一种用于检测kras基因热点突变的试剂盒及其检测方法
【专利摘要】本发明属于生物【技术领域】，公开了一种用于检测KRAS基因热点突变的试剂盒及其检测方法。本发明试剂盒包含PNA试剂，利用钳夹技术封闭野生型KRAS基因序列，从而提高sanger测序法的灵敏度和KRAS基因突变的检出率。本发明检测方法操作简单、安全，不需要较多昂贵试剂的使用，经济高效；同时还具有操作时间短的优点，整个检测过程可在4～6小时内完成。
【专利说明】—种用于检测KRAS基因热点突变的试剂盒及其检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种用于检测KRAS基因热点突变的试剂盒及其检测方法。
【背景技术】
[0002]RAS基因家族与人类肿瘤相关的基因有三种:HRAS、KRAS和NRAS，分别定位在11、12和I号染色体上。KRAS因编码21kD的ras蛋白又名p21基因。在RAS基因中，KRAS对人类癌症影响最大，它好像分子开关:当正常时能控制调控细胞生长的路径；发生异常时，则导致细胞持续生长，并阻止细胞自我毁灭。她参与细胞内的信号传递，当KRAS基因突变时，该基因永久活化，不能产生正常的RAS蛋白，使细胞内信号传导紊乱，细胞增殖失控而癌变。
[0003]KRAS基因可以是正常状态(称为野生型)或异常状态(突变型)。正常生理情况下，在细胞受到外界刺激后激活生长因子等信号通路时，野生型的K-Ras被活性生长因子等酪氨酸激酶磷酸化后短暂活化，活化后的KRAS可以激活该信号通路中的下游信号蛋白，而后K-ras迅速失活。KRAS激活/失活效应是受控的。突变型K-Ras蛋白导致蛋白功能异常，在无生长因子活化信号刺激下仍处于激活状态，其功能状态不可控，导致肿瘤的持续增殖等。
[0004]目前用于基因突变检测的方法有Sanger测序法、高效液相色谱法、实时荧光定量PCR法等。Sanger基因测序技术经过了 30年的不断发展与完善，现在已经可以对长达1，OOObp的DNA片段进行测序，而且对每一个碱基的读取准确率高达99.999%。由于具有很高的读取准确率，Sanger法测序成为基因突变、单核苷酸多态性等基因分析的金标准。
[0005]肿瘤组织中，KRAS野生型细胞与突变型细胞混杂，而Sanger测序法的灵敏度仅为10~20%，即当突变型细胞占整体检测细胞的10~20%时才能检出，因此而极大的限制了Sanger测序法的应用。
[0006]肽核酸(peptide nucleic acids, PNA) 一类以多肽骨架取代糖磷酸主链的DNA类似物。它是在第一代、第二代反义试剂的基础上，通过计算机设计构建并最终人工合成的第三代反义试剂，是一种全新的DNA类似物，即以中性的肽链酰胺2-氨基乙基甘氨酸键取代了 DNA中的戊糖磷酸二酯键骨架，其余的与DNA相同，PNA可以通过Watson-Crick碱基配对的形式识别并结合DNA或RNA序列，形成稳定的双螺旋结构。由于PNA不带负电荷，与DNA和RNA之间不存在静电斥力，因而结合的稳定性和特异性都大为提高；不同于DNA或DNA、RNA间的杂交，PNA与DNA或RNA的杂交几乎不受杂交体系盐浓度影响，与DNA或RNA分子的杂交能力远优于DNA/DNA或DNA/RNA，表现在很高的杂交稳定性、优良的特异序列识别能力、不被核酸酶和蛋白酶水解。并且PNA与互补DNA具有I个碱基不匹配时，其溶解温度会下降8 V~20°C，2个碱基不匹配时则完全不能杂交。鉴于上述诸多DNA分子不具备的优点，近十年来，人们为其在许多高【技术领域】找到了用途。
【发明内容】
[0007]本发明针对现有技术的不足，提供一种用于检测KRAS基因热点突变的试剂盒及其检测方法，本发明采用PNA钳夹技术封闭野生型BRAF基因序列，从而提高检测KRAS基因热点突变的敏感度和突变检出率。
[0008]为解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:
[0009]一种用于检测KRAS基因热点突变的试剂盒，包括PCR反应液、PNA试剂、酶消化液、测序反应液、磁珠和产物纯化液，所述PCR反应液包含PCR缓冲液、dNTPs、PCR正向引物、PCR反向引物、探针和DNA聚合酶，所述PCR正向引物的序列为SEQ.1D N0.1，所述PCR反向引物的序列为SEQ.1D N0.2，所述探针的序列为SEQ.1D N0.3，所述探针的5’端的荧光基团为FAM，3’端的荧光基团为BHQl ;所述PNA的序列为SEQ.1D N0.4 ;所述测序反应液中含有Bi gdye、Bigdye缓冲液和测序引物。
[0010]上述方案中，所述PCR缓冲液由100mmol/L Tris-HCl、500mmol/L KCl 和 15mmol/LMgCl2组成；所述dNTPs的摩尔浓度为2.5mmol/L dNTPs ;所述PCR正向引物的摩尔浓度为10 μ mol/L，所述PCR反向引物的摩尔浓度为10 μ mol/L ;所述探针的摩尔浓度为IOymol/L ;所述DNA聚合酶的酶活力单位浓度为5U/ μ I ;所述PNA试剂的摩尔浓度为10 μ mol/L。
[0011]上述方案中，所述酶消化液包括核酸外切酶I和碱性磷酸酶。
[0012]上述方案中，所述核酸外切酶I和碱性磷酸酶的酶活力单位比为5:2。
[0013]上述方案中，所述测序反应液含有5XBigdye、2.5XBigdye缓冲液和3 μ mol/L的测序引物。
[0014]上述方案中，所述产物纯化液为0.75M氯化钠溶液。
[0015]上述方案中，在所述PCR正向引物的5’端插入通用Ml3序列:
[0016]TGTAAAACGACGGCCAGT，在所`述PCR反向引物的5’端插入通用Ml3序列:
[0017]CAGGAAACAGCTATGACC，则所述的测序引物序列为:
[0018]TGTAAAACGACGGCCAGT。
[0019]一种利用上述试剂盒检测BRAF基因热点突变的方法，具体包括如下步骤:
[0020](I)目的基因荧光定量PCR扩增:使用试剂盒中荧光定量PCR反应液和PNA试剂，对样品DNA进行PCR扩增反应，得到目的基因的定量结果和PCR产物；
[0021](2)根据步骤(1)中的定量结果，使用试剂盒中的酶消化液，对步骤(1)得到的PCR产物进行纯化，得到纯化后PCR产物；
[0022](3)使用试剂盒中的测序反应液，对步骤(2)得到的纯化后PCR产物进行测序PCR反应，得到测序PCR产物；
[0023](4)使用试剂盒中的磁珠和产物纯化液，对步骤(3)得到的测序PCR产物进行纯化，得到纯化后测序PCR产物；
[0024](5)将步骤(4)得到的纯化后测序PCR产物加样至测序仪进行序列分析，测序所得基因序列与NCBI (美国国立生物技术信息中心)数据库中KRAS基因标准序列进行比对，并查看峰图，判断是否存在KRAS基因热点突变:若峰图中KRAS基因热点突变区域12位点GGT峰图下游典型的突变套峰，或者完全为突变峰图，可知样本中部分或全部细胞含有KRAS热点突变区域12位点。本发明的有益效果:
[0025](I)本发明试剂盒包含PNA试剂，在对样本DNA进行PCR扩增反应中，利用PNA试剂封闭野生型KRAS基因序列，提高sanger测序法的灵敏度和KRAS基因突变的检出率。[0026](2)本发明检测方法操作简单、安全，同时不需要较多昂贵试剂的使用，经济高效。
[0027](3)本发明检测方法操作时间短，整个检测过程可在4~6小时内完成。
【专利附图】
【附图说明】
[0028]图1为KRAS基因突变热点区域序列，其中下划线代表引物序列或引物结合位点，方框代表探针序列或探针结合位点，下划虚线代表PNA序列或PNA结合位点，斜体字母代表突变位点。 [0029]图2为实施例1中KRAS基因荧光定量PCR扩增曲线。
[0030]图3为实施例1中KRAS基因测序图。
【具体实施方式】
[0031]为了更好地理解本发明，下面结合附图、表格、实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实例。
[0032]实施例1
[0033]1、试剂盒中PCR反应液中的引物、探针序列的合成和PNA序列的合成
[0034]根据KRAS基因热点突变区域和测序片段的要求(见图1)，设计如下引物、探针和PNA，并用人工合成的方法合成如下引物、探针和PNA:
[0035]KRAS12F:ACTGGTGGAGTATTTGATAGTGTA (SEQ.1D N0.1)
[0036]KRAS12R:CTTTATCTGTATCAAAGAATGGTCCTG (SEQ.1D N0.2)
[0037]KRAS12P:FAM-ACCTTATGTGTGACATGTTCTAATATAGT-BHQ1 (SEQ.1D N0.3)
[0038]KRAS12PNA:GGAGCTGGTGGCGTAGGC (SEQ.1D N0.4)
[0039]上述引物、探针和PNA序列均为5’端至3’端，12表示KRAS突变热点区域密码子编号，F表示正向引物，R表示反向引物，P表示探针，FAM表示探针中突光基团，BHQl表示淬灭基团。
[0040]在上述正向引物的5’端插入通用M13序列:TGTAAAACGACGGCCAGT，在反向引物的5’端插入通用M13序列:CAGGAAACAGCTATGACC，该通用引物插入的意义在于能够使本实验方案后于的测序反应均使用统一的测序引物。
[0041]2、目的基因片段的荧光定量PCR扩增:利用上述合成的PCR引物、探针和PNA序列，通过荧光定量PCR扩增反应，得到荧光定量PCR产物。
[0042](I)提取样本DNA:人工合成KRAS基因突变热点区域野生型和突变型基因，KRAS基因突变热点区域野生型的序列为SEQ.1D N0.5，KRAS基因突变热点区域突变型的序列为SEQ.1D N0.6，分别转化入DH5 α大肠杆菌后培养，然后以野生型菌:突变型菌浓度比为99:1混合，再提取混合菌液DNA，得到样本DNA ；
[0043](2)使用试剂盒中PCR反应液和PNA试剂，对上述样本DNA进行荧光PCR反应扩增，得到目的片段DNA，PCR反应体系为25 μ I体系:
[0044]FCR反炖液4.2μΙ
PNAI μ!
样木DNA2μ1
双蒸水17.8μΙ
[0045]上述PCR反应液含有10X100mmol/L Tris-HCl、500mmol/L KC1、15mmol/LMgCl2、、
2.5mmol/L dNTPs、10 μ mol/L 正向引物、10 μ mol/L 反向引物、10 μ mol/L 探针、5U/μ I TaqDNA聚合酶；上述PNA试剂的摩尔浓度为10 μ mol/L ;其中正向引物的序列为SEQ.1D N0.1，反向引物的序列为SEQ.1D N0.2，探针的序列为SEQ.1D N0.3，PNA的序列为SEQ.1D N0.4。
[0046](3) PCR扩增程序如下表:
[0047]表1PCR扩增程序
[0048]
【权利要求】
1.一种用于检测KRAS基因热点突变的试剂盒，其特征在于，包括PCR反应液、PNA试剂、酶消化液、测序反应液、磁珠和产物纯化液，所述PCR反应液包含PCR缓冲液、dNTPs、PCR正向引物、PCR反向引物、探针和DNA聚合酶，所述PCR正向引物的序列为SEQ.1D N0.1，所述PCR反向引物的序列为SEQ.1D N0.2，所述探针的序列为SEQ.1D N0.3，所述探针的5’端的荧光基团为FAM，3’端的荧光基团为BHQl ;所述？嫩的序列为SEQ.1D N0.4 ;所述测序反应液包含Bigdye、Bigdye缓冲液和测序引物。
2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述PCR缓冲液由lOOmmol/LTris-HCl、500mmol/L KCl 和 15mmol/L MgCl2 组成；所述 dNTPs 的摩尔浓度为 2.5mmol/L dNTPs ;所述PCR正向引物的摩尔浓度为10 μ mol/L，所述PCR反向引物的摩尔浓度为ΙΟμπιοΙ/L;所述探针的摩尔浓度为10 μ mol/L ;所述DNA聚合酶的酶活力单位浓度为5U/μ I ;所述PNA试剂的摩尔浓度为10 μ mol/L。
3.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于所述酶消化液包括核酸外切酶I和碱性磷酸酶。
4.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于所述核酸外切酶I和碱性磷酸酶的酶活力单位比为5:2。
5.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述测序反应液含有5XBigdye、2.5 X Bigdye缓冲液和3 μ mol/L的测序引物。
6.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于所述产物纯化液为0.75M氯化钠溶液。
7.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于在所述PCR正向引物的5’端 插入通用M13序列:TGTAAAACGACGGCCAGT，在所述PCR反向引物的5’端插入通用M13序列:CAGGAAACAGCTATGACC，则所述的测序引物序列为:TGTAAAACGACGGCCAGT。
8.一种使用权利要求1~7所述试剂盒检测KRAS基因热点突变的方法，其特征在于它包括如下步骤: (1)目的基因荧光定量PCR扩增:使用试剂盒中的PCR反应液和PNA试剂，对样品DNA进行PCR扩增反应，得到目的基因的荧光定量结果和PCR产物； (2)根据步骤(1)中的定量结果，使用试剂盒中的酶消化液，对步骤(1)得到的PCR产物进行纯化，得到纯化后PCR产物； (3)使用试剂盒中的测序反应液，对步骤(2)得到的纯化后PCR产物进行测序PCR反应，得到测序PCR产物； (4)使用试剂盒中的磁珠和产物纯化 液，对步骤(3)得到的测序PCR产物进行纯化，得到纯化后测序PCR产物； (5)将步骤(4)得到的纯化后测序PCR产物加样至测序仪进行序列分析，测序所得基因序列与KRAS基因标准序列进行比对，并查看峰图，判断是否存在KRAS基因热点突变。
【文档编号】C12Q1/68GK103571947SQ201310466108
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年10月9日 优先权日:2013年10月9日
【发明者】叶伦, 李雪梅, 付金玲, 陈刚 申请人:武汉康录生物技术有限公司