶类似，这种酶在淀粉的水解过程是一种重要的酶。因此，，该酶在广泛的领域中具有工业应用，这些领域包括葡萄糖、异构化糖以及寡糖的生产，以及酒类和发酵乙醇的生产。葡萄糖通常像下面这样从淀粉中生产。淀粉通过糊化(cooking)进行胶化。胶化的淀粉通过α-淀粉葡萄糖酶在约80℃下对其作用而液化。随后，通过用葡聚糖1，4-α-葡萄糖苷酶在55到60℃下作用而进行寡糖化。在高温下进行液化是因为胶化的淀粉高度的粘稠并且热稳定的α-淀粉葡萄糖酶已经被投入实际使用。选择55℃或更高的温度进行寡糖化以避免微生物的污染是较为理想的。但是，如果使用的为常用的产自真菌的酶，由于该酶的热稳定性，必须选择60℃或更低的温度。这样，由于它们的最佳温度彼此不同，同时进行液化和寡糖化的步骤是不可能的，这导致了能量成本的巨大浪费。α-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.20)为一种作用于非还原末端的α-葡萄糖苷键以释放α-D-葡萄糖的酶。该酶广泛存在于动物、植物和微生物中。α-葡萄糖苷酶根据如下的底物特异性分类为群体(1)至(3)(1)作用于种类广泛的不均一或均一的α-葡萄糖苷化合物的酶；(2)高度特异于α-1，4-寡葡萄糖并且对高分子量的葡聚糖和不均一葡萄糖苷的活性相对较弱的酶；(3)高度特异于α-1，4-葡萄糖苷键或者还作用于淀粉或糖原的酶。在这些酶中，属于群体(3)的酶通常被称为葡萄糖淀粉酶(“OyoKosogaku”，Tsujisakaetal.(eds)，Kodansha(1979)pp.56)。适应高温环境的嗜高温微生物生产高热稳定性的酶。已知一种嗜高热的古细菌激烈热球菌(Pyrococcusfurious)可以产生糖类水解酶，如α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、β-寡糖酶以及葡聚糖酶。这些酶中有几种的基因已被克隆(TheJournalofBiologicalChemistry，26824402-24407(1993)；TheJournalofBiologicalChemistry，27216335-16342(1997)；JournalofBacteriology，1723654-3660(1990)；JournalofBacteriology，1777105-7111(1995)；JournalofBacteriology，181284-290(1999))。然而，没有已知的产生葡聚糖1，4-α-葡萄糖苷酶或者高热稳定的葡聚糖1，4-α-葡萄糖苷酶的嗜高热微生物。进一步，由包括激烈热球菌在内的嗜高热微生物所产生的已知的α-葡萄糖苷酶仅仅作用于低分子量底物并且不消化高分子量的底物，如淀粉。发明目标本发明的主要目的为提供一种具有热稳定葡萄糖淀粉酶活性的有工业价值的多肽、编码所述的多肽的基因以及一种通过遗传工程产生所述的多肽的方法。发明概述本发明的概述如下。本发明的第一个方面涉及到一种多肽，该多肽具有SEQIDNO6的氨基酸序列或者一种在SEQIDNO6的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸删除、添加、插入和/或替换的氨基酸序列，并且该多肽具有热稳定葡萄糖淀粉酶活性。本发明的第二个方面涉及到一种编码第一个方面的多肽的核酸。本发明的第三个方面涉及到一种核酸，该核酸编码一种具有热稳定葡萄糖淀粉酶活性的多肽，该核酸能够在严苛条件下同第二个方面的核酸杂交。本发明的第四个方面涉及到一种重组DNA，该DNA含有第二或第三个方面的核酸。本发明的第五个方面涉及到一种转化子，该转化子被第四个方面的重组DNA所转化。本发明的第六个方面涉及到一种用于产生第一个方面的多肽的方法，该方法包括对第五个方面的转化子进行培养并且从培养物中收集具有具有热稳定葡萄糖淀粉酶活性的多肽。本发明的第七个方面涉及到一种用于产生葡萄糖的方法，该方法包括使第一个方面的多肽作用于通过α-1，4键连接的D-吡喃葡萄糖多聚物以释放β-D-葡萄糖。本发明的第八个方面涉及到一种用于产生寡糖的方法，该方法包括使第一个方面的多肽作用于通过α-1，4键连接的D-吡喃葡萄糖多聚物以释放寡糖。本发明的第九个方面涉及到一种用于制备环糊精的方法，该方法包括使第一个方面的多肽作用于通过α-1，4键连接的D-吡喃葡萄糖多聚物以释放环糊精。作为大量研究的结果，本发明的发明者已经发现激烈热球菌的基因组中存在一种编码新的多肽的基因。进一步，本发明者惊喜地发现，尽管该多肽的氨基酸序列只是同来自细菌的多种α-淀粉酶和环麦芽糖糊精葡聚糖转移酶的氨基酸序列具有高度同源性，但该多肽具有一种热稳定的葡萄糖淀粉酶活性。本发明者还进一步探索建立了一种用于通过遗传工程生产多肽的方法。由此，完成了本发明。附图概述图1所示为反应温度和本发明的多肽的葡萄糖淀粉酶活性之间的关系。图2所示为反应pH和本发明的多肽的葡萄糖淀粉酶活性之间的关系。图3所示为本发明的多肽在80℃的加热下的剩余葡萄糖淀粉酶活性。图4所示为本发明的多肽在95℃的加热下的剩余葡萄糖淀粉酶活性。图5所示为金属离子或者EDTA的浓度和本发明的多肽的葡萄糖淀粉酶活性之间的关系。图6所示为通过使相应的粗抽提物作用于麦芽五糖而获得的产物的组成。图7所示为通过使相应的粗抽提物作用于可溶淀粉而获得的产物的组成。发明详述1.本发明的多肽本发明的多肽具有SEQIDNO6的氨基酸序列或者一种在SEQIDNO6的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸删除、添加、插入和/或替换的氨基酸序列，并且该多肽具有热稳定葡萄糖淀粉酶活性。如本文所使用，葡萄糖淀粉酶活性指的是一种在非还原末端连续地水解多聚糖或者寡聚糖中的葡糖苷键以释放D-葡萄糖的活性，该多聚糖或者寡聚糖由D-吡喃葡萄糖通过α-1，4键连接而成。一种释放β-D-葡萄糖的酶被称为葡聚糖1，4-α-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.3)。一种释放α-D-葡萄糖的酶被称为α-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.20)。如本文所用，具有葡萄糖淀粉酶活性是指至少表现出两种催化活性中的一种。用于测定葡萄糖淀粉酶活性的方法通过已知的方法例示。这样的方法包括，一种使用直链淀粉作为底物的进行酶反应的方法，该方法根据Park&Johnson方法测定了还原性糖数量的增加，这样的方法还包括另一种方法，在该方法中根据一种使用葡萄糖氧化酶的的酶学方法来测定由相同的酶反应所释放的D-葡萄糖。本发明的多肽具有一种葡萄糖淀粉酶的活性。本发明的多肽还包括一些多肽，这些多肽除葡萄糖淀粉酶的活性之外还具有其它活性，如水解酶活性(例如，α-淀粉酶活性或者β-淀粉酶活性)或者糖基转移酶活性(例如，环麦芽糖糊精葡聚糖转移酶)。例如，具有SEQIDNO6的氨基酸序列的本发明的多肽具有一种糖基转移酶活性，这是因为当一种诸如麦芽糖、麦芽三糖或麦芽四糖这样的寡糖被用作为底物时该酶产生葡萄糖以及一种分子量高于作为底物的寡糖的产物。本发明的多肽具有一种热稳定葡萄糖淀粉酶活性。尽管并非意图限制本发明，“具有一种热稳定葡萄糖淀粉酶活性的”是指该多肽在70℃或更高的温度下表现出葡萄糖淀粉酶的活性，在优选的情况下在80℃或更高的温度下表现出该活性，在更优选的情况下在85℃或更高的温度下表现出该活性，最优选的情况下在90℃或更高的温度下表现出该活性。本发明的多肽包括一种多肽，该多肽所具有的氨基酸序列为在SEQIDNO6的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸残基的删除、添加、插入和/或替换，只要该酶具有一种热稳定葡萄糖淀粉酶活性便可。天然存在的多肽中可产生一种突变，如氨基酸序列中的氨基酸删除、插入、添加或替换。这样的突变的产生可能是由于编码该多肽的DNA的多形性或者突变，或者由于该多肽的体内修饰或合成之后在纯化中的修饰。然而，已知如果这样的突变存在于对于该多肽的活性或结构的维持不重要的部位时，这样的突变多肽可表现出生理或者生物活性，这些活性同没有突变的多肽的活性基本相同。在多肽的氨基酸序列中被人工引入这样的一种突变是可行的。在这种情况下，产生更多样的突变是可能的。例如，已知在人类白细胞介素-2(IL-2)的氨基酸序列中半胱氨酸被替换为丝氨酸的多肽还保持了白细胞介素-2活性(Science，2241431(1984))。进一步，已知特定的多肽具有对于其活性不可缺少的肽区域。这样的肽区域的例子为被分泌于细胞外的多肽的信号肽或者见于一种蛋白酶前体的前序列。多数这样的序列在翻译后或者转变为活性多肽时被除去。这样的多肽所具有的一级序列不同于不具备有待除去的区域的多肽，但是最终表现出相同的活性。具有SEQIDNO2的一种核苷酸序列的基因编码一种具有SEQIDNO1的氨基酸序列的多肽，该基因根据本发明而分离。该多肽具有一种热稳定葡萄糖淀粉酶活性。一种由19个氨基酸残基所组成的类似信号肽序列存在于所编码多肽的氨基末端。从该多肽中除去了该信号肽的多肽，即，具有SEQIDNO6的氨基酸序列的多肽，也具有热稳定葡萄糖淀粉酶活性。由此，本发明的多肽包括了上述两种多肽。当通过遗传工程产生一种多肽时，同目的多肽活性无关的一条肽链可被添加到该多肽的氨基末端或者羧基末端。例如，可以表达一种融合多肽以提高该目的多肽的表达水平，在该融合多肽中一种在所使用的宿主中高水平表达的多肽的氨基末端被添加于目的多肽的氨基末端。在另一情况下，一种对特定底物具有亲和性的的多肽可被添加于目的多肽的氨基或者羧基末端以有助于该表达多肽的纯化。如果该附加多肽不对该目的多肽的活性具有有害影响则可保留。如果需要可以进行加工，通过适当的处理而从目的多肽上除去附加多肽，例如通过蛋白酶的限制性消化。因此，具有在本文所披露的氨基酸序列(SEQIDNO1)中具有一个或多个氨基酸残基的删除、添加、插入和/或替换，氨基酸序列的多肽，如果具有热稳定葡糖淀粉酶活性，就包含在本发明中。本发明的多肽包括如下文实例所描述的突变体多肽，例如F206S、P142I、L337V、FS/PI以及FS/LV。本发明的多肽的产生可通过，例如，(1)从一种产生本发明的多肽的微生物体的培养物中纯化，或者(2)从含有编码本发明的多肽的核酸的转化子的培养物中纯化。(1)从一种产生本发明的多肽的微生物体的培养物中进行的纯化产生本发明的多肽的微生物体的例子如激烈热球菌DSM3638，该菌株可购自DeutscheMikroorgsnidmenundZellkulturenGmbH。该微生物在适于其生长的条件下培养。在优选的情况下使用可提高目的多肽的表达水平的培养条件。这些细胞中或培养基中所产生的目的多肽可根据用于纯化蛋白质的传统方法进行纯化。用于培养嗜高温生物的传统方法可被用于上述菌株的培养。向该培养基中添加入可被该菌株利用的营养物。例如，淀粉可被用作为碳源，并且胰蛋白胨、胃蛋白胨和酵母抽提物被用作为氮源。可向培养基中添加诸如镁盐、钠盐或铁盐这样的金属盐类作为微量元素。另外，例如使用人造海水制备培养基也是有利的。不含固体硫的澄清的培养基是理想的。通过使用这样的培养基，细胞的生长可很容易地通过测量培养物的浊度来监测。该培养可以是静置培养(standingculture)或者振荡培养(spinnerculture)。例如，可以使用在AppliedandEnvironmentalMicrobiology，552086-2088(1992)中所描述的透析培养。在通常情况下，该培养温度优选地为95℃。通常情况下，培养约16个小时后在培养物中积累了相当大量的多肽。根据所使用的菌株或者培养基的组成来决定培养条件以使该多肽的产量最高是优选的。为了获得多肽首先制备无细胞抽提物。该无细胞抽提的制备可通过，例如，通过离心、过滤或类似方法从培养物中收集细胞并随后破碎这些细胞来进行。可从超声、磨珠破碎、分解酶处理等方法中选出对于抽提目的酶具有高效的细胞破碎方法。如果该多肽被分泌入培养物的上清，则通过硫酸铵沉淀、超滤或类似方法浓缩培养物上清中的多肽。该浓缩多肽被用作为无细胞抽提物。可以使用传统上用于纯化蛋白的方法以从这样获得的无细胞抽提物中分离该多肽。例如，可综合使用硫酸铵沉淀、离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤层析及类似方法。(2)从含有编码本发明的多肽的核酸的转化子培养物中进行的纯化本发明的多肽可从含有编码本发明的多肽的核酸的重组DNA所转化的转化子中获得，例如，具有SEQIDNO2或7的核苷酸序列的核酸。具有SEQIDNO1的氨基酸序列的多肽使用具有SEQIDNO2的核苷酸序列的核酸进行生产。具有SEQIDNO6的氨基酸序列的多肽使用具有SEQIDNO7的核苷酸序列的核酸进行生产。用于转化的宿主并不限于特定的某种，其例子为在重组DNA领域中传统上使用的宿主，包括大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、酵母、丝状真菌、植物、动物、植物培养细胞以及动物培养细胞。例如，本发明的多肽可使用带有pSJ3231的大肠杆菌JM109而获得，pSJ3231中在lac启动子下游连接有具有SEQIDNO2的核苷酸序列的DNA。被pSJ3231转化的大肠杆菌JM109被命名并表示为大肠杆菌JM109/pSJ3231，于1999年7月30日(原始保存日期)根据布达佩斯协议保存于NationalInstituteofBioscienceandHuman-Technology，AgencyofIndustrialScienceandTechnology，MinistryofInternationalTradeandIndustry，1-3，Higashi1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，序列号为FERMBP-7196。该多肽可通过在传统培养条件下培养带有pSJ3231的大肠杆菌JM109而在培养细胞中表达，例如在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基(10g/l胰蛋白胨、5g/l酵母抽提物、5g/lNaCl，pH7.2)中在37℃下培养直至对数生长期，此时加入终浓度为0.2mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷并在37℃下继续培养。在培养后通过离心收集细胞，超声破碎，离心收集上清作为无细胞抽提物。该无细胞抽提物表现出热稳定的葡萄糖淀粉酶活性。本发明的多肽可使用已知的方法从无细胞抽提物中纯化，如离子交换层析、凝胶过滤层析、疏水层析和硫酸铵沉淀。在天然情况下，在上文所描述的加工过程中所获得的部分纯化的产物也表现出葡萄糖淀粉酶活性。由于在带有pSJ3231的大肠杆菌JM109中表达的本发明的多肽高度热稳定，为纯化该多肽，被培养的细胞和/或无细胞抽提物可被加热以除去来自宿主的热变性的不溶蛋白，例如，在80℃下进行10分钟的加热。另外，具有SEQIDNO6的氨基酸序列的本发明的多肽可以以类似的方式使用带有下文实施例所述的pET21amyCΔS大肠杆菌而获得。如上文所述，当本发明的多肽在正常温度下(例如，37℃)使用一种带有编码该多肽的核酸的转化子进行表达时，所产生的表达产物保持了活性、热稳定性和其它类似性质。这就是说，本发明的多肽即使在完全不同于原产生细胞的生长温度的温度下表达也具有其天然的高度有序的结构。下文所示为如上文描述所获得的本发明的多肽(例如，具有SEQIDNO6所描述的氨基酸序列的多肽)的一些酶学特征(1)作用本发明的多肽水解直链淀粉以产生葡萄糖和寡糖。另外，本发明的多肽还作用于直链淀粉以产生环糊精。(2)最佳温度在85-90℃下表现出最大活性。(3)最佳pH在pH5-6下表现出最大活性。(4)在存在CaCl2的情况下其稳定性增加。(5)该活性为EDTA所抑制。2.本发明的核酸本发明的核酸为一种编码上文所述的本发明的多肽的核酸。具体地，该核酸的例子为(1)编码一种多肽的核酸，该多肽具有SEQIDNO6的氨基酸序列或者在SEQIDNO6的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸删除、添加、插入和/或替换的氨基酸序列，并且该多肽具有热稳定的葡萄糖淀粉酶活性；(2)具有SEQIDNO7的核苷酸序列的核酸；以及(3)编码具有热稳定的葡萄糖淀粉酶活性的多肽的核酸，该核酸能够同(1)或者(2)的核酸在严苛的条件下杂交。如本文所使用，核酸指的是单链或者双链的DNA或RNA。例如，如果上文(2)的核酸为一种RNA，则该RNA为SEQIDNO7的核苷酸序列中将T替换成为U所形成的核苷酸序列。例如，本发明的核酸可如下获得。上文(2)的具有SEQIDNO7的核苷酸序列的核酸如下进行分离。根据传统方法从激烈热球菌DSM3638中获得基因组DNA，该激烈热球菌DSM3638为获得本发明的多肽如上文所述进行培养。该基因组DNA被用于构建DNA文库。该核酸可从该DNA文库中分离。该核酸也可通过使用该基因组DNA作为模板以聚合酶链反应(PCR)对具有SEQIDNO7的核苷酸序列的核酸进行扩增来获得。进一步，一种编码具有类似于本发明的多肽的热稳定的葡萄糖淀粉酶活性的多肽的核酸可在由本发明提供的编码本发明多肽的核酸核苷酸序列(例如，SEQIDNO7的核苷酸序列)的基础上获得。具体地，一种编码具有热稳定的葡萄糖淀粉酶活性的多肽的DNA可通过使用编码本发明的多肽的核酸或该核酸序列的一部分作为杂交探针而从细胞中提取出的DNA或者PCR产物中筛选，该PCR产物使用该DNA作为模板而获得。或者，编码一种具有热稳定的葡萄糖淀粉酶活性的多肽的DNA可使用诸如PCR这样的基因扩增方法进行扩增，该PCR使用基于上述的核苷酸序列而设计的引物进行。另外，可以化学合成编码具有热稳定的葡萄糖淀粉酶活性的多肽的DNA。上文(1)或(3)的核酸可根据这样的方法获得。可以根据上述方法获得仅仅含有目的核酸一部分的核酸片段。在这种情况下，完整的目的核酸序列可如下获得。所获得的核酸片段的核苷酸序列经测定以证实该片段为目的核酸的一部分。使用该核酸片段或其一部分作为探针进行杂交。或者，使用在该核酸片段的核苷酸序列的基础上合成的引物进行PCR。“在严苛条件下的进行杂交”指的是能够在T.Maniatisetal.(eds.)，MolecularCloningALaboratoryManual2nded.，ColdSpringHarborLaboratory(1989)中所描述的条件下进行杂交，例如在以下条件下杂交。将固定化有一种核酸的膜同一种探针在6×SSC(1×SSC0.15MNaCl，0.015M柠檬酸钠，pH7.0)中在50℃温浴12到50小时，该SSC中含有0.5％SDS、0.1％牛血清白蛋白(BSA)、0.1％聚乙烯吡咯烷(polyvinylpyrrilidone)、0.1％的Ficoll400以及0.01％的变性鲑鱼精核酸。温浴之后，在37℃下含有0.5％SDS的2×SSC中洗涤该膜，同时将SSC浓度降至0.1×而温度升至50℃直至固定化的核酸的信号可从背景中辨认，并且随后检测出该探针。这样获得的新核酸所编码的蛋白的活性如上文进行测定，由此证实了该核酸为目的核酸。如果使用了一种寡核苷酸探针，则“严苛条件”指的是，例如，在6×SSC，0.5％SDS，5×Denhardt′s以及0.01％的变性鲑鱼精核酸中[Tm-25℃]的温度下过夜保温，但该例并不是对本发明进行限制。寡核苷酸探针或引物的Tm的测定可通过，例如，根据以下方程进行Tm＝81.5-16.6(log10[Na+])+0.41(％G+C)-(600/N)，其中N为寡核苷酸探针或引物的链长；％G+C为寡核苷酸探中或引物中的鸟嘌呤和胞嘧啶残基含量。如果该寡核苷酸探中或引物的链长短于18个碱基，Tm可被估测为，例如，A+T(腺嘌呤或胸腺嘧啶)残基数同2(℃)的乘积与G+C残基数同4(℃)的乘积的和[(A+T)×2+(G+C)×4]。根据本发明，能够在严苛条件下同编码本发明的多肽的核酸进行杂交的核酸，在其编码一种具有热稳定的葡萄糖淀粉酶的情况下，即使其同本文所披露的核酸不具有相同的核苷酸序列也被本发明所涵盖。已知定义基因中的氨基酸的1到6个密码子(3个碱基的组合)被设定对应于每一个氨基酸。这样，一种特定的氨基酸序列可以由许多核酸编码，尽管这种情况依赖于氨基酸序列。核酸在自然状态下不一定稳定。核苷酸序列中突变的产生并不罕见。在一种核酸中产生的突变可能并不改变所编码的氨基酸序列(称之为沉默突变)。在这种情况下，可以说产生了编码同样的氨基酸序列的不同的核酸。这样，不可否认含有编码某种具体氨基酸序列的核酸的生物体可以在传代期间产生编码相同氨基酸序列的多种核酸。进一步，如果使用遗传工程闸门，人工产生多种编码相同的氨基酸序列的核酸并不困难。例如，如果在编码目的蛋白的原始核酸中使用的某种密码子为在遗传工程生产蛋白质所使用的宿主中使用频率较低的密码子时，该蛋白的表达可能会较低。在这种情况下，该密码子可在不改变所编码的目的氨基酸序列的情况下被人工转化为一种在宿主中被频繁使用的密码子，其目的在于提高该目的蛋白的表达水平(例如，JP-B7-102146)。如上文所述，编码某一特定氨基酸序列的多种核酸理所当然可被人工制备。这些核酸也可在自然状态下产生。编码本发明的多肽的核酸(例如，一种具有SEQIDNO7的核苷酸序列的核酸)可被连接于一种适当的载体以构建一种重组DNA。用于该重组DNA的构建的载体并不受具体限制。例如，可以使用质粒载体、噬菌体载体和病毒载体。可以选择用于该重组DNA目的的适当的载体。进一步，一种重组子可以通过向适当的宿主引入该重组DNA来产生。用于产生该转化子的宿主并不受具体限制。可以使用诸如细菌、酵母以及丝状真菌这样的微生物以及来自哺乳类、植物、昆虫及类似生物的的培养细胞。本发明的多肽可通过培养该转化子以在培养物中产生本发明的多肽而批量生产。3.使用本发明的多肽生产葡萄糖、寡糖或环糊精的方法通过使用本发明的多肽可从以α-1，4键连接的D-吡喃葡萄糖多聚物中释放D-葡萄糖。根据本发明，以α-1，4键连接的D-吡喃葡萄糖多聚物中的吡喃葡萄糖的聚合度并不受具体限制。麦芽糖、直链淀粉和淀粉被包括在内。根据本发明，以α-1，4键连接的D-吡喃葡萄糖多聚物，在分子中也包括一种含有不同于α-1，4键的键(例如，α-1，6键)或含有除D-葡萄糖之外的糖(例如，果糖)的多聚物。具有SEQIDNO1的序列的本发明多肽是高度热稳定的。这样，该多肽可高效地消化底物，这部分是由于在加热下底物的构象和物理特性的变化一起发生的协同作用所导致。具体的反应条件的例子如下。如果使用的为具有SEQIDNO1的氨基酸序列的多肽，则可通过将该多肽同底物在50mM乙酸钠缓冲液(pH5.5)中在80℃下进行反应来释放D-葡萄糖。自然条件下最佳反应条件可根据底物类型(淀粉、麦芽糖等)而变化。用于产生本发明的葡萄糖的方法中使用的多肽并不拘于一种分离以及纯化的多肽。也可使用粗分或者部分分离的多肽，只要其对于葡萄糖的产生无有害影响。本发明的多肽可以以游离状态加入底物溶液。然而，如果该多肽被固定化于一种适当的载体并与底物进行反应，则该多肽在反应完成后可以容易地回收。进一步，通过将诸如α-淀粉酶这样的热稳定的酶同本发明的多肽共同使用，可以将淀粉高效消化成为D-葡萄糖。进一步，本发明的多肽可被用于产生寡糖以及环糊精。寡糖或者环糊精可通过在适当条件下以淀粉、直链淀粉或者适当的寡糖作为本发明的多肽的底物，如上所述进行反应而产生。自然地，该反应条件可根据目的产物的类型而适当地调节。根据本发明的方法所获得的寡糖的例子为从麦芽糖(G2)到麦芽八糖(G8)的麦芽寡糖。根据本发明的方法而获得的环糊精的例子为α-环糊精、β-环糊精以及γ-环糊精。实施例以下的实施例进一步详细阐明了本发明，但并不应被解释为对其范围的限制。在本文所述的程序中，包括质粒DNA的制备以及限制性酶消化在内的基础程序如在MolecularCloningALaboratoryManual2nded.(如上述)中描述的那样进行。除非另外说明，大肠杆菌JM109被用作为构建使用大肠杆菌的质粒的宿主。被转化的大肠杆菌细胞使用含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB培养基(1％胰蛋白胨，0.5％酵母抽提物，0.5％NaCl，pH7.0)或者通过向LB培养基中加入浓度1.5％的琼脂并固化所产生的混合物而制备的LB平板，在37℃下进行通气培养。实施例1编码具有葡萄糖淀粉酶活性的多肽的基因的分离(1)激烈热球菌中基因组DNA的制备激烈热球菌DSM3638(购自DeutscheSammlungMikroorgsnidmenundZellkulturenGmbH)进行如下培养。含有1％胰蛋白胨(DifcoLaboratories)，0.5％酵母抽提物(DifcoLaboratories)，1％可溶淀粉(NacalaiTesque)，3.5％JamarineSSolid(JamarineLaboratory)，0.5％JamarineSliquid(JamarineLaboratory)，0.003％MgSO4，0.001％NaCl，0.0001％FeSO4·7H2O，0.0001％CoSO4，0.0001％CaCl2·7H2O，0.0001％ZnSO4，0.1ppmCuSO4·5H2O，0.1ppmKAl(SO4)2，0.1ppmH3BO3，0.1ppmNa2MoO4·2H2O，0.25ppmNiCl2·6H2O的2升培养基被置于一个2升的培养基瓶，在120℃下灭菌20分钟，并且以氮气充气以除去溶解的氧。随后，上述菌株被接种入该培养基并且在95℃下静置培养16小时。培养之后，通过离心收集细胞。随后在含有25％蔗糖的50mMTris-HCl(pH8.0)中悬浮所得到的细胞。向该悬浮物中加入2ml0.2MEDTA和0.8ml溶菌酶(5mg/ml)。在20℃下对该混合物保温1小时。随后向该混合物中加入24ml的SET溶液(150mMNaCl，1mMEDTA，20mMTris-HCl，pH8.0)、4ml5％的SDS以及400μl蛋白酶K(10mg/ml)。随后在37℃下进一步温育1小时。通过以酚-氯仿抽提该混合物而终止该反应。随后进行乙醇沉淀而获得基因组DNA。(2)含有编码具有葡萄糖淀粉酶活性的多肽的基因的DNA片段的制备在激烈热球菌基因组的基础上合成具有SEQIDNO3的核苷酸序列的寡核苷酸am1-F1以及具有SEQIDNO4的核苷酸序列的寡核苷酸AMY-2N。使用这两种寡核苷酸作为引物并且使用上述的基因组DNA作为模板进行PCR。该PCR根据附于TakaraExTaq(TakaraShuro)的方案如下进行94℃下0.5分钟，55℃下1分钟以及72℃下5分钟，如此进行30个循环。对该反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳。从该凝胶中提取约3.5kb的扩增DNA片段并进行纯化。约3.5kb的被扩增DNA片段的核苷酸序列如SEQIDNO5所示。(3)重组质粒pSJ3231的构建以XbaI和SphI(均来自于TakaraShuro)消化在(2)中获得的约3.5kb的被扩增DNA片段，并对其进行琼脂糖凝胶电泳。一种含有目的基因的约2.3kb的DNA片段随后被提取并且纯化。在另一方面，以XbaI和SphI消化质粒载体pUC19(TakaraShuro)并且以碱性磷酸酶(TakaraShuro)进行去磷酸化。使用DNA连接酶(TakaraShuro)连接这两种DNA片段。连接产物被用于转化大肠杆菌JM109(TakaraShuro)。从所产生的转化子中选出几个转化子，并且测定各转化子中携带的质粒DNA中所插入的DNA片段的大小。具有约2.3kb的DNA片段的质粒被纯化。测定由此获得的质粒DNA的核苷酸序列。由此获得了具有来自上述的3.5kbDNA片段并且具有SEQIDNO2的核苷酸序列的DNA的质粒pSJ3231。携带有pSJ3231的大肠杆菌JM109被命名为大肠杆菌JM109/pSJ3231。实施例2多肽的产生(1)多肽的表达在实施例1(3)中制备的携带pSJ3231的大肠杆菌JM109或者携带作为载体对照的pUC19的大肠杆菌JM109，被分别接种于含有100μg/ml氨苄青霉素的5mlLB培养基并且在37℃下通气过夜培养。该培养物以1％的浓度被接种于20ml相同的新鲜培养基中并且在37℃下通气培养。当浊度达到OD600＝0.4到0.7时加入终浓度为0.2mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG，TakaraShuzo)。这些细胞被进一步过夜培养。培养之后，通过离心收集这些细胞，悬浮于0.5ml50mM的乙酸钠缓冲液(pH5.5)，通过超声进行破碎并且在80℃下处理10分钟。使用Ultrafree-MC(Millpore)将通过离心所获得的上清浓缩20倍并将其用作为下文活性测定的无细胞抽提物。将5μl的无细胞抽提物同等体积的2×样品缓冲液相混合(125mMTris-HCl(pH6.8)，4％SDS，20％甘油，0.005％溴酚蓝)。用该混合物进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，在分离胶中含有0.1％的可溶淀粉，根据传统方法进行电泳。在电泳之后，在50mM的乙酸钠(pH5.5)中室温下洗涤该凝胶3次，每次5分钟，并且在同样的缓冲液中80℃下反应1.5小时。反应之后，以水简短洗涤该凝胶并且以碘溶液(含有10mMI2和1％KI的水溶液)进行染色。结果，从携带pUC19的大肠杆菌JM109所制备的无细胞抽提物中没有观察到淀粉的消化。在另一方面，在由携带pSJ3231的大肠杆菌JM109所制备的无细胞抽提物的凝胶中观察到由于淀粉的消化所产生的澄清的带。通过添加0.2mMIPTG所获得的样品的带比不添加IPTG而获得的样品的带更为明显。这些结果表明，在携带pSJ3231的大肠杆菌JM109中表达的多肽具有消化淀粉的活性。(2)淀粉经所表达的多肽的作用而水解产生的产物的鉴定在鉴定之前，如下制备表达的多肽。将携带pSJ3231的大肠杆菌JM109接种于20ml含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB培养基，并且在37℃过夜培养。该培养物被接种于1升相同的培养基中并且在37℃下培养直至浊度达到OD600＝0.5。此时加入终浓度为0.2mM的IPTG。这些细胞被进一步过夜培养。通过离心收集这些细胞，悬浮于40ml50mM的乙酸钠缓冲液(pH5.5)，通过超声进行破碎并且在80℃下处理10分钟。随后通过离心获得上清。向该上清中加入硫酸铵直至60％饱和度。在4℃下搅拌该混合物过夜。将通过离心所收集的沉淀溶解于1ml乙酸缓冲液并且以同样的缓冲液进行透析。透析之后所获得的沉淀被悬浮于200μl的该缓冲液中。该悬浮液在随后的实验中被用作为表达多肽的悬浮液。该表达多肽水解淀粉的活性如下进行鉴定。该表达多肽被用于具体地作用于多种底物。随后在薄板层析中鉴定产物。将20μl含有浓度为5％的可溶淀粉(NacalaiTesque)的水溶液或者含有浓度为5％直链淀粉(NacalaiTesque)的水悬浮物，20μl该表达多肽悬浮物，10μl500mM乙酸钠缓冲液(pH5.5)以及50μl水在一起混合。该混合物在80℃下反应17小时。将2μl该反应混合物用于硅胶薄板层析，该层析使用SilicaGel60F254(Merck)作为薄层板并且使用乙醇∶1-丙醇∶水＝5∶5∶3作为展层溶剂。为证实来自底物的产物，在展层之后用一种地衣酚-硫酸试剂[通过将400mg地衣酚(Sigma)溶于22.8ml硫酸并随即加水至总体积200ml而制备]或者硝酸银氨试剂(等体积0.1M硝酸银和5N氨水的混合物)对该薄层板进行喷洒，并且在一热平板上进行加热以观察样点。其结果，使用可溶性淀粉或者直链淀粉作为底物，通过表达多肽的作用产生了葡萄糖。在参照组实验中未观察到葡萄糖，在该参照组中，表达多肽或者底物被单独使用。除使用一种被硼氢化钠还原的底物并且反应时间为0，1，3，5.5或23小时之外，以类似上文所述的方式进行一个反应。该底物如下进行还原。将200mg淀粉或者直链淀粉悬浮于1ml水中并通过加热溶解。该溶液被稀释至体积4.5ml。在冰上冷却所产生的溶液。随后缓缓加入0.5ml冰冷的1.5％硼氢化钠。所产生的混合物在25℃下反应1小时。随后加入0.1ml丙酮。在室温下静置该混合物20分钟并且随后使用1N乙酸钠进行中和。所产生的混合物并用作为底物溶液。根据Park&Johnson方法测量在该反应混合物中含有的还原性糖的量。简略的讲，将10μl经适当稀释的反应混合物、40μl水、50μl碳酸氰溶液以及50μl的0.05％铁氰化钾水溶液一起混合并在沸水浴中反应15分钟。通过将5.3g氰化钠以及0.65g氰化钾溶于1升水中，制备碳酸氰溶液。将75μl该反应混合物同125μl的硫酸铁铵溶液混合。该硫酸铁铵溶液通过将1.5g硫酸铁铵以及1gSDS溶于1升0.15N的硫酸而制备。将所产生的混合物在室温下静置15分钟。随后测量在690nm下的吸收。根据使用已知浓度的葡萄糖而制备的校准曲线测定还原性末端的量以作为对应的葡萄糖的量。另外，使用GlucoseTestWako(WakoPureChemicalIndustries)测定在反应混合物中的葡萄糖的量。其结果，还原性糖以及葡萄糖的量随着反应时间的进行而增加。由此，这表明本发明的多肽具有葡萄糖淀粉酶活性。实施例3多肽的酶学特征(1)粗抽提物的制备将携带pSJ3231的大肠杆菌JM109接种于20ml含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB培养基，并且在37℃过夜培养。该培养物被接种于1升相同的培养基中并且在37℃下振荡培养直至浊度达到OD600＝0.5。此时加入终浓度为0.2mM的IPTG。这些细胞被进一步过夜培养。通过离心收集这些细胞，悬浮于75ml50mM的乙酸钠缓冲液(pH5.5)并进行超声。在80℃下处理10分钟通过离心该超声悬浮物而获得的上清。随后通过离心除去所产生的不溶物质以获得上清。向该上清中加入硫酸铵直至60％饱和度。在4℃下搅拌该混合物5小时。将通过离心所收集的沉淀悬浮于1ml乙酸缓冲液并且以同样的缓冲液进行透析。通过离心所获得的上清在随后的实验中被用作为粗抽提物。(2)对反应温度的依赖性向10μl实施例3-(1)中制备的粗抽提物中加入麦芽三糖(终浓度为1％)、CaCl2(终浓度为1mM)以及乙酸钠缓冲液(终浓度为50mM)，并将总体积调至50μl。在40、60、70、80、85、90、95或者100℃下反应1小时。通过使用GlucoseTestWako测量该反应混合物中葡萄糖的量来测定本发明多肽的葡萄糖淀粉酶活性。其结果，本发明的多肽在85到90℃下表现出最大活性。这些结果见图1。图1所示为本发明的多肽的葡萄糖淀粉酶活性同反应温度之间的关系。横轴代表反应温度(℃)，纵轴代表葡萄糖淀粉酶活性(相对值，％)。(3)对反应pH的依赖性向10μl实施例3-(1)中制备的粗抽提物中加入麦芽三糖(终浓度为1％)和一种缓冲液(乙酸钠、MES-NaOH、磷酸钠、Tris-HCl或者甘氨酸-NaOH；终浓度为50mM)，并将总体积调至50μl。该混合物在80℃下反应1小时。在80℃下调节各缓冲液的pH值。通过使用GlucoseTestWako测量该反应混合物中葡萄糖的量来测定本发明多肽的葡萄糖淀粉酶活性。其结果，本发明的多肽在pH5到6时表现出最大活性。这些结果见图2。图2所示为本发明的多肽的葡萄糖淀粉酶活性同反应pH之间的关系。横轴代表反应pH，纵轴代表葡萄糖淀粉酶活性(相对值，％)。在图2中，空心圆(○)、实心圆(●)、空心方块(□)、实心方块(■)以及空心三角(△)分别代表乙酸钠缓冲液、MES-NaOH缓冲液、磷酸钠缓冲液、Tris-HCl缓冲液以及甘氨酸-NaOH的结果。(4)热稳定性向实施例3-(1)中制备的粗抽提物中加入等体积的50mM乙酸钠缓冲液(pH5.5)、含有2mMEDTA或者2mMCaCl2的相同缓冲液。在80或者95℃下加热混合物1、5或者24小时。向30μl加热混合物中加入麦芽三糖(终浓度为1％)、CaCl2(终浓度为1mM)以及乙酸钠缓冲液(终浓度为50mM)，并将总体积调至50μl。混合物在80℃下反应1小时。通过使用GlucoseTestWako测量该反应混合物中葡萄糖的量来测定相对于未经加热处理的粗抽提物的残余活性。其结果，该粗抽提物在缺乏EDTA的条件下在80℃加热24小时后几乎观察不到失活。当该粗抽提物在95℃下加热的情况时，在不加入CaCl2的情况下加热一小时后多数活性失去。在另一方面，在加入浓度为1mM的CaCl2的情况下加热5小时观察不到失活，而在加热24小时后观察到了轻微的残余活性。这些结果见于图3和4。图3和4所示分别为本发明的多肽在80℃和90℃下加热后的残余葡萄糖淀粉酶活性。横轴代表热处理时间(小时)，纵轴代表残余葡萄糖淀粉酶活性(％)。在图3和4中，空心圆(○)、实心圆(●)以及空心方块(□)分别代表在不加入EDTA或者CaCl2情况下、在加入1mMEDTA的情况下以及在加入1mMCaCl2情况下进行加热的结果。另外，当在存在10mMCaCl2的情况下在95℃下加热24小时后测定残余活性时，与上文所述方式类似，几乎保留了100％的活性。(5)pH稳定性向20μl实施例3-(1)中制备的粗抽提物中加入20μl的100mM缓冲液(乙酸钠、MES-NaOH、磷酸钠、Tris-HCl或者甘氨酸-NaOH)。在80℃下加热该混合物10分钟。向30μl该加热后的混合物中加入麦芽三糖(终浓度为1％)和乙酸钠缓冲液液(终浓度为50mM)，并将总体积调至50μl。该混合物在80℃下反应1小时。通过使用GlucoseTestWako测量该反应混合物中葡萄糖的量来测定的相对于未经加热处理的粗抽提物的残余活性。其结果，在pH5到9进行加热后，保留了50％或者更多的活性。(6)金属离子的影响向10μl实施例3-(1)中制备的粗抽提物中加入麦芽三糖(终浓度为1％)，乙酸钠缓冲液(pH5.5，终浓度为50mM)以及CoCl2、CaCl2、CuSO4、FeCl2、ZnCl2、MgCl2或者EDTA(终浓度0、0.5、1、2或者10mM)，并将总体积调至50μl。该混合物在80℃下反应1小时。通过使用GlucoseTestWako测量该反应混合物中葡萄糖的量来测定本发明多肽的葡萄糖淀粉酶活性。其结果，本发明的多肽的葡萄糖淀粉酶活性并不明显受到浓度为0.5、1、2或者10mM的CoCl2、CaCl2、FeCl2或者MgCl2的影响。该活性被浓度为2mM的CuSO4或ZnCl2或者0.5mM的EDTA完全抑制。这些结果见图5。图5所示为金属离子或者EDTA的浓度与本发明多肽的葡萄糖淀粉酶活性之间的关系。横轴代表所加入的金属离子或者EDTA的浓度，纵轴代表葡萄糖淀粉酶活性(相对值，％)。在图5中空心圆(○)、实心圆(●)、空心方块(□)、实心方块(■)、空心三角(△)、实心三角(▲)以及星号(*)分别代表添加CoCl2、CaCl2、CuSO4、FeCl2、ZnCl2、MgCl2或者EDTA的结果。实施例4突变体多肽的性质(1)重组质粒pET21amyCΔS的构建合成具有SEQIDNO8的核苷酸序列的寡核苷酸PX253-01以及具有SEQIDNO9的核苷酸序列的寡核苷酸R4。使用这两种寡核苷酸作为引物以及pSJ3231作为模板进行PCR。该PCR根据附于TaKaRaExTaq的方案进行如下进行30个循环，每个循环包括在94℃下进行0.5分钟、在55℃下进行0.5分钟以及在72℃下进行2分钟。通过乙醇沉淀从该反应混合物中回收DNA，以NcoI和EcoRI(均来自TaKaRaShuzo)对其进行消化并随后进行琼脂糖凝胶电泳。从凝胶中抽提和纯化出一个约1.0kb的DNA片段。使用T4连接酶将该DNA片段同经NcoI和EcoRI消化的pET21d(Novagen)进行连接。该连接混合物被用于转化大肠杆菌JM109。从所产生的转化子中制备质粒以获得pRH03。该约1.0kb的DNA被插入了pRH03。当进行核苷酸序列的测定时显示该片段含有一个被NcoI识别的CCATGG，随后的序列为SEQIDNO7的核苷酸序列的位置2的C到位置1048的C的序列。以Af1II和SacI(均来自TaKaRaShuzo)消化在实施例1-(2)中制备的约3.5kb的扩增DNA片段并进行琼脂糖凝胶电泳。从凝胶中抽提并纯化出一个约1.8kb的DNA片段。使用T4连接酶将该DNA片段同经Af1II和SacI消化的pRH03进行连接。该连接混合物被用于转化大肠杆菌JM109。从所产生的转化子中制备质粒以获得pET21amyCΔS。当进行核苷酸序列的测定时显示该质粒含有具有SEQIDNO7的核苷酸序列的多聚核苷酸，并且该核苷酸序列编码一种具有SEQIDNO6的氨基酸序列的多肽。(2)突变体多肽的表达质粒的构建合成了以下的寡核苷酸一种具有SEQIDNO10的核苷酸序列的寡核苷酸F206S-F；一种具有SEQIDNO11的核苷酸序列的寡核苷酸F206S-R；一种具有SEQIDNO12的核苷酸序列的寡核苷酸P142I-F；一种具有SEQIDNO13的核苷酸序列的寡核苷酸P142I-R；一种具有SEQIDNO14的核苷酸序列的寡核苷酸L337V-F；一种具有SEQIDNO15的核苷酸序列的寡核苷酸L337V-R；一种具有SEQIDNO16的核苷酸序列的寡核苷酸F2；一种具有SEQIDNO17的核苷酸序列的寡核苷酸F3；一种具有SEQIDNO18的核苷酸序列的寡核苷酸AN2R1F2；一种具有SEQIDNO19的核苷酸序列的寡核苷酸R5；以及一种具有SEQIDNO20的核苷酸序列的寡核苷酸R6。使用pSJ3231作为模板并且以表1所示的寡核苷酸作为引物进行PCR。该PCR根据附于TaKaRaExTaq的方案进行如下进行20个循环，每个循环包括在94℃下进行0.5分钟、在55℃下进行0.5分钟以及在72℃下进行1分钟。以该PCR反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳。从凝胶中抽提并纯化具有表1所示的链长的DNA片段。表1反应FS-FFS-RPI-FPI-RLV-FLV-R引物1F206S-FF206S-RP142I-FP142I-RL337V-FL337V-R引物2R5F2R6AN2-R1F2R4F3链长(bp)约400约260约290约260约300350如上文所述纯化的被扩增DNA片段被用于以下的PCR。使用纯化的DNA片段作为模板同表2所示的引物进行组合，进一步进行PCR。表2所示的“模板1”和“模板2”对应于表1中的“反应”，表示来自表1所示的反应的DNA片段在表2所示的反应中被用作为模板。该PCR根据附于TaKaRaExTaq的方案进行如下进行10个循环，每个循环包括在94℃下进行0.5分钟、在55℃下进行0.5分钟以及在72℃下进行1分钟。以该PCR反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳。从凝胶中抽提并纯化具有表2所示的链长的DNA片段。表2反应FSPILV模板1FS-FPI-FLV-F模板2FS-RPI-RLV-R引物1F2AN2-R1F2F3引物2R5R6R4链长(bp)约650约530约640以Af1II和NdeI(TaKaRaShuzo)消化来自表2中反应FS的DNA片段并进行琼脂糖凝胶电泳。从凝胶中抽提并纯化出一个约320bp的DNA片段。使用T4连接酶将该DNA片段同经Af1II和NdeI消化的pET21amyCΔS进行连接。该连接混合物被用于转化大肠杆菌JM109。从所产生的转化子中制备质粒以获得pamyCΔS-F206S。当进行pamyCΔS-F206S的核苷酸序列的测定时显示该质粒编码一种具有SEQIDNO6的氨基酸序列的多肽，该多肽在该序列的位置187的Phe(对应于SEQIDNO1的氨基酸序列中的位置206)被Ser替换。该突变体被命名为F206S。以Ba1I和Af1II(TaKaRaShuzo)消化来自表2中反应PI的DNA片段并进行琼脂糖凝胶电泳。从凝胶中抽提并纯化出一个约280bp的DNA片段。使用T4连接酶将该DNA片段同经Ba1I和Af1II消化的pET21amyCΔS进行连接。该连接混合物被用于转化大肠杆菌JM109。从所产生的转化子中制备质粒以获得pamyCΔS-P142I。当进行pamyCΔS-P142I的核苷酸序列的测定时显示该质粒编码一种具有SEQIDNO6的氨基酸序列的多肽，该多肽在该序列的位置123的Pro(对应于SEQIDNO1的氨基酸序列中的位置142)被Ile替换。该突变体被命名为P142I。以NdeI和EcoRI(TaKaRaShuzo)消化来自表2中反应LV的DNA片段并进行琼脂糖凝胶电泳。从凝胶中抽提并纯化出一个约170bp的DNA片段。使用T4连接酶将该DNA片段同经NdeI和EcoRI消化的pET21amyCΔS进行连接。该连接混合物被用于转化大肠杆菌JM109。从所产生的转化子中制备质粒以获得pamyCΔS-L337V。当进行pamyCΔSL337V的核苷酸序列的测定时显示该质粒编码一种具有SEQIDNO6的氨基酸序列的多肽，该多肽在该序列的位置318的Leu(对应于SEQIDNO1的氨基酸序列中的位置337)被Val替换。该突变体被命名为L337V。(3)野生型和突变体多肽的产生以pETamyCΔS、pamyCΔS-F206S、pamyCΔS-P142I或pamyCΔS-L337V对大肠杆菌BL21(DE3)进行转化。所产生的各转化子接种于20ml含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB培养基并且在37℃下通气过夜培养。培养之后，通过离心收集细胞，悬浮于0.8ml的50mM乙酸钠缓冲液(pH5.5)中，通过超声进行破碎并且在80℃下处理30分钟。通过离心所收集的上清用作为粗抽提物。此后，来自分别以pETamyCΔS、pamyCΔS-F206S、pamyCΔS-P142I和pamyCΔS-L337V进行转化的大肠杆菌BL21(DE3)的粗抽提物，分别被称为粗抽提物WT、粗抽提物F206S、粗抽提物P142I、粗抽提物L337V。(4)以野生型和突变体多肽进行的对麦芽寡糖的消化向10μl实施例4-(3)中制备的粗抽提物中加入麦芽三糖(终浓度为1％)、乙酸钠缓冲液(pH5.5，终浓度为50mM)以及CaCl2(终浓度为1mM)，并将总体积调至50μl。该混合物在80℃下反应1小时。通过使用GlucoseTestWako测量该反应混合物中葡萄糖的量来测定这些粗抽提物中含有的本发明多肽的葡萄糖淀粉酶活性。其结果，如果粗抽提物WT的葡萄糖淀粉酶活性被定义为1，则粗抽提物F206S、粗抽提物P142I以及粗抽提物L337V的葡萄糖淀粉酶活性经测定分别为2.08、0.55以及0.30。使用麦芽五糖代替麦芽三糖进行类似的反应。其结果，如果粗抽提物WT的葡萄糖淀粉酶活性被定义为1，则粗抽提物F206S、粗抽提物P142I以及粗抽提物L337V的葡萄糖淀粉酶活性经测定分别为1.92、0.53以及0.37。向35μl上文所述的使用麦芽五糖作为底物的反应混合物中加入65μl的乙腈并进行混合。对该混合物进行离心以除去不溶物质。使用PalpakTypeS通过正相HPLC对该样品中含有的寡糖组成进行分析。对于流动相使用65％的乙腈。流速为1ml/分钟并且柱温为40℃。使用差示折射检测仪ShodexRI-71(ShoeaDenko)进行检测。向35μl含有浓度为0.1％的葡萄糖(NacalaiTesque)、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽五糖或者麦芽七糖(SeikagakuCorporation)的各水溶液中加入65μl的乙腈。使用通过离心混合物所获得的上清作为标准。这些标准的保留时间如下5.6分钟(葡萄糖)、7.3分钟(麦芽糖)、9.7分钟(麦芽三糖)、17.8分钟(麦芽五糖)以及30.7分钟(麦芽七糖)。其结果表明，使各粗抽提物作用于麦芽五糖期间，产生了聚合度为1到8的麦芽寡糖。这些结果见图6。图6所示为通过使各粗抽提物作用于麦芽五糖而获得的产物的组成。横轴代表产物(G1葡萄糖，G2麦芽糖，G3麦芽三糖，G4麦芽四糖，G5麦芽五糖，G6麦芽六糖G7麦芽七糖，G8麦芽八糖)，纵轴代表反应混合物中产物的浓度(对应于葡萄糖的浓度；μM)。在图6中，空心圆(○)、实心圆(●)、空心方块(□)、实心方块(■)分别代表粗抽提物WT、粗抽提物F206S、粗抽提物P142I以及粗抽提物L337V的结果。如上所述使用HPLC测定的所产生的葡萄糖的量同使用GlucoseTestWako获得的结果不一致。这被认为是由于在HPLC中在葡萄糖的位置洗脱了一个溶剂峰，由此对葡萄糖的测量包含了误差。(5)以野生型和突变体多肽进行的对淀粉的消化根据在名为“嗜高温α-淀粉酶基因(Hyperthermostableα-amylasegene)”的JP-A7-143880中的实施例3中所描述的方法制备一种嗜高温α-淀粉酶制备物。使用了如下体积的粗抽提物F206S以及嗜高温α-淀粉酶制备物40μlhe和0μl(反应1)；30μl和10μl(反应2)；20μl和20μl(反应3)；10μl和30μl(反应4)；0μl和40μl(反应5)。对其加入可溶性淀粉(NacalaiTesque；终浓度为2％)，乙酸钠缓冲液(pH5.5；终浓度为50mM)以及CaCl2(终浓度为1mM)，将总体积调至200μl。该混合物在80℃下过夜反应。如实施例4-(4)所述通过正相HPLC分析反应混合物中的寡糖。同单独使用嗜高温α-淀粉酶制备物或者粗抽提物F206S所获得的结果相比，葡萄糖、麦芽糖和麦芽三糖浓度的总量(作为相对应葡萄糖的浓度)，在结合使用这些酶的情况下更大，所述的三种糖通常可被酵母进行酒精发酵。结果见图7。图7所示为通过以下各粗抽提物作用于可溶淀粉所获得的产物的组成。横轴代表产物(G5麦芽五糖；其它见图6描述)，纵轴代表该产物在反应混合物中的浓度(作为相对应葡萄糖的浓度；μM)。图7中空心圆(○)、空心三角(△)、空心方块(□)、实心三角(▲)以及实心圆(●)分别代表反应1、反应2、反应3、反应4和反应5。(6)本发明的多肽合成环糊精的活性向50μl实施例4-(5)的反应1的反应混合物中加入2个单位来自雪白曲霉(SeikagakuCorporation)的葡萄糖淀粉酶。该混合物在37℃下反应3小时。当如实施例4-(4)所述通过普通相HPLC分析反应混合物时，观察到的峰同在α-环糊精(CD)、β-CD和γ-CD(SeikagakuCorporation)中所观察到的峰具有相同的保留时间。α-CD、β-CD和γ-CD的保留时间分别为12.3分钟、15.2分钟和19.7分钟。收集对应于这些峰的级分并进行在正离子模式下使用三阶四极质谱仪(triplestagequadrupolemassspectometer)API300(Perkin-ElmerSciex)进行分析。其结果，来自各峰的样品产生了同α-CD、β-CD和γ-CD相同的质谱图。由此表明粗抽提物F206S所含有的本发明的多肽具有合成CD的活性。(7)双突变多肽的表达载体的构建以PstI(TaKaRaShuzo)和Af1II消化pamyCΔS-F206S并且进行琼脂糖凝胶电泳。为获得DNA1，从凝胶中抽提并纯化出一种约3.1kb的DNA片段。以PstI和Af1II消化pamyCΔS-P142I并且进行琼脂糖凝胶电泳。为获得DNA2，从凝胶中抽提并纯化出一种约4.6kb的DNA片段。以PstI和NdeI消化pamyCΔS-F206S并且进行琼脂糖凝胶电泳。为获得DNA3，从凝胶中抽提并纯化出一种约4.9kb的DNA片段。以PstI和NdeI消化pamyCΔS-L337V并且进行琼脂糖凝胶电泳。为获得DNA4，从凝胶中抽提并纯化出一种约2.8kb的DNA片段。使用T4连接酶对DNA1和DNA2进行互相连接。该连接混合物被用于转化大肠杆菌HB101(TaKaRaShuzo)。从转化子中获得了一种质粒pamyCΔS-F206S/P142I。检测该pamyCΔS-F206S/P142IDNA的核苷酸序列，表明该质粒编码一种具有SEQIDNO6的氨基酸序列的多肽，该多肽在该序列的位置187的Phe被Ser替换，位置123的Pro被Ile替换。该突变体被命名为FS/PI。使用T4连接酶对DNA3和DNA4进行互相连接。该连接混合物被用于转化大肠杆菌HB101。从转化子中获得了一种质粒pamyCΔS-F206S/L337V。检测该pamyCΔS-F206S/L337VDNA的核苷酸序列，表明该质粒编码一种具有SEQIDNO6的氨基酸序列的多肽，该多肽在该序列的位置187的Phe被Ser替换，位置318的Leu被Val替换。该突变体被命名为FS/LV。(8)双突变多肽的性质以pamyCΔS-F206S/P142I或者pamyCΔS-F206S/L337V转化大肠杆菌BL21(DE3)。如实施例4-(3)的描述使用这些转化子获得了粗抽提物FS/PI以及粗抽提物FS/LV。向20μl的粗抽提物WT、粗抽提物F206S(均在实施例4-(3)中制备)、粗抽提物FS/PI或者粗抽提物FS/LV中，加入可溶性淀粉(终浓度为2％)，乙酸钠缓冲液(pH5.5；终浓度为50mM)以及CaCl2(终浓度为1mM)，将总体积调至100μl。该混合物在80℃下过夜反应。如实施例4-(4)所述通过普通HPLC分析反应混合物中的寡糖。其结果，设对应于粗抽提物WT的葡萄糖、麦芽糖和麦芽三糖浓度的总和(作为相对应葡萄糖的浓度)为1，则对应于粗抽提物F206S、粗抽提物FS/PI和粗抽提物FS/LV的该数值分别为2.22、2.22和2.79。关于所产生的CD的组成，在使用粗抽提物WT时，γ-CD的量约为β-CD的量的一半。在使用粗抽提物F206S或者粗抽提物FS/LV时，γ-CD和β-CD的量几乎相同。在使用粗抽提物FS/PI时，γ-CD的量比β-CD的量多1.7倍。这些结果见表3。表3所产生的量(μM)粗抽提物β-CDγ-CDWT220103F206S292294FS/PI227386FS/LV379363工业应用本发明提供了一种具有葡萄糖淀粉酶活性的多肽。本发明的多肽高度热稳定并且可以有效的消化淀粉。进一步，通过本发明的多肽与来自嗜高温生物的α-淀粉酶的联合使用，这有助于生物物质的应用，可以从淀粉中有效地产生葡萄糖。序列表自由原文SEQIDNO3用于从激烈热球菌扩增编码具有葡萄糖淀粉酶活性的多肽的基因的PCR引物am1-F1。SEQIDNO4用于从激烈热球菌扩增编码具有葡萄糖淀粉酶活性的多肽的基因的PCR引物AMY-2N。SEQIDNO8PCR引物PX253-01SEQIDNO9PCR引物R4SEQIDNO10PCR引物206S-FSEQIDNO11PCR引物F206S-RSEQIDNO12PCR引物P142I-FSEQIDNO13PCR引物P142I-RSEQIDNO14PCR引物L337V-FSEQIDNO15PCR引物L337V-RSEQIDNO16PCR引物F2SEQIDNO17PCR引物F3SEQIDNO18PCR引物AN2-R1F2SEQIDNO19PCR引物R5SEQIDNO20PCR引物R6序列表<110>TakaraShuzoCo.，Ltd.<120>多肽<130>662046<150>JP11-218778<151>1999-08-02<160>20<210>1<211>722<212>PRT<213>激烈热球菌(Pyrococcusfuriosus)<400>1MetArgLysLeuIleIleSerPheThrIleLeuValLeuTyrPhe51015SerGlnValAlaAlaTyrTyrValProGluArgSerValIleTyr202530GlnIleMetValAspArgPheTyrArgArgAsnProThrAsnAsn354045GluProPheTyrAspProGluLysLysAsnTyrArgLeuTyrTrp505560GlyGlyAspIleGluGlyIleIleGluArgLeuAspTyrIleGlu657075SerLeuGlyValSerMetIleTrpLeuSerProLeuAsnAspAsn808590IleAsnArgMetAlaGlyGlySerAlaProTyrHisGlyTyrTrp95100105ProArgAspPheLysArgIleAspGluHisPheGlyThrTrpGlu110115120AspPheArgArgLeuValGluGluAlaLysLysArgGlyIleCys125130135IleIleValAspTyrValProAsnHisSerAsnProAlaThrAsp140145150GlyGluPheGlyAlaLeuTyrAspAsnGlyThrLeuValThrAsn155160165TyrTyrGluAspArgLysAsnAlaThrArgAsnProTyrThrAla170175180SerLeuGluAsnIleTyrHisHisAsnGlyAsnIleAsnAspTrp185190195PheGlyPheGlnLeuLysTyrAlaAsnLeuPheGlyLeuAlaAsp200205210PheAsnGlnMetAsnAspPheValAspAsnTyrLeuLysGluGly215220225AlaAlaLeuPheValLysAsnGlyAlaCysGlyPheArgIleAsp230235240AlaValLysHisIleGluLeuGlyTrpLeuGluThrPheTyrLeu245250255TyrLeuTyrGlnIleSerAspGluProLeuPheIleTyrGlyGlu260265270TyrPheAlaAsnThrProAspLysThrPheAspLeuTyrGluPhe275280285TyrArgTyrSerAsnValSerSerLeuLeuAsnIleProIleArg290295300GluSerIleAlaArgThrPheAlaTyrGlyGlySerPheGluGln305310315LeuAlaLysMetLeuGluGluTyrTyrSerLeuPheValTyrPro320325330AsnLysGlnLeuAsnPheLeuAspSerHisAspLeuValArgPhe335340345LeuAsnMetAsnProAsnLysAspArgTyrHisMetAlaLeuGly350355360LeuValMetThrLeuProGlyIleProValIleTyrTyrGlyAsp365370375GluSerTyrLeuValSerLysGluGlyLysGlyAspProTyrAsn380385390ArgProMetMetValPheAspAsnSerThrLysAlaAlaGluIle395400405IleArgLysLeuSerLeuLeuArgLysValAsnAspAlaLeuAla410415420TyrSerAspPheArgThrValTyrValAspTyrAsnThrTrpIle425430435PheGluArgLysPheGlySerHisLysIleLeuValAlaLeuAsn440445450LysGlyProAspLysAsnIleThrIleSerLeuAsnTrpThrAsp455460465GlyThrTyrIleAspIleIleGluGlyAlaIleLeuLysValLys470475480GluGlyGlnGlyGluIleLysLeuProArgTyrSerPheTyrVal485490495PheHisValGluGluGluGlnLysThrProLeuIleGlySerIle500505510ThrProTyrIleAlaGlnProGlyGlnLysIleLeuIleAlaGly515520525AlaGlyLeuAsnGlyAsnIleLysValTyrIleGlyGlyArgArg530535540AlaArgIleIleGluLysGluGluAsnSerIleLeuValGluVal545550555ProGluIleLysThrMetAsnAlaTrpIleProValTrpValVal560565570ValAsnGlyThrArgSerAsnGluValLysLeuArgTyrTyrSer575580585SerAsnAspIleProAlaLeuIleValLeuGlnGlyAsnTyrThr590595600GlyTyrLeuTrpValLysGlyAsnIleProGluLeuSerGluPro605610615ArgProLeuLeuLyrSerProThrGlyHisTyrPheAlaValVal620625630ProLeuProArgAsnLysThrPheThrValGlnLeuTyrLysGly635640645LeuProTrpGluProLeuGlnProThrAsnValThrLeuTyrGly650655660IleGlyAsnLysThrValIleLeuAsnGluAalAlaProGluThr665670675ProValCysGlyProGlyIleValAlaValPheAlaLeuLeuPro680685690LeuLeuLysArgLysLysLysLysSerProAsnThrThrIleThr695700705ProTyrGlyValProIleValAlaValSerTrpIleValArgTrp710715720CysLeu<210>2<211>2169<212>DNA<213>激烈热球菌(Pyrococcusfuriosus)<400>2atgagaaagctgataataagttttacaattcttgtactctatttttcccaggtcgcagcc60tattatgttccagagagaagtgttatatatcaaataatggtggacagattttacgataga120aacccaacaaataacgaacccttctatgatccagagaagaaaaactacaggctctattgg180ggaggagacattgaaggcatcatagagagacttgactatatagagagtctaggtgtttca240atgatatggctttcaccattaaacgacaacataaacagaatggcaggtggaagcgctcct300tatcatgggtattggccaagagacttcaaaaggatagacgagcactttggcacctgggaa360gactttagaaggttagtagaagaagctaagaaaagaggaatttgcataatagtagactat420gtccccaaccattcaaatccagcaactgatggggagtttggagctttgtacgataatgga480acattagtgactaactactatgaagacagaaaaaatgccacaagaaatccctatactgcg540agcctggaaaacatctatcaccacaatggcaacataaacgattggtttggctttcagctt600aagtacgcaaatctttttggattggcagatttcaaccaaatgaatgactttgtggataat660tatcttaaagaaggggcagctttattcgtgaaaaatggcgcttgtggatttagaattgat720gctgttaagcatatagagctgggatggcttgaaaccttctacctttacctatatcaaatc780tcagatgaaccactctttatctacggagaatactttgcaaacactcctgacaaaacgttt840gacctctatgagttctataggtactcaaatgtatcttccctcttaaatatcccaattaga900gaatcaattgcgagaacttttgcatatggaggaagttttgagcagctagcaaagatgtta960gaggagtattacagtttgttcgtttatcccaacaagcagttgaacttcttagacagccat1020gatttagttaggttcctgaacatgaacccaaacaaagacaggtaccacatggccctcgga1080ttagtaatgacactcccaggaattcctgttatatattatggagatgaaagctatttagtg1140agtaaggaagggaagggagacccctacaacagaccaatgatggtttttgataactctact1200aaggctgctgagattataagaaagctttcattgctaagaaaagtcaacgatgcccttgct1260tatagtgatttcagaaccgtatatgtggactacaacacatggatatttgagagaaagttt1320ggaagccacaagatattagttgctctaaacaaagggccagacaaaaacatcacgatttcc1380ctaaactggacagatggaacatacatagacatcatcgaaggagcaattctcaaagttaaa1440gaaggtcagggtgagataaagctacccagatattcattttatgtctttcatgtagaggaa1500gaacagaaaacccctctcataggatctataactccatacatagcccaacctgggcaaaaa1560atccttatagccggagcaggcctcaatggaaacatcaaggtgtatataggaggtaggaga1620gcaagaattattgagaaagaagaaaattccatccttgtagaggttcccgagattaaaact1680atgaatgcgtggattcctgtttgggttgttgttaatggaactagaagcaatgaggttaag1740cttaggtactattctagcaatgatatcccagcactaatagtcctacaaggaaactacact1800ggttacctttgggtcaaggggaacataccagaactctcagagccgagacccctcttgaaa1860tctccaacgggacactactttgccgtggttcccctccccagaaacaaaacttttacagtt1920caactatataagggacttccctgggaacctctccaaccaacaaatgtcacgttgtatgga1980attggaaataaaacagtaatattgaatgaagccgctccagaaactcctgtatgcggccca2040ggaattgtcgcagtatttgcacttctcccattgttaaaaagaaaaaagaaaaagtcaccc2100aacaccacaataactccatacggagtacccatagtagccgttagctggatcgtgaggtgg2160tgcctctag2169<210>3<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于扩增来自激烈热球菌(Pyrococcusfuriosus)编码具有葡萄糖淀粉酶活性多肽基因的PCR引物am1-F1.<400>3aaagcatgcactaaaggtgataacatgag29<210>4<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于扩增来自激烈热球菌(Pyrococcusfuriosus)编码具有葡萄糖淀粉酶活性多肽基因的PCR引物AMY-2N<400>4gcaggtcgacggatcacgtgaacataaag29<210>5<211>3519<212>DNA<213>激烈热球菌(Pyrococcusfuriosus)<400>5aaagcatgcactaaaggtgataacatgagaaagctgataataagttttacaattcttgta60ctctatttttcccaggtcgcaagcctattatgttccagagagaagtgttatatatcaaat120aatggtggacagattttacgatagaaacccaacaaataacgaacccttctatgatccaga180gaagaaaaactacaggctctattggggaggagacattgaaggcatcatagagagacttga240ctatatagagagtctaggtgtttcaatgatatggctttcaccattaaacgacaacataaa300cagaatggcaggtggaagcgctccttatcatgggtattggccaagagacttcaaaaggat360agacgagcactttggcacctgggaagactttagaaggttagtagaagaagctaagaaaag420aggaatttgcataatagtagactatgtccccaaccattcaaatccagcaactgatgggga480gtttggagctttgtacgataatggaacattagtgactaactactatgaagacagaaaaaa540tgccacaagaaatccctatactgcgagcctggaaaacatctatcaccacaatggcaacat600aaacgattggtttggctttcagcttaagtacgcaaatctttttggattggcagatttcaa660ccaaatgaatgactttgtggataattatcttaaagaaggggcagctttattcgtgaaaaa720tggcgcttgtggatttagaattgatgctgttaagcatatagagctgggatggcttgaaac780cttctacctttacctatatcaaatctcagatgaaccactctttatctacggagaatactt840tgcaaacactcctgacaaaacgtttgacctctatgagttctataggtactcaaatgtatc900ttccctcttaaatatcccaattagagaatcaattgcgagaacttttgcatatggaggaag960ttttgagcagctagcaaagatgttagaggagtattacagtttgttcgtttatcccaacaa1020gcagttgaacttcttagacagccatgatttagttaggttcctgaacatgaacccaaacaa1080agacaggtaccacatggccctcggattagtaatgacactcccaggaattcctgttatata1140ttatggagatgaaagctatttagtgagtaaggaagggaagggagacccctacaacagacc1200aatgatggtttttgataactctactaaggctgctgagattataagaaagctttcattgct1260aagaaaagtcaacgatgcccttgcttatagtgatttcagaaccgtatatgtggactacaa1320cacatggatatttgagagaaagtttggaagccacaagatattagttgctctaaacaaagg1380gccagacaaaaacatcacgatttccctaaactggacagatggaacatacatagacatcat1440cgaaggagcaattctcaaagttaaagaaggtcagggtgagataaagctacccagatattc1500attttatgtctttcatgtagaggaagaacagaaaacccctctcataggatctataactcc1560atacatagcccaacctgggcaaaaaatccttatagccggagcaggcctcaatggaaacat1620caaggtgtatataggaggtaggagagcaagaattattgagaaagaagaaaattccatcct1680tgtagaggttcccgagattaaaactatgaatgcgtggattcctgtttgggttgttgttaa1740tggaactagaagcaatgaggttaagcttaggtactattctagcaatgatatcccagcact1800aatagtcctacaaggaaactacactggttacctttgggtcaaggggaacataccagaact1860ctcagagccgagacccctcttgaaatctccaacgggacactactttgccgtggttcccct1920ccccagaaacaaaacttttacagttcaactatataagggacttccctgggaacctctcca1980accaacaaatgtcacgttgtatggaattggaaataaaacagtaatattgaatgaagccgc2040tccagaaactcctgtatgcggcccaggaattgtcgcagtatttgcacttctcccattgtt2100aaaaagaaaaaagaaaaagtcacccaacaccacaataactccatacggagtacccatagt2160agccgttagctggatcgtgaggtggtgcctctaggtatacccatccgctactatctactc2220ttttatctacccatcctcctaggtttccagtgtattcatgaatacaagcccctgcaaact2280ttggaacgtatacccacctaccaacccagttagggctcaagttaatgtaagttataagcc2340caggccttctagaatctccatttctcacaaatatgagctcatcgttgtcgtagtagacaa2400ttgttgtgcttcctcctgccaaatgatcatggatccaaatgaggttaattagcttatcct2460tgttcagccattcctcaaagtccctgtagaatattactggctgtccctcatatgtcaata2520tgaacgcatatgctggatacttgttccatattatatctgtgtcatgattggcaacgaaag2580ttactgccttaaatggatctctcgaaactacagtttgtccgttttgtagggcatagacta2640atgctggaatgttgttattgtcaaatgcttcatccattttatagtagagcgggaagtcaa2700agacctttgcaccactctcatatgcccagcttagtagtgcatctacatttgtgtcccagt2760actctccaactgcccaacctccccaccaattaagccagtctctgacaacccaagctccat2820agcccttaacatagtcaaatctccaaccatcaaatcctatgcttcttaaataagcagcat2880aactctcattgctcttccatagccagtactgatcccactctttgtgatgacatatatctg2940gaaatcctccaaaggttccttcgtcacaacaatgaagctcgtttggatggaagtccagat3000agttagctgtatatttccctgaggcaactttagaaaagtctgtccatgtgtaatctccaa3060cgaaggggttccattctaggtcaccaccagccctgtggtttataactacatcggcgatta3120cctttattccataggcatgggcagtttgtatcaatctcactagttcttcttttgatccaa3180aacgcgtctctacagttcccttctggtagtactcgccgagatcaaagtaatcatagggat3240cgtagcccattgaatatcctccactcatccccttgcttggtggaggtagccatattgcag3300agattccagcttcataccattcaggaatcttcgatcttatatgatcccaccaaattcctc3360cccctggaacatcccaatagaatgcttgcattataactcctccctcttcaagctccaagt3420attttgctgcacttactggacttgctagtactataaaaaacagtaatagagttaggaggg3480gtgttaatttctttatgttcacgtgatccgtcgacctgc3519<210>6<211>703<212>PRT<213>激烈热球菌(Pyrococcusfuriosus)<400>6AlaTyrTyrValProGluArgSerValIleTyrGlnIleMetVal51015AspArgPheTyrAspArgAsnProThrAsnAsnGluProPheTyr202530AspProGluLysLysAsnTyrArgLeuTyrTrpGlyGlyAspIle354045GluGlyIleIleGluArgLeuAspTyrIleGluSerLeuGlyVal505560SerMetIleTrpLeuSerProLeuAsnAspAsnIleAsnArgMet657075AlaGlyGlySerAlaProTyrHisGlyTyrTrpProArgAspPhe808590LysArgIleAspGluHisPheGlyThrTrpGluAspPheArgArg95100105LeuValGluGluAlaLysLysArgGlyIleCysIleIleValAsp110115120TyrValProAsnHisSerAsnProAlaThrAspGlyGluPheGly125130135AlaLeuTyrAspAsnGlyThrLeuValThrAsnTyrTyrGluAsp140145150ArgLysAsnAlaThrArgAsnProTyrThrAlaSerLeuGluAsn155160165IleTyrHisHisAsnGlyAsnIleAsnAspTrpPheGlyPheGln170175180LeuLysTyrAlaAsnLeuPheGlyLeuAlaAspPheAsnGlnMet185190195AsnAspPheValAspAanTyrLeuLysGluGlyAlaAlaLeuPhe200205210ValLysAsnGlyAlaCysGlyPheArgIleAspAlaValLysHis215220225IleGluLeuGlyTrpLeuGluThrPheTyrLeuTyrLeuTyrGln230235240IleSerAspGluProLeuPheIleTyrGlyGluTyrPheAlaAsn245250255ThrProAspLysThrPheAspLeuTyrGluPheTyrArgTyrSer260265270AsnValSerSerLeuLeuAsnIleProIleArgGluSerIleAla275280285ArgThrPheAlaTyrGlyGlySerPheGluGluLeuAlaLysMet290295300LeuGluGLuTyrTyrSerLeuPheValTyrProAsnLysGlnLeu305310315AsnPheLeuAspSerHisAspLeuValArgPheLeuAsnMetAsn320325330ProAsnLysAspArgTyrHisMetAlaLeuGlyLeuValMetThr335340345LeuProGlyIleProValIleTyrTyrGlyAspGluSerTyrLeu350355360ValSerLysGluGlyLysGlyAspProTyrAsnArgProMetMet365370375ValPheAspAsnSerThrLysAlaAlaGluIleIleArgLysLeu380385390SerLeuLeuArgLysValAsnAspAlaLeuAlaTyrSerAspPhe395400405ArgThrValTyrValAspTyrAsnThrTrpIlePheGluArgLys410415420PheGlySerHisLysIleLeuValAlaLeuAsnLysGlyProAsp425430435LysAsnIleThrIleSerLeuAsnTrpThrAspGlyThrTyrIle440445450AspIleIleGluGlyAlaIleLeuLysValLysGluGlyGlnGLy455460465GluIleLysLeuProArgTyrSerPheTyrValPheHisValGlu470475480GluGluGlnLysThrProLeuIleGlySerIleThrProTyrIle485490495AlaGlnProGlyGlnLysIleLeuIleAlaGlyAlaGlyLeuAsn500505510GlyAsnIleLysValTyrIleGlyGlyArgAlaAlaArgIleIle515520525GluLysGluGluAsnSerIleLeuValGluValProGluIleLys530535540ThrMetAsnAlaTrpIleProValTrpValValValAsnGlyThr545550555ArgSerAsnGluValLysLeuArgTyrTyrSerSerAsnAspIle560565570ProAlaLeuIleValLeuGlnGlyAsnTyrThrGlyTyrLeuTrp575580585ValLysGlyAsnIleProGluLeuSerGluProArgProLeuLeu590595600LysSerProThrGlyHisTyrPheAlaValValProLeuProArg605610615AsnLysThrPheThrValGlnLeuTyrLysGlyLeuProTrpGlu620625630ProLeuGlnProThrAsnValThrLeuTyrGlyIleGlyAsnLys635640645ThrValIleLeuAsnGluAlaAlaProGluThrProValCysGly650655660ProGlyIleValAlaValPheAlaLeuLeuProLeuLeuLysArg665670675LysLysLysLysSerProAsnThrThrIleThrProTyrGlyVal680685690ProIleValAlaValSerTrpIleValArgTrpCysLeu685700<210>7<211>2112<212>DNA<213>激烈热球菌(Pyrococcusfuriosus)<400>7gcctattatgttccagagagaagtgttatatatcaaataatggtggacagattttacgat60agaaacccaacaaataacgaacccttctatgatccagagaagaaaaactacaggctctat120tggggaggagacattgaaggcatcatagagagacttgactatatagagagtctaggtgtt180tcaatgatatggctttcaccattaaacgacaacataaacagaatggcaggtggaagcgct240ccttatcatgggtattggccaagagacttcaaaaggatagacgagcactttggcacctgg300gaagactttagaaggttagtagaagaagctaagaaaagaggaatttgcataatagtagac360tatgtccccaaccattcaaatccagcaactgatggggagtttggagctttgtacgataat420ggaacattagtgactaactactatgaagacagaaaaaatgccacaagaaatccctatact480gcgagcctggaaaacatctatcaccacaatggcaacataaacgattggtttggctttcag540cttaagtacgcaaatctttttggattggcagatttcaaccaaatgaatgactttgtggat600aattatcttaaagaaggggcagctttattcgtgaaaaatggcgcttgtggatttagaatt660gatgctgttaagcatatagagctgggatggcttgaaaccttctacctttacctatatcaa720atctcagatgaaccactctttatctacggagaatactttgcaaacactcctgacaaaacg780tttgacctctatgagttctataggtactcaaatgtatcttccctcttaaatatcccaatt840agagaatcaattgcgagaacttttgcatatggaggaagttttgagcagctagcaaagatg900ttagaggagtattacagtttgttcgtttatcccaacaagcagttgaacttcttagacagc960catgatttagttaggttcctgaacatgaacccaaacaaagacaggtaccacatggccctc1020ggattagtaatgacactcccaggaattcctgttatatattatggagatgaaagctattta1080gtgagtaaggaagggaagggagacccctacaacagaccaatgatggtttttgataactct1140actaaggctgctgagattataagaaagctttcattgctaagaaaagtcaacgatgccctt1200gcttatagtgatttcagaaccgtatatgtggactacaacacatggatatttgagagaaag1260tttggaagccacaagatattagttgctctaaacaaagggccagacaaaaacatcacgatt1320tccctaaactggacagatggaacatacatagacatcatcgaaggagcaattctcaaagtt1380aaagaaggtcagggtgagataaagctacccagatattcattttatgtctttcatgtagag1440gaagaacagaaaacccctctcataggatctataactccatacatagcccaacctgggcaa1500aaaatccttatagccggagcaggcctcaatggaaacatcaaggtgtatataggaggtagg1560agagcaagaattattgagaaagaagaaaattccatccttgtagaggttcccgagattaaa1620actatgaatgcgtggattcctgtttgggttgttgttaatggaactagaagcaatgaggtt1660aagcttaggtactattctagcaatgatatcccagcactaatagtcctacaaggaaactac1740actggttacctttgggtcaaggggaacataccagaactctcagagccgagacccctcttg1800aaatctccaacgggacactactttgccgtggttcccctccccagaaacaaaacttttaca1860gttcaactatataagggacttccctgggaacctctccaaccaacaaatgtcacgttgtat1920ggaattggaaataaaacagtaatattgaatgaagccgctccagaaactcctgtatgcggc1980ccaggaattgtcgcagtatttgcacttctcccattgttaaaaagaaaaaagaaaaagtca2040cccaacaccacaataactccatacggagtacccatagtagccgttagctggatcgtgagg2100tggtgcctctag2112<210>8<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物PX253-01.<400>8cgcgccatggcctattatgttccagagag29<210>9<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物R4.<400>9tatccatgtgttgtagtcc19<210>10<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物206S-F.<400>10acgcaaatcttagtggattggcagatttcaac32<210>11<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物F206S-R.<400>11gccaatccactaagatttgcgtacttaagctg32<210>12<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物P142I-F.<400>12agactatgtcattaaccattcaaatccagc30<210>13<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物P142I-R.<400>13tgaatggttaatgacatagtctactattatgc32<210>14<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物L337V-F.<400>14tgaacttcgtcgacagccatgatttagttag31<210>15<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物L337V-R.<400>15catggctgtcgacgaagttcaactgcttgttg32<210>16<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物F2.<400>16ctttagaaggttagtagaa19<210>17<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物F3.<400>17atcttaaagaaggggcagct20<210>18<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物AN2-R1F2.<400>18ggggaggagacattgaaggc20<210>19<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物R5.<400>19aagttcaactgcttgttggga21<210>20<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物R6.<400>20acaagcgccatttttcacga20权利要求1.一种多肽，该多肽具有SEQIDNO6的氨基酸序列或者具有在SEQIDNO6的氨基酸序列中有一个或者多个氨基酸残基缺失、添加、插入和/或替换的氨基酸序列，并且具有热稳定的葡萄糖淀粉酶活性。2.一种核酸，该核酸编码权利要求1所定义的多肽。3.依据权利要求2的核酸，该核酸具有SEQIDNO7的核苷酸序列。4.一种核酸，该核酸编码一种具有热稳定的葡萄糖淀粉酶活性的多肽，能够在严苛的条件下同权利要求2或3定义的核酸进行杂交。5.一种重组DNA，该DNA含有权利要求2到4中任意一个所定义的核酸。6.一种转化子，该转化子被权利要求5所定义的重组DNA所转化。7.一种方法，该方法用于产生权利要求1所定义的多肽，该方法包括对权利要求6所定义的转化子进行培养以及从该培养物中收集具有热稳定的葡萄糖淀粉酶活性的多肽。8.一种用于产生葡萄糖的方法，该方法包括使权利要求1所定义的多肽作用于一种通过α-1，4键连接的D-吡喃葡萄糖的多聚物以释放葡萄糖。9.一种用于产生寡糖的方法，该方法包括使权利要求1所定义的多肽作用于一种通过α-1，4键连接的D-吡喃葡萄糖的多聚物以释放寡糖。10.一种用于产生环糊精的方法，该方法包括使权利要求1所定义的多肽作用于一种通过α-1，4键连接的D-吡喃葡萄糖的多聚物以释放环糊精。全文摘要具有序列表中的SEQIDNO:6所代表的氨基酸序列,或者具有通过一个或多个氨基酸的至少一个删除、添加、插入或者替换而衍生自上述序列的氨基酸序列,并且表现出嗜热的葡萄糖淀粉酶活性的多肽。文档编号C12N9/28GK1377412SQ00813797公开日2002年10月30日申请日期2000年7月26日优先权日1999年8月2日发明者小山信人,奥井利豪,高蔵晃,浅田起代蔵,加藤郁之进申请人:宝酒造株式会社