合成多核苷酸的方法

专利名称：合成多核苷酸的方法
技术领域：
本发明涉及合成多核苷酸的方法。
背景技术：
近年来，使用聚合酶链反应(PCR)法的依赖于模板的核酸合成法已成为生物科学领域研究的主要推动力。PCR法通过使用少量双链核酸为模板，使指数扩增核酸成为可能，所述核酸由与模板互补的核苷酸序列组成。最近，PCR被广泛用作基因克隆和检测的工具。在PCR法中，使用了一套引物，其含有与靶核苷酸序列的两端互补的核苷酸序列。其中的一个引物被设计成与另一个引物产生的延伸产物退火。在此方法中，合成反应得以进行，其中不断重复与彼此延伸产物的退火和互补链合成，从而获得指数扩增。
在PCR法中，必需进行复杂的温度控制。必需使用特殊的反应装置来提供这一复杂的温度控制。因此，在医院的病床边或户外难以进行PCR。另外，改善反应特异性已成为已知互补链合成反应所面临的重要问题。例如，在PCR法中，当将互补链合成产物用作新模板时，与引物退火的区域不是严格意义上的、得自样品的核苷酸序列，而仅仅是引物的核苷酸序列拷贝。因此，使用PCR引物一般难以识别核苷酸序列中的细微差别。
已发明LAMP法(环-介导的等温扩增)(Nucleic Acid Res.2000，Vol.28，No.12 e63，WO 00/28082)作为解决这些问题的一种方法。LAMP法使模板多核苷酸能与自身3’-末端退火以用作互补链合成起点，同时，也使得能够通过联合与此时形成的环发生退火的引物，来进行等温互补链合成反应。另外，在LAMP法中，由于3’-末端与得自样品的区域退火，核苷酸序列检验机制重复起作用。结果，使鉴定核苷酸序列中很细微的差异成为可能。
当基于互补链合成反应，如LAMP或PCR检测靶核苷酸序列时，反应所需时间和检测敏感性之间有密切关系。换句话说，使反应持续尽可能长的时间直至反应到达平稳期是获得高检测敏感性的条件。对于已知的互补链合成反应，如LAMP和PCR而言，反应在约1小时后到达平稳期。也就是说，为了获得最高的敏感性，需要约1小时的反应时间。尽管1小时的反应时间不那么长，但如果能使反应时间缩短而不影响检测敏感性或操作的简易性，那将更加有用。
鉴定出基因组图谱之后，科学进入后-基因组时代。人们不断地需要分析单核苷酸多态性(SNP)和基因功能以及基于这些分析结果进行基因诊断。因此，不论是就快速进行功能性分析而言，还是就基因功能分析的结果在实际临床背景中的实际应用而言，开发一种能更准确和快速地分析基因核苷酸序列的技术正成为一个重要的问题。

发明内容
本发明的目的是提供能使用多核苷酸为模板，快速进行互补链合成反应的方法。
为了解决上述问题，本发明人对互补链合成的反应条件进行了深入研究。结果发现联合使用用于互补链合成的引物和用作互补链合成起点的3’-末端明显与互补链合成的反应速率相关。另外，本发明人揭示出通过联合使用具有特定结构的模板多核苷酸以及能在此多核苷酸的特定位置处提供互补链合成起点的引物，即可改善互补链合成反应的效率，从而导致完成本发明。也即本发明涉及下列多核苷酸合成法及其应用。
合成多核苷酸的方法，其含有下列步骤混合下列组分1至5，并在允许使用4中的DNA聚合酶进行依赖于模板的互补链合成的条件下进行保温1模板多核苷酸，其(a)具有含有至少一套互补核苷酸序列的靶核苷酸序列，(b)当(a)中的互补核苷酸序列杂交时即形成能碱基配对的环，(c)通过使其3’-末端与其自身退火而形成环，和(d)与其自身退火的3’-末端可成为使用其自身为模板的互补链合成的起点；2至少两种引物，所述引物可在模板多核苷酸环上的不同位置处提供互补链合成起点；3至少一种引物，所述引物可在环中与2中所述的引物不同的位置处提供互补链合成起点，所述环是通过模板多核苷酸和/或使2中所述的引物与模板多核苷酸退火而产生的延伸产物形成的；
4催化伴随着链置换的互补链合成的DNA聚合酶；和5互补链合成的底物。
[1]的方法，其中所述模板多核苷酸在其5’-末端具有与其自身核苷酸序列的任意区域互补的核苷酸序列。
[2]的方法，其中所述模板多核苷酸是通过下列步骤产生的a)退火第一引物与靶核苷酸序列，并使用其作为起点进行互补链合成反应，其中所述第一引物(i)可在3’-末端为限定构成靶核苷酸序列一条链的3’-方向的区域提供互补链合成起点，和(ii)在其5’-方向具有与使用该引物作为起点的互补链合成反应产物的任意区域互补的核苷酸序列；b)将步骤a)中合成的第一引物延伸产物中与第二引物退火的区域置于允许碱基配对的条件下，其中所述第二引物(i)在其3’-末端具有核苷酸序列，该序列能为限定使用第一引物为起点的延伸产物中的靶核苷酸序列3’-方向的区域提供互补链合成起点，和(ii)在其5’-方向具有与使用该引物作为起点的互补链合成反应产物的任意区域互补的核苷酸序列；c)使所述第二引物与步骤b)中可形成碱基配对的区域退火，并使用其作为起点进行互补链合成；和d)使步骤c)中合成的第二引物延伸产物的3’-末端与其自身退火，并使用其自身作为模板进行互补链合成。
[3]的方法，其中两种引物是第一引物和第二引物，至少一种引物是环引物，它可在第一引物或第二引物延伸产物中的得自每种引物的区域与和每种引物有关的任意区域之间提供互补链合成起点。
[4]的方法，其中所述环引物是(i)第一环引物，它可在第一引物延伸产物中的得自第一引物的区域与和第一引物有关的任意区域之间提供互补链合成起点，和(ii)第二环引物，它可在第二引物延伸产物中的得自第二引物的区域与和第二引物有关的任意区域之间提供互补链合成起点。
[4]的方法，其中所述环引物在其5’-末端进一步含有与任意区域互补的核苷酸序列。
[3]的方法，其中通过根据自外部引物起的互补链合成来置换第一引物和/或第二引物的延伸产物，使第一引物或第二引物的每种产物转变为单链，所述外部引物可为步骤b)和/或步骤c)中的与第一引物或第二引物有关的模板的3’-方向提供互补链合成起点。
[3]的方法，其中步骤a)中的靶核苷酸序列以双链多核苷酸的形式存在，根据使用任意引物为起点的互补链合成反应，使与第一引物退火的区域形成碱基对键。
[8]的方法，其中在解链温度调节剂的存在下进行步骤a)。
[9]的方法，其中解链温度调节剂是选自下列的至少一种化合物甜菜碱、脯氨酸、二甲基亚砜和三甲胺N-氧化物。
扩增模板多核苷酸的方法，其包括下列步骤根据[1]或[5]的方法，使用模板多核苷酸作为模板重复进行互补链合成，并根据[1]或[5]的方法，使用合成反应产生的延伸产物作为新的模板多核苷酸，进行另一个多核苷酸合成反应。
检测样品中的靶核苷酸序列的方法，其包括下列步骤进行[11]的扩增方法，并将扩增反应产物的产生与靶核苷酸序列的存在相联系。
[12]的方法，其中在多核苷酸检测试剂的存在下进行[11]的方法，根据检测试剂的信号变化观察是否产生扩增反应产物。
根据[12]的检测方法检测靶核苷酸序列中的突变的方法，所述方法包括下列步骤(i)当靶核苷酸序列不是预测的核苷酸序列时，阻断至少一个选自构成扩增法的互补链合成反应的互补链合成反应，和(ii)观察对扩增反应的抑制作用。
[14]的方法，其使用了下列第一引物和第二引物，其中至少第一引物或第二引物在其5’-方向含有检验序列，其中，检验序列指的是一种核苷酸序列，其中(i)当构成特定区域的核苷酸序列不是预测的核苷酸序列时，使用检验序列作为模板合成的互补链的3’-末端与靶核苷酸序列或其互补链退火时会发生错配，和(ii)此错配会抑制通过使用3’-末端作为起点而起始的互补链合成反应，第一引物(i)可在其3’-末端为限定构成靶核苷酸序列一条链的3’-方向的区域提供互补链合成起点，和(ii)在其5’-方向具有与使用该引物作为起点的互补链合成反应产物的任意区域互补的核苷酸序列，和第二引物(i)在其3’-末端具有核苷酸序列，该序列能为限定使用第一引物为起点的延伸产物中的靶核苷酸序列3’-方向的区域提供互补链合成起点，和(ii)在其5’-方向具有与使用该引物作为起点的互补链合成反应产物的任意区域互补的核苷酸序列。
[15]的方法，其中当构成特定区域的核苷酸序列不是预测的核苷酸序列时，使用检验序列作为模板合成的互补链与靶核苷酸序列或其互补链退火时，在自互补链3’-末端起的第2至第4个核苷酸处会发生错配。
[15]的方法，其使用下列第一环引物和/或第二环引物作为环引物；需满足的条件是当环引物在其5’-方向含有与引物5’-方向上安排的任意区域互补的核苷酸时，或当引物5’-方向上安排的核苷酸序列是检验序列时，需在环引物的5’-方向上安排序列，该序列中用于提供检验序列中的错配的核苷酸不同于检验序列第一环引物它可在第一引物延伸产物中的得自第一引物的区域与和第一引物有关的任意区域之间提供互补链合成起点；第二环引物它可在第二引物延伸产物中的得自第二引物的区域与和第二引物有关的任意区域之间提供互补链合成起点。
[17]的方法，其中当构成特定区域的核苷酸序列不是预测的核苷酸序列时，使用检验序列作为模板合成的互补链与靶核苷酸序列或其互补链退火时，在自互补链3’-末端起的第2至第4个核苷酸处会发生错配，其中第一环引物和/或第二环引物的5’-方向上安排的核苷酸序列与导致检验序列中的错配的核苷酸有所不同。
用于扩增靶核苷酸序列的试剂盒，其含有a)第一引物(i)可在其3’-末端为限定构成靶核苷酸序列一条链的3’-方向的区域提供互补链合成起点，和(ii)在其5’-方向具有与使用该引物作为起点的互补链合成反应产物的任意区域互补的核苷酸序列；b)第二引物(i)在其3’-末端具有核苷酸序列，该序列能为限定使用第一引物为起点的延伸产物中的靶核苷酸序列3’-方向的区域提供互补链合成起点，和(ii)在其5’-方向具有与使用该引物作为起点的互补链合成反应产物的任意区域互补的核苷酸序列；c)第一环引物，它可在第一引物延伸产物中的得自第一引物的区域与和第一引物有关的任意区域之间提供互补链合成起点；d)第二环引物，它可在第二引物延伸产物中的得自第二引物的区域与和第二引物有关的任意区域之间提供互补链合成起点；e)催化伴随着链置换的互补链合成的DNA聚合酶；和f)互补链合成的底物。
[19]的试剂盒，其进一步含有g)外部引物，它可为第一引物和/或第二引物的模板的3’-方向提供互补链合成起点。
[19]的试剂盒，其中第一引物和/或第二引物在其5’-方向上含有检验序列。
[19]的试剂盒，其含有下列第一环引物和/或第二环引物作为环引物；需满足的条件是当环引物在其5’-方向含有与引物5’-方向上安排的任意区域互补的核苷酸序列时，或当引物5’-方向上安排的核苷酸序列是检验序列时，用于提供检验序列中的错配的核苷酸在环引物的5’-方向上安排不同于检验序列的序列第一环引物它可在第一引物延伸产物中的得自第一引物的区域与和第一引物有关的任意区域之间提供互补链合成起点；和第二环引物它可在第二引物延伸产物中的得自第二引物的区域与和第二引物有关的任意区域之间提供互补链合成起点。
扩增多核苷酸的方法，其含有下列步骤混合下列组分a)至g)，并在能进行伴随着链置换的互补链合成反应的条件下保温a)第一引物(i)可在其3’-末端为限定构成靶核苷酸序列一条链的3’-方向的区域提供互补链合成起点，和(ii)在其5’-方向具有与使用该引物作为起点的互补链合成反应产物的任意区域互补的核苷酸序列；b)第二引物(i)在其3’-末端具有核苷酸序列，该序列能为限定使用第一引物为起点的延伸产物中的靶核苷酸序列3’-方向的区域提供互补链合成起点，和(ii)在其5’-方向具有与使用该引物作为起点的互补链合成反应产物的任意区域互补的核苷酸序列；c)第一环引物，它可在第一引物延伸产物中的得自第一引物的区域与和第一引物有关的任意区域之间提供互补链合成起点；d)第二环引物，它可在第二引物延伸产物中的得自第二引物的区域与和第二引物有关的任意区域之间提供互补链合成起点；e)催化伴随着链置换的互补链合成的DNA聚合酶；和f)互补链合成的底物；和g)含有靶核苷酸序列的受试多核苷酸。
[23]的方法，其进一步含有
h)外部引物，它可为模板的3’-方向提供互补链合成起点，所述模板与其中第一引物和/或第二引物的3’-末端与靶核苷酸序列退火的区域有关。
测定靶核苷酸序列中的特定核苷酸是否为第一核苷酸或第二核苷酸的方法，其包括下列步骤混合下列组分a)至d)，并在能进行伴随着链置换的互补链合成反应的条件下保温，其中通过选自下列的a)中的任一个引物套测定扩增产物的形成速率和/或形成的量a)(1)第一核苷酸内部引物对和第一核苷酸环引物对(2)第一核苷酸内部引物对和第二核苷酸环引物对(3)第二核苷酸内部引物对和第一核苷酸环引物对，和(4)第二核苷酸内部引物对和第二核苷酸环引物对；其中，第一核苷酸内部引物对和第二核苷酸内部引物对都是由下一个第一内部引物和第二内部引物组成的引物对，在第一核苷酸引物对中，当靶核苷酸序列中的特定核苷酸是第一核苷酸时，将使用以第一内部引物和第二内部引物的5’-方向为模板而合成的互补链的3’-末端用作起点的互补链合成反应不受抑制，但是，当所述特定的核苷酸是第二核苷酸时，所述反应会受抑制；在第二核苷酸内部引物对中，当靶核苷酸序列中的特定核苷酸是第二核苷酸时，将使用以第一内部引物和第二内部引物的5’-方向为模板而合成的互补链的3’-末端用作起点的互补链合成反应不受抑制，但是，当所述特定的核苷酸是第一核苷酸时，所述反应会受抑制；第一内部引物(i)可在其3’-末端为限定构成靶核苷酸序列一条链的3’-方向的区域提供互补链合成起点，和(ii)在其5’-方向具有与使用该内部引物作为起点的互补链合成反应产物的任意区域互补的核苷酸序列；第二内部引物(i)在其3’-末端具有核苷酸序列，该序列能为限定使用第一内部引物为起点的延伸产物中的靶核苷酸序列3’-方向的区域提供互补链合成起点，和(ii)在其5’-方向具有与使用该内部引物作为起点的互补链合成反应产物的任意区域互补的核苷酸序列；第一核苷酸环引物对和第二核苷酸环引物对都是由下一个第一环引物和第二环引物组成的环引物对，在第一核苷酸环引物对中，当靶核苷酸序列中的特定核苷酸是第一核苷酸时，将使用以第一环引物和第二环引物的5’-方向为模板而合成的互补链的3’-末端用作起点的互补链合成反应不受抑制，但是，当所述特定的核苷酸是第二核苷酸时，所述反应会受抑制；在第二核苷酸环引物对中，当靶核苷酸序列中的特定核苷酸是第二核苷酸时，将使用以第一环引物和第二环引物的5’-方向为模板而合成的互补链的3’-末端用作起点的互补链合成反应不受抑制，但是，当所述特定的核苷酸是第一核苷酸时，所述反应会受抑制；第一环引物，它可在第一内部引物延伸产物中的得自第一内部引物的区域与和第一内部引物有关的任意区域之间提供互补链合成起点；和第二环引物，它可在第二内部引物延伸产物中的得自第二内部引物的区域与和第二内部引物有关的任意区域之间提供互补链合成起点；b)催化伴随着链置换的互补链合成的DNA聚合酶；c)互补链合成的底物；和d)含有靶核苷酸序列的受试多核苷酸。
[25]的方法，其进一步含有e)外部引物，它可为模板的3’-方向提供互补链合成起点，所述模板与其中第一引物和/或第二引物的3’-末端与靶核苷酸序列退火的区域有关。
本发明所用多核苷酸可以是DNA，RNA或其嵌合分子。多核苷酸可以是天然核酸以及人工合成的核酸。另外，本发明的多核苷酸也可包括具有部分或完整人工结构的核苷酸衍生物，只要它能形成碱基对，并且必要时可用作互补链合成模板即可。所述分子的例子包括通过肽键形成骨架的PNA。本发明多核苷酸中的核苷酸数目不受限制。术语多核苷酸与术语核酸的含义相同。另一方面，本文所用术语寡核苷酸特指在多核苷酸中具有较少数目核苷酸的多核苷酸。一般说来，术语寡核苷酸指的是含有2至100，更通常为2至50个核苷酸残基的多核苷酸，但它并不受这些数目的限制。
本发明的术语“靶核苷酸序列”指的是待合成的多核苷酸的核苷酸序列。一般说来，从有义链的5’-方向至3’-方向来描述多核苷酸的核苷酸序列。另外，本发明的靶核苷酸序列不仅包括有义链，也包括其互补链即反义链的核苷酸序列。更具体地，术语“靶核苷酸序列”至少指的是待合成的核苷酸序列或其互补链。另外，本发明提供了多核苷酸合成法以及扩增法。当基于本发明进行多核苷酸扩增时，待扩增的核苷酸序列被称为靶核苷酸序列。靶核苷酸序列可以是任意连串的核苷酸序列，其选自长的多核苷酸，或全长单链或环状多核苷酸。
另外，合成指的是将单个靶核苷酸序列增加至少两倍或更多倍的行为。另一方面，当基于合成的靶核苷酸序列合成连续的、新的靶核苷酸序列时，将其特别地称为扩增。扩增也被称为连续合成。
另外，在本发明中，提供互补链合成起点指的是使用作互补链合成所需引物的多核苷酸3’-末端与用作模板的多核苷酸杂交。当在特定区域提供互补链合成起点时，意味着多核苷酸被杂交，以使欲用作互补链合成起点的3’-末端位于该区域内的任意位置。此时，也可将杂交所需的核苷酸序列部分安排在该区域的外部，条件是3’-末端位于靶区域内。
另一方面，在能进行依赖于模板的互补链合成的条件下，上述DNA聚合酶催化互补链合成反应，所述反应将每一种与上述模板多核苷酸及其自身3’-末端退火的引物用作起点。在本发明中，“能进行依赖于模板的互补链合成的条件”指的是下述反应，其中通过将与模板退火的多核苷酸3’-末端用作起点，来合成新的多核苷酸链，该链含有与模板多核苷酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列。在本发明中，新的多核苷酸链也可以是与模板不同的分子，或是与模板相同的分子。例如，通过使多核苷酸的3’-末端与其自身退火而进行互补链合成反应，该反应产生的新的多核苷酸链是与模板多核苷酸相同的分子。在本发明中，也可将能进行依赖于模板的互补链合成的条件简称为能进行互补链合成的条件。
所述反应一般可在能为DNA聚合酶提供最适反应条件的缓冲液中进行。缓冲液中还可同时存在保护DNA聚合酶活性的保护剂，维持活性所需的无机盐等。本领域技术人员根据DNA聚合酶可适当选择反应条件。
在本发明中，术语“3’-末端”和“5’-末端”不是指任一末端的核苷酸，而是指包括单个末端核苷酸的、位于末端的区域。更具体地，术语“3’-末端”和“5’-末端”包括自任一末端起的500个核苷酸，优选为100个核苷酸，或至少为20个核苷酸。与之形成对照的是，为了表示单个末端核苷酸或末端附近存在的特定位置处的核苷酸，需特别指出其位置的数值。
本发明的靶核苷酸序列含有至少一对互补的核苷酸序列。本文所用术语“相同的”和“互补的”包含不完全相同和不完全互补的情况。更具体地，与某个序列相同的序列包括与能和某个序列退火的核苷酸序列互补的序列。另一方面，互补序列指的是在严紧条件下退火，并能提供3’-末端作为互补链合成起点的序列。更具体地，与某个核苷酸序列具有一般为50％至100％，通常为70％至100％，优选为80％至100％的同一性的核苷酸序列可被认为是基本上相同的序列。基于已知的算法，如BLAST即可测定同一性。
当上述互补的核苷酸序列杂交时，本发明的模板多核苷酸即可形成环。互补的核苷酸序列杂交之后，在能稳定保持碱基配对的条件下，难以出现新的碱基对键。另一方面，环能与不同的多核苷酸形成新的碱基对键，所述多核苷酸由与构成此环的核苷酸序列互补的核苷酸序列组成。构成此环的核苷酸序列是任意的。
本发明所用术语“杂交”指的是通过碱基配对使含有互补核苷酸序列的多核苷酸键合。经受碱基配对的多核苷酸可以是不同的分子或相同的分子。如果不同分子之间发生的杂交被终止，就会解离成多个多核苷酸分子。另一方面，在相同分子上杂交的多核苷酸仍保持为一个多核苷酸，甚至当碱基对键溶解时也是如此。在本发明中，也使用术语“退火”。在有些特殊情况下，即当多核苷酸与含有互补核苷酸序列的多核苷酸杂交，并提供3’-末端以用作互补链合成起点时，使用了术语退火。
本发明的模板多核苷酸通过使其3’-末端与自身退火即可形成环。与自身退火的3’-末端能用作使用自身为模板的互补链合成的起点。对用于退火的核苷酸序列没有限制，只要它能自其3’-末端进行互补链合成即可。更具体地，例如，自多核苷酸3’-末端起的100-200个核苷酸，一般为50-80个核苷酸，优选为20-30个核苷酸含有与上述靶核苷酸序列内的任意区域互补的核苷酸序列。此时，退火的3’-末端的核苷酸优选为与靶核苷酸序列完全互补。尽管3’-末端的核苷酸不必完全互补，但这是有效互补链合成的重要条件。
本发明的模板多核苷酸通过使其3’-末端与自身退火即可形成环。与上述环类似，该环由任意的核苷酸序列组成，并以能与另一个多核苷酸进行碱基配对的状态存在。
另外，本发明的模板多核苷酸可在其5’-末端具有与模板自身的任意区域互补的核苷酸序列。当合成该模板多核苷酸的互补链时，合成的新的多核苷酸的3’-末端通过与其自身的任意区域退火，可用作使用自身为模板的互补链合成反应的起点。3’-末端与自身退火形成环。本发明中的引物可与按此方式形成的环退火。
按此方式，通过使模板多核苷酸的5’-末端成为与模板中的任意区域互补的核苷酸序列，即可将互补链合成的产物重新用作模板多核苷酸。因此，这种模板多核苷酸具有可获得本发明的高效互补链合成反应的优选结构。
可以酶促或化学合成本发明的模板多核苷酸。例如，可通过进行下列步骤a)至d)来合成模板多核苷酸。下列步骤a)至d)可以说是LAMP法的多核苷酸合成法a)退火第一引物与靶核苷酸序列，并进行使用其作为起点的互补链合成反应，其中所述第一引物(i)可在其3’-末端为限定构成靶核苷酸序列一条链的3’-方向的区域提供互补链合成起点，和(ii)在其5’-方向具有与使用该引物作为起点的互补链合成反应产物的任意区域互补的核苷酸序列；b)将步骤a)中合成的第一引物延伸产物中与第二引物退火的区域置于允许碱基配对的条件下，其中所述第二引物(i)在其3’-末端具有核苷酸序列，该序列能为限定使用第一引物为起点的延伸产物中的靶核苷酸序列3’-方向的区域提供互补链合成起点，和(ii)在其5’-方向具有与使用该引物作为起点的互补链合成反应产物的任意区域互补的核苷酸序列；c)使所述第二引物与步骤b)中可形成碱基配对的区域退火，并使用其作为起点进行互补链合成；和d)使步骤c)中合成的第二引物延伸产物的3’-末端与自身退火，并使用其自身作为模板进行互补链合成。
下文基于

图1提供了有关上述步骤的更加具体的解释。在下述解释中，阐明了一个方法的例子，其中使用含有R2和R1c的第一引物(RA)和含有F2和F1c的第二引物(FA)产生了本发明的模板多核苷酸。在下述解释中，暂时将第一引物和第二引物分别称为RA和FA。
第一引物RA(i)可在3’-末端为限定构成靶核苷酸序列一条链的3’-方向的区域提供互补链合成起点，和(ii)在5’-方向具有与使用该引物作为起点的互补链合成反应产物的任意区域互补的核苷酸序列。位于RA 3’-方向的区域被称为R2，而位于5’-方向的区域被称为R1c。另一方面，第二引物FA(i)在其3’-末端具有核苷酸序列，该序列能为限定使用上述第一引物RA为起点的延伸产物中的靶核苷酸序列3’-方向的区域提供互补链合成起点，和(ii)在其5’-方向具有与使用该引物作为起点的互补链合成反应产物的任意区域互补的核苷酸序列。FA的3’-方向被称为F2，而5’-方向被称为F1c。另外，分别构成RA和FA的3’-方向和5’-方向的每个区域含有与下列区域互补的核苷酸序列。
RA的3’-方向(R2)R2cRA的5’-方向(R1c)R1FA的3’-方向(F2)F2cFA的5’-方向(F1c)F1最终，通过靶核苷酸序列的R2c和R1测定RA结构，而通过靶核苷酸序列的F2c和F1测定FA结构。因此，在本发明中，需要靶核苷酸序列是这样一种核苷酸序列，即其中该核苷酸序列的至少一部分应是已知的或是可推测的。核苷酸序列可被阐明的部分含有决定着RA和FA结构的每个区域，或含有它们的互补核苷酸序列的区域。R2c和R1c(或F2c和F1c)可以彼此相连，也可以独立存在。通过产物多核苷酸的自身退火形成的环部分的状态取决于两个区域的相对位置。术语自身退火指的是含有单链多核苷酸3’-末端的区域与多核苷酸自身的互补核苷酸序列杂交，以起始使用多核苷酸自身为模板的互补链合成。优选两个区域必需分隔开，使得相对于两个分子的退火而言，更优先进行产物多核苷酸的自身退火。因此，两个区域之间间隔核苷酸序列的长度一般优选为0至500个核苷酸。然而，在有些情况下，区域彼此靠得太近会不利于通过自身退火形成合乎需要的环。
更具体地，环优选具有能退火新的寡核苷酸和伴随着链置换的互补链合成反应的平滑起点的结构。因此，更优选将引物设计成使位于X2c 5’-方向的区域R2c和区域R1c之间的距离为0至100个核苷酸，更优选为10至70个核苷酸。该值不包括R1c和R2c的长度。环部分的核苷酸长度还包括相当于R2的长度。类似的条件也适用于FA中区域F2c和区域F1c之间的距离。
构成RA和FA的区域R2和R1c(或F2和F1c)一般被连续安排，而不会存在与上述核苷酸序列有关的重叠。或者，如果R2(或F2)和R1c(或F1c)享有共同的核苷酸序列，可使它们处于部分重叠的状态。由于需将R2(或F2)用作引物，因此在任何时候都应该将它们置于3’-末端。另一方面，如下所述，应将R1c(或F1c)置于5’-末端，从而为使用R1c(或F1c)为模板所合成的互补链的3’-末端提供引物的功能。将使用寡核苷酸作为合成起点所获得的互补链用作下一步中的反向互补链合成的模板，最终，RA和FA作为互补链的模板被拷贝。被拷贝的3’-末端含有核苷酸序列R1(或F1)，并与位于相同链中的R1c(或F1c)退火以形成环。
开始时，通过退火第一引物的R2与靶核苷酸序列中的R2c来进行互补链合成(图1-(1))。当第一引物的延伸产物转变为单链，并通过退火第二引物的F2与其F2c以进行互补链合成时，当到达第一引物的5’-末端时，互补链合成结束。此时合成的第二引物延伸产物在其3’-末端具有R1。3’-末端的R1是使用第一引物5’-方向的R1c作为模板而合成的区域。R1通过与其自身的R1c退火而用作互补链合成起点，使用自身为模板进行互补链合成(参见图1-(2)的“再循环产物”)。
上述反应最终产生的多核苷酸具有一套由靶核苷酸序列及其互补链组成的互补的核苷酸序列，当它们杂交时，可形成能进行碱基配对的环。另外，F1在其3’-末端含有与其自身F1c互补的核苷酸序列。F1是使用第二引物的F1c作为模板而合成的区域。即该产物在本发明中仅仅是模板多核苷酸而已。
另外，图1中的“再循环产物”表示的是用于提供多核苷酸的结构，所述多核苷酸可用作多核苷酸合成反应的新的起始物质。使用这些结构为模板产生的产物都能产生新的模板多核苷酸。
另外，在图1中还显示出一个步骤，其中通过模板多核苷酸进行互补链合成，所述模板多核苷酸是通过其3’-末端与其自身进一步退火而产生的。结果，产生了具有两套互补靶核苷酸序列的模板多核苷酸(图1-(3))。另外，构成图1-(3)中的靶核苷酸序列的序列是构成F2和R2c之间及其互补核苷酸序列R2和F2c之间的核苷酸序列。
甚至在靶核苷酸序列的互补链中，实际上也在平行进行上述反应。即反应起始于第二引物的互补链合成，贯穿第一引物的延伸产物进行(图1-(2’))，并产生具有两套互补靶核苷酸序列的模板多核苷酸(图1-(3’))。图1-(3)中所示的模板多核苷酸和图1-(3’)中所示的模板多核苷酸具有彼此互补的核苷酸序列。
接着，在进行基于LAMP法合成模板多核苷酸的反应中的步骤b)，即将步骤a)中合成的第一引物延伸产物中与第二引物退火的区域置于允许碱基配对的条件下的步骤中，使用外部引物是有利的。在本发明中，外部引物指的是含有核苷酸序列的引物，所述核苷酸序列与和靶核苷酸序列退火的第一引物和第二引物的上游互补。在本发明中，上游指的是模板的3’-方向。因此，与外部引物退火的区域是第一引物和第二引物5’-方向上的区域。
例如，图1-(1)描述了外部引物R3，它与位于与RA退火的区域R2c的3’-方向的R3c退火。类似地，在其互补链上，外部引物F3可与位于与FA退火的区域的3’-方向的F3c退火。至少在其3’-方向具有可用作引物的核苷酸序列的寡核苷酸可用作外部引物。在本发明中，第一引物和第二引物可用作三种引物中的两种。另一方面，另一方面，本文所描述的外部引物不必由本发明的三种引物组成。使用外部引物合成模板多核苷酸。
与通常由两个引物联合组成的第一引物和第二引物不同，外部引物可由任意数目的引物组成。在本发明中，典型的外部引物由两个外部引物组成，所述引物能为第一引物和第二引物中的每一个的上游提供互补链合成起点。然而，甚至在仅针对第一引物或第二引物安排外部引物的情况下，也可实施本发明的方法。或者，使多个外部引物与第一引物和第二引物中的每一个或其中的一个相混合。在任何情况下，当伴随着更远的上游的互补链合成时，即可有效产生使用第一引物和第二引物作为复制起点的互补链合成反应的产物。
设计本发明中的自外部引物起的互补链合成，使得它比使用第一和第二引物作为复制起点的互补链合成开始得晚。完成此目的的最简单的方法是使第一和第二引物的浓度高于外部引物的浓度。更具体地，一般通过使用浓度差异为2-50倍，优选为4-10倍的引物，即可优先进行自第一和第二引物起的互补链合成。另外，通过将外部引物的解链温度(Tm)设置为低于第一和第二引物的Tm，也可控制合成的时机。
即，通过相对于内部引物FA而言，将外部引物的Tm设计成(外部引物F3∶F3c)≤(F2c/F2)，即可有效进行核酸扩增。优选设计构成FA的每个区域，使得相对于(F2c/F2)而言，优先发生(F1c/F1)之间的退火。在设计中需考虑Tm、组成的核苷酸等等。另外，由于是分子内反应，因此优先进行F1c/F1之间的退火的可能性高，这一点也应该考虑。在设计与FA延伸产物退火的RA时，也应考虑类似的条件。
产生这种关系的结果，可获得随机理想的反应条件。如果其它条件不变，通过退火的互补链的长度和构成碱基对的核苷酸组合即可在理论上计算出解链温度(Tm)。因此，本领域技术人员基于本文说明书的教导能够容易地获得优选的条件。
另外，为了调节外部引物的退火时机，也可使用被称为“邻接堆积”的现象。邻接堆积是当将不能独立退火的寡核苷酸置于与双链部分相邻的位置时，所述寡核苷酸就能够退火的现象(Chiara Borghesi-Nicoletti等，BioTechniques 12，474-477，1992)。换句话说，即将外部引物置于与第一引物和第二引物相邻的位置，设计外部引物，使其在保温条件下不能独立退火。当做到这一点时，由于仅当第一引物和第二引物退火之后，外部引物才可能退火，因此，必然会进行第一引物和第二引物的退火。根据这一原理，实施例中描述了设置一系列反应所需引物寡核苷酸的核苷酸序列的例子。
在上述反应中，含有靶核苷酸序列的多核苷酸样品使用能用作互补链合成模板的任意多核苷酸。具体例子可包括DNA、RNA以及它们的衍生物和嵌合分子。另外，除了天然多核苷酸，如基因组DNA和mRNA外，人工整合至质粒、噬菌体等中的多核苷酸也可用于多核苷酸样品。可以使用纯化的、以及粗的多核苷酸样品。细胞内存在的多核苷酸也可用于原位合成。
接着，在本发明中，使用至少三种引物，它们能为环的不同区域提供互补链合成起点。由引物赋予互补链合成起点的环不仅包括上述模板多核苷酸中存在的环，也包括使用其3’-末端或任何引物作为起点的互补链合成所产生的新的多核苷酸形成的环。
模板多核苷酸至少具有下列两种环1.通过杂交靶核苷酸序列形成的环；和2.通过使模板多核苷酸的3’-末端与其自身退火形成的环。
在模板多核苷酸具有两套或更多套互补核苷酸序列，且互补核苷酸序列被交替安排的情况下，在模板多核苷酸上形成相当于互补核苷酸序列的数目的环。例如，假定多核苷酸由某个核苷酸序列A及其互补核苷酸序列a组成。多套互补核苷酸序列交替安排的状态的例子可由下式表示。
5’-[A]-(L)-[a]-[A]-(L)-[a]-[A]-(L)-[a]-3’
在此例子中，当相邻的[A]和[a]之间发生杂交时，可形成三个环。-(L)-表示因互补核苷酸序列杂交而形成的环部分。另外，通过使3’-末端与其自身退火又可以形成一个环，从而使该模板多核苷酸总共可形成四个环。当3’-末端通过与其自身退火而形成环时，核苷酸序列[a]的一部分被用于退火。因此，当用于与自身退火时，3’-末端的[a]具有与[A]互补的核苷酸序列区域。
另外，对可存在于本发明的模板多核苷酸中的互补核苷酸序列的数目没有限制。因此，由[A]和[a]组成的模板多核苷酸可由下式表示。在该式中，n指的是任何自然数。
5’-{[A]-(L)-[a]}n-3’另一方面，使用模板多核苷酸的3’-末端或任何引物作为起点的互补链合成所产生的新的多核苷酸形成的环具体是按照下述方式形成的。开始时，通过使模板多核苷酸的3’-末端与其自身退火，并使用其自身为模板进行互补链合成反应。如果处于3’-末端和与其退火的区域之间能重复进行碱基配对的状态，反应即可持续进行。结果，重复延伸了与模板多核苷酸互补的核苷酸序列。因此，当模板多核苷酸由一套互补核苷酸序列组成时，随着互补链合成反应的每次重复，互补链合成所得新的多核苷酸中的互补核苷酸序列的数目也随之加倍。当两套互补核苷酸序列在新产生的多核苷酸中分别被杂交时，所产生的环的数目相当于互补核苷酸序列的套数(参见例如图1-(4)或图1-(5))。在这些环中，一些环原先就存在于模板多核苷酸中。其它环由模板多核苷酸的互补核苷酸序列环组成。本发明的与引物退火的环也包括按照此方式产生的新环。
另外，本发明的环还包括通过使引物与模板多核苷酸中存在的环退火，并通过使用其作为互补链合成起点而产生的新的多核苷酸所形成的环。例如，通过使用能为环提供互补链合成起点的引物作为起点即可合成互补链，所述环是通过使模板多核苷酸的3’-末端与其自身退火而形成的。该产物成为含有与模板互补的核苷酸序列的多核苷酸。与模板多核苷酸类似，该多核苷酸通过与互补核苷酸序列杂交而形成环。即产生了具有环的多核苷酸，所述环含有与模板多核苷酸中存在的环互补的核苷酸序列。本发明的引物包括能为按照此方式形成的新环提供互补链合成起点的引物。或者，如上所述，当模板多核苷酸含有与其自身5’-末端的任意区域互补的核苷酸序列时，通过使用其为模板而合成的多核苷酸的3’-末端能通过与自身退火形成环。在本发明中，也可使用能为按此方式形成的环提供互补链合成起点的引物。
另外，当模板多核苷酸的5’-末端含有与其自身的任意区域互补的核苷酸序列时，5’-末端能通过与自身杂交形成环。5’-末端的环也处于能进行碱基配对的状态。然而，一般情况下，仅有自环延伸至5’-末端的一小段区域适用于自引物起的互补链合成，所述引物可为该环提供互补链合成起点。
在本发明中，使用了三种或更多种本发明的引物，它们能在选自上述几种环中的至少一种，优选两种，或三种或更多种环中用作互补链合成起点。“三种或更多种”指的是三种或更多种能在彼此不同的位置提供互补链合成起点的引物。
在本发明中，可以联合使用至少三种，优选四种，或五种或更多种引物。应指出“彼此不同的位置”指的是当引物已退火时，每个引物3’-末端的位置彼此不同。因此，退火所需的核苷酸序列可以部分重叠。然而，当退火所需的区域重叠时，由于引物之间发生竞争，优选将引物的核苷酸序列设计成能尽可能多地与彼此独立的区域退火。另外，通过设计引物的核苷酸序列，使得对于模板多核苷酸中经受杂交和退火的区域而言仅有最少的重叠，有望更加快速地进行互补链合成。因此，例如，可以说本发明的优选引物组合是模板多核苷酸与三种或更多种引物的组合，所述引物能与互补链合成产物中形成的彼此不同的环退火，所述产物是通过使用模板多核苷酸作为模板而产生的。
构成本发明引物的核苷酸序列含有与上述多个环的核苷酸序列互补的核苷酸序列。其3’-方向是赋予这些环以互补链合成起点所必需的。因此，至少其3’-末端应该位于此环内。然而，无需将退火所需的所有核苷酸序列都安排在环内。因此，只要引物能在所需的反应条件下赋予互补链合成起点，退火所需的核苷酸序列的一部分即可与构成与环相邻之双链多核苷酸的核苷酸序列重叠。另外，也可在引物的5’-方向添加任意核苷酸序列。在本发明中，以前提到的LAMP引物可用作能为模板多核苷酸中存在的环提供互补链合成起点的引物。
LAMP法(Nucleic Acid Res.2000，Vol.28，No.12 e63，WO 00/28082)是通过联合使用引物进行高等温互补链合成反应的方法，所述引物通过使模板多核苷酸与其自身的3’-末端退火以用作互补链合成起点，同时也能赋予此时形成的环以互补链合成起点。LAMP法中使用了至少两种引物。第一引物第一引物(i)可在其3’-末端为限定构成靶核苷酸序列一条链的3’-方向的区域提供互补链合成起点，和(ii)在其5’-方向具有与使用该引物作为起点的互补链合成反应产物的任意区域互补的核苷酸序列，[2] 第二引物第二引物(i)在其3’-末端具有核苷酸序列，该序列能为限定使用上述第一引物为起点的延伸产物中的靶核苷酸序列3’-方向的区域提供互补链合成起点，和(ii)在其5’-方向具有与使用该引物作为起点的互补链合成反应产物的任意区域互补的核苷酸序列。
即，用于合成上述模板多核苷酸的第一引物和第二引物能构成基于本发明的多核苷酸合成法中的至少三种引物的一部分。换句话说，通过联合使用第三引物可进行本发明，所述引物能在模板多核苷酸或反应产物形成的环内不同于上述第一引物和第二引物的位置处提供互补链合成起点。在本发明中，除了合成靶核苷酸序列所需的引物外，有时将联合使用的其它引物称为环引物。
不必将用于模板多核苷酸合成的引物也用作合成靶核苷酸序列的引物。可在合成模板多核苷酸的引物中分开加入合成靶核苷酸序列的引物。然而，通常用尽可能少的组分构成反应会更具操作性。
本发明特别优选的环引物是能为R1和R2之间(或F1和F2之间)的区域提供互补链合成起点的引物。当能在R1和R2之间或F1和F2之间退火的环引物与LAMP引物联合使用时，即使用了三种引物。另外，如果除了两种用作LAMP引物的环引物之外，还联合使用了能在R1和R2之间以及F1和F2之间退火的引物，则总共使用了四种引物。在本发明中，环引物有望通过联合使用至少一种，优选为两种或更多种而具有加速多核苷酸合成反应的作用。
该环引物与含有R2的环退火(参见例如图1-(4))。该环由靶核苷酸序列中自R1延伸至R2的区域构成(然而，在图1-(4)中，含有的是R2而不是R1)。对于这种环而言，本发明的环引物可以是具有任意核苷酸序列的核苷酸，所述核苷酸序列含有与构成环的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
然而，实施例中清楚地表明通过选择环内的区域，能更有效地合成多核苷酸。例如，能为不与R1c重叠的区域，即比R1c更靠近3’-方向的区域提供复制起点的环引物可大大增强LAMP法的反应效率。
最终，在将本发明应用于LAMP法时联合使用的优选环引物的例子包括满足下列条件的引物即能为环提供互补链合成起点的引物，所述环(i)是由模板多核苷酸和/或通过使模板多核苷酸与第一引物和第二引物反应而产生的多核苷酸形成的，和(ii)第一引物和第二引物不能与该环退火。环引物应能与安排有3’-末端的区域退火，从而用作环内互补链合成起点。因此，当环内完整地包含退火所需的核苷酸序列时，以及当该序列的一部分与除环以外的区域重叠时，如果3’-末端位于环内，即可以说已满足优选的条件。例如，实施例表明甚至当与环引物退火的核苷酸序列的一部分延伸至与环相邻的双链结构时，也可获得与将被退火的区域完全置于环内所看到的结果相类似的加速反应效果。
图3显示了环引物和构成模板多核苷酸的核苷酸序列之间的优选位置关系。图3表示使用与自身退火的F13’-末端为起点的互补链合成。图3显示了与图1-(2’)相同的结构。即一旦该图中显示的互补链合成已经结束，本发明的模板多核苷酸即已完成。如图3所示，环引物R是与含有R2的环退火的引物。应该指出提供图3是为了显示出与环引物R退火的区域。一到达5’-末端，自与图3的结构退火的环引物R起的互补链合成实际上即已终止。当通过与模板多核苷酸产生的反应产物中形成的类似核苷酸序列的环退火以进行互补链合成时，使用环引物R作为起点的互补链合成可以改善反应效率。
当将本发明应用于LAMP法时，优选环引物能在与LAMP法的条件相同的条件下进行退火。LAMP法的主要优点是无需改变温度即可进行所有反应这一事实。当也联合使用本发明的环引物时，较为理想的是在与LAMP法相同的温度条件下使用环引物以不失去该优点。为了达到此目的，将环引物的Tm设计成与LAMP法引物的Tm水平相同。通过构成引物的核苷酸的类型和数目，以及反应溶液中所含的对Tm有影响的盐和多种组分即可确定Tm。因此，在本发明中，通过与LAMP法反应溶液的条件相匹配的引物的核苷酸序列，可以调节环引物的Tm。本领域技术人员通过调节匹配多种条件的引物的核苷酸序列，即可赋予适当的Tm。这些与环引物相关的条件也适用于由F1c和F2c(或由R1c和R2c)构成的环。
图1-(4)所示的结构是重复互补链合成反应所产生的产物，在所述反应中，模板多核苷酸使用自身作为模板。环由与模板多核苷酸的环互补的核苷酸序列构成。与模板多核苷酸退火的引物不能作为引物与模板多核苷酸的互补核苷酸序列退火。换句话说，本发明优选的环引物能赋予新的多核苷酸上形成的环以互补链合成起点，所述新的多核苷酸是通过使用模板多核苷酸作为模板的合成产生的。利用这种关系的结果，可以进行使用模板多核苷酸作为模板的互补链合成，和使用新产生的多核苷酸作为模板的互补链合成。结果，在短时间内可快速产生更多的多核苷酸。
如上所述，本发明的环引物的3’-方向通过与环退火而用作互补链合成起点。与之形成对照的是，可以在环引物的5’-方向安排与构成互补链任意区域的核苷酸序列互补的核苷酸序列，所述互补链是使用环引物的3’-末端为起点而合成的。在本发明中，安排在环引物的5’-方向上的核苷酸序列的优选例子是与安排在上述内部引物(F1c或R1c)的5’-方向上的核苷酸序列基本上相同的核苷酸序列。本文中，基本上相同的序列包括下述情况通过使用安排在环引物的5’-方向上的核苷酸序列作为模板而产生的互补链的3’-末端能为与互补链的3’-末端退火的区域提供互补链合成起点，所述互补链是使用安排在上述内部引物RA或FA的5’-方向的核苷酸序列为模板而产生的。
例如，可将与安排在RA的5’-方向的核苷酸序列R1c基本上相同的核苷酸序列安排在环引物R中，所述环引物R与含有引物RA的核苷酸序列的环退火。类似地，可将与构成F1c的核苷酸序列基本上相同的核苷酸序列安排在环引物F的5’-方向，所述环引物F与含有内部引物FA的核苷酸序列的环退火。
由在5’-方向上具有与其自身互补的核苷酸序列的环引物产生的延伸产物能在通过使用其为模板产生的互补链的3’-末端赋予与其自身互补的核苷酸序列。结果，环引物的产物也具有可用作LAMP再循环产物的结构。因此，通过环引物也能引发LAMP核酸扩增反应，从而能够预期获得高扩增速率。
从上述解释中可以清楚地看出当将LAMP法应用于本发明的多核苷酸合成法时，如果使用了上述第一引物，第二引物和环引物，可基于靶核苷酸序列得到模板多核苷酸，另外，可进行本发明的多核苷酸合成法。换句话说，如果使下列组分与靶核苷酸序列一起保温，可进行本发明的多核苷酸合成法。可以任何次序混合或同时混合这些反应组分。通过在该反应系统中再加入外部引物(将在下文中描述)，可在相同温度下，靶向双链多核苷酸样品进行所有步骤。
*含有靶核苷酸序列的多核苷酸样品*第一引物*第二引物*环引物(一种或两种或更多种)*能催化伴随着链置换的互补链合成的DNA聚合酶*互补链合成的底物另外，如果在能进行互补链合成的条件下保温这些组分，基于靶核苷酸序列最终合成的多核苷酸将持续产生新的模板多核苷酸。所有新产生的多核苷酸都能用作合成新的多核苷酸的物质。即发生了多核苷酸扩增。本发明包括按照此方式获得的多核苷酸扩增法。通过基于本发明的多核苷酸合成法扩增多核苷酸，可以大大改善扩增效率。例如，通过进行基于本发明的、在优选条件下联合使用环引物和LAMP引物的扩增法，与不存在环引物时相比，反应时间可缩短至一半或更短。
下文提供了有关通过使用RA(第一引物)、FA(第二引物)、环引物F和环引物R，并与催化链置换型互补链合成反应的DNA聚合酶混合，还参照图1和2中阐明的基本原理扩增双链多核苷酸的反应的解释。在此例子中，RA和FA构成了一套由用于合成靶核苷酸序列的第一引物和第二引物组成的引物。环引物F能为含有F2的环提供互补链合成起点，而环引物R能为含有R2的环提供互补链合成起点。
如上所述，当通过使图1-(2)或图1-(2’)所示的3’-末端与自身退火以进行互补链合成的步骤完成时，即可获得本发明的模板多核苷酸。另外，在该模板多核苷酸的环中，通过分别与RA(图1-(2))或FA(图1-(2’))退火以进行互补链合成，模板多核苷酸的3’-末端因置换而再次成为单链。成为单链之后，3’-末端与自身退火，互补链合成得以进行。结果，产生了图1-(3)和图1-(3’)所示的产物。按照此方式，重复互补链合成循环，所述循环由使引物RA或引物FA与环退火，互补链合成，置换模板多核苷酸的3’-末端，最终使3’-末端与自身退火组成。
此时，模板多核苷酸使用自身为模板延伸其3’-末端，结果，置换了使用与环退火的RA或FA作为复制起点的互补链合成的产物，导致产生新的单链多核苷酸。该单链多核苷酸在其3’-末端和5’-末端具有与自身互补的核苷酸序列。换句话说，制备出具有与图1-(2)和图1-(2’)相同之结构的产物。这些产物成为新的模板多核苷酸，重复进行类似的反应。到达该点的整个反应机制被阐明为LAMP法。
在图1-(3)中，与环退火的引物FA延伸，同时置换模板多核苷酸的双链结构，直至最终到达5’-末端。此时，被置换的模板多核苷酸的3’-末端方向具有单链结构。因而，与其自身互补的核苷酸序列相互杂交。按照此方式形成的产物具有图1-(4)所示的结构。即，在与互补核苷酸序列杂交的同时，通过使模板多核苷酸的3’-末端与自身退火而形成环。因与互补核苷酸序列杂交而形成的环是互补链，该互补链是用作起点的模板多核苷酸环部分的拷贝。从图中可以清楚地看出该环含有R2，FA和RA不能与其退火。然而，环引物R能与含有R2的环退火。因此，通过使环引物R与含有R2的环退火即可起始互补链合成。
另一方面，基于已知的LAMP法的多核苷酸扩增反应得以继续。即，由于通过使用自身为模板的模板多核苷酸和通过与环退火的引物FA的延伸反应，扩增反应得以继续。该反应本身只是多核苷酸扩增反应，其中新的模板多核苷酸不断产生。应指出的是本文未显示起始于图1-(4)中的，以前以LAMP法阐明的扩增反应。
伴随着环引物R的延伸，模板多核苷酸和引物FA的延伸产物都被置换以进行碱基配对，再次导致产生模板多核苷酸。图1-(6)中特别显示的环引物R的延伸产物具有能退火三种由环引物F、环引物R和FA组成的引物的结构。已知的LAMP法不能产生这种类型的产物。本发明的方法产生了图1-(6)中所示的、区别于基于LAMP法的已知产物的模板多核苷酸。图1-(6)所示的模板多核苷酸与环引物一起起始另一个多核苷酸扩增反应。按照此方式，进行再次产生新的多核苷酸的反应，该反应不同于LAMP法中已知的互补链合成。结果，显著改善了互补链合成的合成效率，并大大缩短了反应时间。
另外，在图1-(6)所示的结构中，引物RA能与5’-末端附近含有R2c的区域退火。然而，由于与该位置退火的引物仅适宜5’-末端附近小区域的互补链合成，因此未在图1-(6)中显示。
以下描述继续提供有关当本发明的反应得以再次持续时产生的产物类型的解释。图1-(4)中由环引物R产生的延伸产物具有图1-(6)所示的结构。在图1-(6)中显示了这样一种结构，其中两个环引物和一个引物FA按照与图1-(5)中相同的方式退火。其中，两个环引物的延伸产物完全被置换，通过自3’-末端进行的、将图1-(6)中所示多核苷酸的自身用作模板的互补链合成反应产生单链多核苷酸。
另一方面，完成了将图1-(6)中所示多核苷酸的自身用作模板的互补链合成。在图2-(7)含有F2c的环中，通过使引物FA与该环退火以起始互补链合成。由于图2-(7)中含F2c的环实际上已在图1-(6)中形成，FA与该环退火的反应与产生图2-(7)的反应平行进行。在任何情况下，从图2-(7)所示的多核苷酸环延伸至3’-末端的区域被置换，由于与环退火的FA的延伸而产生单链。
已成为单链的区域中含有的互补核苷酸序列分别被杂交，导致形成图2-(8)所示的结构。另外，在已成为单链的多核苷酸中，很有可能会优先发生与物理上靠近的区域中的互补核苷酸序列的杂交。因此，与邻近区域的杂交优先于与其它分子的杂交，所述分子如多种引物或位于更远处的互补核苷酸序列。从图中可以清楚地看出环引物R与图2-(8)所示的多核苷酸的3’-末端退火。另外，形成了两个能与引物FA和RA退火的环。除了已与环退火的每个引物的延伸外，它们也通过自环引物R起的延伸反应被置换，导致产生单链多核苷酸，由图2-(8)的多核苷酸上解离下来。
通过环引物R的互补链合成的结果所形成的双链多核苷酸未形成任何新的环，而是成为图2-(12)中稳定的双链多核苷酸。尽管该多核苷酸在LAMP法的反应条件下是稳定的并且是双链多核苷酸，它可用作新的模板。换句话说，尽管如图2-(12)所示，它是不伴随有环的双链多核苷酸，但它通过用作FA和RA的模板能起始新的反应。图2-(12)中所示的结构不具有与外部引物退火的区域R3或F3(图1-(1))，当将双链多核苷酸用作模板多核苷酸时会使用所述区域。然而，在图2-(12)中所示的结构中，由于连续安排了多个能与引物FA和RA退火的区域，上游的FA有望为下游的FA阐明外部引物的功能。下文再描述将双链多核苷酸用作模板的反应。
使用图2-(8)的多核苷酸作为模板而产生的单链多核苷酸具有图2-(9)、图2-(10)和图2-(11)所示的三种结构。下文显示了模板和产生每种结构的引物之间的关系。每个多核苷酸以图2括号()中的数字表示。
模板 (7) (8) (8)引物 FARAFA单链多核苷酸 (9) (10) (11)通过使对应于由每个多核苷酸形成的环的引物与多核苷酸退火，由这些单链多核苷酸起进行下列反应。开始时，图2-(9)的多核苷酸通过与F2c退火的引物FA和与R2c退火的引物RA，产生图2-(14)和图2-(15)所示的产物作为延伸产物。因自环引物R的互补链合成反应而被置换的结果，这些产物都解离成单链多核苷酸，其中所述环引物与多核苷酸图2-(9)中含有R2的环退火。图2-(14)和图2-(15)所示的两种多核苷酸具有等同于在图1中被表示为“再循环产物”的图1-(2)和图1-(3)中的一系列多核苷酸的结构。严格的对比揭示出当环形成时，环内的R2和F2(或R2c和F2c)两者之间的安排有所不同。然而，这些多核苷酸都能导致产生模板多核苷酸，并构成多核苷酸扩增反应。
接着，将注意力集中于图2-(10)的多核苷酸。按照与图2-(9)几乎相同的方式，由这些多核苷酸也产生了引物FA和引物RA的延伸产物，也就是图2-(15’)和图2-(16)的单链多核苷酸。这些多核苷酸伴随着环引物R的互补链合成而被置换，并解离成单链多核苷酸。图2-(15’)所示的多核苷酸具有等同于图1-(3’)的结构。图2-(16)也是模板多核苷酸，它具有能按照与图1-(3)相同的方式与自身退火的3’-末端。因此，都能用作模板多核苷酸或用作新互补链反应的模板。
另外，图2-(11)的多核苷酸也按照与上述多核苷酸相同的方式产生新反应的起始物质。即，图2-(17)和图2-(18)分别作为与环退火的引物FA和引物RA的延伸产物而被产生。这些产物伴随着环引物R的互补链合成而被置换，并解离成单链多核苷酸。所产生的图2-(1 8)仅仅是模板多核苷酸，其具有能按照与图1-(3)相同的方式与自身退火的3’-末端，而图2-(17)也仅仅是模板多核苷酸，其具有能按照与图1-(3’)相同的方式与自身退火的3’-末端。
据认为得自环引物FA的图2-(13)经受如下所述的反应，例如随后会与引物F退火的互补链合成；自环引物R起的互补链合成，所述环引物与被上述互补链合成置换的区域退火；和通过解离上述引物FA的延伸产物产生单链多核苷酸。由于不认为这些反应可以导致产生新的模板多核苷酸，因此图中未显示这些反应。
最终，图2-(14)至图2-(18)所示的所有产物通过成为本发明的模板多核苷酸而用作新的互补链合成的起始物质。即，它们导致形成图1中被表示为“再循环产物”的结构。按照此方式继续基于本发明的多核苷酸扩增法。
通过将双链状态的多核苷酸中包含的靶核苷酸序列用作起始物质，即可合成本发明的模板多核苷酸。本发明人已报道了通过使引物与双链状态的靶核苷酸序列退火以进行互补链合成的方法(23rd Annual Meeting of theJapan Molecular Biology Society，December 13-16，2000，Kobe，Nagamine，K.，Watanabe，K.，Ohtsuka，K.，Hase，T.，and Notomi，T.(2001)，Loop-mediatedisothermal amplification reaction using a non-denatured template，Clin.Chem.47，1742-1743)。
在图1中，通过使用单链靶核苷酸序列作为起始物质来合成模板多核苷酸。然而，如果使用将双链状态的多核苷酸中包含的靶核苷酸序列用作起始物质的方法，可以省略变性成单链的步骤，可直接将双链多核苷酸用作起始物质。本发明的双链多核苷酸包括例如cDNA和基因组DNA。另外，还可将多种已插入这些DNA的载体用作本发明的双链多核苷酸。另一方面，单链多核苷酸包括通过用热、碱等变性双链多核苷酸获得的单链多核苷酸，以及原本就以单链多核苷酸形式存在的单链多核苷酸，如mRNA。本发明的双链多核苷酸可以是纯化的或粗的核酸。另外，本发明的方法也可用于细胞中的核酸(原位)。使用细胞中的多核苷酸作为模板可以进行原位基因组分析。
当将cDNA用作本发明的模板时，可在相同的条件下进行cDNA合成的步骤和本发明的多核苷酸合成法。当使用RNA作为模板来合成cDNA的第一条链时，会形成DNA-RNA杂交体形式的双链多核苷酸。使用双链多核苷酸作为本发明的模板，可以进行多核苷酸合成法。当本发明的多核苷酸合成法中所用的DNA聚合酶具有逆转录酶活性时，可在相同条件下使用单个酶进行多核苷酸合成。例如，Bca DNA聚合酶是具有链置换活性以及逆转录酶活性的DNA聚合酶。也可以在通过合成第二条链形成完整的双链eDNA之后，使用本发明的多核苷酸合成法。
当由双链多核苷酸中的靶核苷酸序列合成模板多核苷酸时，首先将任意引物与双链多核苷酸混合，在确保使用引物为起点进行互补链合成的条件下保温混合物。此处，用任意引物使得将与第一引物退火的区域处于碱基配对的条件下。因此，任意引物必须能与靶核苷酸序列中的多核苷酸链的互补链退火，所述靶核苷酸序列与第一引物退火。另外，使用本发明的任意引物作为合成起点的互补链合成中的链延伸应该朝着与第一引物退火的区域进行。换句话说，引物可与该区域的任意部分退火，所述区域用作以第一引物为起点的互补链合成的模板。可从任意区域中选择任意引物，只要它满足上述标准即可。例如，第二引物也可用作任意引物。由于必需反应组分数目的减少，外部引物的使用是本发明的优选实施方案之一。
因此，在基于LAMP法合成模板多核苷酸的反应的步骤a)中，即在第一引物与靶核苷酸序列退火以起始互补链合成的步骤中，通过在使用任意引物为起点的互补链合成中置换双链多核苷酸两条链中的一条链，可以确保与第一引物的碱基配对。通过选择这种条件，无需改变温度即可进行合成法。能确保任意引物和双链多核苷酸退火，以及使用该引物作为起点的互补链合成的条件实际上是无需改变反应条件即可获得下列多个步骤的条件i)使引物与双链多核苷酸模板退火；和ii)使用退火引物作为复制起点进行互补链合成。
据信仅当与引物退火的区域为单链时，引物才能与核酸链退火。因此，当将双链多核苷酸用作模板时，核酸需经受在引物退火之前通过变性将核酸转变为单链的步骤。然而，通过在以某种方式使双链去稳定化但不完全地将双链转变为单链的条件下保温模板和引物，可获得使用引物为起点的互补链合成反应。这种使双链去稳定化的条件的例子包括加热双链核酸几乎达到解链温度(下文简称为Tm)。或者，添加Tm调节剂也是有效的。
在合成本发明的多核苷酸的方法中，在缓冲液的存在下进行包括一系列步骤的反应，所述缓冲液能提供适于酶反应的pH，以及退火引物和维持酶催化活性所需的盐，酶的防腐剂，必要时还可加入解链温度(Tm)调节剂等。本发明中使用了具有缓冲作用的，pH范围为中性至弱碱性的缓冲液，如Tris-HCl。根据所用DNA聚合酶的类型来调节pH。为了维持酶活性和改变多核苷酸解链温度(Tm)而添加的盐的例子包括KCl，NaCl，MgCl2，MgSO4，(NH4)2SO4等。酶防腐剂包括牛血清白蛋白和糖。
另外，典型的解链温度(Tm)调节剂包括甜菜碱，脯氨酸，二甲基亚砜(下文简称为DMSO)，甲酰胺和三甲胺-N-氧化物(下文简称为TMANO)。当使用解链温度(Tm)调节剂时，可以在有限的温度范围内调节上述寡核苷酸的退火。另外，甜菜碱(N，N，N-三甲基甘氨酸)和四烷基铵盐因其等稳定化作用，能有效改善链置换的效率。在反应溶液中添加浓度约为0.2至约3.0M，优选约0.5至约1.5M的甜菜碱有望能增强本发明的多核苷酸扩增。由于这些解链温度调节剂能降低解链温度，可通过考虑反应条件，如盐浓度和反应温度，选择能给出所需严紧度和反应性的条件。
通过利用Tm调节剂可以容易地选择适于酶反应的温度条件。可根据引物和靶核苷酸序列的关系改变Tm。因此，优选调节Tm调节剂的量，以使维持酶活性的条件与符合本发明标准的保温条件相一致。根据本发明的内容，本领域技术人员可以根据引物核苷酸序列容易地选择需添加的Tm调节剂的适当量。例如，可根据退火核苷酸序列的长度，GC含量，盐浓度和Tm调节剂的浓度确定Tm。
假设这种条件下引物与双链多核苷酸的退火是不稳定的。然而，当将DNA与能置换链的聚合酶一起保温时，使用不稳定的退火引物作为复制起点能进行互补链合成。一旦合成互补链，引物退火在此过程中变得更加稳定。下列DNA聚合酶可在确保引物与双链核酸退火的条件下催化互补链合成。
可以化学合成本发明所用的所有引物。合成DNA的方法是众所周知的。或者，可将天然多核苷酸截短和改变或连接以包含必需的序列。另外，本发明所用的所有引物可以是经人工诱变的，以及具有天然DNA结构的引物。引物必需符合两个要求(1)能够形成与靶核苷酸序列互补的碱基对，和(2)能在碱基对的3’-末端提供-OH基团，以用作互补链合成起点。另外，优选引物可以是互补链合成的模板。引物的骨架不局限于由磷酸二酯键构成的那些骨架。例如，引物可以是硫代磷酸酯，或可含有基于肽结合的肽核酸。另外，核苷酸可以是任何核苷酸，只要它能形成互补的碱基对即可。一般说来，有五种类型的天然核苷酸，即A，C，T，G和U；然而，也包括例如类似物，如溴脱氧尿苷。本发明中所用的寡核苷酸不仅可用作合成起点，也优选可用作互补链合成的模板。
本发明中所用引物由具有适当长度的核苷酸组成，使得能在本发明的多种类型的多核苷酸合成反应的给定条件下，通过维持所需特异性与互补链进行碱基配对。具体地，引物含有5至200个核苷酸，更优选10至50个核苷酸。已知的能催化序列-依赖型多核苷酸合成的聚合酶所能识别的引物的最小长度为5个核苷酸左右。因此，退火部分的长度应该长于5个核苷酸。另外，为了确保核苷酸-序列特异性，引物含有随机的10个核苷酸或更多个核苷酸。另一方面，难以化学合成过长的核苷酸序列。因此，举例说明的上述引物长度是优选的范围。例举的引物长度仅对应于与互补链退火的部分。例如，RA至少由两个区域组成，即R2和R1c。因此，应将上文例举的引物长度理解为其对应于构成引物的每个区域的长度。
本发明所用术语“模板”指的是用作互补链合成模板的多核苷酸。尽管具有与模板互补的核苷酸序列的互补链是对应于模板的链，但这两者之间的关系仅仅是相关。具体地说，作为互补链被合成的链能用作模板。换句话说，互补链也可用作模板。
在本发明合成或扩增多核苷酸的方法中，使用了催化包含链置换的互补链合成反应的DNA聚合酶。与SDA等方法中所用类型相同的聚合酶也可用作本发明的DNA聚合酶。本领域已知特定的聚合酶，它能在互补链合成期间，通过置换5’方向上的双链区域(如果模板上存在任何双链区域的话)来合成互补链，其中所述互补链合成使用与某个核苷酸序列3’方向的区域互补的引物作为合成起点。因此，模板的5’方向是互补链合成反应进行的方向。在本发明中，进一步加入互补链合成所需的底物。
催化伴随着链置换的互补链合成反应的DNA聚合酶在本发明的多核苷酸合成法中起着核心作用。所述DNA聚合酶包括下文所列的那些酶。另外，本发明中还可使用这些酶的多种突变体，只要它们具有依赖于-序列的互补链合成活性和链置换活性即可。所述突变体包括仅含有具有催化活性之结构的截短形式的酶，或已通过氨基酸突变修饰其催化活性，稳定性或热稳定性的突变酶等。
Bst DNA聚合酶Bca(外切-)DNA聚合酶DNA聚合酶I的Klenow片段Vent DNA聚合酶Vent(外切-)DNA聚合酶(无外切核酸酶活性的Vent DNA聚合酶)DeepVent DNA聚合酶DeepVent(外切-)DNA聚合酶(无外切核酸酶活性的Deep Vent DNA聚合酶)φ29噬菌体DNA聚合酶MS-2噬菌体DNA聚合酶Z-Taq DNA聚合酶(Takara Shuzo)KOD DNA聚合酶(TOYOBO)在这些酶中，特别优选Bst DNA聚合酶和Bca(外切-)DNA聚合酶，因为它们具有某种水平的热稳定性和高催化活性。在本发明中，特别是当使用双链多核苷酸作为模板时，在相同条件下进行引物的退火和互补链合成。由于所述反应经常需要一些加热，因此优选使用热稳定性酶。可在使用热稳定性酶的多种条件下进行反应。
例如，Vent(外切-)DNA聚合酶是具有链置换活性的高热稳定性酶。据报道添加单链-结合蛋白能加速由DNA聚合酶催化的包括链置换的互补链合成反应(Paul M.Lizardi等，Nature Genetics 19，225-232，July，1998)。通过将该方法应用于本发明，有望通过加入单链-结合蛋白来加速互补链合成。当使用Vent(外切-)DNA聚合酶时，T4基因32作为单链-结合蛋白是有效的。
已知缺乏3’-5’外切核酸酶活性的DNA聚合酶具有这样一种现象，其中甚至当反应到达模板的5’-末端，反应继续进行，直至在合成的链中加入额外的核苷酸时，互补链合成也未终止。本发明中不优选这种现象，因为接下来的互补链合成从已合成的3’-末端互补链序列开始。然而，通过DNA聚合酶添加至3’-末端的核苷酸很有可能是核苷酸“A”。因此，应该选择互补链合成所用的序列，以从3’-末端的A开始合成，从而避免因错误添加单个-dATP核苷酸带来的问题。或者，甚至当3’-末端在互补链合成过程中突出时，可通过3’→5’外切核酸酶活性将其消化成平端。例如，可以联合使用具有这种活性的天然Vent DNA聚合酶与Vent(外切-)DNA聚合酶以克服上述问题。
与上述DNA聚合酶不同，常规用于PCR等的DNA聚合酶，如Taq聚合酶在一般条件下基本上不表现出链置换活性。然而，这种DNA聚合酶可用于本发明，只要在确保链置换的条件下使用它们即可。
另外，本发明涉及基于上述多核苷酸扩增法的多核苷酸检测法。即通过使用根据上述扩增法的产物的量或存在作为指数，可以测定靶核苷酸序列的量或存在。检测多核苷酸的方法是已知的。例如，诸如溴化乙锭(简称为EtBr)的嵌入剂通过与双链DNA反应而发出荧光。通过使用这种类型的指数即可测定基于本发明的扩增反应的产物的量或存在。
例如，可以使用下述方法测定基于本发明的多核苷酸检测法的多核苷酸量。开始时，可以使用测定给予固定信号所需时间的方法。由于本发明的扩增法是依赖于量的反应，用作模板的多核苷酸最初存在的量会影响直至反应到达平稳期的时间。因此，只要其它反应条件相同，可将多核苷酸的量表示为直至反应到达平稳期的时间的函数。另外，也可将多核苷酸的丰度表示为在固定的反应时间内形成的扩增产物量的函数。
在LAMP法中，当与靶核苷酸序列的引物退火的区域处于适当的位置关系中，且它的核苷酸序列与设计的相同时，会发生先进的扩增反应。换句话说，当在必须用作互补链合成起点的区域中，靶核苷酸序列不同于预测的核苷酸序列时，LAMP法受到相当程度的抑制。将与自身退火的3’-末端用作起点的互补链合成特别重要。在LAMP法中，与自身退火的3’-末端等同于将引物5’-末端上安排的核苷酸序列用作模板而合成的互补链的3’-末端。因此，优选在第一引物(RA)和/或第二引物(FA)的5’-方向上安排的区域(R1或F1)的5’-末端或其附近安排与待测突变位点互补的核苷酸。因此，如果经设计使得这一重要的序列对应于待测突变，通过观察根据LAMP法的扩增反应产物，即可分析如核苷酸缺失或插入的突变，或如SNP的基因多态性的存在。
更具体地，设计预测具有突变或多态性的核苷酸，使其等同于用作互补链合成起点的3’-末端的附近(或者当互补链是起点时，等同于5’-末端的附近)。即设计该核苷酸，使得当在与引物或与和自身互补的3’-末端退火的区域中，任何核苷酸都不同于预测的核苷酸时，使用该引物作为起点的互补链合成受到损害。例如，当自用作互补链合成起点的3’-末端起计数的10个核苷酸内，特别是第2至第4个核苷酸，更优选为第2或第3个核苷酸有错配时，互补链合成受到显著抑制。此处，预测的核苷酸序列可以是野生型序列或突变的序列。当突变的序列被预测时，仅当存在特定的突变时才会开始互补链合成。当在用作互补链合成起点的3’-末端或其附近有错配时，多核苷酸互补链合成反应受到显著抑制。因此，当扩增反应未受抑制时，可以判断靶核苷酸序列由预测的核苷酸序列组成。相反，当扩增反应受到抑制，且形成产物的水平与对照不同时，可以判断靶核苷酸序列不同于预测的核苷酸序列。
LAMP法不会导致先进的扩增反应，除非在最初的反应产物的末端结构上重复进行反应。因此，即使错误地进行合成，由于构成扩增反应的互补链合成在每个阶段总是受抑制，故不会发生先进的扩增，而是含有错配。结果，错配有效抑制了扩增反应，最终导致获得正确的结果。换句话说，基于LAMP法的多核苷酸扩增反应具有更加高度完备的核苷酸序列检验机制。这些特征提供了不同于如PCR的方法所预期的优点，在PCR法中，仅在两个区域中进行扩增反应。本发明人已递交了一份与基于LAMP法的多态性和突变检测法有关的专利申请(WO 01/34838)。
本发明提供了通过使用本发明的环引物来检测靶核苷酸序列中的突变的方法，其中当靶核苷酸序列中的特定核苷酸不是预测的核苷酸时，至少一种选自使用内部引物的3’-末端、环引物和这些引物的延伸产物作为起点的互补链反应的互补链合成反应受到损害，通过使用上述扩增反应的产物为指数，检测靶核苷酸序列是否是预测的核苷酸序列。通过观察基于上述互补链合成反应形成的扩增反应产物的产生，当与靶核苷酸序列是预测的核苷酸序列时相比，上述产生受到抑制时，可以判断特定的核苷酸不是预测的核苷酸。
例如，当通过使用内部引物的5’-末端作为模板而合成的互补链通过与自身退火起始互补链合成时，为了通过使用基于本发明的LAMP法检测靶序列中的特定核苷酸是否是预测的核苷酸，应该进行设计，使得互补链合成受上述特定核苷酸的控制。也可设计本发明，以调节开始于内部引物3’-末端的互补链合成反应。然而，为了利用重复与模板核苷酸序列退火的LAMP法的特征，优选在内部引物的5’-方向安排检验序列。在本发明中，检验序列指的是满足下列条件(a)、(b)和(c)的核苷酸序列。
(a)检验序列被安排在内部引物的5’-末端，通过使用其核苷酸序列作为模板而合成的互补链的3’-末端通过与靶核苷酸序列或其互补链退火而用作互补链合成起点。
(b)在待检验的核苷酸不是预测的核苷酸的情况下，当(a)的3’-末端与靶核苷酸序列或其互补链退火时会发生错配。
(c)(b)中发生的错配会抑制(a)的互补链合成。
即，本发明提供了通过在使用下列第一引物和第二引物作为内部引物的本发明中联合使用环引物，以检测靶核苷酸序列中的特定核苷酸是否是预测的核苷酸的方法，其中至少第一引物或第二引物中的任一个在其5’-方向含有检验序列。
检验序列指的是这样一种核苷酸序列，其中，当构成上述特定区域的核苷酸序列不是预测的核苷酸序列时，当使用检验序列为模板而合成的互补链的3’-末端与靶核苷酸序列或其互补链退火时会发生错配，使用该3’-末端作为起点而起始的互补链合成反应受到该错配的抑制。
第一引物第一引物(i)可在其3’-末端为限定构成靶核苷酸序列一条链的3’-方向的区域提供互补链合成起点，和(ii)在其5’-方向具有与使用该引物作为起点的互补链合成反应产物的任意区域互补的核苷酸序列。
第二引物第二引物(i)在其3’-末端具有核苷酸序列，该序列能为限定使用第一引物为起点的延伸产物中的靶核苷酸序列3’-方向的区域提供互补链合成起点，和(ii)在其5’-方向具有与使用该引物作为起点的互补链合成反应产物的任意区域互补的核苷酸序列。
例如，能通过使用检验序列提供基于特定核苷酸中的差异的错配的位置优选为自用作互补链合成起点的3’-末端起计数的10个核苷酸内，特别优选为自3’-末端起计数的第2至第4个核苷酸，更优选为第2或第3个核苷酸。在本发明中，此位置处的错配能最有效地抑制互补链合成。此处，预测的核苷酸序列可以是野生型序列或突变序列。当在用作互补链合成起点的3’-末端或其附近存在错配时，多核苷酸互补链合成反应受到显著抑制。
上述每一种方法的目的是通过将检验序列置于内部引物的5’-方向来检验靶核苷酸序列中的特定核苷酸。在LAMP法中，通过将内部引物的5’-方向上安排的核苷酸序列用作模板而合成的互补链的3’-末端可以用于通过使用互补链合成反应的产物为指数来检验靶核苷酸序列中的特定核苷酸。
另外，本发明提供了通过使用内部引物以及环引物的5’-方向上安排的核苷酸序列检验靶核苷酸序列中的特定核苷酸的方法。即本发明提供了通过使用下列第一环引物和/或第二环引物作为环引物以及含有检验序列的上述内部引物，检测靶核苷酸序列中的特定核苷酸是否为预测的核苷酸的方法。然而，此时，当环引物含有与先前所述的内部引物的5’-方向上安排的任意区域互补的核苷酸序列时，或当内部引物的5’-方向上安排的核苷酸序列是检验序列时，其中的用于提供检验序列中的上述错配的核苷酸不同于检验序列的序列被置于环引物的5’-方向。当内部引物的5’-方向上安置的核苷酸序列是检验序列时，其中的用于提供错配的核苷酸不同于检验序列的序列可以仅仅是所述核苷酸有所不同，或者可以是包括该核苷酸的多个核苷酸有所不同。
第一环引物它可在第一内部引物延伸产物中的得自第一内部引物的区域与和第一内部引物有关的上述任意区域之间提供互补链合成起点。
第二环引物它可在第二内部引物延伸产物中的得自第二内部引物的区域与和第二内部引物有关的上述任意区域之间提供互补链合成起点。
基于LAMP法的特定核苷酸检验机制的主要特征是使用与模板或其互补链退火的3’-末端作为起点的互补链合成反应重复发生。由于该特征，通过使用互补链合成反应作为指数，可以敏感地检测模板中的核苷酸差异。然而，在LAMP法中，也会发生非检验机制介导的反应。由于非检验机制介导的反应产生了检验模板的核苷酸序列所不能产生的产物，这种反应产物很可能破坏对结果的判断。在重复根据LAMP法的扩增反应的过程中，反应系统中逐渐积累导致该反应的产物。
在使用扩增反应作为指数的分析方法中，更敏感的检测所需的重要条件产生了，即在扩增反应得以进行和反应被抑制这两种情况之间，扩增反应产物量的差异和反应速率的差异应尽可能地大。然而，如果存在多个以与模板核苷酸不相关的方式形成的反应产物，就难以在这两者之间形成大的差异。换句话说，会存在这样一种风险，即可能会丧失使用所形成的扩增产物的量及其形成速率为指数的分析方法的敏感性。
在本发明中，使用环引物的5’-方向来检验靶核苷酸序列中的特定核苷酸具有抑制可能会妨碍结果判断的产物的作用。下文提供了对本发明环引物的5’-方向上安排的核苷酸序列的功能的解释。
环引物的5’-方向上安排的核苷酸序列提供了3’-末端，该3’-末端通过在使用该引物为模板而产生的互补链中与自身退火而用作互补链合成起点。此时，当特定的核苷酸是预测的核苷酸时，使用该3’-末端作为起点的互补链合成受到抑制。原因如下文所述。
如上文所提到的，在本发明的方法中，设计内部引物的5’-方向上安排的检验序列，使得当在使用其作为模板而产生的互补链的3’-末端中，特定的核苷酸不是预测的核苷酸时，互补链合成被该错配抑制。换句话说，当特定的核苷酸是预测的核苷酸时，内部引物的检验序列能使互补链合成反应得以进行，所述反应将用于模板的互补链的3’-末端用作起点。在此方法中，当模板核苷酸序列中的特定核苷酸不是预测的核苷酸时才会终止发生的、不合乎需要的反应所产生的产物含有被不同于模板的核苷酸置换的核苷酸序列，在所述模板中，特定的核苷酸是预测的核苷酸。因某些原因，贯穿由经使用检验序列为模板而合成的互补链的3’-末端所提供的检验机制的结果可产生该产物。为了便于进行以下解释，在将经使用内部引物的5’-方向为模板而产生的互补链的3’-末端用作起点的互补链合成反应中，将其中的上述特定核苷酸已被置换的产物暂时称为假产物。在分析特定核苷酸时，应该抑制假产物的形成和使用所形成的假产物作为模板的新的互补链合成反应。
在构成假产物的核苷酸序列中，特定的核苷酸不是预测的核苷酸。对环引物而言，由于通过使用假产物为模板进行反应，当特定的核苷酸不是预测的核苷酸时，将使用环引物的5’-方向为模板而产生的互补链的3’-末端用作起点的互补链合成反应受到损害。最终，使用假产物为模板的、自3’-末端起的互补链反应受到损害。按照此方式，通过使用环引物的5’-方向上安排的核苷酸序列，可以抑制不合乎需要的反应。
另一方面，甚至当靶核苷酸序列中的特定核苷酸是预测的核苷酸时，也可抑制将使用环引物的5’-方向上安排的核苷酸序列为模板而产生的互补链的3’-末端用作起点的互补链合成反应。然而，由于使用环引物的3’-方向为起点的互补链合成反应的进行与其5’-方向上安排的核苷酸序列不相关，环引物对LAMP反应的加速反应作用本身未受抑制。另外，当特定的核苷酸是预测的核苷酸时，与产生的大量产物相反，所产生的上述假产物的量仅仅是微量。由于上述机制的存在，反应的抑制效力对假产物所起的作用更大。最终，根据特定的核苷酸是否是预测的核苷酸，反应产物的量和生产速率的差异进一步扩大。在实施例中也证实了以下事实环引物的5’-方向上安排的核苷酸序列具有扩大上述差异的作用。
通过使用特定核苷酸的检验机制，可以鉴定出靶核苷酸序列中的核苷酸突变，所述检验机制使用了上述内部引物、以及环引物的5’-方向上安排的核苷酸序列。因此，本发明提供了测定靶核苷酸序列中的特定核苷酸是否是第一核苷酸或第二核苷酸的方法，所述方法包括混合下列组分a)至d)，然后在能进行伴随着链置换的互补链合成反应的条件下进行保温的步骤，并通过选自下列a)中的任何一个引物套测定扩增产物的形成速率和/或形成的量a)(1)第一核苷酸内部引物对和第一核苷酸环引物对(2)第一核苷酸内部引物对和第二核苷酸环引物对(3)第二核苷酸内部引物对和第一核苷酸环引物对，和(4)第二核苷酸内部引物对和第二核苷酸环引物对；其中，第一核苷酸内部引物对和第二核苷酸内部引物对都是由下一个第一内部引物和第二内部引物组成的引物对，在第一核苷酸引物对中，当靶核苷酸序列中的特定核苷酸是第一核苷酸时，将使用第一内部引物和第二内部引物的5’-方向作为模板而合成的互补链的3’-末端用作起点的互补链合成反应不受抑制，但是，当所述特定核苷酸是第二核苷酸时，所述反应受到抑制；在第二核苷酸内部引物对中，当靶核苷酸序列中的特定核苷酸是第二核苷酸时，将使用第一内部引物和第二内部引物的5’-方向作为模板而合成的互补链的3’-末端用作起点的互补链合成不受抑制，但是，当所述特定核苷酸是第一核苷酸时，所述反应受到抑制；第一内部引物(i)可在其3’-末端为限定构成靶核苷酸序列一条链的3’-方向的区域提供互补链合成起点，和(ii)在其5’-方向具有与使用该内部引物作为起点的互补链合成反应产物的任意区域互补的核苷酸序列；
第二内部引物(i)在其3’-末端具有核苷酸序列，该序列能为限定使用第一内部引物为起点的延伸产物中的靶核苷酸序列3’-方向的区域提供互补链合成起点，和(ii)在其5’-方向具有与使用该内部引物作为起点的互补链合成反应产物的任意区域互补的核苷酸序列；第一核苷酸环引物对和第二核苷酸环引物对都是由下一个第一环引物和第二环引物组成的环引物对，在第一核苷酸环引物对中，当靶核苷酸序列中的特定核苷酸是第一核苷酸时，将使用以第一环引物和第二环引物的5’-方向为模板而合成的互补链的3’-末端用作起点的互补链合成反应不受抑制，但是，当所述特定核苷酸是第二核苷酸时，所述反应会受抑制；在第二核苷酸环引物对中，当靶核苷酸序列中的特定核苷酸是第二核苷酸时，将使用以第一环引物和第二环引物的5’-方向为模板而合成的互补链的3’-末端用作起点的互补链合成反应不受抑制，但是，当所述特定核苷酸是第一核苷酸时，所述反应会受抑制；第一环引物，它可在第一内部引物延伸产物中的得自第一内部引物的区域与和第一内部引物有关的任意区域之间提供互补链合成起点；和第二环引物，它可在第二内部引物延伸产物中的得自第二内部引物的区域与和第二内部引物有关的任意区域之间提供互补链合成起点；b)催化伴随着链置换的互补链合成的DNA聚合酶；c)互补链合成的底物；和d)含有靶核苷酸序列的受试多核苷酸。
在解释上述每个引物的核苷酸序列时，抑制互补链合成指的是当特定核苷酸是某个核苷酸时发生错配，以及当互补链的3’-末端与含有特定核苷酸的区域按照与上述内部引物中的检验序列相同的方式进行退火时，所述错配导致的互补链合成受到损害，其中所述互补链是使用每个引物的5’-方向上安排的核苷酸序列作为模板而产生的。本发明的鉴定特定核苷酸的方法可用于鉴定核苷酸突变和多态性。例如，可以使用本发明测定某个核苷酸是否为野生型或突变型。在这种情况下，通过使用第一核苷酸或第二核苷酸中的任一个作为野生型，而使用另一个作为突变型来设计上述每个引物，从而进行本发明的方法。结果，基于当互补链合成反应产物的产生速率达到最大和最小时的引物套组合，可将核苷酸鉴定为野生型或突变型。更具体地，与下列(1)至(4)的引物套有关的、当特定核苷酸为野生型和当特定核苷酸是突变型时的扩增产物的产生速率是下列组合。
当靶核苷酸序列是野生型时(1)最大，和(3)最小当靶核苷酸序列是突变型时(4)最大，和(2)最小(1)野生型内部引物对和野生型环引物对(2)野生型内部引物对和突变型环引物对(3)突变型内部引物对和野生型环引物对(4)突变型内部引物对和突变型环引物对该方法仅仅是双重检验特定核苷酸的方法。按照此方式，通过使用由多个引物构成的引物对，可以改善靶核苷酸序列中的特定核苷酸分析结果的可靠性。在基于已知的核酸扩增反应，如PCR的特定核苷酸鉴定法中，没有一种已知的方法可用于按照此方式增强分析结果的可靠性。
通过包装于试剂盒中可以提供下述方法所需的多种试剂，所述方法为根据本发明的多核苷酸合成法，使用该合成法的扩增法，或使用该扩增法检测靶核苷酸序列中的突变的方法。更具体地，可提供试剂盒以进行本发明，所述试剂盒由试剂组成，所述试剂包括用作第一引物、第二引物和环引物所需的多种寡核苷酸，用作互补链合成之底物的dNTP，进行链置换型互补链合成的DNA聚合酶，和提供酶反应所需适宜条件的缓冲液。另外，本发明的试剂盒中还可包含外部引物。联合使用外部引物能进行等温反应。
如上所述，本发明的多核苷酸扩增反应能够检测靶核苷酸序列。因此，本发明的多核苷酸扩增反应试剂盒可用作检测靶核苷酸序列的试剂盒，或用作检测靶核苷酸序列中的突变的试剂盒。
即，本发明涉及检测靶核苷酸序列的试剂盒，该试剂盒含有上述组分。另外，通过使用构成本发明的检测靶核苷酸序列的试剂盒的用于检测突变的引物中的每个引物，可以提供用于检测靶核苷酸序列中的突变的试剂盒。除了外部引物外，必要时可在本发明的试剂盒中包含检测合成反应产物所需的试剂。
特别地，在本发明的优选实施方案中，由于不必在反应过程中添加试剂，因此可简单地通过加入样品，通过提供含有单次反应所需试剂的反应容器来起始反应。如果提供的系统能通过使用发光信号或荧光信号在反应容器中直接进行反应产物的检测，则完全不必在反应之后打开容器。这样对防止污染十分有利。
附图简述图1阐明了使用本发明进行多核苷酸扩增反应的原理。FALAMP法的引物FA；RALAMP法的引物RA；环F环引物F；环R环引物R。
图2显示了使用本发明进行多核苷酸扩增法的反应原理。图中使用的缩写与图1中的相同。
图3显示了环引物和模板多核苷酸序列之间的优选位置关系。
图4显示了实施例中使用的模板多核苷酸序列(SEQ ID NO1)与各个引物的核苷酸序列之间的位置关系。空心字母(outline)所示核苷酸表示环引物的退火位点，箭头表示互补链的合成方向。
图5显示了环引物对多核苷酸扩增反应的加速作用。X-轴表示反应时间，Y轴表示荧光强度的改变(ΔRn)。环F/R使用了环引物R和环引物F。环cF/cR使用了由环引物F和R的互补序列组成的环cF和环cR。-/-未添加环引物。
图6显示了评价所添加的模板DNA和扩增产物的量的结果。X-轴表示反应时间，Y轴表示荧光强度的改变(ΔRn)。
图7显示了环引物对浓度的依赖性。X-轴表示反应时间，Y轴表示荧光强度的改变(ΔRn)。
图8显示了3’-氨基化环引物的作用。X-轴表示反应时间，Y轴表示荧光强度的改变(ΔRn)。环引物使用了具有未经修饰的3’末端的环引物。3’N-环引物使用了具有经氨基化的3’末端的环引物。-/-未添加环引物。
图9显示了外部引物的存在或缺乏对多核苷酸扩增的作用。X-轴表示反应时间，Y轴表示荧光强度的改变(ΔRn)。外部引物(+)存在外部引物。外部引物(-)缺乏外部引物。阴性对照未添加模板cDNA。
图10显示了评价引物长度的结果。X-轴表示反应时间，Y轴表示荧光强度的改变(ΔRn)。F/R使用了环引物R和F。F-1/R-1使用了5’末端少一个核苷酸的环引物F和R。F-2/R-2使用了5’末端少两个核苷酸的环引物F和R。
图11显示了评价环引物设计位点的结果。X-轴表示反应时间，Y轴表示荧光强度的改变(ΔRn)。F3/R4使用了分别不与F2和R2区域重叠的环引物F3和R4。F5/R5使用了分别与F2和R2区域重叠3个核苷酸的环引物F5和R5。F6/R6使用了分别与F1和R1区域重叠3个核苷酸的环引物F6和R6。F7/R7使用了分别与F1和R1区域重叠10个核苷酸的环引物F7和R7。F8/R8使用了分别与F1和R1区域完全重叠的环引物F8和R8。-/-未添加环引物。
图12显示了根据本发明的SRY基因扩增的结果。X-轴表示反应时间，Y轴表示荧光强度的改变(ΔRn)。环引物(+)存在环引物。环引物(-)缺乏环引物。阴性对照未添加模板DNA。
图13显示了添加至5’末端的环引物与模板核苷酸序列之间的位置关系。“c”指的是互补序列。
图14显示了添加至5’末端的环引物的加速作用。X-轴表示反应时间，Y轴表示荧光强度的改变(ΔRn)。
图15显示了对环引物5’末端的SNP识别的评价。X-轴表示反应时间，Y轴表示荧光强度的改变(ΔRn)。
图16显示了对内部引物和环引物的5’末端的SNP识别的评价。X-轴表示反应时间，Y轴表示荧光强度的改变(ΔRn)。
图17阐明了用于本发明的SNP检测法的反应原理。
实施本发明的最佳模式下文将参照实施例详细解释本发明。
环引物对多核苷酸扩增的加速作用1.设计环引物为了通过LAMP法加速多核苷酸扩增，试验添加引物的作用。设置环引物的设计位点，使其不处于LAMP反应过程中形成的环结构的R2或F2区域内部。引物的方向与R1或F1的相同(下文将它们描述为环引物)。R1或F1的方向即为与模板多核苷酸与自身退火以合成互补链的方向相同的方向。首先，根据已知的LAMP法(WO 00/28082)，分别设计靶序列(SEQ ID NO1)的下列引物。图4中显示了模板多核苷酸序列(SEQ ID NO1)和各个引物序列之间的位置关系。露面的核苷酸显示出与环引物退火的位点，箭头表示互补链合成的方向。
内部引物RA(Inner F，SEQ ID NO2)，内部引物FA(Inner R，SEQ ID NO3)，
外部引物F(Outer F，SEQ ID NO4)，和外部引物R(Outer R，SEQ ID NO5)。
将下列引物设计成与上述引物所限定的R1和F1的方向相同。
环引物F(Loop F，SEQ ID NO6)和环引物R(Loop R，SEQ ID NO8)。
通过已知的LAMP法合成所有引物。
通过使用环引物，除了已知LAMP法的反应外，预期还可发生另一个扩增反应，该反应有望加速扩增反应(图1和2)。
2.环引物的作用根据下文所述的反应条件，使用λDNA(1×105个分子)作为模板进行LAMP反应。制备非热变性的λDNA。使用序列检测系统ABI PRISM 7700(Perkin-Elmer Biosystems)，于65℃进行反应，周期性地监测反应的变化。
反应组合物(25μl)20mM Tris-HCl pH8.810mM KCl10mM(NH4)2SO44mM MgSO41M甜菜碱0.1％Triton X-1000.4mM dNTP8U Bst DNA聚合酶(NEW ENGLAND BioLabs)0.25μg/ml EtBr引物1600nM Inner F1600nM Inner R400nM Outer F400nM Outer RSEQ ID NO1是λDNA的靶核苷酸序列(λDNA 1)。同时加入终浓度为400nM的环引物。结果，在加入环引物的反应系统中观察到反应加速作用。另一方面，由环引物的互补链组成的引物(Loop cF/SEQ ID NO7和LoopcR/SEQ ID NO9)却没有作用(图5)。
环引物的存在下，将多种浓度的λDNA(1×102，1×103，1×105个分子)用作模板以评价检测限。结果，当使用多达1×103个模板分子时，获得了可再现的结果(图6)。在缺乏环引物时，甚至多达1×105个模板DNA分子也只能给出可变的结果(数据未显示)，这表明通过使用环引物可完成低量模板的扩增。
2.环引物的浓度依赖性在LAMP反应系统中加入终浓度为200，400，800，1200，1600和2000nM的环引物，以检测改变环引物浓度对LAMP反应的作用。结果，当环引物的浓度增加时，观察到LAMP反应的加速(图7)。在下文实施例中使用终浓度为800nM的环引物。
3.3’经修饰的环引物对LAMP反应的作用为了抑制自环引物起的延伸反应，制备3’末端被氨基化的环引物。在LAMP反应中加入终浓度为800nM的氨基化环引物以检测加速作用。结果表明当存在氨基化环引物时，未观察到加速反应。这说明自环引物起的延伸反应参与加速LAMP反应(图8)。
**4.外部引物的作用在环引物的存在下试验外部引物的缺乏或存在对LAMP反应的作用。在缺乏外部引物时，反应延迟10分钟(图9)。该结果表明联合使用外部引物和环引物也有利于进一步加速反应。
5.环引物Tm的作用通过缩短引物的5’末端试验环引物Tm的作用。实验中所用环引物如下缺1个核苷酸的环引物F-1(Loop F-1，SEQ ID NO10)；缺1个核苷酸的环引物R-1(Loop R-1，SEQ ID NO12)；缺2个核苷酸的环引物F-2(Loop F-2，SEQ ID NO11)；和缺2个核苷酸的环引物R-2(Loop R-2，SEQ ID NO13)。
使用这些引物的结果，当使用缺1个核苷酸的引物时，反应速率放慢，当使用缺2个核苷酸的引物时，反应速率进一步降低(图10)。这暗示着反应速率降低的原因是环引物Tm的降低，所述Tm的降低使得反应在65℃更难进行。
6.环引物设计位点的作用为了评价环引物设计位点，在λDNA的不同区域设计新的引物。靶核苷酸序列的序列(λDNA2)示于SEQ ID NO14。设计下列LAMP引物以扩增靶核苷酸序列。
内部引物RA(Inner F，SEQ ID NO15)，内部引物FA(Inner R，SEQ ID NO16)，外部引物F(Outer F，SEQ ID NO17)，和外部引物R(Outer R，SEQ ID NO18)。
然后设计下列引物，使它们的方向与上述引物所限定的R1和F1相同。
环引物F3与R2区域没有重叠(Loop F3，SEQ ID NO19)环引物R4与F2区域没有重叠(Loop R4，SEQ ID NO20)环引物F5与R2区域重叠3个核苷酸(Loop F5，SEQ ID NO21)环引物R5与F2区域重叠3个核苷酸(Loop R5，SEQ ID NO22)环引物F6与R1区域重叠3个核苷酸(Loop F6，SEQ ID NO23)环引物R6与F1区域重叠3个核苷酸(Loop R6，SEQ ID NO24)环引物F7与R1区域重叠10个核苷酸(Loop F7，SEQ ID NO25)环引物R7与F1区域重叠10个核苷酸(Loop R7，SEQ ID NO26)环引物F8与R1区域完全重叠(Loop F8，SEQ ID NO27)环引物R8与F1区域完全重叠(Loop R8，SEQ ID NO28)与R2和F2区域是否重叠不会影响反应速率，在这些环引物中，反应速率没有差异。还使用了与R1(或F1)区域重叠3个核苷酸的引物(loopF6/loop R6)，但不影响反应速率(图11)。
另外，制备与R1(或F1)区域重叠10个核苷酸的引物(loop F7/loop R7)。尽管与具有3个或更少个核苷酸重叠相比，该设置使反应速率放慢，但仍能观察到加速作用(图11)。对于与R1(或F1)区域完全重叠的引物(loopF8/loop R8)而言，与不存在环引物的反应相比，观察到加速作用(图11)。反应速率降低的原因可能是R1(或F1)区域中的竞争性抑制，使得更难形成哑铃样结构(图3)，以及引物不得不与成为双链的R1区域退火这一事实。
SRY基因扩增试验环引物对使用人类基因组作为模板的LAMP反应的作用。将作图于Y染色体上的SRY基因选择为靶基因。靶核苷酸序列示于SEQ ID NO29。为了扩增靶核苷酸序列，设计下列LAMP引物。
内部引物RA(Inner F，SEQ ID NO30)内部引物FA(Inner R，SEQ ID NO31)外部引物F(Outer F，SEQ ID NO32)，和外部引物R(Outer R，SEQ ID NO33)。
然后设计下列环引物，使它们的方向与上述引物所限定的R1和F1相同。
环引物F(Loop F，SEQ ID NO34)和环引物R(Loop R，SEQ ID NO35)。
使用100ng人类基因组进行LAMP反应。结果证实当加入环引物时，反应加速(图12)。即由此实验可以证实甚至当将人类基因组用作模板时，环引物也对LAMP反应有加速作用。这说明基于本发明可以进行快速基因组分析，如检测SNP。
5’方向添加有核苷酸序列的环引物当在环引物的5’方向添加核苷酸序列时，可证实反应速率的加速，其中所述核苷酸序列与自环引物的3’末端合成的互补链的任意区域互补。该实验中使用的模板是实施例1中描述的λDNA(λDNA2)。反应条件也和实施例1中的相同。首先，如图13所示设计引物F9-F15。在环引物的5’方向添加多个核苷酸序列。以下列出了添加至5’方向的核苷酸序列。
环引物5’方向的序列3’方向的序列F9inner F1 F3F10 F1 FF11 F1 Fc
F12 F F1F14inner F1cF2F15inner F1 F1图13显示了构成上述环引物的每个核苷酸序列相对于模板核苷酸序列的位置关系。下文简单描述了每个核苷酸序列。带“c”的核苷酸序列表示互补序列。
下述解释描述了包括内部引物FA的核苷酸序列的环的每个区域。然而，在此实验中，也为包括内部引物RA序列的环设计相同的环引物，并使用这些环引物。结尾处描述了该实验中实际使用的引物序列。
Inner F1位于内部引物FA的5’方向的F1c的互补核苷酸序列。
F1与环中的inner F1的5’方向相邻的区域。
F2与环中的F1部分重叠的区域，与F1相比，其3’末端更靠近5’方向。
F3与环中的F1部分重叠的区域，与F2相比，其3’末端更靠近5’方向。
F与环中的与内部引物F2c退火的区域相邻的区域。
使用这些环引物进行LAMP法，与未加环引物的反应相比，反应加速。
在以前的实验中，已阐明与环杂交的环引物(loop CF/CR)对此反应无作用(图5)，其中所述环与内部引物结合。在此实验中，如图14所示，用引物组合F11/R11观察到LAMP反应的加速作用。在F11和R1 1的5’方向，引物具有含核苷酸序列的结构，所述序列与自其3’末端延伸的互补链的任意区域互补。该结构就是所谓的内部引物结构。因此，据认为使用环引物作为模板而合成的互补链具有导致下一个使用自身为模板的延伸反应发生的结构。
以下是该实验中使用的引物序列F9/SEQ ID NO36/CGTGAGCAATGGGTATATGCAAATGGAACTCCGGGTGCTATCAGR9/SEQ ID NO37/ATGTCCTTGTCGATATAGGGATGAATGACCTTTCTCTCCCATATTGCAGTCGF10/SEQ ID NO38/TTCGTTTCCGGAACTCCGGGTTGAATGCCCGGCGAACTGGAG
R10/SEQ ID NO39/TCGCTTGGTGTACCTCATCTACTGCGGCAGTCGCGGCACGATGGAACTAF11/SEQ ID NO40/TTCGTTTCCGGAACTCCGGGTCTCCAGTTCGCCGGGCATTCAR11/SEQ ID NO41/TCGCTTGGTGTACCTCATCTACTGCGTAGTTCCATCGTGCCGCGACTGCF12/SEQ ID NO42/CTCCAGTTCGCCGGGCATTCATTCGTTTCCGGAACTCCGGGTR12/SEQ ID NO43/TAGTTCCATCGTGCCGCGACTGCTCGCTTGGTGTACCTCATCTACTGCGF13/SEQ ID NO44/TCCAGTTCGCCGGGCATTGTTTCCGGAACTCCGGGTR13/SEQ ID NO45/TAGTTCCATCGTGCCGCGACTTCGCTTGGTGTACCTCATCTACTGF14/SEQ ID NO46/ATTTGCATATACCCATTGCTCACGGGAACTCCGGGTGCTATCAGR14/SEQ ID NO47/TTCATCCCTATATCGACAAGGACATTGACCTTTCTCTCCCATATTGCAGTCGF15/SEQ ID NO48/CGTGAGCAATGGGTATATGCAAATTTCGTTTCCGGAACTCCGGGTR15/SEQ ID NO49/ATGTCCTTGTCGATATAGGGATGAATCGCTTGGTGTACCTCATCTACTGCG[实施例4]用位于环引物5’方向的核苷酸序列检测突变通过利用位于本发明环引物5’方向的核苷酸序列，证实当靶核苷酸序列中的特定核苷酸不是预测的核苷酸时，本发明的多核苷酸扩增法会受到抑制。因此，通过监测反应抑制的存在或缺乏，即可检测特定核苷酸的突变。
在用于此实验的环引物的5’方向，放置与内部引物5’方向上安置的核苷酸序列相同的核苷酸序列。即在环引物F的5’方向放置内部引物FA的5’方向的核苷酸序列。设计环引物R的5’方向，使其具有内部引物RA的5’方向的核苷酸序列。另外，在每个引物的5’末端，制备含有与突变序列(MT)和野生型序列(WT)互补的核苷酸的引物，使用所有引物组合进行基于本发明的扩增反应。当使用这些引物进行基于本发明的扩增反应时，使用每个环引物作为模板合成互补链。然后，当互补链与自身退火以起始互补链合成时，即可区分特定的核苷酸。换句话说，当特定的核苷酸是突变核苷酸时，使用含有与突变核苷酸互补的核苷酸的引物(MT)作为模板而合成的互补链的3’末端可用作互补链合成起点。例如，如果SEQ ID NO50的第82位核苷酸是T而不是A，设计MT引物序列以起始预期的扩增反应。另外，WT引物含有与野生型核苷酸互补的核苷酸。因此，当将其用作模板以合成互补链时，3’末端可用作野生型核苷酸的互补链合成起点。即，可将WT引物称为SNP识别引物。
将含有得自λDNA的核苷酸序列的、以SEQ ID NO50表示的106聚体多核苷酸用作模板。反应条件如下反应组合物(25μL)20mM Tris-HCl pH8.810mM KCl10mM (NH4)2SO44mM MgSO40.8M 甜菜碱0.1％ Triton X-1000.4mM dNTP8U BstDNA聚合酶(NEW ENGLAND BioLabs)0.25μg/ml EtBr引物800nM Inner F 400nM Loop F800nM Inner R 400nM Loop R200nM Outer F200nM Outer R下文描述了该实验中使用的模板DNA和每个引物序列λDNA 3(SEQ ID NO50)5’-GCTCACTGTTCAGGCCGGAGCCACAGACCGCCGTTGAATGGGCGGATGCTAATTACTATCTCCCGAAAGAATCCGCATACCAGGAAGGGCGCTGGGAAACACTGCCCTTTCAGCGGGCCATCATGAATGCGATGGGCAGCGACTACATCCG-3’InnerF_WT(SEQ ID NO51)TGGTATGCGGATTCTTTCGGGAGGCTCACTGTTCAGGCCGGAGInnerR_WT(SEQ ID NO52)AGGAAGGGCGCTGGGAAACACTCGGATGTAGTCGCTGCCCATCInnerF_MT(SEQ ID NO53)AGGTATGCGGATTCTTTCGGGAGGCTCACTGTTCAGGCCGGAGInnerR_MT(SEQ ID NO54)TGGAAGGGCGCTGGGAAACACTCGGATGTAGTCGCTGCCCATCOuterF(SEQ ID NO55)AACAGGCTGCGGCATTTTGTCOuterR(SEQ ID NO56)GGCAGACTTCACCACATTCACCTCLoopF(SEQ ID NO57)GAGATAGTAATTAGCATCCGCCLoopR(SEQ ID NO58)CACTGCCCTTTCAGCGGGCCATLoopF_WT(SEQ ID NO59)TGGTATGCGGATTCTTTCGGGAGGAGATAGTAATTAGCATCCGCCLoopR_WT(SEQ ID NO60)AGGAAGGGCGCTGGGAAACACTCACTGCCCTTTCAGCGGGCCATLoopF_MT(SEQ ID NO61)AGGTATGCGGATTCTTTCGGGAGGAGATAGTAATTAGCATCCGCCLoopR_MT(SEQ ID NO62)TGGAAGGGCGCTGGGAAACACTCACTGCCCTTTCAGCGGGCCAT制备非热变性的模板多核苷酸(λDNA，106个分子)。使用ABI PRISM7700(Perkin-Elmer Biosystems)，于66℃进行反应以周期性地观察扩增的变化。
反应结果示于图15和16。首先，使用5’方向添加有F1(或R1)区域的环引物检查它们的5’末端是否能检测SNP(图15)。对于内部引物而言，使用能识别SNP(WT)的序列。结果表明与使用能识别SNP的引物(WT环)时相比，使用5’末端不能识别SNP的环引物(MT环)时的信号有所增加。这表明通过将上述引物的5’末端改变为不同的核苷酸，基于反应速率的差异即可检测SNP。
接着，使用识别SNP的内部引物进行LAMP反应。与实施例1类似，发明人使用了环引物，特别是其5’方向没有另外的特定序列的引物，仅有5’方向的核苷酸序列有所改变。结果表明甚至当按照本发明人在WO01/34838中所述与环引物联合使用时，利用位于内部引物5’方向上的核苷酸序列也能够检测一个核苷酸的差异(图16-1和2)。
为了使图16-1和2之间的差异更大，使用上述环引物(WT环)进行LAMP反应。结果，如图16-4所示，与图16-2相比，信号增加得更慢。与仅使用内部引物相比，通过使用5’方向添加有核苷酸序列的环引物，可以清楚地鉴定野生型和突变型之间的反应速率差异。
当基于LAMP法检测突变型时，野生型和突变型之间信号的差异较小。据认为信号差异减小背后的一个机制如下。例如，当将野生型用作模板时，假定使用内部引物(Mt inner)进行反应以检测突变。当将该反应产物用作模板时，MT内部引物与使用该引物序列为模板而产生的部分退火，起始互补链合成。结果，在应该已被识别的SNP位置处发生核苷酸取代，并扩增出突变的模板。
在此实施例中，通过使用能检验5’方向的特定核苷酸序列的环引物完成检验模板中的核苷酸取代的机制。图17显示了该检验机制的原理。使用该方法，基于上述机制抑制了不利的扩增反应，导致图16-4所示的明显的信号差异。
工业实用性本发明提供了快速多核苷酸合成法。通过使用可形成环结构的模板多核苷酸，以及多个可与环结合以起始互补链合成的引物，可以进行本发明的多核苷酸合成法。通过已知的方法，如LAMP法可以容易地合成形成环结构的模板多核苷酸。通过使用LAMP法，可在相同温度下进行所涉及的所有反应。因此，在本发明中，通过使用LAMP法，可在相同温度下进行所有反应。另外，本发明保持高特异性，并可在短时间内产生大量多核苷酸。
理论上，LAMP法很少产生非特异性产物。当将本发明应用于LAMP法时，可按一定的方式设计环引物，使得它能与特定的反应产物退火。在这种情况下，仅当产生适当的反应产物时，才能快速合成多核苷酸。将本发明应用于LAMP法使非特异性反应更难发生。因此，本发明能不仅能改善LAMP法的反应效率，也能改善其反应特异性。
简单地通过在LAMP法所需引物中加入至少一种环引物，即可进行本发明的方法。因此，本发明的方法也被称为具有广泛用途之潜能的灵活方法。仅通过在LAMP法所需试剂中加入环引物，即可制备实施本发明所需的试剂。因此，可以容易地生产试剂盒。
LAMP法是特异性高、易于操作的多核苷酸扩增法。本发明提供了LAMP法的所有优点，另外，还大大提高了互补链合成反应的速率。
人们不断地需要分析SNP和基因功能以及基于这些分析结果进行基因诊断。因此，不论是就快速进行功能性分析而言，还是就基因功能分析的结果在实际临床背景中的实际应用而言，开发一种能更准确和快速地分析基因核苷酸序列的技术正成为一个重要的问题。
实际上，已经开始对基于SNP分析而开发的药剂进行临床试验。当使用这种已通过临床试验的药剂时，在医院的病床边对患者基因组进行简单和快速的SNP分析的方法将是必需的。本发明完成了符合这一高要求的有用的基因分析技术。
序列表<110>荣研化学株式会社(EIKEN KAGAKU KABUSHIKI KAISHA)<120>合成多核苷酸的方法<130>E2-A0005P<140><141><150>JP 2000-283862<151>2000-09-19<160>62<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>245<212>DNA<213>噬菌体λ<400>1ggcttggctc tgctaacacg ttgctcatag gagatatggt agagccgcag acacgtcgta 60tgcaggaacg tgctgcggct ggctggtgaa cttccgatag tgcgggtgtt gaatgatttc 120cagttgctac cgattttaca tattttttgc atgagagaat ttgtaccacc tcccaccgac 180catctatgac tgtacgccac tgtccctagg actgctatgt gccggagcgg acattacaaa 240cgtcc 245<210>2<211>46<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的说明人工合成的引物序列<400>2cagccagccg cagcacgttc gctcatagga gatatggtag agccgc 46<210>3<211>51<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的说明人工合成的引物序列<400>3gagagaattt gtaccacctc ccaccgggca catagcagtc ctagggacag t51<210>4<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的说明人工合成的引物序列<400>4ggcttggctc tgctaacacg tt22<210>5<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的说明人工合成的引物序列<400>5ggacgtttgt aatgtccgct cc 22<210>6<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的说明人工合成的引物序列<400>6ctgcatacga 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1.合成多核苷酸的方法，其含有下列步骤混合下列组分1至5，并在允许使用4中的DNA聚合酶进行依赖于模板的互补链合成的条件下进行保温(1)模板多核苷酸，其(a)具有含有至少一套互补核苷酸序列的靶核苷酸序列，(b)当(a)中的互补核苷酸序列杂交时即形成能碱基配对的环，(c)通过使其3’-末端与其自身退火而形成环，和(d)与其自身退火的3’-末端可成为使用其自身为模板的互补链合成的起点；(2)至少两种引物，所述引物可在模板多核苷酸环上的不同位置处提供互补链合成起点；(3)至少一种引物，所述引物可在环中与2中所述的引物不同的位置处提供互补链合成起点，所述环是通过模板多核苷酸和/或使2中所述的引物与模板多核苷酸退火而产生的延伸产物形成的；(4)催化伴随着链置换的互补链合成的DNA聚合酶；和(5)互补链合成的底物。
2.权利要求1的方法，其中所述模板多核苷酸在其5’-末端具有与其自身核苷酸序列的任意区域互补的核苷酸序列。
3.权利要求2的方法，其中所述模板多核苷酸是通过下列步骤产生的a)退火第一引物与靶核苷酸序列，并使用其作为起点进行互补链合成反应，其中所述第一引物(i)可在3’-末端为限定构成靶核苷酸序列一条链的3’-方向的区域提供互补链合成起点，和(ii)在其5’-方向具有与使用该引物作为起点的互补链合成反应产物的任意区域互补的核苷酸序列；b)将步骤a)中合成的第一引物延伸产物中与第二引物退火的区域置于允许碱基配对的条件下，其中所述第二引物(i)在其3’-末端具有核苷酸序列，该序列能为限定使用第一引物为起点的延伸产物中的靶核苷酸序列3’-方向的区域提供互补链合成起点，和(ii)在其5’-方向具有与使用该引物作为起点的互补链合成反应产物的任意区域互补的核苷酸序列；c)使所述第二引物与步骤b)中可形成碱基配对的区域退火，并使用其作为起点进行互补链合成；和d)使步骤c)中合成的第二引物延伸产物的3’-末端与其自身退火，并使用其自身作为模板进行互补链合成。
4.权利要求3的方法，其中两种引物是第一引物和第二引物，至少一种引物是环引物，它可在第一引物或第二引物延伸产物中的得自每种引物的区域与和每种引物有关的上述任意区域之间提供互补链合成起点。
5.权利要求4的方法，其中所述环引物是(i)第一环引物，它可在第一引物延伸产物中的得自第一引物的区域与和第一引物有关的任意区域之间提供互补链合成起点，和(ii)第二环引物，它可在第二引物延伸产物中的得自第二引物的区域与和第二引物有关的上述任意区域之间提供互补链合成起点。
6.权利要求4的方法，其中所述环引物在其5’-末端进一步含有与上述任意区域互补的核苷酸序列。
7.权利要求3的方法，其中通过自外部引物起的互补链合成来置换第一引物和/或第二引物的延伸产物，使第一引物或第二引物的每种产物转变为单链，所述外部引物可为步骤b)和/或步骤c)中的与第一引物或第二引物有关的模板的3’-方向提供互补链合成起点。
8.权利要求3的方法，其中步骤a)中的靶核苷酸序列以双链多核苷酸的形式存在，通过使用任意引物为起点的互补链合成反应，使与第一引物退火的区域形成碱基对键。
9.权利要求8的方法，其中在解链温度调节剂的存在下进行步骤a)。
10.权利要求9的方法，其中解链温度调节剂是选自下列的至少一种化合物甜菜碱、脯氨酸、二甲基亚砜和三甲胺N-氧化物。
11.扩增模板多核苷酸的方法，其包括下列步骤根据权利要求1或5的方法，使用模板多核苷酸作为模板重复进行互补链合成，并根据权利要求1或5的方法，使用合成反应产生的延伸产物作为新的模板多核苷酸，进行另一个多核苷酸合成反应。
12.检测样品中的靶核苷酸序列的方法，其包括下列步骤进行权利要求11的扩增方法，并将扩增反应产物的产生与靶核苷酸序列的存在相联系。
13.权利要求12的方法，其中在多核苷酸检测试剂的存在下进行权利要求11的方法，根据检测试剂的信号变化观察是否产生扩增反应产物。
14.根据权利要求12的检测方法检测靶核苷酸序列中的突变的方法，所述方法包括下列步骤(i)当靶核苷酸序列不是预测的核苷酸序列时，阻断至少一个选自构成上述扩增法的互补链合成反应的互补链合成反应，和(ii)观察对扩增反应的抑制作用。
15.权利要求14的方法，其使用了下列第一引物和第二引物，其中至少第一引物或第二引物在其5’-方向含有检验序列，其中，检验序列指的是一种核苷酸序列，其中(i)当构成特定区域的核苷酸序列不是预测的核苷酸序列时，使用检验序列作为模板合成的互补链的3’-末端与靶核苷酸序列或其互补链退火时会发生错配，和(ii)此错配会抑制通过使用3’-末端作为起点而起始的互补链合成反应，第一引物(i)可在其3’-末端为限定构成靶核苷酸序列一条链的3’-方向的区域提供互补链合成起点，和(ii)在其5’-方向具有与使用该引物作为起点的互补链合成反应产物的任意区域互补的核苷酸序列，和第二引物(i)在其3’-末端具有核苷酸序列，该序列能为限定使用第一引物为起点的延伸产物中的靶核苷酸序列3’-方向的区域提供互补链合成起点，和(ii)在其5’-方向具有与使用该引物作为起点的互补链合成反应产物的任意区域互补的核苷酸序列。
16.权利要求15的方法，其中当构成特定区域的核苷酸序列不是预测的核苷酸序列时，使用检验序列作为模板合成的互补链与靶核苷酸序列或其互补链退火时，在自互补链3’-末端起的第2至第4个核苷酸处会发生错配。
17.权利要求15的方法，其使用下列第一环引物和/或第二环引物作为环引物；需满足的条件是当环引物在其5’-方向含有与引物5’-方向上安排的任意区域互补的核苷酸时，或当引物5’-方向上安排的核苷酸序列是检验序列时，需在环引物的5’-方向上安排序列，该序列中用于提供检验序列中的错配的核苷酸不同于检验序列第一环引物它可在第一引物延伸产物中的得自第一引物的区域与和第一引物有关的任意区域之间提供互补链合成起点；第二环引物它可在第二引物延伸产物中的得自第二引物的区域与和第二引物有关的任意区域之间提供互补链合成起点。
18.权利要求17的方法，其中当构成上述特定区域的核苷酸序列不是预测的核苷酸序列时，使用检验序列作为模板合成的互补链与靶核苷酸序列或其互补链退火时，在自该互补链3’-末端起的第2至第4个核苷酸处会发生错配，其中第一环引物和/或第二环引物的5’-方向上安排的核苷酸序列与导致检验序列中的错配的核苷酸有所不同。
19.用于扩增靶核苷酸序列的试剂盒，其含有a)第一引物(i)可在其3’-末端为限定构成靶核苷酸序列一条链的3’-方向的区域提供互补链合成起点，和(ii)在其5’-方向具有与使用该引物作为起点的互补链合成反应产物的任意区域互补的核苷酸序列；b)第二引物(i)在其3’-末端具有核苷酸序列，该序列能为限定使用第一引物为起点的延伸产物中的靶核苷酸序列3’-方向的区域提供互补链合成起点，和(ii)在其5’-方向具有与使用该引物作为起点的互补链合成反应产物的任意区域互补的核苷酸序列；c)第一环引物，它可在第一引物延伸产物中的得自第一引物的区域与和第一引物有关的任意区域之间提供互补链合成起点；d)第二环引物，它可在第二引物延伸产物中的得自第二引物的区域与和第二引物有关的任意区域之间提供互补链合成起点；e)催化伴随着链置换的互补链合成的DNA聚合酶；和f)互补链合成的底物。
20.权利要求19的试剂盒，其进一步含有g)外部引物，它可为第一引物和/或第二引物的模板的3’-方向提供互补链合成起点。
21.权利要求19的试剂盒，其中第一引物和/或第二引物在其5’-方向上含有检验序列。
22.权利要求19的试剂盒，其含有下列第一环引物和/或第二环引物作为环引物；需满足的条件是当环引物在其5’-方向含有与引物5’-方向上安排的任意区域互补的核苷酸序列时，或当引物5’-方向上安排的核苷酸序列是检验序列时，用于提供检验序列中的错配的核苷酸在环引物的5’-方向上安排不同于检验序列的序列第一环引物它可在第一引物延伸产物中的得自第一引物的区域与和第一引物有关的任意区域之间提供互补链合成起点；和第二环引物它可在第二引物延伸产物中的得自第二引物的区域与和第二引物有关的任意区域之间提供互补链合成起点。
23.扩增多核苷酸的方法，其含有下列步骤混合下列组分a)至g)，并在能进行伴随着链置换的互补链合成反应的条件下保温a)第一引物(i)可在其3’-末端为限定构成靶核苷酸序列一条链的3’-方向的区域提供互补链合成起点，和(ii)在其5’-方向具有与使用该引物作为起点的互补链合成反应产物的任意区域互补的核苷酸序列；b)第二引物(i)在其3’-末端具有核苷酸序列，该序列能为限定使用第一引物为起点的延伸产物中的靶核苷酸序列3’-方向的区域提供互补链合成起点，和(ii)在其5’-方向具有与使用该引物作为起点的互补链合成反应产物的任意区域互补的核苷酸序列；c)第一环引物，它可在第一引物延伸产物中的得自第一引物的区域与和第一引物有关的任意区域之间提供互补链合成起点；d)第二环引物，它可在第二引物延伸产物中的得自第二引物的区域与和第二引物有关的任意区域之间提供互补链合成起点；e)催化伴随着链置换的互补链合成的DNA聚合酶；和f)互补链合成的底物；和g)含有靶核苷酸序列的受试多核苷酸。
24.权利要求23的方法，其进一步含有h)外部引物，它可为模板的3’-方向提供互补链合成起点，所述模板与其中第一引物和/或第二引物的3’-末端与靶核苷酸序列退火的区域有关。
25.测定靶核苷酸序列中的特定核苷酸是否为第一核苷酸或第二核苷酸的方法，其包括下列步骤混合下列组分a)至d)，并在能进行伴随着链置换的互补链合成反应的条件下保温，通过选自下列的a)中的任一个引物套测定扩增产物的形成速率和/或形成的量a)(1)第一核苷酸内部引物对和第一核苷酸环引物对(2)第一核苷酸内部引物对和第二核苷酸环引物对(3)第二核苷酸内部引物对和第一核苷酸环引物对，和(4)第二核苷酸内部引物对和第二核苷酸环引物对；其中，第一核苷酸内部引物对和第二核苷酸内部引物对都是由下一个第一内部引物和第二内部引物组成的引物对，在第一核苷酸引物对中，当靶核苷酸序列中的特定核苷酸是第一核苷酸时，将使用以第一内部引物和第二内部引物的5’-方向为模板而合成的互补链的3’-末端用作起点的互补链合成反应不受抑制，但是，当所述特定的核苷酸是第二核苷酸时，所述反应会受抑制；在第二核苷酸内部引物对中，当靶核苷酸序列中的特定核苷酸是第二核苷酸时，将使用以第一内部引物和第二内部引物的5’-方向为模板而合成的互补链的3’-末端用作起点的互补链合成反应不受抑制，但是，当所述特定的核苷酸是第一核苷酸时，所述反应会受抑制；第一内部引物(i)可在其3’-末端为限定构成靶核苷酸序列一条链的3’-方向的区域提供互补链合成起点，和(ii)在其5’-方向具有与使用该内部引物作为起点的互补链合成反应产物的任意区域互补的核苷酸序列；第二内部引物(i)在其3’-末端具有核苷酸序列，该序列能为限定使用第一内部引物为起点的延伸产物中的靶核苷酸序列3’-方向的区域提供互补链合成起点，和(ii)在其5’-方向具有与使用该内部引物作为起点的互补链合成反应产物的任意区域互补的核苷酸序列；第一核苷酸环引物对和第二核苷酸环引物对都是由下一个第一环引物和第二环引物组成的环引物对，在第一核苷酸环引物对中，当靶核苷酸序列中的特定核苷酸是第一核苷酸时，将使用以第一环引物和第二环引物的5’-方向为模板而合成的互补链的3’-末端用作起点的互补链合成反应不受抑制，但是，当所述特定的核苷酸是第二核苷酸时，所述反应会受抑制；在第二核苷酸环引物对中，当靶核苷酸序列中的特定核苷酸是第二核苷酸时，将使用以第一环引物和第二环引物的5’-方向为模板而合成的互补链的3’-末端用作起点的互补链合成反应不受抑制，但是，当所述特定的核苷酸是第一核苷酸时，所述反应会受抑制；第一环引物，它可在第一内部引物延伸产物中的得自第一内部引物的区域与和第一内部引物有关的任意区域之间提供互补链合成起点；和第二环引物，它可在第二内部引物延伸产物中的得自第二内部引物的区域与和第二内部引物有关的任意区域之间提供互补链合成起点；b)催化伴随着链置换的互补链合成的DNA聚合酶；c)互补链合成的底物；和d)含有靶核苷酸序列的受试多核苷酸。
26.权利要求25的方法，其进一步含有e)外部引物，它可为模板的3’-方向提供互补链合成起点，所述模板与其中第一引物和/或第二引物的3’-末端与靶核苷酸序列退火的区域有关。
全文摘要
本发明通过将具有能形成环的结构的多核苷酸用作模板，并联合使用多个能为该环提供互补链合成起点的引物，使等温和快速的多核苷酸合成成为现实。如果使用LAMP法，由于也可通过等温反应合成模板多核苷酸本身，因此可等温和快速进行所有反应。
文档编号C12N15/10GK1474870SQ01819083
公开日2004年2月11日 申请日期2001年9月19日 优先权日2000年9月19日
发明者长岭宪太郎 申请人:荣研化学株式会社