专利名称：多发性硬化症治疗中所用的趋化因子突变体的制作方法
技术领域：
本发明涉及在40’s环(40’s loop)上含有至少两种突变的CC趋化因子突变体，与野生型分子相比，其GAG结合活性较低。业已发现，这些突变的趋化因子有效地治疗多发性硬化症和/或其他脱髓鞘疾病。
许多C-X-C趋化因子，如白介素-8(IL-8)，对于嗜中性粒细胞有趋化作用，而C-C趋化因子则对包括单核细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、NK细胞和树突细胞在内的各种白细胞有活性。
趋化因子的氨基末端(NH2-末端)区域参与受体结合，氨基末端的处理可以激活趋化因子或者使趋化因子完全没有活性。
已有人对合成的C-C趋化因子的N-末端变异体作为天然存在的抑制剂或拮抗剂的活性进行了测试。缺少8到9个氨基末端氨基酸的MCP-1、MCP-3和RANTES对单核细胞没有活性，并被用作受体拮抗剂(Gong JH等人，J Exp Med.1995，181(2)631-40和Gong JH等人，J Biol Chem.1996，271(18)10521-7)。
RANTES延伸一个甲硫氨酸将导致该分子几乎完全失活，Met-RANTES表现为真正的拮抗剂(Proudfoot AE等人，J Biol Chem.1996年2月2日；271(5)2599-603)。
WO 99/16877涉及氨基末端截短的RANTES，其缺少对应于天然存在的RANTES的氨基酸残基1、1-2、1-3或1-4的氨基末端氨基酸，并具有趋化因子拮抗剂活性以及编码它们的cDNA序列，它们在治疗和/或诊断疾病的应用，其中趋化因子作用的拮抗剂活性是所需要的。RANTES(3-68)是优选的截短的趋化因子拮抗剂。
即使主要在特异性细胞膜受体方面已对RANTES和CC趋化因子的趋化活性进行了一般研究，但RANTES也可与糖胺聚糖(GAGs)相互作用，糖胺聚糖是高度可变的支链糖基，翻译后被加到一些蛋白质中，统称蛋白聚糖(PGs)。这样一些蛋白质存在于细胞膜上、细胞外基质及血流中，这些部位也存在分离的糖胺聚糖。
与糖胺聚糖相互作用是许多细胞信号可溶性分子(白介素、生长因子)的共同特征。蛋白聚糖、或者分离的糖胺聚糖都可以与可溶性分子形成复合物，多半在这范围内保护该分子在细胞外的环境中免于蛋白水解。也有人提出，糖胺聚糖可帮助细胞信号分子对其特异性受体正确显示，最后，还可有助调节靶细胞的活化。
就趋化因子而论，在炎症部位浓度梯度不变，因此与细胞受体相互作用及它们的活化状态似乎由不同型式的糖胺聚糖调节(Hoogewerf AJ等人，Biochemistry1997，36(44)13570-8)。所以，有人提出，这种相互作用的调节可能代表炎症疾病(Schwarz MK Wells TN，Curr Opin Chem Biol.1999，3(4)407-17)和爱滋病(Burns JM等人，Proc Natl Acad Sci USA 1999，96(25)14499504)的一种治疗方法。
已有人以各种模型对GAG-RANTES相互作用的结构要求和功能性效果进行了研究。RANTES以比其他趋化因子如MCP-1、IL-8或MIP-1α更高的亲和力及特异性在人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)上以微摩尔浓度结合糖胺聚糖。这种相互作用似乎不是简单的静电作用，而是取决于其他参数，如糖胺聚糖的长度及N-和O-硫酸化作用(Kuschert GS等人，Biochemistry 1999，38(39)12959-68)。缺失糖胺聚糖的细胞系仍然能够结合趋化因子，但当它们浓度较低时，细胞表面糖胺聚糖的存在会大大增强其对受体的活性(Ali S等人，J Biol Chem 2000，275(16)11721-7)。其他一些实验显示糖胺聚糖，特别是硫酸肝素，有助RANTES与巨噬细胞的细胞表面相互作用及后来对爱滋病感染的抑制，该结果与这些弱表达硫酸肝素的细胞所具有的公认的对RANTES的抗病毒效应的抗性是一致的(Oravecz T等人，J Immunol.1997，15999)4587-92)。
可溶性糖胺聚糖与细胞膜糖胺聚糖竞争，而且它们能够用作RANTES诱导的活化表面的特异性抑制剂(Appay V等人，Int Immunol 2000，12(8)1173-82)，或者用作爱滋病感染的抑制剂(Burns JM等人，Proc Natl Acad Sci USA 1999，96(25)14499-504)。
一些关于结构与功能的研究曾经尝试鉴定负责与糖胺聚糖相互作用的RANTES区，这是因为传统共有序列(BBXB，其中B是碱基，X可以是任何一种残基)非常普通。用一种单克隆抗体进行表位作图研究，所述单克隆抗体由抗重组人RANTES产生并能阻断由RANTES介导的抗病毒效应和钙在细胞内部的移动(Burns JM等人，J.Exp.Med.1998，188(10)1917-27)。这种方法可以限定这些活性和糖胺聚糖相互作用所需的残基55-56，论证了糖胺聚糖相互作用的功能与典型受体介导的功能互补或与之截然不同，而在对具有不同聚集性质的RANTES变异体进行的研究也提出这样一个结论(Appay V等人，J Biol Chem 1999，274(39)27505-12)。
55-66区表示C末端α-螺旋片段，与其他趋化因子如IL-8的GAG结合区同源(Witt DP和Lander AD，Curr.Biol 1994，4(5)394-400)，它含有一个包含赖氨酸和精氨酸的阳离子位点(KKWVR)。这样一个结合区与位于N末端的细胞受体的结合区截然不同(Pakianathan DR等人，Biochemistry 1997，36(32)9642-8)，它含有一些参与RANTES单体聚集的残基，即使这些解集突变似乎不会影响与糖胺聚糖的相互作用(Czaplewski LG等人，J.Biol Chem.1999，274(23)16077-84；WO 98/13495)。
RANTES在残基44-47含有另一个阳离子位点(RKNR)，该位点被保存在其他趋化因子，如MIP-1α(Koopmann W和Krangel MS，J.Biol.Chem.1997，272(15)10103-9)及MIP-1β(Koopmann W等人，J Immunol.1999，163(4)2120-7)，的GAG结合区。
已有报导，在这些阳离子位点上含有单突变的人RANTES变异体作为RANTES拮抗剂，其在治疗爱滋病感染与炎症或过敏性疾病中具有潜在的治疗用途(WO99/33989)。
也有报导，只有在位置44、45和47的三个残基被丙氨酸取代的RANTES三突变体丧失了GAG结合能力(A.Proudfoot等人，Chemokine Gordon Conference，Session I，2000年7月24日，personal communication)。
根据本发明至少有两种突变的区域，即所谓的“40’s环”有许多CC趋化因子，如
图1所示。具体地说，业已发现，位置44、45和47的三个碱性残基被丙氨酸取代的RANTES三突变体对在动物模型中多发性硬化症的治疗具有活性。这种RANTES三突变体在小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型中显示了一种与剂量相关的效应，其功效比得上用重组IFN-β进行的参考治疗。用截短的RANTES三突变体也发现有类似的结果，其中位置44、45和47的三个残基被丙氨酸取代并且缺少开头2个N末端氨基酸。这种截短的RANTES三突变体(氨基酸序列为SEQ IDNO3)是新颖的，也是本发明的另一个目的。
在MIP-1α和MIP-1β三突变体方面有人也获得了相似的实验结果，这些已为周知，本文称为MIP-1α三突变体R18A-R46A-R48A(Koopmann W和Krangel MS.，J BiolChem.1997，272(15)10103-9)和40’s MIP-1β三突变体K45A-R46A-K48A(LaurenceJS，Biochemistry 2001，404990-4999)。
术语“较低的GAG结合活性”指的是本发明的突变体与糖胺聚糖的结合能力较低，即这些突变体中每一种结合糖胺聚糖(如硫酸肝素)的百分比都比相应的野生型分子低。
更优选的是人RANTES突变体，其中野生型分子的位置44、45和47的三个碱性氨基酸被其他氨基酸取代。这些残基可以用小的脂族非极性或弱极性残基取代，例如Ala、Ser、Thr、Pro和Gly，优选为丙氨酸。
业已发现，在多发性硬化症治疗中特别有效的RANTES突变体是那些氨基酸序列分别如SEQ ID NO2和SEQ ID NO3所示的突变体。
本发明的另一个目的是使用如上所述的趋化因子突变体来制备一种治疗多发性硬化症和/或其他脱髓鞘疾病的药物组合物。
多发性硬化症是一种缓慢地持续恶化的中枢神经系统疾病，其特征在于脑和脊髓里面的脱髓鞘出现弥漫性空斑，导致各种各样的神经病症状及症候，通常会有时缓解，有时又会加重(见The Merck Manual，第6版)。
目前还不清楚病因，但现时为数不多的线索均显示一种特定的机理，故怀疑是免疫异常。假设的原因包括由慢发病毒或潜隐病毒引起的感染及由酶引起的髓鞘溶解症。脑脊液(CSF)中的IgG通常会升高，而升高的滴度与包括痳疹在内的各种病毒有关。这些发现和已报导的与人类白细胞抗原(HLA)各种异型体及T细胞变化的数目的关联性的意义还不清楚，这是因为有些证据是互相矛盾的。家族关联性的增大可能为遗传易感性；女性有时候比男性更容易受到感染。环境因素也有一定作用。虽然发病年龄通常是20岁至40岁，但多发性硬化症与患者15岁前居住的地区有关。15岁后定居的地区与发病的危险无关。
当少突神经胶质细胞受到破坏且血管周发炎时，脱髓鞘斑或岛通过中枢神经系统播散，主要在白质内，特别是侧后柱体(尤其在颈部和背部区域)、视神经及室周区。中脑、脑桥和小脑的神经束也受到影响，而大脑和脑髓的灰质可能会受到影响。
通常，细胞体和轴突不会受损，特别在病变早期。以后，轴突可能被破坏，特别是长神经束中的轴突，而纤维性神经胶质增生使神经束出现“硬化”。早期和晚期病变可能会被同时发现。业已证明，斑内及斑周围的髓鞘质在脂质和蛋白质组成上均发生化学变化。
该疾病的特点是中枢神经系统功能障碍的主诉及观察结果各有不同，有时症状缓解，有时不断复发加重。
核磁共振成像(MRI)是最灵敏的诊断成像技术；它可显示许多空斑。用增强CT扫描也可观察到病变。
多发性硬化症治疗的进展非常缓慢，部分原因是对疾病病理的理解不完整。对于以实验为根据的治疗，取得进展的主要障碍包括多发性硬化症的病程变化多、最重要疗效评估时间长期、以及缺乏治疗效果的客观指标，特别是短期治疗效果的客观指标。
虽然还未确定多发性硬化症的病理，但仍会继续研究固有的历史。现在已有人研究基于核磁共振成像的客观治疗评估，而临床试验存在的许多不足也已为人所知，故已提出一些改进试验方法，对结果进行更好的分析。
所以，本发明的另一个目的是通过施加本发明有效量的趋化因子和药学上可接受的赋形剂来治疗多发性硬化症的方法。
“有效量”指一定量的活性成分，它足以影响疾病的病程和严重性，从而使这疾病减弱或缓和。有效量将视给药途径和病人的情况而定。
本发明的另一个目的是药物组合物，其含有本发明的趋化因子突变体以及一种或多种药学上可接受的赋形剂，以治疗多发性硬化症和/或其他脱髓鞘疾病。
“药学上可接受的”指包括任何不干涉活性成分的生物活性效果，并对要施加的宿主无毒的载体。例如，对于肠胃外施用，上述活性成分可以以注射用的单位剂量形式配制在载体，如盐水、葡萄糖溶液、血清清蛋白和林格溶液中。
除了药学上可接受的载体外，本发明的组合物还包含微量的添加剂，如稳定剂、赋形剂、缓冲液和防腐剂。
这些活性成分的施加可以是静脉内、肌肉内或皮下途径。本发明也包括其他可达到各成分所需血液水平的给药途径。
根据给药途径、病人的情况和特点(性别、年龄、体重、健康、身高)、症状程度、并行的治疗、治疗频率及所希望的效果适当地选择活性成分的最佳剂量。本领域技术人员能够调整和控制已有的剂量范围。
通常，活性成分的每日剂量可以是每千克体重约0.01至100毫克。一般给予每日每千克体重1至40毫克分次服用或缓释形式就能有效地达到所希望的疗效。第二次或以后施加的剂量可等于、少于或多于最初或先前施加给个体的剂量。
以下，将结合具体实施例来对本发明进行叙述，但叙述的内容包括所有的改型和替换，这些在不超出所附权利要求书的意义和目的可由本领域技术人员作出。
现在将通过下列实施例进行描述，这些实施例不应以任何方式构成对本发明的限制。实施例将参照下文所述的附图。
图2所示为用于克隆本发明的野生型RANTES及其突变体的质粒图谱。
图3所示为在肝素球测定中[125I]-RANTES及突变体竞争结合测试随着肝素浓度的变化所得的结果。
图4所示为RANTES及40’s RANTES三突变体的平衡竞争结合测试结果。
图5所示为由RANTES和40’s及50’s RANTES三突变体诱导的单核细胞和T细胞的趋化活性。
图6所示为40’s RANTES三突变体对腹膜细胞募集的抑制作用。
图7所示为在巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)中产生的40’s RANTES(3-68)三突变体对RANTES诱导的腹膜细胞募集的抑制作用。
图8所示为40’s MIP-1β三突变体(R45AR46AK48A)对MIP-1β诱导的腹膜细胞募集的抑制作用。
图9所示为MIP-1α三突变体(R18A-R46A-R48A)对MIP-1α诱导的腹膜细胞募集的抑制作用。
图10(A)所示为40’s RANTES三突变体对硫乙醇酸盐诱导的细胞募集的抑制作用。
图11所示为本发明的全40’s RANTES三突变体对实验性自身免疫性脑脊髓炎发作的抑制作用。
在实施例和说明书中给出的氨基酸编号考虑到成熟蛋白，即以Ser开始，根据序列表Ser是位置24上的氨基酸。所以，为了使序列表和实施例的氨基酸数字完全一致，实施例或说明书出现的数字应该加上23。
以下是使用的诱变引物的序列，突变碱基以下划线表示。
R44A(有义)5’-TTTGTCACCGCAAAGAACCGCCAAG-3’P1R44A(反义)5’-GACGACTGCTGGGTTGGAGCACTTG-3’P2K45A(有义)5’-TTTGTCACCCGAGCGAACCGCCAAG-3’P3K45A(反义)5’-GACGACTGCTGGGTTGGAGCACTTG-3’P4R47A(有义)5-CGAAAGAACGCCCAAGTGTGTGCCA-3’P5R47A(反义)5’-GGTGACAAAGACGACTGCTGGGTTG-3’P6R44A-K45A-R47A(40’s三突变体，有义)5’-TTTGTCACCGCAGCGAACGCCCAAGTGTGTGCCAAC-3’P7R44A-K45A-R47A(40’s三突变体，反义)5’-GACGACTGCTGGGTTGGAGCACTTGCC-3’P8K55A(有义)5’-GCCAACCCAGAGGCGAAATGGGTTCGG-3’P9K55A(反义)5’-ACACACTTGGCGGTTCTTTCGGGTGAC-3’P10K56A(有义)5’-AACCCAGAGAAGGCATGGGTTCGGGAG-3’P11K56A(反义)5’-GGCACACACTTGGCGGTTCTTTCGGGT-3’P12
R59A(有义)5’-AAGAAATGGGTTGCGGAGTACATCAAC-3’P13R59A(反义)5’-CTCTGGGTTGGCACACACTTGGCG-3’P14K55A-K56A-R59A(50’s三突变体，有义)5’-GCCAACCCAGAGGCGGCATGGGTTGCGGAGTACATC-3’P15K55A-K56A-R59A(50’s三突变体，反义)5’-ACACACTTGGCGGTTCTTTCGGGTGACAAAGAC-3’P16用pfuturboDNA聚合酶(Stratagene)在DNA热循环仪(Perkin-Elmer-Cetus480)上扩增35次。DNA被连接在一起，并转化到前10个F’感受态大肠杆菌细胞(Invitrogen)。通过DNA排序确定突变体的序列。b)大肠杆菌中野生型RANTES和RANTES突变体的表达和纯化将通过上述PCR技术获得的DNA片段克隆到质粒pET24d(图2)，生成一系列载体。野生型或突变RANTES编码序列在3’中被克隆在Xbal和Nhel/Xhol位点之间的pT7启动子。该质粒含有2个标记基因(Km和lacl)以及一个活性复制起点(Orifl)。
用所得的载体重新转化BL21(DE3)大肠杆菌株，这使得用pT7/Lacl系统就可以得到强的蛋白质表达。将1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)加入到培养基以诱导蛋白质表达。收集细胞，重新悬浮于裂解缓冲液(50mM pH8 Tris-HCl、10mM氯化镁、5mM苯甲酰胺/盐酸、1mM DTT、0.1mM苯基甲基磺酰氟(PMSF)、20mg/L脱氧核糖核酸酶(Dnase))。通过挤压式细胞破碎机(French press cellunit)由三条通道使细胞破碎。然后，悬浮液在4℃以10000xg离心速度离心30分钟。含有野生型RANTES或其中一种RANTES突变体的包涵体粒子溶解在含有6M胍/盐酸和1mM DTT的0.1M pH8 Tris-HC中，在60℃搅拌30分钟。溶液对1％乙酸透析，其间乙酸更换三次。以10000xg离心速度离心30分钟去掉不溶性物质。使含有野生型RANTES或其中一种RANTES突变体的上清液冻干。
冻干粉末溶于含有6M胍/盐酸和1mM DTT的0.1M pH8 Tris-HCl中，制成的浓度约1mg/ml。蛋白质通过逐滴稀释到10倍体积的含有0.01mM氧化谷胱甘肽和0.1mM还原谷胱甘肽的20mM pH8 Tris-HCl的胍溶液中而复性。溶液在4℃搅拌过夜。以10000xg离心速度离心30分钟去掉不溶性物质。用乙酸调pH至4.5，并用水稀释使导电性调至20mS。溶液装在预先用20mM pH4.5的乙酸钠溶液平衡过的HiLoad S 26/10层析柱，蛋白质用在同一种缓冲液中0-2M氯化钠的线性梯度洗脱。合并含有野生型RANTES或其中一种RANTES突变体蛋白质的馏分，对乙酸透析，其间乙酸更换三次，并使其冻干。
冻干后的蛋白质溶于50mM pH8 Tris-HCl缓冲液中。野生型RANTES或其中一种RANTES突变体蛋白与内切蛋白酶Arg-C(酶基质之比为1∶600，重量/重量)在37℃培养过夜，裂解出衍生自克隆步骤的MKKKWPR前导序列。裂解蛋白通过阳离子交换层析与未裂解的蛋白分离，层析柱是预先用含有6M尿素的20mM pH4.5乙酸钠溶液平衡过的HiLoad S 26/10柱，蛋白质用在同一种缓冲液中0-2M氯化钠的线性梯度洗脱。合并裂解馏分，对1％乙酸透析，其间乙酸更换二次，最后对0.1％三氟乙酸透析，然后冻干(Edgerton MD等人，第33-40页，以及Proudfoot AE等人，Methods in Molecular Biology 2000中“Chemokine Protocols”，vol.138，第75-87页，Humana出版社)。
用质谱法确定野生型或RANTES突变蛋白质的真实性。用类似的步骤制备另一个突变体，其含有作为氨基末端延伸的Met和40’s RANTES单或三突变体和50’sRANTES单或三突变体。c)Pichia pastoris中野生型RANTES和RANTES突变体的表达和纯化用基于大型引物的PCR诱变技术产生成熟的40’s RANTES三突变体(R44A-K45A-R47A)(Datta AK，Nucleic Acid Reaserch 1995，23(21)4530-31)。将它克隆到Pichia pastoris表达载体pPIC9K，与酿酒酵母Mat α pre-pro信号肽同一读框。
确定序列后，通过电穿孔将质粒转移到Pichia pastoris宿主菌株GS115(his4)。筛选His+克隆，以表达RANTES突变体。用Invitrogen的Pichia表达试剂盒(Life Technologies)所述的标准步骤进行小型的表达研究。简单地说，用甘油作为碳源在富集培养基扩展培养物，之后将培养物切粒，重新悬浮于含有甲醇的培养基中，以诱导RANTES突变蛋白质的表达。用以考马斯蓝(CoomassieBlue)染色的SDS-PAGE检测培养基中RANTES突变体的分泌。
选用分泌高水平RANTES突变体(约500-750mg/l)的克隆在大摇瓶进行放大试验。离心发酵液，转速为5000rpm，上清液用于纯化步骤。
通过单层析步骤从上清液纯化蛋白质，层析柱是用0.1M Tris-HCl平衡过的肝素琼脂糖柱，而蛋白质用20倍层析柱容积的在同一种缓冲液中0-2M氯化钠的线性梯度洗脱。通过质谱确定该蛋白质的真实性，结果发现，在这样一个系统中所制备的RANTES突变体(R44A-K45A-R47A)与野生型分子相比，N末端是截短的，即它缺少开头2个氨基酸。因此，所得到的突变体被确认为40’s RANTES(3-68)三突变体(R44A、K45A、R47A)，它的氨基酸序列是SEQ ID NO3的序列。d)肝素结合测试将50μg野生型或突变RANTES蛋白质装在用25mM pH8 Tris-HCl和50mM氯化钠溶液平衡过的肝素琼脂糖层析柱，以进行肝素琼脂糖层析，并用在25mM pH8 Tris-HCl中的0-2M氯化钠的线性梯度洗脱。
将50μg野生型或突变RANTES蛋白质装在用50mM pH4.5的乙酸钠溶液平衡过的MonoS阳离子交换层析柱，以进行肝素琼脂糖层析。蛋白质用0-2M氯化钠的线性梯度洗脱。
野生型RANTES、50’s RANTES三突变体及40’s RANTES三突变体(SEQ ID NO2-本文也称“R44A-K45A-R47A RANTES”)以Amersham的125I放射性同位素标记，比活性为2200mCi/摩尔，用它们进行竞争结合试验。具有96个孔的滤板浸泡在结合缓冲液(含有1mM氯化钙、5mM氯化镁、0.15mM氯化钠和0.5％BSA的50mM pH7.2 HEPES)中。用结合缓冲液稀释肝素，得到一系列稀释液，浓度范围为20mg/ml至1μg/ml。测试在100μl总体积中进行，即向每个孔加入25μl肝素稀释液、25μl 0.4nM[125I]-趋化因子、25μl肝素球(0.2μg/ml水溶液)和25μl结合缓冲液。测试重复三次。孔板在室温下搅拌培养4小时。滤板利用真空泵用200μl洗涤缓冲液洗三次，除去没有结合标记的趋化因子。然后，向每个孔加入50μl闪烁体，计算放射活性(1分钟/孔)。用GraFit软件分析数据。e)平衡竞争受体结合测试以[125I]-MIP-1α为示踪剂用液闪接近性测定技术(SPA)在表达CCR1或CCR5的中国仓鼠卵巢细胞膜上进行这些测试。用结合缓冲液稀释无标记的趋化因子，得到一系列稀释液，浓度范围为10-6-10-12M，以这些稀释液制备竞争试剂。所用的结合缓冲液是含有1mM氯化钙、5mM氯化镁、0.15mM氯化钠和0.5％BSA的50mMpH7.2 HEPES。麦芽SPA球(Amersham)溶于PBS，配成50mg/ml的溶液，用结合缓冲液稀释至10mg/ml，测试的终浓度为0.25mg/孔。由表达CCR1或CCR5的中国仓鼠卵巢细胞所制备的膜储存于-80℃，并用结合缓冲液稀释至80μg/ml。在进行测试前使等体积的膜和球母液混合，以减少本底。膜的终浓度是2μg/ml，[125I]-MIP-1α的终浓度是0.1nM。孔板在室温下搅拌培养4小时。测定放射活性并如肝素结合测试所述的方法分析数据。f)趋化活性测定用micro-Boyden室测定单核的细胞趋化活性。用以下分离步骤从血沉棕黄层(buffy coat)纯化单核细胞用100ml PBS稀释100 ml血沉棕黄层溶液，置于Ficoll分层液上面，室温下以600xg离心速度离心20分钟。收集形成界面的细胞，用PBS洗二次，以40-100×106/ml的浓度重新悬浮于含有5％失活胎牛血清(FCS)、2mM胍和25mM pH7.2 HEPES的RPMI 1640培养基中。通过加入106绵羊红血细胞/ml使它们从淋巴馏分作进一步纯化，在4℃以玫瑰形团(rosetted)过夜，室温下以600xg离心速度进行第二次Ficoll梯度离心20分钟而分离。在Ficoll分层液和缓冲液之间的界面得到单核细胞，而T细胞则在粒子内。用PBS洗涤单核细胞，以2.5×106/ml的浓度重新悬浮于RPMI 1640培养基中。用FACS分析法通过正向和侧向散射测定纯度，获得纯度是40-80％，视供体而定。将趋化因子稀释至终体积为30μl，并将RPMI培养基中的10-6-10-12M浓度范围置于下面的孔中。对于单核细胞，在下面的孔上放置孔径为5μm的滤板(Neuroprobe)，对于T细胞，则放置孔径为8μm的滤板，以确保没有气泡和系统密封。上面的孔加入50微升在RPMI培养基中的细胞悬浮液(2.5×106细胞/ml)。对于单核细胞和T细胞，微室在37℃和氧气存在下分别培养30分钟和1.5小时。然后，弃掉细胞，膜的上表面刮净细胞，再用PBS洗涤膜。膜浸在甲醇1分钟而凝固，风干，并用Fields A和B溶液染色。通过在配有IBAS成像分析软件的标准显微镜上用20x物镜选择每个孔的任意区域来计算迁移的细胞。用GraFit软件分析数据。g)腹膜细胞募集测试在第一次测试中，通过将10μg趋化因子在0.2毫升消毒盐水(不含PBS的氯化钠)的稀释液以腹膜内注射到8至12周大的雌性BALB/c小鼠中诱导细胞募集。在施加拮抗剂之前30分钟给予趋化因子突变体(稀释在0.2毫升消毒盐水的10μg趋化因子)。16小时后，喷洒二氧化碳处死小鼠。腹膜用5ml PBS灌洗三次，合并灌洗液。细胞以600xg离心速度离心10分钟，重新悬浮于1ml终体积中，用血球计数器计算所产生的全部白细胞。
在第二次测试中，通过将200μl 3％硫乙醇酸盐的蒸馏水溶液以腹膜内注射到8至12周大的雌性BALB/c小鼠诱导细胞募集(第一天)。在施加硫乙醇酸盐之前30分钟给予趋化因子突变体(稀释在0.2毫升消毒盐水的10μg趋化因子)。之后的三天每一天均施加趋化因子突变体(第二、三和四天)。在第五天喷洒二氧化碳处死小鼠。腹膜用5ml PBS灌洗三次，合并灌洗液。细胞以600xg离心速度离心10分钟，重新悬浮于1ml终体积中，用血球计数器计算所产生的全部白细胞。h)实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)免疫步骤通过在重18-22克、8周大的C57 BL/6NCrIBR雌性小鼠的颈后皮下注射0.1ml由200μg MOG35-55肽(购白Neosystem公司，Strasbourg，法国)和含有0.25mg结核分枝杆菌的弗氏完全佐剂(含有乳酪分枝杆菌的CFA，购自Difco公司，Detroit，美国)组成的乳液，使该小鼠免疫。在皮下注射之前，先在它们的尾巴静脉内静脉注射200μl溶于PBS的300ng百日咳毒素(List Biological Lab.，Campbell，CA，美国)。在第二天，给动物再一次腹膜注射300ng百日咳毒素。
这个步骤大约从第8至10天开始，会出现渐进麻痹(progressive paralysis)，从尾部开始逐渐上升至上肢。研究设计本研究包括数组动物，每组10只。所有组均按照免疫方案用含有MOG35-55肽的CFA和百日咳毒素免疫。
第1组通过腹膜途径仅给予载体(PBS)的阳性对照组。
第2组通过皮下途径仅给予载体(PBS)的阳性对照组。
第3组每只小鼠通过腹膜给予10μg 40’s RANTES三突变体。
第4组每只小鼠通过腹膜给予1μg 40’s RANTES三突变体。
第5组每只小鼠通过腹膜给予10μg 40’s Met-RANTES三突变体。
第6组每只小鼠通过腹膜给予1μg 40’s Met-RANTES三突变体。
第7组每只小鼠通过皮下给予10,000U小鼠重组白介素β(m-IFN-β)。
第8组每只小鼠通过皮下给予20,000Um-IFN-β。载体用PBS将全部40’s RANTES三突变体、全部40’s Met-RANTES三突变体及m-IFN-β稀释至适当浓度。给药途径每天通过腹膜给每只小鼠施加200μl施加量的40’s RANTES三突变体、40’sMet-RANTES三突变体及m-IFN-β。第1、2组每只小鼠通过腹膜给予200μl PBS。治疗时间每只动物的治疗从实验的第4天开始(通常在发病前大约3-5天)，然后连续治疗14天(在实验第18天处死动物)。临床观察从第5天开始，通过以下临床评分检查各只动物是否出现麻痹。
0＝无麻痹迹象0.5＝尾部局部麻痹1＝尾部麻痹1.5＝尾部麻痹+单侧下肢局部麻痹2＝尾部麻痹+下肢软弱或下肢局部麻痹2.5＝尾部麻痹+下肢局部麻痹(下骨盆)3＝尾部麻痹+下肢完全麻痹3.5＝尾部麻痹+下肢完全麻痹+失禁4＝尾部麻痹+下肢麻痹+上肢软弱或局部麻痹5＝半死状态或死亡2.结果a)肝素结合测定通过肝素层析法分析在一个或三个位置上发生突变的纯化RANTES蛋白质，并将用来洗脱它们的氯化钠浓度与野生型RANTES洗脱峰进行比较。由于突变体与肝素的相互作用是静电作用，所以也使突变体在MonoS柱上进行阳离子交换层析。由于诱变使碱基被除去，所以这会导致用来洗脱它们的氯化钠浓度降低。将肝素层析法所得的氯化钠浓度差减去阳离子交换层析法所得的氯化钠浓度差。若该数值是正数，就确定与肝素有特异性相互作用(表1)。
在竞争结合测试中，用40’s和50’s RANTES三突变体直接测定与肝素的结合。通过Amersham使野生型RANTES和突变体碘化，它们的特异性放射活性相同，均为2200mCi/摩尔。然而，只有大约20％的40’s三突变体与肝素球结合，最大数值为4000cpm，与之相比，野生型RANTES和50’s突变体的最大数值为22000cpm(图3)。这表明在40’s环已发生突变的这些残基对RANTES的肝素结合能力发挥主要作用。另一方面，这也表示50’s环中的推定GAG结合基序不是“真正”的GAG结合位点。b)平衡竞争受体结合测试测定40’s和50’s RANTES三突变体争夺[125I]-MIP-1α的能力，[125I]-MIP-1α用于与由中国仓鼠卵巢细胞稳定转染剂制备的膜内部的重组体CCR1或CCR5结合。两种受体上的任何单种突变均没有显着差异(未示出结果)。测试也显示，三突变体与CCR5的结合和野生型RANTES蛋白质与CCR5的结合是一样的。然而，40’s三突变体在CCR1上的亲和力减弱100倍，而50’s三突变体显示只丧失了少部分亲和力(3倍)(图4)。c)趋化活性试验40’s和50’s三突变体全都可以诱导单核细胞的趋化活性，而活性比得上野生型RANTES，除了40’s三突变体仅可在1μM时才会诱导较高的趋化活性之外。但40’s和50’s三突变体诱导T细胞的趋化活性的能力却相同(图5)。
在单核细胞趋化活性测定中所得的结果与在受体结合测试所得的结果完全一致。40’s RANTES三突变体在单核细胞趋化活性上损失的活性相当于CCR1损失的亲和力。d)腹膜细胞募集测试40’s RANTES三突变体并不能以RANTES引起大量募集的剂量(10μg/小鼠)诱导细胞募集到腹膜(图6)。
而且，如果在施加RANTES之前施加10μg突变体，就会抑制由RANTES诱导的细胞募集。所以，取消GAG结合可在体内产生趋化因子诱导的细胞募集的抑制剂。
用截短的40’s RANTES(3-68)三突变体(在Pichia pastoris中产生)、40’sMIP-1β三突变体(K45A-R46A-K48A)及40’s MIP-1α三突变体(R18A-R46A-R48A)也得到类似的结果，分别见图7、图8和图9。40’s RANTES三突变体也抑制了由硫乙醇酸盐刺激的细胞募集，如图10所示。e)实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)40’s RANTES三突变体在小鼠EAE模型中显示了一种与剂量有关的效应。用MOG初步免疫后第10天开始，每只小鼠每天腹膜注射1μg和10μg，蛋白质证明功效可与参考治疗即重组体m-IFN-β的治疗相比(图11)。疾病的发作大大推迟，而疾病的严重性(按曲线下的面积估计)也显着减缓。而且，实验期间达到的最大临床评分的平均值也有所下降。其他突变体(40’s Met-RANTES三突变体)在同一个实验中显示没有任何有益的效果。
我们的结果表明，全部40’s RANTES三突变体均取得十分有益的治疗效果，在小鼠用MOG免疫后减缓了慢性EAE的临床症状。所以，40’s RANTES三突变体具有有益的治疗效果，可用于治疗慢性脱髓鞘疾病，如多发性硬化症。
表1 从肝素和Mono-S(阳离子交换)层析柱洗脱的氯化钠体积摩尔浓度
下表2将阐明序列表和整份说明书所提到的序列同一性
序列表<110>应用研究系统ARS股份公司(Applied Research Systems ARS Holding N.V.)<120>多发性硬化症治疗中所用的趋化因子突变体<130>WO465<160>37<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>91<212>PRT<213>大肠杆菌(Escherichia coli)<220><221>SIGNAL<222>(1)..(23)<400>1Met Lys Val Ser Ala Ala Ala Leu Ala Val Ile Leu Ile Ala Thr Ala1 5 10 15Leu Cys Ala Pro Ala Ser Ala Ser Pro Tyr Ser Ser Asp Thr Thr Pro20 25 30Cys Cys Phe Ala Tyr Ile Ala Arg Pro Leu Pro Arg Ala His Ile Lys35 40 45Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly Lys Cys Ser Asn Pro Ala Val Val Phe50 55 60Val Thr Arg Lys Asn Arg Gln Val Cys Ala Asn Pro Glu Lys Lys Trp65 70 75 80Val Arg Glu Tyr Ile Asn Ser Leu Glu Met Ser85 90<210>2<211>66<212>PRT<213>巴斯德毕赤酵母(Pichia Pastoris)<400>2Tyr Ser Ser Asp Thr Thr Pro Cys Cys Phe Ala Tyr Ile Ala Arg Pro1 5 10 15Leu Pro Arg Ala His Ile Lys Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly Lys Cys20 25 30Ser Asn Pro Ala Val Val Phe Val Thr Ala Ala Asn Ala Gln Val Cys35 40 45Ala Asn Pro Glu Lys Lys Trp Val Arg Glu Tyr Ile Asn Ser Leu Glu
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15Ala Arg Lys Leu Pro Arg Asn Phe Val Val Asp Tyr Tyr Glu Thr Ser20 25 30Ser Leu Cys Ser Gln Pro Ala Val Val Phe Gln Thr Ala Ala Ser Ala35 40 45Gln Val Cys Ala Asp Pro Ser Glu Ser Trp Val Gln Glu Tyr Val Tyr50 55 60Asp Leu Glu Leu Asn65<210>6<211>91<212>PRT<213>大肠杆菌(Escherichia coli)<220><221>SIGNAL<222>(1)..(23)<400>6Met Lys Val Ser Ala Ala Ala Leu Ala Val Ile Leu Ile Ala Thr Ala1 5 10 15Leu Cys Ala Pro Ala Ser Ala Ser Pro Tyr Ser Ser Asp Thr Thr Pro20 25 30Cys Cys Phe Ala Tyr Ile Ala Arg Pro Leu Pro Arg Ala His Ile Lys35 40 45Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly Lys Cys Ser Asn Pro Ala Val Val Phe50 55 60Val Thr Arg Lys Asn Arg Gln Val Cys Ala Asn Pro Glu Ala Ala Trp65 70 75 80Val Ala Glu Tyr Ile Asn Ser Leu Glu Met Ser85 90<210>7<211>92<212>PRT<213>大肠杆菌(Escherichia coli)<400>7Met Lys Val Ser Ala Ala Ala Leu Ala Val Ile Leu Ile Ala Thr Ala1 5 10 15Leu Cys Ala Pro Ala Ser Ala Met Ser Pro Tyr Ser Ser Asp Thr Thr20 25 30Pro Cys Cys Phe Ala Tyr Ile Ala Arg Pro Leu Pro Arg Ala His Ile35 40 45Lys 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Asn Pro Ala Val Val Phe50 55 60Val Thr Arg Lys Asn Arg Gln Val Cys Ala Asn Pro Glu Lys Lys Trp65 70 75 80Val Ala Glu Tyr Ile Asn Ser Leu Glu Met Ser85 90<210>14<211>25<212>DNA<213>大肠杆菌(Escherichia coli)<400>14tttgtcaccg caaagaaccg ccaag 25<210>15<211>25<212>DNA<213>大肠杆菌(Escherichia coli)<400>15gacgactgct gggttggagc acttg 25<210>16<211>25<212>DNA<213>大肠杆菌(Escherichia coli)<400>16tttgtcaccc gagcgaaccg ccaag 25<210>17<211>25<212>DNA<213>大肠杆菌(Escherichia coli)<400>17gacgactgct gggttggagc acttg 25<210>18<211>25<212>DNA<213>大肠杆菌(Escherichia coli)<400>18cgaaagaacg cccaagtgtg tgcca25<210>19<211>25<212>DNA<213>大肠杆菌(Escherichia coli)<400>19ggtgacaaag acgactgctg ggttg25<210>20<211>36<212>DNA<213>大肠杆菌(Escherichia coli)<400>20tttgtcaccg cagcgaacgc ccaagtgtgt gccaac36<210>21<211>27<212>DNA<213>大肠杆菌(Escherichia coli)<400>21gacgactgct gggttggagc acttgcc 27<210>22<211>27<212>DNA<213>大肠杆菌(Escherichia coli)<400>22gccaacccag aggcgaaatg ggttcgg 27<210>23<211>27<212>DNA<213>大肠杆菌(Escherichia 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35 40 45Glu Ala Cys Ala Leu Asp Thr Val Gly Trp Val Gln Arg His Arg Lys50 55 60Met Leu Arg His Cys Pro Ser Lys Arg Lys65 70<210>31<211>70<212>PRT<213>大肠杆菌(Escherichia coli)<400>31Ala Ser Leu Ala Ala Asp Thr Pro Thr Ala Cys Cys Phe Ser Tyr Thr1 5 10 15Ser Arg Gln Ile Pro Gln Asn Phe Ile Ala Asp Tyr Phe Glu Thr Ser20 25 30Ser Gln Cys Ser Lys Pro Gly Val Ile Phe Leu Thr Lys Arg Ser Arg35 40 45Gln Val Cys Ala Asp Pro Ser Glu Glu Trp Val Gln Lys Tyr Val Ser50 55 60Asp Leu Glu Leu Ser Ala65 70<210>32<211>68<212>PRT<213>大肠杆菌(Escherichia coli)<400>32Ser Phe His Phe Ala Ala Asp Cys Cys Thr Ser Tyr Ile Ser Gln Ser1 5 10 15Ile Pro Cys Ser Leu Met Lys Ser Tyr Phe Glu Thr Ser Ser Glu Cys20 25 30Ser Lys Pro Gly Val Ile Phe Leu Thr Lys Lys Gly Arg Gln Val Cys35 40 45Ala Lys Pro Ser Gly Pro Gly Val Gln Asp Cys Met Lys Lys Leu Lys50 55 60Pro Tyr Ser Ile65<210>33<211>68<212>PRT<213>大肠杆菌(Escherichia coli)<400>33Gln Val Gly Thr Asn Lys Glu Leu Cys Cys Leu Val Tyr Thr Ser Trp1 5 10 15Gln Ile Pro Gln Lys Phe Ile Val Asp Tyr Ser Glu Thr Ser Pro Gln20 25 30Cys Pro Lys Leu Gly Val Ile Leu Leu Thr Lys Arg Gly Arg Gln Ile35 40 45Cys Ala Asp Pro Asn Lys Lys Trp Val Gln Lys Tyr Ile Ser Asp Leu50 55 60Lys Leu Asn Ala65<210>34<211>76<212>PRT<213>大肠杆菌(Escherichia coli)<400>34Asp Arg Phe His Ala Thr Ser Ala Asp Cys Cys Ile Ser Tyr Thr Pro1 5 10 15Arg Ser Ile Pro Cys Ser Leu Leu Glu Ser Tyr Phe Glu Thr Asn Ser20 25 30Glu Cys Ser Lys Pro Gly Val Ile Phe Leu Thr Lys Lys Gly Arg Arg35 40 45Phe Cys Ala Asn Pro Ser Asp Lys Gln Val Gln Val Cys Met Arg Met50 55 60Leu Lys Leu Asp Thr Arg Ile Lys Thr Arg Lys Asn65 70 75<210>35<211>74<212>PRT<213>大肠杆菌(Escherichia coli)<400>35Thr Lys Thr Glu Ser Ser Ser Arg Gly Pro Tyr His Pro Ser Glu Cys1 5 10 15Cys Phe Thr Tyr Thr Thr Tyr Lys Ile Pro Arg Gln Arg Ile Met Asp20 25 30Tyr Tyr Glu Thr Asn Ser Gln Cys Ser Lys Pro Gly Ile Val Phe Ile35 40 45Thr Lys Arg Gly His Ser Val Cys Thr Asn Pro Ser Asp Lys Trp Val50 55 60Gln Asp Tyr Ile Lys Asp Met Lys Glu Asn65 70<210>36<211>96<212>PRT<213>大肠杆菌(Escherichia coli)<400>36Pro Lys Val Pro Glu Trp Val Asn Thr Pro Ser Thr Cys Cys Leu Lys1 5 10 15Tyr Tyr Glu Lys Val Leu Pro Arg Arg Leu Val Val Gly Tyr Arg Lys20 25 30Ala Leu Asn Cys His Leu Pro Ala Ile Ile Phe Val Thr Lys Arg Asn35 40 45Arg Glu Val Cys Thr Asn Pro Asn Asp Asp Trp Val Gln Glu Tyr Ile50 55 60Lys Asp Pro Asn Leu Pro Leu Leu Pro Thr Arg Asn Leu Ser Thr Val65 70 75 80Lys Ile Ile Thr Ala Lys Asn Gly Gln Pro Gln Leu Leu Asn Ser Gln85 90 95<210>37<211>76<212>PRT<213>大肠杆菌(Escherichia coli)<400>37Gln Pro Asp Ser Val Ser Ile Pro Ile Thr Cys Cys Phe Asn Val Ile1 5 10 15Asn Arg Lys Ile Pro Ile Gln Arg Leu Glu Ser Tyr Thr Arg Ile Thr20 25 30Asn Ile Gln Cys Pro Lys Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Lys Arg Gly35 40 45Lys Glu Val Cys Ala Asp Pro Lys Glu Arg Trp Val Arg Asp Ser Met50 55 60Lys His Leu Asp Gln Ile Phe Gln Asn Leu Lys Pro65 70 7权利要求
1.截短和突变的人RANTES，其特征在于所述RANTES具有SEQ ID NO3的氨基酸序列。
2.一种在40’s环阳离子位点上含有至少两种突变，而且与野生型分子相比其GAG结合活性较低的CC趋化因子突变体的应用，其特征在于所述突变体用于制备治疗多发性硬化症和/或其他脱髓鞘疾病的药物组合物。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述趋化因子突变体是RANTES突变体。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述趋化因子突变体是RANTES三突变体，其中40’s环阳离子位点上的三个碱性氨基酸已被其他氨基酸取代。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于40’s环阳离子位点上的三个碱性氨基酸已被丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸或甘氨酸取代。
6.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述趋化因子突变体是权利要求1的截短和突变的RANTES。
7.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述趋化因子突变体是SEQ ID NO2的RANTES突变体。
8.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述趋化因子突变体是SEQ ID NO4的MIP-1-α突变体。
9.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述趋化因子突变体是SEQ ID NO5的MIP-1-β突变体。
10.一种治疗多发性硬化症和/或其他脱髓鞘疾病的药物组合物，其特征在于所述药物组合物包括作为活性成分如权利要求1至9所限定的趋化因子突变体以及一种药学上可接受的赋形剂。
11.一种DNA分子，其特征在于所述DNA分子包括为权利要求1的截短和突变的RANTES编码的DNA序列。
12.一种表达载体，其特征在于所述载体包括权利要求11的DNA分子。
13.一种宿主细胞，其特征在于所述宿主细胞包括权利要求12的表达载体。
14.一种制备如权利要求1所述的多肽的重组方法，其特征在于所述方法包括在合适的培养基中培养如权利要求13所述的细胞。
全文摘要
CC趋化因子突变体在40’s环(40’sloop)阳离子位点上含有至少两种突变，它们与野生型分子相比，其GAG结合活性较低。具体地说，本发明业已得出，这些突变的趋化因子可有效地治疗多发性硬化症和/或其他脱髓鞘疾病。RANTES三突变体是效果最好的化合物。
文档编号C12N1/15GK1477969SQ01819917
公开日2004年2月25日 申请日期2001年10月3日 优先权日2000年10月4日
发明者A·普罗德富特, A 普罗德富特, C 韦尔斯, T·N·C·韦尔斯, M·科斯科-维尔博伊斯, 箍 维尔博伊斯 申请人:应用研究系统Ars股份公司