专利名称：人子宫颈癌抑制蛋白,编码该蛋白的多核苷酸,用该多核苷酸转化的细胞和用表达载体抑 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种人子宫颈癌抑制蛋白，编码所述蛋白的多核苷酸，包含所述多核苷酸的表达载体，用所述表达载体转化的细胞，使用所述表达载体抑制癌细胞增殖的方法和包含所述多核苷酸的预防或治疗癌症的药物组合物。
已报道了超过20个肿瘤抑制基因和由它们突变引起的癌症倾向综合征(Haber DA等.，Lancet，351，1-8(1998))。其中，已发现p53肿瘤抑制基因编码序列的变更是大多数人类癌症的遗传起源(Weinberg RA，见上；Klein G.，见上；和Bishop JM，细胞，64，235-248(1991))。然而，仅一小部分，即2-11％的子宫颈癌组织显示出p53突变(Crook T等.，Lancet，339，1070-1073(1992)；并且Busby-Earle RMC等(Br.J.癌症，69，732-737(1994))已推测对于子宫颈癌，存在其它的肿瘤抑制基因。因此，存在鉴定抑制子宫颈癌的基因的需要。
本发明的另一个目的是提供一种使用这种表达载体抑制癌细胞增殖的方法。
本发明的另一个目的是提供一种包含这种多核苷酸的、预防或治疗癌症的药物组合物。
按照本发明的一个方面，提供了一种分离自人的肿瘤抑制蛋白，其具有氨基酸序列SEQ ID NO2。
图10A和10B是用膜联蛋白V-FITC和PI染色的HCCS-1转染的HeLa细胞和亲本野生型细胞的各自的流式细胞计数(flow cytometric)的分析结果；和
图11A和11B是不用阿霉素或UVC处理的转染了HCCS-1基因的HeLa细胞和亲本野生型细胞各自的细胞周期分布图；
图11C和11D，0.1μg/ml阿霉素处理后的细胞周期分布图；
图11E和11F，2μg/ml阿霉素处理后的细胞周期分布图；和
图11G和11H，UVC处理后的细胞周期分布图。
发明详述本发明的肿瘤抑制蛋白，即人子宫颈癌抑制蛋白1(下文为“HCCS-1蛋白”)，具有氨基酸序列SEQ ID NO2，和约9kDa的分子量。然而，可进行该蛋白氨基酸残基的各种取代，加成和/或缺失，而对蛋白的功能无不利的影响。而且，当实现特殊的用途时，可使用该蛋白的一部分。此处使用的术语“本发明的肿瘤抑制蛋白”包括这些修饰的氨基酸和它们的片段。因此，在它的范围方面，本发明包括具有与具有SEQ ID NO2氨基酸序列的HCCS-1蛋白基本相同氨基酸序列的多肽和它的片段。作为在此处使用，“基本相同的多肽”表示一种多肽，其氨基酸序列显示与氨基酸序列SEQ ID NO2优选80％或更多，更优选90％或更多，最优选95％或更多的同源性。
本发明的HCCS-1蛋白可由包含按照遗传密码，从HCCS-1蛋白的氨基酸序列推导出的核苷酸序列的多核苷酸编码(下文为“HCCS-1基因”)。已知由于密码简并性，可存在几个不同的密码子编码同一个氨基酸，因此，本发明的HCCS-1基因可包括从HCCS-1蛋白的氨基酸序列推导出的各种核苷酸序列。优选的HCCS-1基因具有核苷酸序列SEQ ID NO1，其长555-bp，并包含79个氨基酸残基的开放阅读框架。核苷酸序列SEQ ID NO1于2000年3月24日于GenBank注册，注册号为AF249277。
本发明的HCCS-1基因或蛋白可获自人组织或使用常规的DNA或肽合成法合成。而且，可将如此制得的基因插入到常规载体中，以获得表达载体，其又可被引入合适的宿主例如微生物如大肠杆菌或酵母，或动物细胞如鼠或人细胞中。
然后转化的宿主可用于大规模生产本发明的DNA或蛋白。例如，用含本发明HCCS-1基因的表达载体pCEV-LAC(表示为HCCS-1/pCEV-LAC)转化大肠杆菌JM109(Miki，T.等.，基因，83，137-146(1989))，以获得表示为JM109/HCCS1的大肠杆菌转化子，按照国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约，其于2000年4月10日保藏于韩国典型培养物保藏中心(Korean Collection for Type Cultures)(地址#52，Oun-dong，Yusong-ku，大田305-333，韩国)，保藏号为KCTC 0768BP。
在制备载体过程中，依据使用的宿主细胞，适当地选择表达控制序列，例如启动子，终止子，自复制序列和分泌信号。
本发明的HCCS-1基因在正常人组织如正常子宫颈，胎盘，肾，肝，骨骼肌，心脏组织中表达，但在癌组织如初期子宫颈癌和转移的骼总淋巴结组织，和癌细胞系如早幼粒细胞性白血病(promyelocytic leukemia)HL-60细胞，HeLa子宫颈癌细胞，慢性骨髓性白血病K-562细胞，淋巴性白血病MOLT-4细胞，伯基特淋巴瘤Raji细胞，SW480结肠癌细胞，A549肺癌细胞和G361黑素瘤细胞中不表达。在正常组织中，大多数它的转录物具有0.6kb的长度，尽管已观察到1.6kb或1.0kb的转录物。
如此表达的本发明的HCCS-1蛋白具有诱导癌细胞程序化细胞死亡的活性。具体地，本发明的HCCS-1蛋白诱导细胞色素c从线粒体至细胞质的释放，以获得DNA断裂。此外，本发明的HCCS-1基因引起质膜脂质改变，如内小叶的磷脂酰丝氨酸转移入胞外侧，从而不可逆地导致细胞死亡。而且，本发明的HCCS-1基因诱导细胞对由化疗剂如阿霉素或放射线如UVC引发的程序化细胞死亡(apoptic)途径更加敏感。本发明的HCCS-1基因诱导肿瘤诱发蛋白如p53肿瘤抑制蛋白突变型，Bc1-2或c-Myc的负调节。
本发明HCCS-1蛋白的这种诱导程序化细胞死亡的活性可在抑制癌细胞增殖的过程中有利地使用。因此，本发明提供了一种抑制癌细胞增殖的方法，其包含将包含本发明HCCS-1基因的表达载体引入癌细胞以诱导癌细胞的程序化细胞死亡。本发明的方法可用于任何类型的癌细胞。优选子宫颈，胎盘，肾，肝，骨骼肌和心脏癌细胞，更优选子宫颈癌细胞。
在本发明的范围内还包括用于治疗或预防癌症的药物组合物，其包含作为活性成分的本发明的肿瘤抑制基因和药用载体，如果需要，也可包括赋形剂或其它添加剂。优选按适于通过注射给药的形式配制本发明的药物组合物。
以常规方式将本发明的药物组合物给药到受试者的癌组织内，以诱导该组织的程序化细胞死亡。例如，按照Kim，J.S.等公开的方法(J.ControlledRelease，53，175-182(1998))，使用疏水的聚-L-赖氨酸衍生物包被本发明的肿瘤抑制基因，并将得到的被包被基因注入受试者的癌组织。
可按照各种相关的因素，包括处理的条件，选择的给药途径，患者个体的年龄和体重，患者症状的严重程度确定实际给药的肿瘤抑制基因的量。
下列实施例是意图进一步说明本发明，而不是限制它的范围。实施例1mRNA的差异显示(步骤1)总RNA的分离正常外子宫颈组织样本在子宫切除期间获自子宫肌瘤患者，未处理的初期子宫颈癌和转移的骼总淋巴结组织样本在彻底的(radical)子宫切除期间获得。在Waymouth MB 751/1培养基上培养人子宫颈癌细胞系CUMC-6(Kim JW等.，Gynecol Oncol，62，230-240(1996))。
使用市售系统(RNeasy总RNA试剂盒，Qiagen Inc.，德国)从组织样本和细胞中提取总RNA，使用信息清除试剂盒(Message clean kit)(GenHunter Corp.，Brookline，MA)去除DNA污染物。(步骤2)差异显示按照Liang等的方法(科学，257，967-971(1992)；和癌症研究(CancerRes).，52，6966-6968(1992))，如下少许改动进行差异显示。
用引物H-T11A(SEQ ID NO3)作为锚定寡-dT引物(RNAimage试剂盒，GenHunter)，将0.2μg在步骤1中获得的每种总RNA进行反转录，接着使用相同的锚定引物和任意5′13mer(RNAimage引物对1，H-AP 1-40)，在0.5mM[α-35S]-标记的dATP(1200Ci/mmol)存在下，进行聚合酶链式反应(PCR)。重复40次PCR热循环，每个循环组成如下95℃40秒，40℃2分钟，和72℃40秒，最后将反应在72℃下进行5分钟。将如此获得的PCR产物在6％聚丙烯酰胺测序凝胶上进行电泳，接着放射自显影。
图1表示使用锚定寡-dT引物和任意5′13mer H-AP 37(SEQ ID NO4)，正常外子宫颈组织，子宫颈癌组织，转移的组织和子宫颈癌细胞系CUMC-6的差异显示结果，其中箭头指出仅在正常外子宫颈组织中表达的193bp片段，表示为CG373。这个结果推测片段CG373是肿瘤抑制基因候选基因。
从干燥的序列凝胶上将片段CG373条带切除，并在水中煮沸15分钟以洗脱片段CG373。除了省去[α-35S]-标记的dATP和20μM dNTPs，使用相同的条件将片段CG373进行PCR。使用TA克隆系统(普洛麦格，美国)，将扩增的片段CG373克隆到pGEM-T Easy载体中，并使用测序酶2.0版DNA测序系统(美国生物化学公司(United States Biochemical Co.)，美国)确定它的核苷酸序列，以获得核苷酸序列SEQ ID NO5。使用BLAST和FASTA程序对片段CG373的核苷酸序列与GenBank数据库的核苷酸序列进行比较分析，结果表明这个片段与GenBank数据库中登记的任何一种核苷酸序列具有很少的相似性。实施例2cDNA文库筛选使用32P-标记的随机引物CG373 cDNA探针，通过噬菌斑杂交(Sambrook，J.等.，分子克隆实验室指南(A laboratory manual)，纽约ColdSpring Harbor Laboratory(1989))筛选噬菌体λgt11人肺胚成纤维细胞cDNA文库(通常由Prof. IY Chung at Hanyang University，汉城，韩国提供)，以获得全长cDNA克隆(表示为HCCS-1)。确定了全长HCCS-1cDNA克隆的核苷酸序列。
全长HCCS-1cDNA克隆含555bp具有核苷酸序列SEQ ID NO1的插入片段，和编码一个多肽的完整的开放阅读框架，该多肽由79个氨基酸残基(SEQ ID NO2)组成，具有大约9kDa的分子量。全长HCCS-1cDNA克隆的核苷酸序列于2000年3月24日在GenBank注册，注册号为AF249277。
将全长HCCS-1cDNA插入到载体pCEV-LAC(Miki，T.等.，基因，83，137-146(1989))中，以获得重组载体HCCS-1/pCEV-LAC，并用这个重组载体HCCS-1/pCEV-LAC转化大肠杆菌JM109，以获得转化的大肠杆菌，表示为JM109/HCCS1，其于2000年4月10日保藏于韩国典型培养物保藏中心(Korean Collection for Type Cultures)(地址#52，Oun-dong，Yusong-ku，大田305-333，韩国)，保藏号为KCTC 0768BP。
为确认HCCS-1蛋白，将全长HCCS-1cDNA插入到原核表达载体pGEX4T-1(Amersham Pharmacia，美国)的BamHI和SalI位点。将得到的重组载体HCCS-1/pGEX4T-1转化大肠杆菌BL21。在LB培养基上培养得到的转化子，通过向其中加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导HCCS-1基因的表达，并在37℃下反应混合物3小时。从在诱导前后收集的培养样品中获得蛋白样品，并按照Sambrook等的方法(见上)进行SDS-PAGE。
图2表示诱导前后转化了HCCS-1基因的大肠杆菌蛋白样品的SDS-PAGE分析结果。从图2可以看出，诱导后表达了一个35kDa的蛋白，该蛋白由融合了衍生自pGEX4T-1的26kDa蛋白的HCCS-1蛋白组成。这个结果推测HCCS-1蛋白具有约9kDa的分子量。
通过重复实施例1步骤1的程序，从正常外子宫颈组织，初期子宫颈癌和转移的骼总淋巴结组织；和人子宫颈癌细胞系CUMC-6和HeLa(ATCCCCL-2)制备总RNA。将20μg每种总RNA变性，然后通过1％甲醛琼脂糖凝胶进行电泳，并转移到尼龙膜上(Boehringer-Mannheim，德国)。用32P-标记的随机引物HCCS-1cDNA探针42℃下过夜杂交印迹，探针用rediprime II随机引物标记系统(Amersham，英国)制备。同样重复RNA印迹分析结果两次，通过光密度测定法定量，用β-肌动蛋白探针杂交相同的印迹以确定mRNA的完整性。
使用正常人12多组织(multiple-tissues)(Clontech)和人癌细胞系(Clontech)，按照供应商的推荐进行RNA印迹分析。
图3A表示使用HCCS-1cDNA探针，正常子宫颈组织，初期子宫颈癌组织和子宫颈癌组织细胞系HeLa和CUMC-6的RNA印迹分析结果；和图3B，用β-肌动蛋白探针杂交相同的印迹。从图3A和3B可以看出，在所有的正常子宫颈组织中HCCS-1基因的表达水平提高，但在子宫颈癌组织和子宫颈癌细胞系中却几乎不表达。
图4A表示使用HCCS-1cDNA探针，正常人组织即脑，心脏，骨骼肌，结肠，胸腺，脾，肾，肝，小肠，胎盘，肺和外周血白细胞的RNA印迹分析结果；和图4B，用β-肌动蛋白探针杂交相同的印迹。从图4A和4B可以看出，约1.6kb的优势HCCS-1 mRNA转录物在正常胎盘，肾，肝，骨骼肌和心脏同样超表达，证实低水平表达的其它组织包括，按递减次序排列，肺，脾，外周血白细胞和结肠组织。另外，在胎盘，肾，肝，骨骼肌和心脏组织中鉴定了约1.0和0.6kb的转录物。
图5A表示使用HCCS-1cDNA探针，人白血病和淋巴瘤细胞系，即早幼粒细胞性白血病(promyelocytic leukemia)HL-60细胞，HeLa子宫颈癌细胞，慢性骨髓性白血病K-562细胞，淋巴性白血病MOLT-4细胞，伯基特淋巴瘤Raji细胞，SW480结肠癌细胞，A549肺癌细胞和G361黑素瘤细胞的RNA印迹分析结果；和图5B，用β-肌动蛋白探针杂交相同的印迹。从图5A和5B可以看出，在人白血病和淋巴瘤细胞系中未检测到0.6，1.0和1.6kb HCCS-1转录物。实施例4制备用人HCCS-1基因转染的HeLa细胞(步骤1)表达载体的构建将在实施例2中制备的重组载体HCCS-1/pCEV-LAC用SalI酶切，以获得含555bp全长HCCS-1cDNA的片段。然后，将SalI酶切片段插入到真核表达载体pCEV-27(Miki，T.等.，基因，83，137-146(1989))的SalI位点，以获得表达载体HCCS-1/pCEV-27。(步骤2)用脂转染胺(Gibco BRL)将在步骤1中获得的表达载体HCCS-1/pCEV-27引入HeLa子宫颈癌细胞(ATCC CCL-2)，然后，在补加以0.6mg/ml G418(Gibco)的培养基中选择得到的转染了表达载体HCCS-1/pCEV-27的HeLa细胞。制备仅含pcDNA3的HeLa细胞另一个种群作为对照。
为鉴定HCCS-1基因的超表达，克隆并筛选转染的HeLa细胞。通过重复实施例1步骤1的程序，从转染的HeLa细胞获得总RNA，进行电泳并转到尼龙膜上。用32P-标记的随机引物HCCS-1cDNA探针杂交印迹。
图6表示转染了HCCS-1基因的HeLa细胞(HCCS-1)，仅转染了载体pcDNA3的HeLa细胞(pcDNA3)和亲本野生型HeLa细胞(1×105的细胞数)各自的RNA印迹分析结果。从图6可以看出，一个单个的0.6kb mRNA转录物，其与实施例3中显示的正常子宫颈组织的转录物一致，在转染了HCCS-1基因的HeLa细胞中表达，但在仅转染了载体pcDNA3的HeLa细胞和亲本野生型HeLa细胞中却不表达。实施例5HCCS-1基因对癌细胞的生长抑制为检验HCCS-1基因对子宫颈癌细胞生长的影响，将每种在实施例4步骤2中获得的转染了HCCS-1基因的HeLa细胞，仅转染了pcDNA3的HeLa细胞和野生型HeLa细胞(1×105的细胞数)培养9天。在三个独立的实验中，分别使用胰蛋白酶消化(detach)三角瓶中的细胞，利用台盼蓝染料排阻，在第0，1，3，5，7和9天记数存活的细胞(Freshney，I.R.，动物细胞的培养，2nd Ed.A.R.Liss，纽约(1987))。通过三次测定，数据表示为±S.D.。
图7表示转染了HCCS-1基因的HeLa细胞(HCCS-1)，仅转染了pcDNA3的HeLa细胞(pcDNA3)和亲本野生型细胞的生长曲线。从图7可以看出，与仅转染了pcDNA3的HeLa细胞或野生型HeLa细胞相比，转染了HCCS-1基因的HeLa细胞的死亡率增加。当与野生型HeLa细胞相比时，9天大约50％转染了HCCS-1基因的HeLa细胞保持存活。这个结果推测HCCS-1基因抑制HeLa子宫颈癌细胞的生长。实施例6HCCS-1基因诱导程序化细胞死亡的活性为检验HCCS-1基因是否具有诱导程序化细胞死亡的活性，如下检验转染了HCCS-1基因的HeLa细胞的DNA断裂，细胞色素c的细胞质转移，膜PS改变和化疗剂引发的程序化细胞死亡。(1)DNA断裂分析在Waymouth MB 751/1培养基上将在实施例4步骤2中获得的转染了HCCS-1基因的HeLa细胞，仅转染了pcDNA3的HeLa细胞和亲本野生型细胞培养3，5或7天，然后，进一步在无血清培养基上培养1天。收集细胞并在含100μg/ml蛋白酶K的裂解缓冲液(10mM Tris-HCl，pH 7.4，10mM EDTA，10mM NaCl，和0.5％SDS)中48℃过夜裂解。向其中加入1/5体积的5M NaCl和等体积的异戊醇以沉淀DNA。将DNA沉淀溶解在TE缓冲液(10mM Tris-HCl，pH 7.8，1mM EDTA)中，并用0.1mg/ml的RNA酶A(RNase A)37℃消化4小时。将5μg的DNA在1％琼脂糖凝胶上进行电泳，用溴化乙锭染色，紫外光下显示。
图8表示转染了HCCS-1基因的HeLa细胞在3，5和7天(分别是第3，第5和第7天)，转染了pcDNA3的HeLa细胞(pcDNA3)在第7天，和亲本野生型HeLa细胞在第7天的DNA断裂分析结果。从图8可以看出，在无血清培养基中，在细胞死亡期间，以依靠时间的方式，与亲本野生型细胞相比，在转染了HCCS-1基因的HeLa细胞中DNA断裂成oligonucleosomal梯是明显的，这推测HCCS-1基因诱导子宫颈癌细胞中的程序化细胞死亡。(2)细胞色素c的细胞质转移为检验在转染的细胞中细胞色素c的细胞质转移，按照Akao Y等(癌症研究(Cancer Res)，54，2468-71(1994))如下确定亚细胞部分的细胞色素c含量。(步骤1)亚细胞分级用PBS洗涤在实施例4步骤2中获得的转染了HCCS-1基因的HeLa细胞，并悬浮在低渗溶液(10mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸，10mMMgCl2和42mM KCl)中，置于冰上5分钟。使细胞流过30计量针(30-gauge needle)，并在600g下离心10分钟，以收集粗胞核。将上清液10,000g下离心10分钟，以获得一个上清液，其在100,000g下被进一步离心90分钟。得到的沉淀和上清液分别用作未标记膜(light membrane)(线粒体部分)和细胞质部分。(步骤2)蛋白质印迹为测定胞质和线粒体部分的细胞色素c含量，如下进行蛋白质印迹。
将在步骤1中获得的胞质和线粒体部分在10％SDS-PAGE上进行电泳，然后电印迹到硝酸纤维素膜上。在三羟甲基氨基甲烷缓冲的盐水(TBS；10mM Tris-HCI，pH 7.5和150mM NaCl)中用5％无脂奶粉孵育该膜1小时，并用一级抗体即鼠抗细胞色素c单克隆抗体(PharMingen，美国)4℃下孵育16小时。洗涤得到的膜，然后室温下用封闭液孵育，封闭液含1∶1,000稀释的二级抗体即结合辣根过氧化物酶的二级羊抗鼠或羊抗兔免疫球蛋白(Jackson免疫研究(ImmunoResearch))。用ECL-蛋白质印迹检测试剂盒(Amersham，Buckinghamshire，UK)显现蛋白。
图9表示转染了HCCS-1基因的HeLa细胞(HCCS-1)和亲本野生型HeLa细胞(野生)的线粒体和细胞质部分的蛋白质印迹分析结果。从图9可以看出，在转染了HCCS-1基因的HeLa细胞中，线粒体部分的细胞色素c被减少，而胞质部分的细胞色素c以伴随方式增加。这些结果推测HCCS-1基因诱导细胞色素c从线粒体到胞质的释放。(3)膜PS改变为检验质膜PS转移，如下进行结合了膜联蛋白V/PI分析系统(VermesI等.，免疫方法杂志(J Immunol Methods).，184，39-51(1995))的流式细胞计数分析。
用冷的PBS洗涤在实施例4步骤2中获得的转染了HCCS-1基因的1×107HeLa细胞，并在10μl的10×结合缓冲液(100mM HEPES pH 7.4，1.5M NaCl，50mM KCI，10mM MgCl2和18mM CaCl2)中稀释。如同程序化细胞死亡试剂盒的生产者(TACSTM膜联蛋白V-FITC，Trevigen，Inc.，Gaithersburg，MD，美国)所指示的，向其中加入1μl的膜联蛋白V偶联物和10μl的碘化丙锭(PI)。将得到的细胞悬液在黑暗中室温孵育15分钟，并向其中加入400μl1×结合缓冲液，然后在Coulter XL Epics流式细胞仪(Coulter Corp.，Miami，FL)上进行分析。
图10A和10B表示使用膜联蛋白V-FITC和PI，转染了HCCS-1基因的HeLa细胞和亲本野生型细胞各自的流式细胞计数分析结果。在
图10A和10B中，log绿色荧光(膜联蛋白V-FITC)对log红色荧光(PI)显示四种种群对两种荧光均显阴性的细胞(R1；下面的左象限)，其代表活的靶细胞；膜联蛋白V-FITC阳性和PI阴性细胞(R2；下面的右象限)，其代表早期的程序化细胞死亡的细胞；对两种荧光均显阳性的细胞(R3；上部的右象限)，其代表晚期程序化细胞死亡的或坏死的细胞，和膜联蛋白V-FITC阴性和PI阳性细胞(R4；上部的左象限)，其代表仅具有透化的(permeabilized)膜的细胞(Aubry J-P等.，细胞计量术，37，197-204(1999))。从
图10A和10B可以看出，有生存的(R1)，早期程序化细胞死亡的(R2)，和晚期程序化细胞死亡的或坏死的(R3)细胞，并且在早期程序化细胞死亡过程中有22％的转染了HCCS-1基因的总HeLa细胞，而有2.2％的野生型HeLa细胞。从这个结果推测HCCS-1基因诱导与质膜脂质改变相关的程序化细胞死亡。
由于在HeLa子宫颈癌细胞中HCCS-1诱导的程序化细胞死亡，这些膜联蛋白V/PI流式细胞计结果是与(2)的细胞色素c释放结果充分相关的。(4)阿霉素或UVC引发的程序化细胞死亡为检测是否药物或紫外光引发转染了HCCS-1基因的细胞的程序化细胞死亡，如同Hedley，D.W.所描述(在流式细胞计中，来自石蜡内嵌块的DNA分析(eds Darzynkiewicz，Z.& Crissman，H.A.)139(Academic Press，San Diego，1990))，进行细胞周期动力学分析。
将在实施例4步骤2中获得的转染了HCCS-1基因的HeLa细胞和亲本野生型细胞培养直至对数中期，并在含0.5％牛的小牛血清的WaymouthMB752/1培养基中孵育36小时以使细胞生长停滞在G0/G1期。用阿霉素(分别为0.1和2μg/ml)或UVC(J/m2)处理细胞，然后，在含0.5％牛的小牛血清的Waymouth MB752/1培养基中培养细胞以恢复细胞生长。24小时后，收获HeLa细胞，用胰蛋白酶处理，并在70％乙醇中固定。
将50μg/ml的PI染色溶液(Sigma)和100单位/ml RNA酶A(BoerhingerMannheim)加入到2×106固定的细胞中。孵育1小时后，使用FACS Caliber(Becton Dickinson)，通过在488nm的荧光分析确定细胞DNA含量。用Modfit 5.2软件分析1×104个细胞每个样本的最小值。
图11A和
图11B是未经阿霉素或UVC处理的，转染了HCCS-1基因的HeLa细胞和亲本野生型细胞各自的细胞周期图；
图11C和11D，用0.1μg/ml阿霉素处理后；
图11E和11F，2μg/ml阿霉素处理后；和
图11G和11H，UVC处理后，其中M1表示G0/G1期；M2，S-期；M3，G2/M期；和M4，程序化细胞死亡的亚G0/G1期。从
图11A-11H可以看出，在亲本野生型细胞和转染了HCCS-1基因的HeLa细胞之间，在细胞种群中关于细胞周期进展阿霉素未引起明显的差异。在野生型HeLa细胞中，用阿霉素或UVC处理后，几乎没有细胞保持在程序化细胞死亡的亚G0/G1期。相反，相当大量的转染了HCCS-1基因的细胞仍处于程序化细胞死亡的亚G0/G1期。这些结果推测HCCS-1基因诱导细胞对于药物或紫外光引发的程序化细胞死亡更敏感。
仅参照优选的实施方案对本发明进行了描述和说明，对于那些本领域的技术人员是明显的，即如果未脱离在后附的权利要求中限定的本发明的精神和范围，可对本发明进行各种改变和修改。
涉及微生物或其它生物材料的保藏的说明保藏人金振宇Hyundae Apt.118-804，Apgujung-dong，Kangnam-gu，汉城135-110，韩国
序列表<110>金振字<120>人子宫颈癌抑制蛋白，编码该蛋白的多核苷酸，用该核苷酸转化的细胞和用表达载体抑制癌细胞增殖的方法<130>PCA01147/KJW<150>KR 2000-21897<151>2000-04-25<160>5<170>KOPATIN 1.5<210>1<211>555<212>DNA<213>人<220><221>CDS<222>(283)..(522)<400>1ggccattacc aatcgcgaaa cccgaatccc ggacctgcgc tgaggaggcg gttcatctgt 60ggccagcggt gcttcgggac ccgcgctggg ggaaccctgg cgacggggcc tggccctgct120atatgcgggg gcctcggctg gagtgagcgg cgtggacgcc tctttcctcc ggctcttccc180ttgttgctgc gagagcgaga gggccgcggg cggcggaggc agcggggccg ggatggagga240cgttaactct aacgtgaacg cggaccagga ggctggagtg ca atg gcg cga 291Met Ala Arg1tct cgg ctc act gca acc tct gtc tcc cag gtt cag gaa aat ggc ttt 339Ser Arg Leu Thr Ala Thr Ser Val Ser Gln Val Gln Glu Asn Gly Phe5 10 15gta aag aag ctt gag cct aaa tct ggc tgg atg act ttt cta gaa gtt 387Val Lys Lys Leu Glu Pro Lys Ser Gly Trp Met Thr Phe Leu Glu Val20 25 30 35aca gga aag atc tgt gaa atg ctc ttc tgt cct gaa gca ata ctg ttg 435Thr Gly Lys Ile Cys Glu Met Leu Phe Cys Pro Glu Ala Ile Leu Leu40 45 50acc aga aag gac act cta tat tgt gaa acc ggc cta att ttt ctg act483Thr Arg Lys Asp Thr Leu Tyr Cys Glu Thr Gly Leu Ile Phe Leu Thr55 60 65ctt acg aaa acg att gcc aac aca tac ttc tac ttt taaataaacaa530Leu Thr Lys Thr Ile Ala Asn Thr Tyr Phe Tyr Phe ***70 75 80ctttgatgat gtaacttgaa aaaaa555<210>2<211>79<212>PRT<213>人<400>2Met Ala Arg Ser Arg Leu Thr Ala Thr Ser Val Ser Gln Val Gln Glu1 5 10 15Asn Gly Phe Val Lys Lys Leu Glu Pro Lys Ser Gly Trp Met Thr Phe20 25 30Leu Glu Val Thr Gly Lys Ile Cys Glu Met Leu Phe Cys Pro Glu Ala35 40 45Ile Leu Leu Thr Arg Lys Asp Thr Leu Tyr Cys Glu Thr Gly Leu Ile50 55 60Phe Leu Thr Leu Thr Lys Thr Ile Ala Asn Thr Tyr Phe Tyr Phe ***65 70 75 80<210>3<211>16<212>DNA<213>人工序列<220><223>H-T11G锚定的寡-dT引物<400>3aagctttttt tttttg 16<210>4<211>13<212>DNA<213>人工序列<220><223>任意5′13 mer H-AP 37<400>4aagcttgggc cta 13<210>5<211>193<212>DNA<213>人<400>5taactctaac gtgaacgcgg accaggaggc tggagtgcaa tggcgcgatc tcggctcact 60gcaacctctg tctcccaggt tcaggaaaat ggctttgtaa agaagcttga gcctaaatct120ggctggatga cttttctaga agttacagga aagatctgtg aaatgctctt ctgtcctgaa180gcaatactgt tga 193权利要求
1.一种分离自人的肿瘤抑制蛋白，其具有氨基酸序列SEQ ID NO2。
2.一种编码权利要求1的肿瘤抑制蛋白的多核苷酸。
3.权利要求2的多核苷酸，其具有核苷酸序列SEQ ID NO1。
4.一种包含权利要求2或3的多核苷酸的表达载体。
5.权利要求4的表达载体，其是载体HCCS-1/pCEV-LAC。
6.一种用权利要求4的表达载体转化的细胞，该细胞是微生物细胞或动物细胞。
7.权利要求6的细胞，其是大肠杆菌JM109/HCCS1(KCTC 0768BP)。
8.一种抑制癌细胞增殖的方法，其包含将权利要求4的表达载体引入癌细胞，以诱导它的程序化细胞死亡。
9.一种预防或治疗癌症的组合物，其包含治疗有效量的权利要求2或3的多核苷酸和药用载体。
全文摘要
本发明提供了一种具有氨基酸序列SEQ ID NO2的人肿瘤抑制蛋白；编码该肿瘤抑制蛋白的多核苷酸；含该多核苷酸的表达载体；用该表达载体转化的微生物或动物细胞；一种抑制癌细胞增殖的方法，其包含将该表达载体引入癌细胞以诱导它的程序化细胞死亡；和一种预防或治疗癌症的药物组合物，其包含治疗有效量的多核苷酸和药用载体。
文档编号C12N15/12GK1451016SQ00819384
公开日2003年10月22日 申请日期2000年12月4日 优先权日2000年4月25日
发明者金振宇 申请人:金振宇