专利名称：发酵生产柠檬酸的方法及该方法所用的菌株的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物发酵领域，尤其涉及发酵生产有机酸的领域。更具体地说，本发明涉及一种用糖蜜作为原料来发酵生产柠檬酸的方法，以及该方法所用的菌株。
背景技术：
柠檬酸通常是用淀粉作为碳源发酵生产制得的。由于我国有发达的制糖工业，作为制糖工业副产物的糖蜜来源相当丰富，因此也有人尝试用糖蜜作为碳源来发酵生产柠檬酸。然而，由于糖蜜中含有成分非常复杂的各种有机物质和无机物质，因此在现有技术中用糖蜜作为原料来直接发酵生产柠檬酸还存在很大的困难。针对这一问题，有人用经过预处理的糖蜜作为发酵原料，但是这种方法还需对糖蜜进行附加的预处理步骤，而且发酵水平都不高，产酸、转化率等各项指标都无法与水解糖为原料的工艺以及我国的以淀粉为原料的工艺相比。目前还没有关于用未经预处理的糖蜜来直接发酵生产柠檬酸的报道。
发明内容
因此，本发明所要解决的技术问题是用糖蜜作为原料来发酵生产柠檬酸。本发明的另一个目的在于提供一种用于发酵生产柠檬酸的新的黑曲霉菌株。
本发明一方面涉及一种生产柠檬酸的方法，该方法是在培养基中利用微生物发酵产生柠檬酸，其特征在于，所述培养基含有糖蜜，所述微生物是黑曲霉(Aspergillusniger)SNGB313 CGMCC No.0568。
在该方法中，发酵温度为33-37℃，较佳的为34-36℃，更佳的为35℃。发酵罐的压力可以在0.5-1.5千克/平方厘米之间，较佳的为1千克/平方厘米。通气量宜为400-550立方米/小时，较佳的可采用三级通气，例如在发酵0-35小时之间为430立方米/小时，35-66小时之间为480立方米/小时，67小时以后为540立方米/小时。发酵初pH是培养基的自然pH。在发酵过程，无需对pH进行控制，但pH通常可在2-8之间。这些参数的控制和选择对于本领域技术人员来说均是显而易见的。
发酵后，产物柠檬酸可用本领域技术人员已知的常规方法如钙盐法来提取精制，例如参见中国轻工业出版社2000年10月出版的《发酵工业有机酸生产与应用手册》。
在本发明的发酵方法中，作为原料的糖蜜可以从商业途径购得。而且，经过试验性生产证实，本发明的黑曲霉变种SNGB313对从各种商业途径购得的糖蜜均可达到相近的发酵水平。购得的糖蜜无需经过任何预处理即可直接用于发酵。本文所述的“无需预处理直接用于发酵”是指无需通过分离、过滤等手段来进行纯化或改变糖蜜的有效组成和含量，就可直接进行灭菌、稀释来配制培养基。由于糖蜜中还含有未被除去的微生物生长所需的其它成分，因此，本发明的发酵培养基中可以不加入常规的微生物发酵培养基所需的其它物质，如其它碳源、氮源、无机盐和金属盐。当然，本领域技术人员也可通过试验来进一步优化发酵培养基组成，例如培养基中可含有硫酸铵。因此，糖蜜的浓度以及加入其它物质的选择对于本领域技术人员来说是显而易见的。由于各批糖蜜的还原糖含量稍有差别，因此宜用还原糖浓度来表示。在本发明的实践中，培养基中的还原糖浓度可以在4-20％之间，较佳的为6-15％，更佳的是为12-15％。该还原糖浓度可用本领域技术人员已知的常规手段(如菲林定糖法)来测定。
本发明方法中所用的黑曲霉变种SNGB313可通过直接接种或中罐培养等常规方式加入发酵培养基中。该黑曲霉变种SNGB313是从浙江奉化果园土壤中分离获得的野生型黑曲霉经紫外线处理、Co60-γ射线照射以及硫酸二乙酯反复诱变处理筛选获得的。该菌株已经于2001年4月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(中国，北京)，保藏号为CGMCC No.0568。
中国微生物保藏中心华东分站对该菌种的形态和性质所作描述如下菌落形态在糖蜜平板培养基上生长非常快，35℃培养4天，菌落直径为4-5厘米，中央絮绒状，边缘平坦，菌丝白色，分生孢子着生致密，呈黑褐色。
显微结构在斜面培养基中营养菌丝有横隔，呈无色，直径为5-10μ。分生孢子梗白色基质生出，表面光滑，在顶囊下不溢缩，长度为2-3毫米，直径为10-18微米。顶囊球形，直径一般为40-50微米。小梗单层，梗基无色，长度为10-12微米，宽3微米。分生孢子球形，呈黑褐色，表面粗糙生刺，直径4-7微米，以串珠式排列。
碳源利用糖蜜。
本发明另一方面涉及一种霉菌，其特征在于，它是黑曲霉菌SNGB313 CGMCCNo.0568。
通过上文描述以及下文实施例可以看出，本发明具有以下优点。第一，糖蜜可作为原料来直接用于发酵生产，无需进行预处理，因此缩短了整个生产周期。第二，由于未经预处理的糖蜜中还含有微生物生长所需的其它成分，因此，糖蜜可作为本发明发酵培养基的主要组分或直接作为发酵培养基(即其中不加入其它物质)，从而大大节约了生产成本。
具体实施例方式
为了便于理解本发明，下面将结合实施例来进一步详细描述本发明。然而，这些实施例只是起说明的作用，而本发明并不局限于这些实施例。在下文实施例中，除非另有特指，所有百分数均指每100毫升培养基所含克数。应注意，在所有培养基中，糖蜜的浓度均以还原糖浓度来表示。
实施例a)培养基的组成斜面培养基含糖6％(对于含还原糖50％的糖蜜(购自四川犍为糖厂)而言，含糖蜜12％)；2.5％琼脂。
平板培养基含糖6％(含糖蜜12％)；2.5％琼脂。
酸性培养基含糖6％(含糖蜜12％)；2％柠檬酸；3.0％琼脂。
发酵培养基含糖15％(含糖蜜30％)；0.3％硫酸铵。
b)黑曲霉SNGB313的诱变和筛选首先，从浙江奉化果园土壤中分离出野生型黑曲霉(Aspergillus .niger)(命名为13-1)。随后，进行紫外线处理。具体方法如下取其斜面一支，用无菌水洗刮，洗下孢子置于含有玻璃珠三角瓶内震荡5分钟，清液稀释至一定浓度。取孢子悬浮液2毫升于培养皿中，于40W紫外灯下，距离9厘米，震荡15～20分钟。适当稀释后涂布在酸性培养基上，35℃培养5天。挑出单菌落在斜面培养基上35℃培养5～7天。
随后如下进行Co60-γ射线照射诱变取斜面一支，同法制得孢子悬浮液，取数毫升在钴源(Co60-γ射线)下辐射，剂量为10万伦琴，时间为1小时。将处理的孢子悬浮液适当稀释后涂布在酸性培养基上，35℃培养5天。挑出单菌落在斜面培养基上35℃培养5～7天。
分离出单菌，如下进行NTG处理。取斜面一支，同法制得孢子悬浮液，加入亚硝基胍(NTG)剂量为400μg/ml，30℃处理40分钟。将经反复洗涤的处理孢子用以柠檬酸为唯一碳源的选择性培养基中培养24小时，清液适当稀释后涂布在酸性培养基上，35℃培养5天。挑出单菌落在斜面培养基上35℃培养5～7天。
对上述所得菌落反复硫酸二乙酯和Co60-γ射线照射处理数次。硫酸二乙酯处理的具体方法如下取斜面一支，用50毫升含1滴土温60的磷酸缓冲液洗刮，用玻璃珠分散后取数毫升加入到磷酸缓冲液内，摇匀后加入一定量无水酒精，再加入数毫升硫酸二乙酯，在30℃摇床震荡10分钟，加入硫代硫酸钠10毫升解毒10分钟，将处理的孢子悬浮液适当稀释后涂布在酸性培养基上，35℃培养5天。挑出单菌落在斜面培养基上35℃培养5～7天。
最后通过摇瓶培养并测定各项发酵指标，筛选得到一株黑曲霉，命名为SNGB313。该菌株的形态描述如下所述菌落形态在糖蜜平板培养基上生长非常快，35℃培养4天，菌落直径为4-5厘米，中央絮绒状，边缘平坦，菌丝白色，分生孢子着生致密，呈黑褐色。
显微结构在斜面培养基中营养菌丝有横隔，呈无色，直径为5-10μ。分生孢子梗白色基质生出，表面光滑，在顶囊下不溢缩，长度为2-3毫米，直径为10-18微米。顶囊球形，直径一般为40-50微米。小梗单层，梗基无色，长度为10-12微米，宽3微米。分生孢子球形，呈黑褐色，表面粗糙生刺，直径4-7微米，以串珠式排列。
碳源利用糖蜜。
c)用糖蜜发酵生产柠檬酸将发酵培养基在250ml三角瓶中分装50ml，用绒布封口，121℃灭菌20分钟，冷却后接斜面孢子或菌丝，置于35℃的290rpm旋转式摇瓶机上发酵五天。
在50立方米不锈钢标准罐中，装入发酵培养基45立方米(含4.5立方米种子培养液)，115℃消毒10分钟，采用菌丝二级接种，接种量10％。控制条件为罐压1千克/平方厘米；罐温35℃±1℃；搅拌速度90rpm。通气采用三级生风，其中0-35小时为430立方米/小时；36-66小时为480立方米/小时；67-结束为540立方米/小时。
表1报道了用野生型黑曲霉13-1和本发明的黑曲霉SNGB313的摇瓶比较结果。表2报道了本发明的黑曲霉菌株SNGB313在50立方米生产试验中的结果。
表1野生型黑曲霉13-1和本发明的黑曲霉SNGB313的摇瓶结果
表2黑曲霉菌株SNGB313 50立方米生产试验结果
从表1可以看出，经改良的黑曲霉菌株SNGB313在产酸、转化率和发酵周期等工艺参数上比野生型13-1均有明显改进。表2的数据表明，利用糖蜜作为原料可获得与淀粉质作为原料的常规发酵工艺相接近的发酵水平。
权利要求
1.一种生产柠檬酸的方法，该方法是在培养基中利用微生物发酵产生柠檬酸，其特征在于，所述培养基含有糖蜜，所述微生物是黑曲霉(Aspergillus niger)SNGB313CGMCC No.0568。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述糖蜜是未经预处理的糖蜜。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养基中的还原糖浓度为4-20％。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵温度为33-37℃。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通气量在400-550立方米/小时之间。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在发酵过程中采用0-35小时之间为430立方米/小时，35-66小时之间为480立方米/小时，67小时以后为540立方米/小时的三级通气。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法还任选地包括在发酵后对发酵液进行纯化。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，该纯化方法是钙盐法。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养基中还可含有硫酸铵。
10.一种霉菌，其特征在于，它是黑曲霉菌SNGB313 CGMCC No.0568。
全文摘要
本发明提供了一种发酵生产柠檬酸的方法，所述柠檬酸是用糖蜜作为原料通过黑曲霉SNGB313发酵制得的。该发酵方法无需对糖蜜原料进行预处理，且发酵培养基中无需加入其它物质。本发明还提供了用于该发酵方法的黑曲霉SNGB313菌株。
文档编号C12P7/48GK1393564SQ01113239
公开日2003年1月29日 申请日期2001年7月4日 优先权日2001年7月4日
发明者朱宝娣, 胡军, 钱志良 申请人:上海新立工业微生物科技有限公司