专利名称：由遗传工程酵母生产人干扰素α的方法
技术领域：
本发明涉及一种用于由遗传工程酵母生产人干扰素α的方法。更具体地讲，本发明涉及在甲基营养酵母巴斯德毕赤酵母中克隆并表达人干扰素α基因，以及用于纯化所述蛋白的方法。
相关技术说明干扰素——身体针对病毒最迅速地产生的防御物质，是一种在体细胞接触到病毒、细菌、和不同类型的大分子时，由体细胞所分泌的一种蛋白。然后由所分泌的干扰素刺激周围的细胞，以便产生其他蛋白，这些蛋白又能够调节病毒的增殖、免疫反应、细胞生长和其他细胞功能。有三种类型的人干扰素(i)干扰素α，它是由白细胞分泌的；(ii)干扰素β，它是由成纤维细胞分泌的；(iii)干扰素γ，它是由淋巴细胞分泌的。
干扰素α和β被称为I型干扰素，而干扰素γ被称为II型干扰素。人干扰素α蛋白通常包括165或166个氨基酸，并且通过SDS-PAGE测定其分子量为17000-20000道尔顿。
业已将干扰素α用于治疗各种病毒和与癌症相关的疾病，例如，用于治疗乙型、丙型和丁型肝炎病毒感染和癌症疾病，如多毛细胞白血病、与AIDS相关的Kaposi’s肉瘤、慢性骨髓白血病、以及肾细胞癌。
人白细胞干扰素α是用生长在组织培养物中的人细胞系生产的或者是通过从血液供体中收集的人白细胞生产的。Horowitz等，1982，美国专利4680261，5503828，5391713，4732683，4696899，5789551和欧洲专利EP0945463。这些方法工作量大，烦琐，并且费时间。所采用的培养基成本高昂，而所获得的纯化材料的产量很低。还存在用于制备白细胞的血液受一种尚未鉴定的感染剂污染的危险。
随着重组DNA技术的出现，业已可以将人干扰素α基因克隆在微生物中，并且由这些微生物生产足够数量的人干扰素α。Stahelin等，1981，Ho等，1989，Yang等，1992，Tarnowski等，1986，Thatcher等，1986，Tiute等，1982，美国专利5710027，5661009，4765903，5196323，4315852，4845032，4530901和欧洲专利EP0032134和EP0679718披露了利用重组大肠杆菌和酿酒酵母生产人干扰素α的方法。尽管在大肠杆菌中表达并纯化人干扰素α，克服了与由天然来源生产这种干扰素相关的问题和潜在危险，但这种方法有它本身的缺陷。在某些场合下，所表达的蛋白不能进行正确的加工。纯化的蛋白应当不含细菌内毒素。为了除去所述内毒素，需要额外的纯化步骤。因此，所采用的方法包括多个层析步骤，因此是费时间的。这些方法难于放大，而放大是大规模生产的先决条件。在酵母属中表达的重组人干扰素α的产量很低。因此，存在对在合适的宿主中表达人干扰素α的方法以及简单、有效而又容易放大的纯化方法的需求。
甲基营养酵母巴斯德毕赤酵母，正日益成为流行的蛋白表达系统。毕赤酵母属具有以下优点首先，细胞内蛋白的产量极高；其次，容易发酵到高细胞密度；第三，遗传学稳定性以及不损失产量的放大；第四，无内毒素污染。因此，通过在甲基营养酵母巴斯德毕赤酵母中克隆并表达人干扰素α，可以克服与大肠杆菌表达和纯化重组干扰素相关的缺陷。因此，本发明的目的是在巴斯德毕赤酵母中克隆并表达人干扰素α基因。本发明的另一个目的是开发一种有效的纯化方法，该方法很容易放大，以便纯化在巴斯德毕赤酵母中表达的重组人干扰素α。
附图的简要说明
图1是干扰素克隆形成的说明性示意图。
图2是表示干扰素α的下游加工和纯化的第一种优选实施方案的流程图。
图3是表示干扰素α的下游加工和纯化的第二种优选实施方案的流程图。
详细说明本发明提供了一种用于由遗传工程酵母生产具有生理学活性的人干扰素α的方法。该方法具有以下步骤。用一种酶(优选NotI)消化一种具有一个启动子，并且在缺乏融合区的情况下与一种人干扰素α基因可操作地连接的质粒，以便产生一种线性化的质粒。通过同源重组用线性化的质粒转化巴斯德毕赤酵母细胞，以便形成巴斯德毕赤酵母克隆。筛选所述巴斯德毕赤酵母克隆的高水平干扰素α表达，以便寻找高产干扰素的巴斯德毕赤酵母克隆。生长所述高产干扰素巴斯德毕赤酵母克隆。从所述高产干扰素巴斯德毕赤酵母克隆中纯化具有生理学活性的人干扰素α蛋白。
所述质粒优选是通过将人干扰素α基因克隆到含有AOX1启动子的质粒pHIL-D2上而构建的。其他启动子，如GAP、MOX、FMD、ADH、LAC4、XPR2、LEU2、GAM1、PGK1、GAL7、GADPH、CYC1和CUP1是已知的，并且能同样成功地使用。用含有所述克隆的人干扰素α基因的质粒pHIL-D2转化大肠杆菌。然后筛选转化过的大肠杆菌，寻找具有相对质粒pHIL-D2中的AOX1启动子为正确方向的干扰素α基因的重组克隆。pHIL-D2质粒可以从Invitrogen公司(Carlsbad，加州，美国)购买，并且在其产品目录中进行了说明。于2000年2月3日，将能表达人干扰素α的转化过的巴斯德毕赤酵母克隆保存在美国典型培养物保藏中心，10801 University Blvd.，Manassas，弗吉尼亚20110-2209，美国，所获得的保藏号为PTA-1276。
优选采用以下步骤，由遗传工程酵母生产人干扰素α1.将人干扰素α基因克隆到质粒pHIL-D2中；2.用含有人干扰素基因的质粒pHIL-D2转化大肠杆菌；3.筛选转化过的大肠杆菌，寻找具有相对质粒pHIL-D2中的AOX1启动子为正确方向的干扰素α基因的重组克隆；4.用NotI酶消化大肠杆菌中的质粒pHIL-D2，以便得到pHIL-D2的NotI片段。
5.通过同源重组用具有干扰素α基因的pHIL-D2的NotI片段转化巴斯德毕赤酵母细胞；6.筛选所述巴斯德毕赤酵母克隆，寻找干扰素α的表达，并验证来自高产干扰素克隆的干扰素α基因的核苷酸序列；7.在本文所披露的优化条件下，在发酵罐中生长所述高产干扰素巴斯德毕赤酵母克隆；8.按本文所披露的方法，用一种缓冲液洗涤从所述发酵罐中获得的巴斯德毕赤酵母细胞；9.按本文所披露的方法，在有蛋白酶抑制剂存在的条件下，在玻璃珠研磨机中用玻璃珠裂解所述巴斯德毕赤酵母细胞；10.按本文所披露的方法，添加蛋白增溶剂至最终浓度为4-8M，并在4-7℃下，以200-300rpm的速度搅拌2-10小时，进行或不进行离心；11.按本文所披露的方法，用缓冲液将以上步骤的提取物稀释10-30倍，然后通过离心或过滤澄清，对该提取物进行浓缩或不进行浓缩；12.按本文所披露的方法，用一种缓冲液将上述提取物的pH调整到pH3-5，然后离心或过滤；13.将上述提取物吸附在“SP-SEPHAROSE”的阳离子交换柱(Pharmacia Fine Chemicals，New Market，新泽西，美国)上，并用碱金属氯化物洗脱含有人干扰素α的蛋白；14.按本文所披露的方法，将上述含有人干扰素α的洗脱样品的pH调整到中性pH，并将它吸附在含有与一种基质结合的抗人干扰素α的单克隆抗体的免疫亲和柱上，并在低于4.0的pH下洗脱干扰素α；和15.对所述洗脱的干扰素α进行渗滤，然后再进行消毒过滤。
用于在发酵罐中生长所述高产干扰素巴斯德毕赤酵母的优选条件为pH5.0，28-30℃，以500-1500rpm的速度旋转培养2天，并且用甲醇诱导48小时。
用于洗涤从所述发酵罐中获得的巴斯德毕赤酵母细胞的优选缓冲液是25-100mM的磷酸钠缓冲液，pH6.5-8，含有1-5mM乙二胺四乙酸(EDTA)。
在用玻璃珠研磨机裂解期间，所使用的优选蛋白酶抑制剂是0.5-2.0mM的苯甲基磺酰氟(PMSF)。
所使用的优选蛋白增溶剂是浓度为4-8M的盐酸胍或尿素。
用于将所述提取物稀释10-30倍的优选的缓冲液是25-100mM Tris-HCl，0-1M的尿素，pH6.5-8.0。
澄清优选是通过离心或过滤进行的，而浓缩优选是通过超滤进行的。
用柠檬酸缓冲液(25-100mM，pH4-5)稀释浓缩样品，然后离心并过滤。
澄清是通过离心或过滤进行的，并且不进行浓缩，用柠檬酸缓冲液(1-2M，pH2-5)调整提取物的pH。
用于将提取物pH的调整到pH3-5的缓冲液优选是柠檬酸，根据提取物的体积，可以是pH2-5的25-100mM的柠檬酸或1-2M的柠檬酸。
用于洗脱含有人干扰素α的蛋白的碱金属氯化物优选是氯化钠。
所述使用的优选基质是可以作为通过伯胺连接配体的亲和支持物的基质。最优选的基质是可以从BIO-RAD(Hercules，加州，美国)获得的“AFFI-GEL-10”。干扰素α优选在pH2-4的条件下洗脱。
下面将结合以下流程图和实施例说明本发明实施例1参见
图1，它表示用于将人干扰素α基因克隆到巴斯德毕赤酵母中的步骤，扩增所述人干扰素α基因(优选通过PCR扩增)，并用EcoRI消化。通过用EcoRI消化，使具有AOX1启动子的pHIL-D2质粒线性化。将干扰素α)基因连接到消化过的pHIL-D2上。用pHIL-D2-IFN质粒转化大肠杆菌细胞。筛选大肠杆菌转化体，寻找其中的IFNα基因相对pHIL-D2质粒中的AOX1启动子成正确方向的重组体。用NotI消化过的pHIL-D2-IFN质粒转化巴斯德毕赤酵母。这会导致IFN基因通过同源重组整合到酵母基因组中。根据其在基本培养基上生长的能力筛选重组体。筛选能在细胞内表达人干扰素α的重组体。在培养罐中，在最低培养基里生长能表达人干扰素α的巴斯德毕赤酵母克隆2天，条件为pH5.0，28-30℃，500-1200rpm，并且用甲醇诱导48小时。
参见图2，它表示用于对从发酵罐方向获得的人干扰素α进行下游加工和纯化的第一种优选方法的步骤，收获发酵罐培养物，并且用裂解缓冲液洗涤细胞，裂解缓冲液为25mM磷酸钠缓冲液，pH8.0，20mMEDTA。在有1mM PMSF的条件下，在玻璃珠研磨机中用玻璃珠裂解洗涤过的细胞，为了裂解细胞提取物，以7M的最终浓度添加固体盐酸胍，并以200-300rpm的速度搅拌4-6小时，进行或不进行离心。用含有1-10微摩尔PMSF的25mM Tris-HCl，pH7.5将上述步骤的提取物稀释20倍，并通过离心或过滤澄清。通过超滤将澄清的提取物浓缩10倍。用pH4.0的含有1微摩尔PMSF的50mM柠檬酸缓冲液再次将所述浓缩10倍的提取物稀释10倍。通过离心或过滤将柠檬酸稀释过的提取物澄清，并通过超滤浓缩10倍。在SP-sepharose上对上述浓缩提取物进行阳离子交换层析，并且用氯化钠梯度洗脱。
将上述洗脱的IFN级份的pH调整到7.0，并将该级份加样到装有与AFFI-Gel-10基质(BIO-RAD，Hercules，加州，美国)结合的单克隆抗体的免疫亲和柱上。用0.2M乙酸和0.15M氯化钠洗脱纯的干扰素。对洗脱的干扰素进行渗滤和消毒过滤。
实施例2以与例1相同的方法扩增并克隆人干扰素α基因。
参见图3，它表示用于对从发酵罐方向获得的人干扰素α进行下游加工和纯化的第二种优选方法的步骤，收获发酵罐培养物，并且用裂解缓冲液洗涤，裂解缓冲液为25mM磷酸钠缓冲液，pH8.0，2mM EDTA。在有1mM PMSF的条件下，在玻璃珠研磨机中用玻璃珠裂解洗涤过的细胞。为了裂解细胞提取物，以7M的最终浓度添加固体盐酸胍，并以200-300rpm的速度搅拌4-6小时，进行或不进行离心。用含有1-10微摩尔PMSF的25mM Tris-HCl，pH7.5的缓冲液将上述步骤的提取物稀释20倍，并通过离心或过滤澄清。用pH2-4的1-2M柠檬酸将上述澄清的提取物的pH降低到4。在SP-sepharose上对上述pH调整过的提取物进行阳离子交换层析，并且用氯化钠梯度洗脱。
将上述含有IFN的洗脱级份的pH调整到7.0，并加样到装有与AFFI-Gel-10基质结合的单克隆抗体的免疫亲和柱上。用0.2M乙酸，0.15M氯化钠洗脱纯的干扰素。对洗脱的干扰素进行渗滤和消毒过滤。
表1提供了纯化的重组干扰素α的比活性和产量。干扰素α的生物学活性是通过病毒致细胞病变效应减弱实验测定的。该实验中使用了Madin Darby牛肾(MDBK)细胞和水疱性口炎病毒(VSV)。该实验用从英国国家生物学标准和对照研究所获得的国际参考标准进行校正。提供了三批纯化干扰素α的数据。
以上利用遗传工程酵母生产干扰素α的方法与同样使用了重组DNA技术的现有方法相比具有若干优点。首先巴斯德毕赤酵母能够生长到非常高的细胞密度，并且，干扰素基因可以用强的乙醇氧化酶启动子进行表达，从而可以获得高产量的重组干扰素α。另外，甲醇是一种廉价的诱导物。其次，由于所述干扰素基因通过同源重组稳定整合到酵母基因组中，因此，没有必要使用抗生素来维持该质粒。第三，所采用的纯化方法简单、有效，并且能得到高回收量的表达蛋白。第四，该方法可以方便地加以放大，以便大规模纯化干扰素α。最后，因为酵母是真核生物，它能提供更适合真核干扰素蛋白折叠的环境。也许正是由于这种原因，发现通过上述方法生产的干扰素所提供的比活性，高于以前报导的有关从大肠杆菌中纯化的干扰素的比活性。
因此，本发明用于由遗传工程酵母巴斯德毕赤酵母生产人干扰素α的方法简单、有效，并且容易放大进行大规模生产。纯化干扰素α的产量和比活性，高于报导的在其他系统中的产量和比活性。
应当理解的是，本发明并不局限于本文所说明和披露的各部分的特定结构和排列顺序，而且包括可以从以下权利要求书范围中得出的它的改进形式。
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权利要求
1.一种用于由遗传工程酵母生产具有生理学活性的人干扰素α的方法，该方法包括a.用一种酶消化一种具有一个启动子，并且在缺乏融合区的情况下与一种人干扰素α基因可操作地连接的质粒，以便产生一种线性化的质粒；b.通过同源重组用线性化的质粒转化巴斯德毕赤酵母细胞，以便形成巴斯德毕赤酵母克隆；c.筛选所述巴斯德毕赤酵母克隆的高水平干扰素α表达，以便寻找高产干扰素的巴斯德毕赤酵母克隆；d.生长所述高产干扰素巴斯德毕赤酵母克隆；和e.从所述高产干扰素巴斯德毕赤酵母克隆中纯化具有生理学活性的人干扰素α蛋白。
2.如权利要求1的方法，其中，在步骤(a)中，所述质粒是通过以下步骤构建的将人干扰素α基因克隆到含有AOX1启动子的质粒pHIL-D2上；用含有所述克隆的人干扰素α基因的质粒pHIL-D2转化大肠杆菌；并筛选转化过的大肠杆菌，寻找具有相对质粒pHIL-D2中的AOX1启动子为正确方向的干扰素α基因的重组克隆。
3.如权利要求1的方法，其中，在步骤(a)中，所述消化包括用NotI酶消化。
4.如权利要求1的方法，其中，在步骤(d)中，所述生长包括在pH5.0，28-30℃的条件下，在发酵罐中生长所述高产干扰素巴斯德毕赤酵母克隆，以500-1500rpm的速度旋转培养2天；并且包括用甲醇诱导所述高产干扰素巴斯德毕赤酵母克隆48小时。
5.如权利要求1的方法，其中，在步骤(e)中，所述纯化包括i.用一种缓冲液洗涤所述高产干扰素巴斯德毕赤酵母克隆；ii.裂解所述高产干扰素巴斯德毕赤酵母克隆；iii.添加蛋白增溶剂至所述高产干扰素巴斯德毕赤酵母克隆中，以便形成一种提取物；iv.用一种缓冲液稀释提取物，然后澄清稀释过的提取物；v.用一种缓冲液将上述提取物的pH调整到pH3-5，然后对该提取物进行离心或过滤；vi.将上述提取物吸附在阳离子交换柱上，并洗脱具有生理学活性的人干扰素α的蛋白；vii.将上述具有生理学活性的人干扰素α蛋白的pH调整到中性pH；并将它吸附在含有与一种基质结合的抗人干扰素α的单克隆抗体的免疫亲和柱上；并在低于4.0的pH下洗脱纯的具有生理学活性的干扰素α蛋白；和viii.渗滤；然后ix.对所述洗脱的具有生理学活性的干扰素α蛋白进行消毒过滤。
6.如权利要求5的方法，其中，在步骤(ii)中，所述裂解包括在有蛋白酶抑制剂存在的条件下，在玻璃珠研磨机中用玻璃珠裂解。
7.如权利要求6的方法，其中，在步骤(ii)中，所述蛋白酶抑制剂包括0.5-2.0mM的苯甲基磺酰氟。
8.如权利要求5的方法，其中，在步骤(i)中，所述缓冲液包括25-100mM的磷酸钠缓冲液，pH6.5-8.0。
9.如权利要求5的方法，其中，在步骤(iii)中，所述添加包括添加蛋白增溶剂至最终浓度为4-8M，并在4-7℃下，以200-300rpm的速度搅拌2-10小时。
10.如权利要求9的方法，其中，在步骤(iii)中，所述蛋白增溶剂包括浓度为4-8M的盐酸胍或尿素。
11.如权利要求5的方法，其中，在步骤(iv)中，所述稀释包括稀释10-30倍；缓冲液包括25-100mM Tris-HCl，0-1M的尿素，pH6.5-8.0；而所述澄清包括离心或过滤。
12.如权利要求11的方法，其中，还包括通过超滤浓缩所述提取物。
13.如权利要求5的方法，其中，在步骤(iv)中，所述澄清包括离心或过滤。
14.如权利要求5的方法，其中，在步骤(v)中，所述用一种缓冲液调整提取物的pH包括用pH2-5的25-100mM的柠檬酸缓冲液或1-2M的柠檬酸缓冲液。
15.如权利要求5的方法，其中，在步骤(vi)中，所述吸附包括将提取物吸附在阳离子交换柱上。
16.如权利要求15的方法，其中，还包括用25-100mM，pH4-5柠檬酸缓冲液稀释所述浓缩的提取物；然后进行离心或过滤。
17.如权利要求5的方法，其中，在步骤(vi)中，所述洗脱包括用碱金属氯化物洗脱。
18.如权利要求17的方法，其中，在步骤(vi)中，所述洗脱包括用氯化钠洗脱。
19.如权利要求5的方法，其中，在步骤(vii)中，所述吸附包括将它吸附在含有与一种基质结合的抗人干扰素α的单克隆抗体的免疫亲和柱上，所述基质是可以通过伯胺连接配体的亲和支持物。
20.如权利要求5的方法，其中，在步骤(vii)中，所述洗脱包括在2-4的pH下洗脱纯的具有生理学活性的干扰素α蛋白。
21.一种用于由遗传工程酵母生产具有生理学活性的人干扰素α的方法，包括a.在缺乏融合区的情况下，将人干扰素α基因克隆到含有AOX1启动子的质粒pHIL-D2中；b.用含有克隆的人干扰素α基因的质粒pHIL-D2转化大肠杆菌；c.筛选转化过的大肠杆菌，寻找具有相对质粒pHIL-D2中的AOX1启动子为正确方向的干扰素α基因的重组克隆；d.用一种酶消化质粒pHIL-D2，以便产生pHIL-D2的片段。e.通过同源重组用具有干扰素α基因的pHIL-D2的片段转化巴斯德毕赤酵母细胞，以形成巴斯德毕赤酵母克隆；f.筛选所述巴斯德毕赤酵母克隆，寻找高表达干扰素α的高产干扰素巴斯德毕赤酵母克隆；g.生长所述高产干扰素巴斯德毕赤酵母克隆；h.用一种缓冲液洗涤所述高产干扰素巴斯德毕赤酵母细胞；i.裂解所述高产干扰素巴斯德毕赤酵母克隆；j.添加蛋白增溶剂至所述高产干扰素巴斯德毕赤酵母克隆中，以便形成一种提取物；k.用一种缓冲液稀释提取物，然后澄清稀释过的提取物；l.用一种缓冲液将上述提取物的pH调整到pH3-5，然后对该提取物进行离心或过滤；m.将上述提取物吸附在阳离子交换柱上，并洗脱含有具有生理学活性的人干扰素α的蛋白的混合物；n.将上述具有生理学活性的人干扰素α蛋白的pH调整到中性pH；并将它吸附在含有与一种基质结合的抗人干扰素α的单克隆抗体的免疫亲和柱上；并在低于4.0的pH下洗脱纯的具有生理学活性的干扰素α蛋白；和o.渗滤；然后对所述洗脱的具有生理学活性的干扰素α蛋白进行消毒过滤。
22.一种用权利要求1的方法制备的重组人干扰素。
全文摘要
一种用于由遗传工程酵母巴斯德毕赤酵母生产具有生理学活性的人干扰素α的方法，该方法包括用一种酶消化具有一个启动子，并且在缺乏融合基因的情况下与人干扰素α基因可操作地连接的质粒，以便产生一种线性化的质粒；通过同源重组用所述线性化的质粒转化巴斯德毕赤酵母细胞，以便形成巴斯德毕赤酵母克隆；在所述巴斯德毕赤酵母克隆中筛选干扰素α的高水平表达，以便寻找高产干扰素的巴斯德毕赤酵母克隆；生长所述高产干扰素巴斯德毕赤酵母克隆；并从所述高产干扰素巴斯德毕赤酵母克隆中纯化具有生理学活性的人干扰素α蛋白。
文档编号C12N5/10GK1452658SQ00819549
公开日2003年10月29日 申请日期2000年3月16日 优先权日2000年3月16日
发明者K·V·苏德希尔, C·R·约古拉马, A·V·斯里拉姆, K·S·N·普拉萨德, K·V·拉马纳 申请人:山塔生物技术股份有限公司