专利名称：检棒分析改良的捕获及检测形式多样性的制作方法
技术领域：
本发明涉及检棒(dipsticks)改良的核酸检测。本发明的检棒用于检测样品溶液中目标核酸的存在，例如鉴定病人是否受致病微生物，例如砂眼衣原体(Chlamydia trachomatis(CT))的感染。
用于检测样品溶液中目标核酸存在的一些常规测试依赖利用聚合酶链式反应(PCR)扩增目标核酸。此反应可检测小量的目标核酸，然而得到结果前需耗时数小时，但因通常希望可尽快得到结果，例如使病人等待的时间减至最少，故此为其显著缺点。此等方法的进一步缺点是需要昂贵的专家设备进行反应以及相当高成本的试剂。
相反，检棒可检测未扩增的目标核酸，不需任何专家设备且能比基于PCR的方法更快速地得到结果。病人就可于同时接受治疗，故特别有益于不喜欢或不能日后复诊的病人。
US5,310,650所述的典型常规检棒中，单链DNA捕获探针固定于硝化纤维素滤器上远离过滤器末端(接触端)的捕获区。捕获探针序列互补于欲测目标核酸第一区域的序列。标记的单链DNA检测探针固定于硝化纤维素滤器上捕获区及滤器接触端之间的探针区。检测探针含有互补于目标核酸第二区域序列(不同于第一区域)的序列。
在认为含有目标DNA的样品溶液中检测目标DNA时，将硝化纤维素滤器的接触端接触样品溶液。样品溶液通过毛细作用进入滤纸并经过探针区及捕获区。当样品溶液经过探针区时，可使检测探针移动并使其与样品溶液一起朝向捕获区上升。然后移动的检测探针能杂交到样品溶液中存在的任何目标DNA的第二区域。
当杂交的检测探针及目标DNA到达捕获区时，目标DNA的第一区域能杂交到固定的捕获探针。由此在目标核酸、捕获探针及标记的检测探针之间形成三重复合物。捕获区出现标记时说明样品溶液中存在目标DNA。
至于第二类常规检棒，标记的DNA检测探针未固定在硝化纤维素滤器上。而是在允许检测探针杂交到样品溶液中任何目标核酸的条件下将检测探针加入到样品溶液中。然后将硝化纤维素滤器的接触端接触样品溶液，且当样品溶液沿检棒上移时，杂交到检测探针的目标核酸沿硝化纤维素滤器上升，并可通过捕获探针在捕获区捕获。
上述常规检棒检测法的缺点为捕获探针特异地杂交目标核酸，以至对于欲检测的每一种不同的目标核酸必须制备不同的含有固定捕获探针的检棒。同样，标记的检测探针特异地杂交目标核酸，以至对于欲检测的每一种不同的目标核酸必须制备不同的已标记的检测探针。
根据本发明，提供在检棒分析中能杂交到目标核酸的吊钩捕获探针，以及能杂交到吊钩捕获探针的通用捕获探针的用途，以测试检测样品溶液中目标核酸的存在。
文中使用的“检棒分析”术语意指使用检棒的任何分析，其中样品溶液与检棒接触，通过毛细作用移动到检棒捕获区，由此使样品溶液中的目标核酸在捕获区通过通用及吊钩捕获探针捕获，并于捕获区检测。
根据本发明第一方面，提供测试样品溶液中目标核酸存在的方法，其包含a)提供层析片，含有接触端用于接触样品溶液以及通用捕获探针固定在层析片远离接触端的捕获区上；b)提供吊钩捕获探针，其能杂交目标核酸的第一区域以及能杂交通用捕获探针；c)提供检测探针，其能附着目标核酸而由此允许运用检测探针直接或间接检测目标核酸；d)在检测探针可附着样品溶液中目标核酸的条件下，孵育样品溶液与检测探针；以及在吊钩捕获探针可附着样品溶液中目标核酸第一区域的条件下，孵育样品溶液与吊钩捕获探针；e)以层析片的接触端接触样品溶液，以使吊钩捕获探针、检测探针及目标核酸之间形成复合物能通过毛细作用移行到捕获区，并通过复合物的吊钩捕获探针与固定在捕获区的通用捕获探针间的相互作用而结合到捕获区；以及f)在捕获区检查检测探针的存在。
这种方法允许使用相同的层析片来捕获不同的目标核酸，只需使用特异于目标核酸的吊钩捕获探针即可。
检测探针及吊钩捕获探针可以任何顺序与样品溶液孵育，或者它们可在同时加入样品溶液。
如果样品足够允许杂交发生，也可以通过简单的将探针同样品溶液接触而孵育它们。
根据本发明的第一方面，也提供用于测试样品溶液中目标核酸存在的检棒，检棒含有的层析片具有接触端，用于接触样品溶液；通用捕获探针，固定在层析片远离接触端的捕获区上，该通用捕获探针能杂交已结合目标核酸第一区域的吊钩捕获探针；以及检测部分(detection moiety)，可释放性地固定在层析片的接触端与捕获区之间的缀合区(conjugate zone)，检测部分能通过非碱基配对相互作用结合已杂交了目标核酸第二区域的检测探针。
根据本发明的第一方面，也提供用于测试样品溶液中目标核酸存在的试剂盒，其包含i)检棒，其含有的层析片具有用于接触样品溶液的接触端，以及通用捕获探针固定在层析片远离接触端的捕获区上；ii)吊钩捕获探针，能杂交目标核酸的第一区域以及能杂交通用捕获探针；以及iii)检测探针，能附着目标核酸而由此允许运用该检测探针直接或间接检测目标核酸。
不与样品溶液孵育，而将吊钩捕获探针可释放性地固定在层析片上接触端与捕获区之间，这只要将吊钩捕获探针溶液点在层析片上并风干就可实现。如此可制备数种层析片含有相同的通用捕获探针固定在捕获区上。使用层析片检测特定的目标核酸之前，将适合的吊钩捕获探针可释放性地固定在层析片上使其能捕获目标核酸。于此方法制备层析片，比通过永久固定捕获探针于层析片而制备含有特异于目标核酸的捕获探针的层析片容易。
根据本发明的第二方面，提供测试样品溶液中目标核酸存在的方法，其包含a)提供层析片，其含有接触端用于接触样品溶液、通用捕获探针固定在层析片远离接触端的捕获区上、以及杂交通用捕获探针的吊钩捕获探针，该吊钩捕获探针能杂交目标核酸的第一区域；b)提供检测探针，能附着目标核酸而由此允许运用该检测探针直接或间接检测目标核酸；c)在检测探针可附着样品溶液中目标核酸的条件下，孵育样品溶液与检测探针；d)以层析片的接触端接触样品溶液，以使目标核酸附着检测探针而可通过毛细作用移行到捕获区，并通过固定在捕获区的吊钩捕获探针与目标核酸第一区域间的相互作用而结合到捕获区；以及e)在捕获区检查检测探针的存在。
根据本发明的第二方面，也提供用于测试样品溶液中目标核酸存在的检棒，检棒含有的层析片具有接触端，用于接触样品溶液；通用捕获探针，固定在层析片远离接触端的捕获区上，以及杂交通用捕获探针的吊钩捕获探针，其能杂交目标核酸的第一区域。
根据本发明的第二方面，进一步提供用于测试样品溶液中目标核酸存在的试剂盒，其包含i)检棒，其含有的层析片具有接触端用于接触样品溶液、通用捕获探针固定在层析片远离接触端的捕获区上、以及杂交通用捕获探针的吊钩捕获探针，其能杂交目标核酸的第一区域；以及ii)检测探针，能附着目标核酸而由此允许运用检测探针直接或间接检测目标核酸。
可制备数种层析片含有相同的通用捕获探针固定在捕获区上。使用层析片检测特别的目标核酸之前，将适当的吊钩捕获探针杂交到通用捕获探针上而制备能捕获目标核酸的层析片。再一次，于此方法制备层析片，比通过永久固定捕获探针于层析片而制备含有特异于目标核酸的捕获探针的层析片容易。
检测探针可通过共价或非共价连接附着目标核酸。优选检测探针含有可通过杂交目标核酸第二区域而附着于目标核酸的核酸或核酸类似物。
检测探针可偶联标记而由此允许运用检测探针直接检测目标核酸。然而，优选当检测探针杂交目标核酸时，通过可结合检测探针的检测部分间接检测目标核酸。
当检测探针含有核酸或核酸类似物时，检测部分可包含抗体或抗体片段，其能结合检测探针杂交目标核酸时与目标核酸形成的双链体。
然而，优选检测部分是配体(ligand)结合部分，且检测探针包括偶联检测配体(其能通过检测部分而被结合)的探针。当检测探针含有检测配体时，检测部分可为非抗体，或优选为抗体或抗体片段。
优选检测配体含有生物素(biotin)，而检测部分含有抗-生物素的抗体，或检测配体含有荧光素，而检测部分含有抗-荧光素的抗体，或检测配体含有2，4-二硝基苯酚(DNP)，而检测部分含有抗-DNP的抗体。
或者，检测配体可含有生物素，而检测部分含有抗生物素蛋白(avidin)、链霉抗生物素蛋白(streptavidin)、或其保有生物素结合活性的衍生物。
检测部分可释放性地固定在层析片接触端与捕获区之间的缀合区，以至于当检测探针通过毛细作用移行到捕获区时，检测部分被释放并结合检测探针。
优选为检测部分含有允许运用检测探针间接检测目标核酸的标记。然而，已标记的结合部分(其能结合已结合检测探针的检测部分)，可取代用于间接地检测目标核酸。
检测探针或检测部分的标记优选为非放射性。更优选标记是颜色标记，例如纺织染料，金属溶胶如胶体金，着色的颗粒如着色的乳胶颗粒。
检测探针可包含一或多种探针。例如检测探针可包含吊钩检测探针，其能杂交目标核酸的第二区域，以及通用检测探针，当吊钩检测探针杂交目标核酸时，其能杂交吊钩检测探针。
当检测探针含有通用检测探针及吊钩检测探针时，检测配体或检测探针的标记应偶联于通用探针。
假如检测探针含有单个偶联检测配体的探针，每当欲检测不同目标核酸或同一目标核酸的不同区域时，则必须将不同的探针偶联于检测配体。使用偶联检测配体的通用检测探针配合吊钩检测探针特别有利，因为偶联检测配体的同一通用检测探针可与不同的吊钩检测探针配合使用来检测不同的目标核酸或同一目标核酸的不同区域。如此，只需制备一种偶联检测配体的探针。
根据本发明也提供在检棒分析中能杂交目标核酸的吊钩检测探针，以及能杂交吊钩检测探针的通用检测探针的用途，以测试检测样品溶液中目标核酸的存在。
文中使用的“检棒分析”术语意指使用检棒的任何分析，其中样品溶液与检棒接触，通过毛细作用移动到检棒捕获区，由此使样品溶液中的目标核酸在捕获区被捕获，并利用吊钩及通用检测探针检测。
根据本发明的第三方面，提供测试样品溶液中目标核酸存在的方法，其包含a)提供层析片，含有接触端用于接触样品溶液以及捕获探针固定在层析片远离接触端的捕获区上，该捕获探针能杂交目标核酸的第一区域；b)提供吊钩检测探针，其能杂交目标核酸的第二区域；c)提供通用检测探针，当吊钩检测探针杂交目标核酸第二区域时其能杂交吊钩检测探针，而由此允许运用通用检测探针直接或间接检测目标核酸；
d)在吊钩检测探针可杂交目标核酸第二区域以及通用检测探针可杂交吊钩检测探针的条件下，孵育样品溶液与吊钩检测探针和通用检测探针；e)以层析片的接触端接触样品溶液，以使由通用检测探针、吊钩检测探针及目标核酸之间形成的复合物能通过毛细作用移行到捕获区，并通过复合物中的目标核酸与固定在捕获区的捕获探针间的相互作用而结合到捕获区；以及f)在捕获区检查通用检测探针的存在。
根据本发明的第三方面，也提供用于测试样品溶液中目标核酸存在的试剂盒，其包含i)检棒，其含有的层析片具有接触端用于接触样品溶液，以及捕获探针固定在层析片远离接触端的捕获区上，该捕获探针能杂交目标核酸的第一区域；ii)吊钩检测探针，能杂交目标核酸的第二区域；以及iii)通用检测探针，当吊钩检测探针杂交目标核酸第二区域时其能杂交吊钩检测探针，而由此允许运用通用检测探针直接或间接检测目标核酸。
不与样品溶液孵育，可选带有吊钩检测探针的通用检测探针可释放性地固定在层析片接触端与捕获区之间。然后当探针通过毛细作用移行到捕获区时释放到样品溶液中。
在其它实施方案中，以层析片接触端接触样品溶液之后，可选带有通用检测探针的吊钩检测探针与捕获区接触，而使得目标核酸在捕获区被捕获。这可以通过直接用捕获区接触检测探针溶液，或以层析片接触端在接触样品溶液之后接触检测探针溶液而实现，由此使得检测探针通过毛细作用移动到捕获区。如果检测探针溶液不含通用检测探针，则需在吊钩检测探针接触捕获区之后将通用检测探针结合到吊钩检测探针。
另外，如果吊钩检测探针与样品溶液孵育或可释放性地固定在层析片，以层析片接触端接触样品溶液之后，通用检测探针可与捕获区接触。再一次，其可通过直接应用检测探针溶液接触捕获区，或以层析片接触端接触通用检测探针溶液而实现。
需知吊钩检测探针必须存在以使通用检测探针能结合目标核酸。
在其他类型的检棒分析中，目标核酸可在捕获区被捕获部分(capture moiety)捕获，该捕获部分能通过非碱基配对相互作用结合杂交了目标核酸的捕获探针。捕获探针可包含能被捕获部分结合的配体。通常通过向能够杂交目标核酸的捕获探针部分共价偶联配体而制备捕获探针。
因为捕获探针特异地杂交目标核酸，所以对于每种不同的欲检测目标核酸必须制备不同的带有配体的捕获探针。
或者，如果捕获部分通过非碱基配对相互作用直接结合捕获探针能杂交目标核酸的部分，则每次用不同的捕获探针去捕获不同的目标核酸时可能需要不同的捕获部分。例如，如果捕获部分是能结合由捕获探针和目标核酸之间形成的杂交体的抗体时，该抗体可能不对所有的捕获探针/目标核酸杂交体都有高的亲和力。
根据本发明进一步的方面，提供测试样品溶液中目标核酸存在的方法，其包含a)提供层析片，含有接触端用于接触样品溶液以及捕获部分固定在层析片远离接触端的捕获区上，该捕获部分能通过非碱基配对相互作用结合通用捕获探针，后者通过吊钩捕获探针结合目标核酸；b)提供吊钩捕获探针，其能杂交目标核酸；c)提供通用捕获探针，其能杂交吊钩捕获探针；d)将样品溶液接触在吊钩捕获探针可杂交目标核酸的条件下的吊钩捕获探针；和在通用捕获探针可杂交吊钩捕获探针的条件下的通用捕获探针；e)以层析片的接触端接触样品溶液，以使由通用捕获探针、吊钩捕获探针及目标核酸之间形成的复合物能通过毛细作用移行到捕获区，并通过捕获部分结合复合物中的捕获配体(通过非碱基配对相互作用)而结合到捕获区；以及
f)在捕获区检查目标核酸的存在。
优选，通用捕获探针包含能被捕获部分结合而捕获复合体的捕获配体。适合的捕获配体实例包括生物素，荧光素和DNP。生物素能被抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白或抗生物素抗体结合。荧光素和DNP可分别被抗荧光素抗体和抗DNP抗体结合。
需知通过简单地使用不同的吊钩捕获探针可以捕获不同的目标核酸。只需要制备一类偶联捕获配体(或能被捕获部分结合)的探针。
通用和吊钩捕获探针不需要同样品溶液孵育。在其他方法中，可选带有吊钩捕获探针的通用捕获探针可释放性地固定在层析片接触端与捕获区之间。通过毛细作用移行到捕获区的样品溶液释放通用捕获探针(和吊钩捕获探针)而允许释放的探针结合目标核酸。在层析片上可释放性地固定一或多种探针的优点是由此简化方法以及减少需要加入样品溶液的单独的试剂的数量。这会是重要的优点，尤其是在偏远地区用检棒测试患者的样品溶液(如尿液)来确定患者是否患有疾病的时候。
需知如果吊钩捕获探针未同通用捕获探针一起可释放性地固定在层析片上，则在样品溶液沿层析片上移之前应该优选将吊钩捕获探针同样品溶液孵育。然而，也可能用吊钩捕获探针的单独溶液接触层析片而使吊钩捕获探针溶液通过毛细作用向捕获区迁移，由此释放通用捕获探针并允许通用和吊钩捕获探针在捕获区捕获。然后需要用样品溶液接触层析片而允许目标核酸通过在捕获区同吊钩捕获探针杂交而被捕获。
在这种方法的进一步变化中，通用和吊钩捕获探针可以结合捕获部分，例如，通过直接将它们应用于捕获区或在层析片的接触端接触样品溶液之前将层析片分别接触通用捕获探针和吊钩捕获探针溶液。或者，只要在接触端接触样品溶液之前通用捕获探针结合于捕获部分，可以将吊钩捕获探针可释放性地固定于层析片。
然而，优选在层析片的接触端接触样品溶液之前将通用和吊钩捕获探针加入样品溶液，因为认为在层析片上杂交反应的发生比非碱基配对相互作用更慢。如果在溶液中进行杂交则可以更方便地控制杂交条件。
根据本发明，也提供用于测试样品溶液中目标核酸存在的试剂盒，其包含检棒，其含有的层析片具有接触端用于接触样品溶液，以及捕获部分固定在层析片远离接触端的捕获区上，该捕获部分能通过非碱基配对相互作用结合通用捕获探针，后者通过吊钩捕获探针结合目标核酸。；吊钩捕获探针，其能杂交目标核酸；以及通用捕获探针，其能杂交吊钩捕获探针。
通用捕获探针和/或吊钩捕获探针可以可释放性地固定于层析片的接触端和捕获区之间。
可以用前述检测探针检测目标核酸。
本发明的试剂盒中检测探针或通用检测探针包含检测配体，该试剂盒还可以进一步包含能结合检测配体的被标记的检测部分，由此允许间接检测目标核酸。标记的检测部分可以可释放性地固定于层析片的接触端和捕获区之间。
根据本发明也提供本发明的检棒或试剂盒的用途，以测试样品溶液中目标核酸的存在。
目标核酸可为任何核酸，但优选致病微生物的核酸，更优选引起性传播疾病的微生物的核酸。更优选目标核酸为砂眼衣原体的核酸。
本发明优选方法中，探针与目标核酸的杂交在样品溶液与层析片接触端接触之前在样品溶液中进行(不同于固定的通用捕获探针与目标核酸的杂交)。最优选探针杂交于一步进行。这样简化方法，由此使它们的操作更快速及更容易。
多步骤杂交可通过将不同探针同样品溶液中的目标核酸相继杂交，或通过将层析片接触各含有不同探针的不同溶液而进行。通常后一种多步骤杂交方法涉及在接触每一不同探针溶液之间要清洗层析片。
然而某些情况中优选多步骤杂交，需知通常优选更简单及更快速形式的一步杂交。
最优选样品溶液具有适当的组成而使杂交反应于单一杂交步骤中进行，也允许非碱基配对相互作用(例如在检测配体和检测配体结合部分之间)进行并通过毛细作用使含有目标核酸及一或多种已杂交的探针及(可选地)配体结合部分的复合物在层析片上传送。
使用这样的样品溶液时，需知在样品溶液直接与层析片接触端接触之前杂交反应可于单一步骤中进行，并且可发生任何配体-配体结合部分的相互作用(不需第一次稀释或改变样品溶液)。一旦样品溶液与层析片接触，如果需要，则配体-配体结合部分的相互作用可以额外或另外在层析片上进行。由此促进目标核酸的简单且快速的检棒检测。
我们发现此等结果是以含具有盐，去污剂及封闭性蛋白质例如BSA或奶粉的标准杂交缓冲液(例如SSPE缓冲液或Tris缓冲液)的样品溶液完成的。使用此种分析检测目标核酸的敏感度，已知与其它检棒分析法大约相当。
仅以实施例的方式说明本发明实施。
以下叙述的实施例关于砂眼衣原体(Chllamydia trachomatis(CT))核酸的检测。CT是性传播疾病最常见的诱因之一。CT感染能引起不孕，且于怀孕期间乃至出生可造成自发性流产或产后子宫内膜炎。在新生儿，CT感染能引起失明及慢性呼吸道疾病。接近10％受感染男性及高达70％受感染女性未表现CT感染的症状。因此，CT感染的正确诊断是重要的，以至能开始此疾病的早期治疗。
下列实施例使用的探针序列如下所示SEQ ID NO15’TTC ATA TCC AAG GAC AAT AGA CCA ASEQ ID NO25’TCC CTC GTG ATA TAA CCT ATC CGSEQ ID NO35’CAG GTT GTT AAC AGG ATA GCA CGCSEQ ID NO45’CTC GTT CCG AAA TAG AAA ATC GCASEQ ID NO55’GGT AAA GCT CTG ATA TTT GAA GACSEQ ID NO65’CTG AGG CAG CTT GCT AAT TAT GAG T
实施例1使用通用捕获探针捕获CT目标核酸(1011至108拷贝的872bpDNA)。杂交于吊钩捕获探针的通用捕获探针固定于检棒。吊钩捕获探针的序列互补于通用捕获探针的序列及目标核酸的序列。利用1012拷贝的偶联生物素的Seq ID No 2，3，5及6的检测探针，并以抗-生物素抗体-染料缀合物为检测部分进行检测。检测限经观察为109拷贝的目标核酸。
实施例2使用SEQ ID No4为捕获探针固定于检棒以捕获CT目标核酸(1011至1010拷贝的872bp DNA)。使用吊钩检测探针及通用检测探针检测目标核酸。吊钩检测探针具有对应于SEQ ID No6的序列(能杂交到目标核酸)以及互补于通用检测探针的序列。通用检测探针偶联染料允许检测通用检测探针。少至1010拷贝的目标核酸可被检测到。
本发明允许简化检棒及检测探针的制备。
序列表<110>Lee，Helen<120>检棒分析改良的捕获和检测形式多样性<130>41743A/JMD/NT<140>PCT/GB01/03029<141>2001-07-06<150>GB 0016833.6<151>2000-07-07<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>探针序列<400>1ttcatatcca aggacaatag accaa 25<210>2<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>探针序列<400>2tccctcgtga tataacctat ccg23<210>3<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>探针序列<400>3caggttgtta acaggatagc acgc 24<210>4<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>探针序列<400>4ctcgttccga aatagaaaat cgca 24<210>5<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>探针序列<400>5ggtaaagctc tgatatttga agac 24<210>6<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>探针序列<400>6ctgaggcagc ttgctaatta tgagt 2权利要求
1.测试样品溶液中目标核酸存在的方法，其包含a)提供层析片，其含有接触端用于接触样品溶液以及通用捕获探针(universal capture probe)固定在层析片远离接触端的捕获区上；b)提供吊钩捕获探针(hook capture probe)，其能杂交目标核酸的第一区域以及通用捕获探针；c)在吊钩捕获探针可杂交到样品溶液中目标核酸第一区域的条件下，孵育样品溶液与吊钩捕获探针；d)以层析片的接触端接触样品溶液，以使吊钩捕获探针、检测探针(detection probe)及目标核酸之间形成的复合物能通过毛细作用移行到捕获区，并通过复合物的吊钩捕获探针与固定在捕获区的通用捕获探针之间的相互作用结合到捕获区；以及e)在捕获区检测目标核酸的存在。
2.测试样品溶液中目标核酸存在的方法，其包含a)提供层析片，其含有接触端用于接触样品溶液；通用捕获探针固定在层析片远离接触端的捕获区上；以及吊钩捕获探针可释放性地固定在层析片接触端与捕获区之间，该吊钩捕获探针能杂交目标核酸的第一区域以及通用捕获探针；b)以层析片的接触端接触样品溶液，通过毛细作用引起样品溶液移行到捕获区，并当其向捕获区移动时由此释放吊钩捕获探针并使释放的吊钩捕获探针杂交到样品溶液中的目标核酸，以至含有目标核酸及吊钩捕获探针的复合物能通过通用捕获探针杂交复合物的吊钩捕获探针而在捕获区被捕获；以及c)在捕获区检测目标核酸的存在。
3.测试样品溶液中目标核酸存在的方法，其包含a)提供层析片，其含有接触端用于接触样品溶液以及通用捕获探针固定在层析片远离接触端的捕获区上；b)提供吊钩捕获探针，其能杂交目标核酸的第一区域以及通用捕获探针；c)提供检测探针，其能附着目标核酸而由此允许运用检测探针直接或间接地检测目标核酸；d)在检测探针可附着到样品溶液中目标核酸的条件下，孵育样品溶液与检测探针；以及在吊钩捕获探针可附着到样品溶液中目标核酸第一区域的条件下，孵育样品溶液与吊钩捕获探针；e)以层析片的接触端接触样品溶液，以使吊钩捕获探针、检测探针及目标核酸之间形成的复合物能通过毛细作用移行到捕获区，并通过复合物的吊钩捕获探针与固定在捕获区的通用捕获探针间的相互作用而结合到捕获区；以及f)在捕获区检查检测探针的存在。
4.测试样品溶液中目标核酸存在的方法，其包含a)提供层析片，其含有接触端用于接触样品溶液；通用捕获探针固定在层析片远离接触端的捕获区上，以及杂交通用捕获探针的吊钩捕获探针，该吊钩捕获探针能杂交目标核酸的第一区域；b)以层析片的接触端接触样品溶液，以使样品溶液中的目标核酸可通过毛细作用移行到捕获区，并通过固定在捕获区的吊钩捕获探针与目标核酸第一区域间的相互作用结合到捕获区；以及c)在捕获区检测目标核酸的存在。
5.测试样品溶液中目标核酸存在的方法，其包含a)提供层析片，其含有接触端用于接触样品溶液；通用捕获探针固定在层析片远离接触端的捕获区上，以及杂交通用捕获探针的的吊钩捕获探针，该吊钩捕获探针能杂交目标核酸的第一区域；b)提供检测探针，其能附着目标核酸而由此允许运用检测探针直接或间接检测目标核酸；c)在检测探针可附着到样品溶液中目标核酸的条件下，孵育样品溶液与检测探针；d)以层析片的接触端接触样品溶液，以使附着检测探针的目标核酸可通过毛细作用移行到捕获区，并通过固定在捕获区的吊钩捕获探针与目标核酸第一区域之间的相互作用结合到捕获区；以及e)在捕获区检查检测探针的存在。
6.根据权利要求第3或5项的方法，其中检测探针能通过杂交目标核酸第二区域而附着于目标核酸。
7.根据权利要求第6项的方法，其中检测探针含有能杂交目标核酸第二区域的吊钩检测探针，以及当吊钩检测探针杂交到目标核酸时能杂交吊钩检测探针的通用检测探针。
8.根据权利要求第6或7项的方法，其中检测探针或通用检测探针含有标记而由此允许运用该检测探针或该通用和吊钩检测探针直接检测目标核酸。
9.根据权利要求第6或7项的方法，其进一步包括将检测探针或通用检测探针与检测部分(detection moiety)接触，当检测探针杂交到目标核酸时，该检测部分能以非碱基配对的相互作用结合检测探针，由此允许运用检测探针或通用和吊钩检测探针间接检测目标核酸。
10.根据权利要求第9项的方法，其中检测探针或通用检测探针含有检测配体，其能被检测部分结合。
11.根据权利要求第9或10项的方法，其中检测部分包含抗体或抗体片段。
12.根据权利要求第12项的方法，其中检测配体含有生物素(biotin)并且检测部分含有抗-生物素的抗体，或其中检测配体含有荧光素而检测部分含有抗-荧光素的抗体，或其中检测配体含有2，4-二硝基苯酚(DNP)而检测部分含有抗-DNP的抗体。
13.根据权利要求第9至12项中任一项的方法，其中检测部分可释放性地固定在层析片接触端与捕获区之间的缀合区(conjugatezone)，以至于当复合物通过毛细作用移行到捕获区时，检测部分释放并能结合检测探针。
14.根据权利要求第9至13项中任一项的方法，其中检测部分含有标记允许检测检测部分。
15.根据权利要求第8或14项的方法，其中标记为非放射性标记。
16.根据权利要求第15项的方法，其中标记为颜色标记。
17.根据权利要求第16项的方法，其中颜色标记包括纺织染料，金属溶胶如胶体金，或着色的颗粒如着色的乳胶颗粒。
18.测试样品溶液中目标核酸存在的方法，其包含a)提供层析片，其含有接触端用于接触样品溶液以及捕获探针固定在层析片远离接触端的捕获区上，该捕获探针能杂交到目标核酸的第一区域；b)提供吊钩检测探针，其能杂交到目标核酸的第二区域；c)提供通用检测探针，当吊钩检测探针杂交到目标核酸第二区域时，其能杂交吊钩检测探针，而由此允许运用通用及吊钩检测探针直接或间接检测目标核酸；d)在吊钩检测探针可杂交到目标核酸第二区域以及通用检测探针可杂交到吊钩检测探针的条件下，孵育样品溶液与吊钩检测探针和通用检测探针；e)以层析片的接触端接触样品溶液，以使通用检测探针、吊钩检测探针及目标核酸之间形成的复合物能通过毛细作用移行到捕获区，并通过复合物的目标核酸与固定在捕获区的捕获探针之间的相互作用结合到捕获区；以及f)在捕获区检查通用检测探针的存在。
19.测试样品溶液中目标核酸存在的方法，其包含a)提供层析片，其具有接触端用于接触样品溶液；捕获探针固定在层析片远离接触端的捕获区上，该捕获探针能杂交到目标核酸的第一区域；以及通用检测探针可释放性地固定在层析片接触端与捕获区之间；b)在吊钩检测探针可杂交到目标核酸第二区域的条件下，孵育样品溶液与能杂交目标核酸第二区域的吊钩检测探针；c)以层析片的接触端接触样品溶液，通过毛细作用使样品溶液移行到捕获区，并当其向捕获区移行时由此释放通用检测探针以使释放的通用检测探针能杂交到样品溶液中的吊钩检测探针，并且含有通用检测探针、吊钩检测探针及目标核酸的复合物能通过复合物的目标核酸与固定在捕获区的捕获探针之间的相互作用结合到捕获区；以及f)在捕获区检查通用检测探针的存在。
20.测试样品溶液中目标核酸存在的方法，其包含a)提供层析片，其含有接触端用于接触样品溶液以及捕获探针固定在层析片远离接触端的捕获区上，该捕获探针能杂交到目标核酸的第一区域；b)提供吊钩检测探针，其能杂交到目标核酸的第二区域；c)提供通用检测探针，当吊钩检测探针杂交到目标核酸第二区域时，其能杂交吊钩检测探针，而由此允许运用通用及吊钩检测探针直接地或间接检测目标核酸；d)以层析片的接触端接触样品溶液，通过毛细作用使样品溶液移行到捕获区，并被捕获探针在捕获区捕获；e)将吊钩检测探针及通用检测探针接触捕获区；以及f)在捕获区检查通用检测探针的存在。
21.根据权利要求第18、19或20项的方法，其中通用检测探针含有标记。
22.根据权利要求第20项的方法，其进一步包括将通用检测探针与检测部分接触，当通用检测探针杂交到吊钩检测探针时，该检测部分能以非碱基配对的相互作用结合通用检测探针。
23.根据权利要求第22项的方法，其中通用检测探针含有检测配体，其能被检测部分结合。
24.根据权利要求第22或23项的方法，其中检测部分包含抗体或抗体片段。
25.根据权利要求第24项的方法，其中检测配体含有生物素而检测部分含有抗-生物素的抗体，或其中检测配体含有荧光素而检测部分含有抗-荧光素的抗体，或其中检测配体含有2，4-二硝基苯酚(DNP)而检测部分含有抗-DNP的抗体。
26.根据权利要求第22至25项中任一项的方法，其中检测部分可释放性地固定在层析片接触端与捕获区之间的缀合区，以使得当复合物通过毛细作用移行到捕获区时，该检测部分释放并可结合通用检测探针。
27.测试样品溶液中目标核酸存在的方法，其包括a)提供层析片，其含有接触端，用于接触样品溶液；和捕获部分，固定在层析片远离接触端的捕获区上，该捕获部分能通过非碱基配对相互作用结合通用捕获探针，后者通过吊钩捕获探针结合目标核酸。b)提供吊钩捕获探针，其能杂交目标核酸；c)提供通用捕获探针，其能杂交吊钩捕获探针；d)将样品溶液接触在吊钩捕获探针可杂交目标核酸的条件下的吊钩捕获探针；和在通用捕获探针可杂交吊钩捕获探针的条件下的通用捕获探针；e)以层析片的接触端接触样品溶液，以使通用捕获探针、吊钩捕获探针及目标核酸之间形成的复合物能通过毛细作用移行到捕获区，并通过捕获部分结合复合物中的捕获配体(通过非碱基配对相互作用)而结合到捕获区；以及f)在捕获区检查目标核酸的存在。
28.测试样品溶液中目标核酸存在的检棒，其含有的层析片具有接触端，用于接触样品溶液；通用捕获探针，固定在层析片远离接触端的捕获区上，以及杂交通用捕获探针的吊钩捕获探针，且其能杂交目标核酸的第一区域。
29.测试样品溶液中目标核酸存在的检棒，其包括的层析片具有接触端，用于接触样品溶液；通用捕获探针，固定在层析片远离接触端的捕获区上；以及可释放性固定于层析片的接触端和捕获区之间的吊钩捕获探针，该吊钩捕获探针能杂交目标核酸的第一区域。
30.根据权利要求第28或29项的检棒，其进一步包括检测部分可释放性地固定在层析片接触端与捕获区间的缀合区(conjugatezone)，该检测部分能通过非碱基配对相互作用结合已杂交了目标核酸第二区域的检测探针。
31.测试样品溶液中目标核酸存在的检棒，其含有的层析片具有接触端，用于接触样品溶液；通用捕获探针，固定在层析片远离接触端的捕获区上，该通用捕获探针能杂交到已结合目标核酸第一区域的吊钩捕获探针；以及检测部分可释放性地固定在层析片接触端与捕获区间的缀合区，该检测部分能通过非碱基配对相互作用结合已杂交了目标核酸第二区域的检测探针。
32.根据权利要求第30或31项的检棒，其中检测部分含有标记。
33.根据权利要求第32项的检棒，其中标记为非放射性标记。
34.根据权利要求第33项的检棒，其中标记为颜色标记。
35.根据权利要求第34项的检棒，其中颜色标记包括纺织染料，金属溶胶如胶体金，或着色的颗粒如着色的乳胶颗粒。
36.根据权利要求第30至35项中任一项的检棒，其中检测部分包含抗体或抗体片段。
37.根据权利要求第36项的检棒，其中检测部分含有抗-生物素抗体，抗-荧光素抗体，或抗-DNP抗体。
38.根据权利要求第30至35项中任一项的检棒，其中检测部分含有抗生物素蛋白(avidin)、链霉抗生物素蛋白(streptavidin)、或其保有生物素结合活性的衍生物。
39.测试样品溶液中目标核酸存在的检棒，其含有的层析片具有接触端，用于接触样品溶液；捕获探针固定在层析片远离接触端的捕获区上，该捕获探针能直接或间接地结合目标核酸；通用检测探针可释放性地固定在层析片接触端与捕获区之间，该通用检测探针能杂交吊钩检测探针；以及可选地吊钩检测探针可释放性地固定在层析片接触端与捕获区之间，该吊钩检测探针能杂交到目标核酸。
40.根据权利要求第39项的检棒，其包括检测部分可释放性地固定在层析片接触端与捕获区间的缀合区，该检测部分能通过非碱基配对相互作用结合通用检测探针。
41.测试样品溶液中目标核酸存在的检棒，其包括检棒，其具有的层析片含有接触端，用于接触样品溶液；和捕获部分，固定在层析片远离接触端的捕获区上，该捕获部分能通过非碱基配对相互作用结合通用捕获探针，后者通过吊钩捕获探针结合目标核酸；以及吊钩捕获探针和/或通用捕获探针，可释放性地固定在层析片的接触端和捕获区之间，该吊钩捕获探针能杂交目标核酸，且该通用捕获探针能杂交该吊钩捕获探针。
42.根据权利要求第28至41项中任一项的检棒，其中目标核酸为致病微生物的核酸，优选引起性传播疾病的微生物的核酸。
43.根据权利要求第42项的检棒，其中目标核酸为砂眼衣原体(Chlamydia trachomatis)的核酸。
44.根据权利要求第28至43项中任一项的检棒的用途，用于测试样品溶液中目标核酸存在。
45.测试样品溶液中目标核酸存在的试剂盒，其包含i)检棒，其含有的层析片具有接触端用于接触样品溶液，以及通用捕获探针固定在层析片远离接触端的捕获区上；ii)吊钩捕获探针，其能杂交到目标核酸的第一区域以及通用捕获探针；以及可选地iii)检测探针，其能附着目标核酸而由此允许运用该检测探针直接或间接地检测目标核酸。
46.测试样品溶液中目标核酸存在的试剂盒，其包含i)检棒，其含有的层析片具有接触端用于接触样品溶液；通用捕获探针固定在层析片远离接触端的捕获区上；以及杂交通用捕获探针的吊钩捕获探针，该吊钩探针能杂交目标核酸的第一区域；以及可选地ii)检测探针，其能附着目标核酸而由此允许运用该检测探针直接或间接地检测目标核酸。
47.根据权利要求第45或46项的试剂盒，其中检测探针能通过杂交到目标核酸第二区域而附着目标核酸。
48.根据权利要求第47项的试剂盒，其中检测探针含有吊钩检测探针能杂交到目标核酸的第二区域，以及当吊钩检测探针杂交到目标核酸时能杂交吊钩检测探针的通用检测探针。
49.测试样品溶液中目标核酸存在的试剂盒，其包含i)检棒，其含有的层析片具有接触端用于接触样品溶液，以及捕获探针固定在层析片远离接触端的捕获区上，该捕获探针能杂交到目标核酸的第一区域，或能间接结合目标核酸；ii)吊钩检测探针，其能杂交目标核酸的第二区域；以及iii)通用检测探针，当吊钩检测探针杂交到目标核酸第二区域时，其能杂交吊钩检测探针，而由此允许运用该检测探针直接或间接地检测目标核酸。
50.根据权利要求第45至49项中任一项的试剂盒，其中检测探针或通用检测探针含有标记而由此允许运用该检测探针或该通用及吊钩检测探针直接检测目标核酸。
51.根据权利要求第45至49项中任一项的试剂盒，其中检测探针或通用检测探针含有能被检测部分结合的检测配体，而由此允许运用该检测探针或该通用及吊钩检测探针间接检测目标核酸。
52.根据权利要求第51项的试剂盒，其进一步包括能结合检测配体的检测部分。
53.根据权利要求第52项的试剂盒，其中检测部分包含抗体或抗体片段。
54.根据权利要求第53项的试剂盒，其中检测配体含有生物素而检测部分含有抗-生物素的抗体，或其中检测配体含有荧光素而检测部分含有抗-荧光素的抗体，或其中检测配体含有2，4-二硝基苯酚(DNP)而检测部分含有抗-DNP的抗体。
55.根据权利要求第52至54项中任一项的试剂盒，其中检测部分可释放性地固定在层析片接触端与捕获区间的缀合区。
56.根据权利要求第52至55项中任一项的试剂盒，其中检测部分含有标记而允许检测检测部分。
57.根据权利要求第50或55项的试剂盒，其中标记为非放射性。
58.根据权利要求第57项的试剂盒，其中标记为颜色标记。
59.根据权利要求第58项的试剂盒，其中颜色标记包括纺织染料，金属溶胶如胶体金，或着色的颗粒如着色的乳胶颗粒。
60.测试样品溶液中目标核酸存在的试剂盒，其包括检棒，其具有的层析片含有接触端，用于接触样品溶液；和捕获部分，固定在层析片远离接触端的捕获区上，该捕获部分能通过非碱基配对相互作用结合通用捕获探针，后者通过吊钩捕获探针结合目标核酸；吊钩捕获探针，能杂交目标核酸；及
通用捕获探针，能杂交该吊钩捕获探针。
61.通用及吊钩检测探针在检棒分析中的用途，用于测试样品溶液中目标核酸存在。
62.通用及吊钩检测探针在检棒分析中的用途，用于测试样品溶液中目标核酸存在。
63.根据权利要求第45至60项中任一项的试剂盒的用途，用于测试样品溶液中目标核酸存在。
全文摘要
本发明说明用于测试样品溶液中目标核酸存在的检棒(dipsticks)。检棒含有固定在检棒捕获区上的通用捕获探针(universal captureprobe)。通用捕获探针能杂交到吊钩捕获探针(hook capture probe)，吊钩捕获探针能杂交到样品溶液中的目标核酸。检棒的接触端接触样品溶液，通过毛细作用使杂交了目标核酸的吊钩捕获探针移行到捕获区，而在此处检测目标核酸。通用及吊钩捕获探针的使用使得制备的检棒可用于捕获任何目标核酸，由此简化检棒的制备。目标核酸捕获的特异性可通过使用适合的吊钩捕获探针实现。本发明也说明方法及试剂盒。
文档编号C12M1/34GK1452662SQ0181530
公开日2003年10月29日 申请日期2001年7月6日 优先权日2000年7月7日
发明者海伦·李, 胡香云, 玛格塔·阿纳斯达索瓦·狄尼瓦 申请人:海伦·李