用于检测rgs蛋白质调节物的方法和细胞的制作方法

专利名称：用于检测rgs蛋白质调节物的方法和细胞的制作方法
技术领域：
本发明涉及对信息素(pheromone)应答和表达报道基因的新的细胞，所述报道基因可操作地与信息素应答启动子连接。在一些实施方式中，报道分子是海肾荧光素酶(Renilla luciferase)，虫荧光素酶(Photinusluciferase)，绿色荧光蛋白质，或绿色荧光蛋白质的衍生物。在其它实施方式中，细胞也表达异源的G蛋白质调节物(“RGS蛋白质”)。
在另一个实施方式中，本发明涉及筛选调节RGS蛋白质的化合物的方法，其中，该方法利用了本发明新的细胞。
背景技术：
G蛋白质信号途径是用于转递细胞外信号，如神经递质，激素，有气味的物体和光的最重要信号级联放大之一。在各种生物体，包括酵母和哺乳动物中已经鉴定了该途径。通常，该系统由3个主要成分组成G蛋白质偶联的受体(GPCRs)，具有α，β和γ亚基的异源三聚体G蛋白质和细胞内效应物(Gilman，1987)。最近，发现了蛋白质RGS家族。RGS蛋白质提供了细胞能精确调节通过G蛋白质途径产生的信号持续时间和大小的机理(Kehrl等，1999)。本发明涉及修饰的宿主系统，其能用于分离和表征调节RGS蛋白质的新的因子。该因子显示了控制和治疗由不适当G蛋白质信号途径活性引起的疾病的巨大可能性。
一旦GPCR激活，G蛋白质信号途径就开始了，GPCR是以其7个跨膜结构域为特征。当刺激GPCR时，它的细胞内的环和C-末端尾与相关G蛋白质相互作用(Wieland等，1999)。然后，G蛋白质的Gα亚基释放二磷酸鸟苷(GDP)，并且在其位置结合三磷酸鸟苷(GTP)。GTP的结合改变了Gα亚基的形状或三维构型，引起了异源三聚体解离为GTP-配体的Gα亚基和Gβγ二聚体。然后，释放的亚基是游离的以诱导下游信号活动，最终介导生物化学反应，细胞生理学的改变，或其它细胞应答。当Gα亚基水解GTP，返回到GDP结合状态时，信号终止，随后与Gβγ亚基重新装配以形成失活的异源三聚体(Kehrl，1998)。
为了诱导适合的细胞应答，必需严密地调节细胞内信号的强度。尽管该系统存在许多种类型的调节，如GPCRs磷酸化作用，受体结合蛋白质，和Gβγ捕获蛋白质，但是许多研究人员致力于GTP酶活化蛋白质(GAPs)(参见，Wieland等，1999)。GAPs加速Gα-GTP酶水解的速率，因此降低途径中产生的信号和“脱敏”该系统(DeVries等，1999)。
RGS蛋白质代表一类相对新的GAPs。该家族的第一个成员是从酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)获得(Dohlman等，1996；Weiland等，1999)。鉴定了单倍体突变体，其对信息素诱导的细胞周期停滞，一种GPCR途径介导的应答，是超敏感的。研究表明突变的基因产物，Sst2作为GAP与G蛋白质Gα亚基相互作用。因此，Sst2作为该系统负调节物起作用，控制酵母的成熟。随后，在许多物种中，鉴定了更多的RGS家族成员，包括哺乳动物中的20多种不同成员(Zheng等，1999)。推测通过可选的剪接，大大增加了RGS蛋白质的所有组成成员(Panetta等，1999)。
除了作为活化Gα亚基的GAPs作用外，也已经报告了RGS蛋白质刺激Gβγ介导途径的作用。尽管RGS蛋白质对Gα-GTP有显著较高的亲和性，但是RGS蛋白质对Gα-GDP有较低的亲和性。当RGS蛋白质与Gα-GDP结合时，Gβγ蛋白质保持游离以介导下游活动(参见Panetta等，1999)。因此，RGS蛋白质以多于一个途径来调节G蛋白质信号途径可能是至关重要的。
因为RGS家族的大小和RGS蛋白质在调节G蛋白质信号途径中的决定性作用，科学家已经开始研究个体RGS蛋白质是如何达到它们的特异性的。一个水平的特异性是由不同RGS蛋白质的表达模式引起的；一些RGS蛋白质在特定组织表达，而一些则普遍表达(Zheng等，1999；Panetta等，1999)。推测不同RGS蛋白质对个体Gα-亚基可能有不同特异性(Kehrl等，1998)。这将使一些RGS蛋白质优先于其它RGS蛋白质调节一些G蛋白质信号途径(Zheng等，1999)，或偏向于来源于单一GPCR的双Gα应答。
通过RGS蛋白质浓度或活性的调节也可以达到G蛋白质信号途径的控制。例如，通过生物化学反馈机理可以改变RGS蛋白质编码基因的转录(参见Panetta等，1999)。已表明血小板活化因子触发B细胞的RGSl表达，而碳酰胆碱诱导RGS16的表达。相反地，负调节RGS4表达以应答细胞内cAMP水平。
通过报道基因的应用，许多基于细胞的研究平台将目的基因或药物的期望效果与细胞表现型的改变联系起来。酵母系统中，例如，报道基因通常集中在用于选择培养基上细胞生长的营养缺陷型基因，或用于比色端点检测β-半乳糖苷酶活性测定的LacZ基因。编码荧光素酶的基因，例如来源于海洋海肾(Renilla reniformis)和北美萤火虫(Photinuspyralis)，作为报道基因在酵母中也是有用的。荧光素酶报道基因提供了检测敏感性，速度，简易，信噪比的增加，而且提供了基于酵母测定的高质量的定量数据，用于无数的靶鉴定和药物发现应用。在酵母中应用荧光素酶报道基因对基于酵母的测定，如RGS蛋白质调节物的测定提供了明显的改进。

发明内容
在一个实施方式中，本发明涉及鉴定能够调节RGS蛋白质的化合物的方法，例如，直接或间接与RGS蛋白质本身相互作用的化合物。在文献中可以发现该因子的线索。例如，RGS3和RGS12都有预测呈卷曲螺旋结构的区域；该结构域常常介导与细胞的细胞骨架蛋白质的相互作用(Kehr等，1998)。这可以允许RGS蛋白质在与膜结合和胞质库中变动，因此改变了在特定时间RGS蛋白质的可用性和/或影响了RGS蛋白质调节的Gα-亚基类型(DeVries等，1999)。
本发明新的修饰细胞，和与这些细胞结合的新的方法提供了用于检测影响RGS蛋白质的物质的重要进步。目前，没有一个人研究出系统地检测能调节RGS活性的化合物的有效和特异的筛选系统。该化合物有巨大治疗价值，因为它们能潜在地调节一个或许多G蛋白质途径，该G蛋白质途径介导大量的生物过程，并且是多种疾病的基础。此外，药理学家估计目前所用所有药物，其中达到60％通过G蛋白质信号途径发挥它们的作用(Roush，1996)。通过揭示调节这些系统的新的因子，可以评估与这些药物中许多药物有关的药物耐药性现象。
在一方面，本发明涉及对信息素应答的细胞，包括编码适合报道分子，可操作地与信息素应答启动子连接的异源核酸，其中报道分子是，例如海肾荧光素酶，虫荧光素酶，绿色荧光蛋白质，或绿色荧光蛋白质的衍生物。细胞可以是哺乳动物细胞或酵母细胞。在特定实施方式中，酵母细胞是酿酒酵母，裂殖酵母(schizosaccharomyces pombe)，或巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)，优选酿酒酵母。
编码启动子的异源核酸可以包含在载体，例如质粒中。在可选的实施方式中，异源核酸整合进入细胞基因组。
在一些实施方式中，信息素应答启动子是LUC1、FUS1、FUS2、KAR3、FUS3、STE3、STE13、STE12、CHS1、FAR1，AGA1、AGA2、AGα1、GPA1、STE2、STE3、STE6、MFA1、MFA2、MFα1、MFα2、CIK1或BAR1。
在另一方面，本发明细胞可以进一步包含编码RGS蛋白质的异源核酸。RGS蛋白质可以缺乏Gγ-样(“GGL”)或散乱EGL-10血小板白细胞C激酶底物(“DEP”)结构域。在可选实施方式中，细胞将进一步包含与异源RGS蛋白质对应的编码天然RGS蛋白质的内源核酸，其中突变该内源核酸，这样其不产生功能的天然RGS蛋白质。突变是缺失、插入或置换中的一种。
任何RGS蛋白质都适合用于本发明，包括RGSZ1、RGSZ2、Ret-RGS1、RGS1、RGS2、RGS3、RGS4、RGS5、RGS6、RGS7、RGS8、RGS9-1、RGS9-2、RGS10、RGS11、RGS12、RGS13、RGS14、RGS16、RGS-PX1、GAIP、Axin、Conductin、egl-10、eat-16、P115RhoGEF，和其同种型，或含有RGS-样(RGL)结构域的蛋白质。其中蛋白质含有RGS-样(RGL)结构域，结构域可以是PLCB或cGMP PDE的γ亚基。优选地，RGS蛋白质是RGS2、RGS4、RGS6、RGS11或RGSZ。在一些实施方式中，RGS蛋白质缺少GGL或DEP结构域。
在一些实施方式中，细胞将进一步包含编码Gβ5的异源核酸。在特定实施方式中，Gβ5是人的。
在一些实施方式中，RGS蛋白质是嵌合体。该嵌合体可以包含RGS4的N-末端和完整RGS10，RGS4的N-末端和完整RGS7，RGS4的N-末端和缺失GGL结构域的RGS9，RGS4的N-末端和具有GGL结构域的RGS9，RGS4的N-末端和axin的RGS结构域，或其部分。
在特定实施方式中，RGS4的N-末端包含RGS4的氨基酸1-57，RGS7的C-末端包含RGS7的氨基酸255-470，RGS7的N-末端包含RGS7的氨基酸1-332，RGS4的C-末端包含RGS4的氨基酸58-206，axin RGS结构域包含axin的氨基酸199-345。
本发明包括含有编码嵌合RGS蛋白质异源核酸的细胞，如上述。该细胞可以是哺乳动物细胞或酵母细胞。在特定实施方式中，酵母细胞是酿酒酵母，裂殖酵母或巴斯德毕赤酵母，优选酿酒酵母。
编码嵌合RGS蛋白质的异源核酸可以包含于载体，如质粒中。在可选实施方式中，异源核酸整合进入细胞基因组。
本发明另一个方面涉及编码嵌合蛋白质的分离核酸。嵌合RGS蛋白质可以是上述任何一种。分离的核酸可以插入载体，如质粒或病毒。质粒可以是低拷贝数的质粒。
在进一步的另一方面，本发明是检测实验样品改变RGS蛋白质介导的报道基因表达能力的方法，该方法包括(a)提供至少一种对信息素应答的第一细胞，其中该第一细胞包含编码报道分子的异源核酸，该异源核酸可操作地与信息素应答启动子连接，其中异源核酸的表达产生可检测的信号；(b)提供至少一种对信息素应答的第二细胞，其中该第二细胞包含编码报道分子的异源核酸和编码RGS蛋白质的第二异源核酸，所述编码报道分子的异源核酸可操作地与信息素应答启动子连接，并且该异源核酸的表达产生可检测的信号；(b)在信息素存在的情况下和在适合检测可检测信号的条件下，将实验样品与第一或第二细胞一起温育；(c)检测编码报道分子的异源核酸的表达水平；和(d)比较第一细胞和第二细胞中的表达水平，其中表达水平的差异表明实验样品改变了RGS蛋白质介导的报道基因的表达。
为了实施本发明的方法，可以利用本发明的任何适合的细胞，如上述的细胞。
在一个实施方式中，可以用单一浓度的实验样品实施本方法，或可选地，实验样品可以用于一个浓度范围。
在实施本发明方法中，可以用本领域已知的任何合适的方法完成报道基因表达水平的检测。在一些实施方式中，用晕圈测定法(halo assay)完成报道基因的检测。在可选的实施方式中，用分光光度计测量检测报道基因的表达水平。检测可以自动化，因此增加了本发明用于大规模筛选测试化合物的用途。
在另一不同方面，本发明是检测实验样品改变RGS蛋白质介导的报道基因表达能力的方法，该方法包括(a)提供至少两等量份对信息素应答的细胞，其中该细胞包含编码报道分子的异源核酸和编码RGS蛋白质的第二异源核酸，所述编码报道分子的异源核酸可操作地与信息素应答启动子连接，并且该异源核酸的表达产生可检测的信号；(b)在信息素存在情况下和适合检测可检测信号的条件下，温育所述等量份细胞，其中一份等量份含有实验样品；(c)检测等量份中编码报道分子的异源核酸的表达水平；和(d)比较两等量份中报道分子的表达水平，其中两等量份间表达水平的差异表明实验样品改变了RGS蛋白质介导的报道基因的表达。
为了实施本发明的方法，可以利用本发明的任何适合的细胞，如上述的细胞。
在一个实施方式中，可以用单一浓度的实验样品实施本方法，或可选地，可以在一个浓度范围内使用实验样品。
在实施本发明方法中，可以用本领域已知的任何合适的方法完成报道基因表达水平的检测。在一些实施方式中，用晕圈测定法完成报道基因的检测。在可选的实施方式中，用分光光度计测量检测报道基因的表达水平。检测可以自动化，因此增加了本发明用于大规模筛选试验化合物的用途。
附图的简要说明

图1描述了用于具有包含RGS4构建体质粒的酵母的晕圈测定法。显示了来源于KY103和KY113的株系的酵母。
图2A表示具有RGS4和FUS1-lacZ构建体的酵母与来源于KY103的株系中缺少RGS构建体的对照株系相比，显示了显著的信息素诱导生长的弱化作用。
图2B表示具有RGS4和FUS1-lacZ构建体的酵母与来源于KY113的株系中缺少RGS构建体的对照株系相比，显示了显著的信息素诱导生长的弱化作用。
图3表示在α因子存在的情况下，具有RGS4和FUS1-荧光素酶构建体的酵母株系(KY117)与缺少RGS4构建体的对照株系相比，显示了减弱的发光水平。
图4A描述了在含有RGS4和FUS1-荧光素酶构建体的细胞中和缺少RGS4构建体的对照株系中，对α因子应答的发光剂量应答曲线。两个株系都来源于KY103。
图4B描述了在含有RGS4和FUS1-荧光素酶构建体的细胞中和缺少RGS4构建体的对照株系中，对α因子应答的发光剂量应答曲线。两个株系都来源于KY113。
图5描述了酵母基于信息素测定法的示意图，该测定法用于筛选作为RGS阻断剂的化合物。
图6A-C表示用于96种化合物的单剂量测定法，用于干扰RGS4介导的发光减弱的化合物的筛选。图6A表示在表达RGS4的酵母株系中化合物的作用。图6B表示在具有缺少RGS4序列对照载体的酵母株系中化合物的作用。图6C表示在表达RGS4和对照酵母株系间的倍数的差异。
图7A-D分别表示检测化合物SBQ7/D1、SBQ8/B1、CL485和CL744的剂量应答曲线。对于每个化合物，提供了显示每秒的原始的计数，株系间倍数的差异，和株系内倍数的差异图。
图8表示表达RGSZ1的酵母株系比表达空载体的对照酵母株系显示了较小的晕圈和降低的发光，表明在酵母中sst2的互补。也示出了表达RGS2、RGS7和RGS9的酵母株系的晕圈测定法结果。
图9A-D表示表达RGSZ1、RGS2、RGS7和RGS9的试验酵母株系与表达空载体的对照酵母株系相比，对α因子变化浓度应答的剂量应答曲线。
图10表示共表达RGS9和hGβ5的酵母株系的晕圈测定结果。
图11表示共表达RGS7和hGβ5的酵母株系的晕圈测定结果。
图12表示嵌合RGS4/RGS10、RGS4、RGS10、RGS7、RGS9、RGS6和RGS11的荧光素酶测定结果。
图13表示RGS7、嵌合RGS7(ggl)/RGS4、嵌合RGS4/RGS7(ggl)4/RGS10、RGS4、RGS10、RGS7、RGS9、RGS6和RGS11的荧光素酶测定结果。
具体实施例方式
本发明修饰的细胞应用宿主细胞。用于本发明中有效的宿主细胞仅要求其被基因限定以基因工程改造与报道基因，可选地，与外源RGS蛋白质连接的信息素应答启动子的适合表达和任何其它期望基因操作。宿主细胞可以是任何细胞，如真核细胞或原核细胞，例如哺乳动物细胞，该细胞能够对信息素或其它起GPCR配体作用的化合物应答。细胞可以天然地对信息素或其它化合物应答，或基因工程改造以对它们应答。优选地，宿主细胞是真菌细胞，例如曲霉属(Aspergillus)或链孢霉属(Neuropora)的成员。在更有效实施方式中，宿主细胞是酵母细胞。在可选的优选实施方式中，酵母细胞是啤酒酵母，裂殖酵母，或巴斯德毕赤酵母。
本发明细胞利用至少一个含有编码报道分子的异源核酸的构建体，该异源核酸可操作地与信息素应答启动子连接，其中异源核酸的表达产生可检测的信号。优选地，异源核酸包含在载体，如质粒中。尽管，可选地，核酸可以整合进入细胞的染色体。
在一些实施方式中，宿主细胞进一步包含异源RGS蛋白质。在优选实施方式中，突变宿主细胞中的内源RGS蛋白质。一旦用信息素处理，如α因子，就激活信息素敏感启动子，引起报道基因的表达。功能RGS蛋白质的表达抑制信息素敏感启动子的激活，引起了报道基因表达的降低。抑制RGS蛋白质活性化合物的存在引起了报道基因表达的增加。
在细胞中，异源核酸序列通过，例如表达载体或质粒表达。表达载体或质粒是能复制的DNA构建体，其中异源核酸可操作地与一个或多个适合的控制序列连接，该控制序列能影响预定宿主细胞中异源核酸序列编码的报道基因蛋白质或蛋白质亚基的表达。通常，控制序列包含转录启动子，控制转录的可选的操纵基因序列，编码适合mRNA核糖体结合位点的序列，和控制转录和翻译终止的序列。
除了质粒外，用于实施本发明的载体包括病毒，和能整合的DNA片段，如通过遗传重组整合进入宿主基因组的插入片段和转座子。适于用在本发明中的病毒载体包括腺病毒，腺相关病毒，疱疹单纯病毒，罗斯(Rous)肉瘤病毒，慢病毒和辛德比斯(Sandbis)病毒。载体可以复制，独立于宿主基因组起作用，如质粒的情况下，或可以整合其自身进入基因组，如能整合的DNA片段情况下，例如插入序列或转座子。适合的载体将含有来自与预定宿主细胞共存物种的复制和控制序列。例如，在宿主细胞中可操作启动子是结合于那个细胞RNA聚合酶的启动子。适合的复制和控制序列是本领域技术人员熟知的。
当核酸与控制序列功能性相关时，核酸可操作地与控制序列连接。例如，如果启动子控制核酸的转录，那么其可操作地与核酸连接。如果定位核糖体结合位点以允许翻译，那么其可操作地与核酸连接。
只要信息素应答启动子和所用配体的特异性相互作用是已知的，或能通过可用的科学方法推导出，那么信息素应答启动子和所用配体就可以广泛变化。可以使用各种天然存在的信息素应答启动子，或合成的信息素应答元件，或其它含有信息素应答元件的基因中任何一种。优选地，信息素应答启动子来自于FUS1、FUS2、KAR3、FUS3、STE3、STE13、STE12、CHS1、FAR1、AGA1、AGA2、AGα1、GPA1、STE2、STE3、STE6、MFA1、MFA2、MFα1、MFα2、CIK1、LUC1、BAR1或Ω元件。
尽管与交配过程相关的(如形态学上的变化，凝集作用(agglutiniation)，形态形成，细胞融合，核融合等)任何引发酵母细胞中变化的信息素或功能成分都适合用于本发明，但是优选地，用在本发明的信息素是α因子，因子，或M信息素。
这里所用“异源”指来源于除了本发明细胞以外生物体的核酸，蛋白质和其它物质，或在本发明细胞中没有天然发现的其联合。这个术语也指与本发明细胞来源于相同生物体的核酸，但是与对应的内源序列相比，已经以任何方式修饰了该核酸。
任何G蛋白质偶联的受体系统都可以用于实施本发明。这种受体系统的例子包括但不限于与腺苷受体，促生长素抑制素受体，多巴胺受体，缩胆囊肽受体，毒蕈碱性胆碱能受体，α-肾上腺素能受体，β-肾上腺素能受体，鸦片受体，大麻素受体，组胺受体，生长激素释放因子受体，胰高血糖素受体，血清素受体，加压素受体，melanocortin受体和神经降压素受体相关的受体系统。
通常选择报道基因以便于可以通过熟知和简单的技术监测配体与其GPCR的结合和信息素应答启动子间的相互作用。优选地，基于费用，检测报道基因活性的容易性和低背景选择报道基因。即，因为高信号对背景的比率和/或相对低或没有无诱导的活性，所以在报道基因相对低水平的表达时可以检测活性。报道分子可以是可以通过任何可用方法检测其活性的任何报道分子。可以用在本发明中的示例性报告基因是荧光素酶基因，绿色荧光蛋白质基因，绿色荧光蛋白质基因的衍生物，或CAT。优选地，通过比色或荧光方法指示报道分子的活性。
在优选实施方式中，报道基因是荧光素酶基因，例如来源于海洋海肾和北美萤火虫的荧光素酶基因。来源于其它生物体的荧光素酶基因也是本领域技术人员熟知的。应用荧光素酶报道基因的显著优点是它使快速液体测定法成为可能，因此允许实验样品高通过量的筛选。此外，荧光素酶报道基因在酵母中的应用提供了增加的测定敏感性，能实现定量数据的收集，允许测定自动化，特别是对于高通过量(384孔)的测定形式。短的测定时间避免了由于长温育时间(48+小时)的化合物毒性作用，增加了在药物筛选中应用的用途，而对于需要细胞生长以终点测定的标准营养缺陷型(HIS3，LYS2，URA3)报道分子或反选择(CAN1，URA3，CNH2)报道分子，目前需要长温育时间。
用在本发明的示例性RGS蛋白质是包含RGS结构域的蛋白质，如RGSZ1、RGSZ2、Ret-RGS1、RGS1、RGS2、RGS3、RGS4、RGS5、RGS6、RGS7、RGS8、RGS9-1、RGS9-2、RGS10、RGS11、RGS12、RGS13、RGS14、RGS16、RGS-PX1、GAIP、Axin、Conductin、egl-10、eat-16、p115RhoGEF，和其同种型，或含有RGS-样(RGL)结构域的蛋白质，例如PLCB，cGMP PDE的γ亚基。
可以构建2微米(2micron)和低拷贝数(CEN)形式的信息素应答—启动子—报道基因构建体，以通过细胞内报道基因拷贝数的控制能够进一步控制报道基因功能或测定敏感性。
用标准方法，例如Ausubel等，1998所述的方法进行分子克隆技术。根据制造商的说明进行限制性消化。其中为了适合的克隆策略，根据标准技术用Klenow末端补平cDNA片段以产生平末端。根据制造商的说明(Boehringer Manheim or Amersham Life Science)，用虾碱性磷酸酶(SAP)进行cDNA片段和/或载体的去磷酸化。用标准技术进行连接反应，转化重组载体进入大肠杆菌(Echerichia coli)DH5α细胞，在含有适合抗生素的LB琼脂平板上铺板。回收菌落，用DNA midi prep试剂盒或自动DNA制剂(Qiagen)制备质粒DNA。用Perkin Elmer的试剂和ABI的自动测序装置证实质粒的完整性和克隆策略。用乙酸锂方法转化酵母株系，在适合培养基上铺板(Rose等，1990)。用标准方法制备所有酵母培养基和试剂。
在检测化合物存在的情况下，本发明新的修饰细胞容易应用在各种用于检测报道基因表达的筛选方法中。设计本发明的筛选方法以检测与RGS蛋白质修饰G蛋白质应答途径的能力相互作用的化合物，如同通过报道基因活性的改变所测定。检测化合物可以是肽，优选约2个氨基酸长度，或非肽的化合物。非肽检测化合物包括化合物，复合物和盐及天然产品样品，如植物提取物，组织提取物和从发酵肉汤得到的物质。
在本发明优选的实施方式中，培育细胞，其中可以监测RGS活性。在一个例子中，荧光素酶基因与信息素应答启动子，FUS1连接。在缺失内源性RGS蛋白质，Sst2的酵母细胞中表达该FUS1-荧光素酶报道基因，或在其中内源性sst2基因含有突变的酵母株系中表达，所述突变使得它与sst2缺失的株系功能等同。在“实验”细胞中，加入表达哺乳动物RGS4蛋白质的质粒，而用缺失RGS4基因的质粒转染“对照”细胞。用α因子配体处理实验和对照细胞，α因子配体与受体结合，刺激细胞级联放大以驱动FUS1启动子和荧光素酶报道基因的表达。在对照株系中，表达高水平的荧光素酶，在底物存在的情况下，引起强发光。相反地，含有RGS4的酵母株系，证实RGS4负调节信号级联放大显示大幅度降低的FUS1荧光素酶报道基因活性。这些发现与以前利用其它报道基因，如β-gal活性或营养缺陷型的标记的发现相互关联。
可以通过许多方法利用这些酵母细胞以研究或发现与RGS蛋白质相互作用的因子。例如，可以向表达RGS4蛋白质载体的实验株系中加入一个实验化合物。如果因子与RGS蛋白质相互作用，它将阻断或增强RGS4蛋白质功能，因此影响RGS蛋白质负调节由α因子/受体相互作用诱导的信号的能力。然后α因子信号刺激(延长其能力)可以用来降低报道基因的表达，引起高水平的发光。可选地，增强RGS功能的化合物将降低报道基因的表达。与对照株系相比，认为在实验(表达RGS4)株系中显示了增加的荧光素酶活性的化合物将是潜在的候选药物。可以在剂量应答测定中检测与作为载体对照细胞相比，引起实验株系中荧光素酶活性增加约50％(或一些其它适合测定的百分数)的化合物。
这些类型的RGS测定法显示了在药物发现方面的巨大潜力。它们是非常灵敏的，有短的检测时间，而且对用于大规模药物发现的高通过量系统是理想的。此外，可以用荧光素酶RGS测定法鉴定孤独G蛋白质受体的配体，而且可以用于研究或筛选G蛋白质途径的其它成员，如激酶。
提供了下面的实施例以进一步示例本发明的各个方面。它们不应该解释为限定本发明。
实施例1 FUS1-LacZ报道基因的RGS测定已充分表征和描绘了酵母中α因子的GPCR受体刺激(参见，Dohlman等，1996)。这个途径的刺激通常引起酵母细胞周期停滞。该信号途径受作为GPCR信号负调节物起作用的内源RGS蛋白质，Sst2控制。RGS蛋白质起到加速Gα亚基内源GTPVase活性的作用。因为在酵母中编码Sst2基因的缺失损害了其关闭GPCR信号的能力，所以引起了酵母细胞对配体超敏感。哺乳动物的RGS蛋白质，RGS4能功能互补酵母的Sst2。
在本实验中，在存在或缺少哺乳动物RGS4蛋白质的情况下，在缺失sst2的酵母株系中测定报道基因的活性。在这个测定中，我们实验了是否RGS4蛋白质能调节引起信息素应答基因活化的α因子诱导的信息素应答途径。在信息素应答启动子下游可操作地连接lacZ基因(FUS1-lacZ报道基因)，并且在能对信息素α因子应答的细胞，如MATa细胞中表达。
制备含有FUS-1启动子和LacZ报道基因的质粒(Kp27)。通过用xhoI和EagI消化质粒pRS424(Stragagene)产生该质粒。产生1.095kbEcoRI-SalI片段的FUS1启动子区域(GenBank M16717)，并且产生3.0kbSalI-EagI片段的β-半乳糖苷酶基因(GenBank，CVU89671)。用标准方法，在制备的pRS424载体，FUS1片段和β-半乳糖苷酶片段间进行三路直接连接以产生质粒Kp27。转化重组DNA进入大肠杆菌，通过标准方法制备选定转化体的DNA。通过限制性消化和序列分析证实Kp27构建体。
我们制备了编码RGS4蛋白质的质粒构建体。通过PCR，用质粒pWE2RGS4作模板(Shuey等，1997)，应用下面的引物获得编码全长大鼠RGS4的cDNAKx13(正向)5’-GACGTCTCCCATGTGCAAAGGACTCG(SEQ ID NO1)，其含有内含BsmBI位点和部分NcoI序列；及Kx41(反向)5’-CGGGATCCTTATTAGGCACACTGAGGGACTAGGGAAG(SEQ IDNO2)，其含有外部终止密码子和内含的BamHI位点。
为了构建血凝素标记的(“HA”)RGS4，利用缺少终止密码子，但含有内含BamHI位点的不同的3’-引物Kx42(反向)5’-GAGGATCCGGCACACTGAGGGACTAGGGAAG(SEQ ID NO3)。
用BsmBI和BamHI消化PCR产物(约650bp)，分别连接到载体Kp46或Kp57用于无标记和HA标记的RGS4蛋白质表达。转化由此产生的质粒Kpl18(RGS4-Kp46)和Kpl19(RGS4-Kp57)进入细菌细胞。制备重组DNA，用下面的引物通过序列分析证实重组DNA
KX435’-TTTTTACAGATCATCAAGGA(SEQ ID NO4)KX445’-TGCGTCTTCAGAGCGCTTTT(SEQ ID NO5)Kx395’-GAGCCAAGAAGAAGTCAAGAAAT(SEQ ID NO6)Kx405’-TGGGCTTCATCAAAACAGG(SEQ ID NO7)。
为了产生缺失内源RGS蛋白质，SST2的酵母株系，通过用XhoI和SacI消化，从LEU标记的质粒pEK139/138获得SST2::NEO构建体。凝胶分离和纯化由此产生的含有sst2-NEO-sst2盒子的4.0kb片段。共转化该cDNA片段和URA标记的pRS416(stratagene)进入酵母株系CY770(MATaleu2-3，112 ura3-52 trpl-901 his-200 ade2-101 gal4 gal80 lys2::GALuas-HIS3 cyhR；Young，等，1995)以提高整合。转化后，在YPD培养基上生长酵母细胞，在SC-ura培养基上铺板。在YPD培养基上顺序影印铺板由此产生的URA+酵母菌落，该YPD培养基含有50ug/ml，随后是100ug/ml的G418(遗传霉素，来自BRL)。通过PCR分析检验sst2-NEO-sst2构建体整合证实G418抗性CY770酵母菌落。用于PCR检验的引物如下Kx245’-TATCGAGTCAATGGGGCAGGC(SEQ ID NO8)Kx255’-CGAAACGTGGATTGGTGAAAG](SEQ ID NO9)Kx265’-ATTCGGCTATGACTGGGCACAAC(SEQ ID NO10)Kx275’-GTAAAGCACGAGGAAGCGGTCAG(SEQ ID NO11)。
对于证实的敲除株系，期望是来源于Kx24和Kx25引物的4.2kb的PCR片段，而对于野生型(没有敲除)的酵母株系，期望是4.9kb的PCR产物。对于证实的敲除株系，期望是来源于Kx24和Kx27引物的2.6kb的PCR产物，而期望来源于野生型(没有敲除)株系无PCR产物。对于证实的敲除株系，期望是来源于Kx25和Kx26引物的2.4kb的PCR产物，而期望来源于野生型(没有敲除)株系无PCR产物。
PCR检验后，在SC-ura平板上铺板候选酵母菌落以证实所用有助于整合的pPS416质粒的丢失。为了检测与Sst2蛋白质丢失互补的RGS4蛋白质的能力，用信息素应答晕圈测定法检测G418抗性的缺少ura(ura-minus)菌落对α因子刺激的应答(Dohlman等，1996)。在图1，2A和2B中描述了结果，该结果分别表示在两个酵母背景中的晕圈测定和剂量曲线。测试和证实的CY770Δsst(敲除的)酵母菌落之一命名为KY103(MATaleu2-3.112 ura3-52 trpl-901 his-200 ade2-101 gal4 gal80Lys2::GALuas-HIS3 cyhR，sst2，G418R)。类似地，酵母株系YPH499(美国典型培养物保藏中心，ATCC，Manassas，VA)缺失sst2基因，命名为KY113(MATa ura3-52 lys2-801a ade2-101o trpl-D63 his3-D200 leu2-Dl，sst2)。
用乙酸锂方法产生信息素应答酵母实验株系(Rose，等，1990)，并在质粒保留培养基上铺板。转化质粒Kp118(RGS表达质粒)和Kp27(FUS1-lacZ报道基因质粒)进入KY103中。
通过共转化缺少RGS编码序列的空表达质粒Kp46和报道基因质粒Kp131进入株系KY103中以产生酵母株系Ky116，和进入株系KY113中以产生株系KY118来制备对照酵母株系。
为了观察是否RGS4蛋白质干扰信息素诱导的β-半乳糖苷酶基因的转录，用α因子(25nM)处理具有RGS4构建体的酵母和具有空载体的对照酵母。RGS4在株系KY117中的表达脱敏信息素诱导的LacZ信号(未示出数据)。RGS4的表达也拯救了信息素诱导的生长停滞。
实施例2 FUS1-荧光素酶报道基因的RGS测定实施例1证实用期望骨架和与LacZ基因上游可操作连接的信息素应答FUS1启动子产生的质粒能用于研究RGS蛋白质的活性。在这个实验中，连接荧光素酶基因到FUS1启动子，而不是LacZ基因的下游。该荧光素酶系统比用LacZ报道基因的系统有一些优点，最明显的是增加的速度和监测基因表达的简易。
构建含有荧光素酶基因的FUS-1报道基因质粒(Kp120)。通过质粒pGL(Promega)的NcoI-XbaI消化以分离含有萤火虫荧光素酶基因的1.7kb片段，来构建FUS1-荧光素酶报道基因盒子。平末端化和纯化该片段。Kp27载体作为基础载体，其通过用BamHI-NotI消化(以除去LacZ基因)，去磷酸化，平末端处理和纯化该载体制备。连接制备的载体和荧光素酶片段以产生质粒Kp120。该克隆方案产生了来源于原始Kp27载体的预期的4个额外氨基酸残基(甲硫氨酸，丙氨酸，甘氨酸，丝氨酸)，这些氨基酸融合在框架中荧光素酶ORF的N末端。保留BamHI和NotI限制位点。用下面的引物，通过DNA测序证实质粒Kp120构建体Kx455’-ATATAAGCCATCAAGTTTCTG(SEQ ID NO12)；和Kx465’-CTCACTAAAGGGAACAAAAG(SEQ ID NO13)如实施例1所述制备编码RGS4蛋白质的质粒构建体和缺失内源RGS蛋白质(SST2)的酵母株系。
用乙酸锂方法产生信息素应答酵母实验株系(Rose，等，1990)，并在质粒保留培养基上铺板。转化质粒Kp118(RGS表达质粒)和Kp131(FUS1-luc报道基因质粒)进入酵母株系KY103中产生酵母株系KY115。Kp131来源于Kp120。简而言之，用KpnI和SacI限制酶从Kp120切割下FUS1荧光素酶报道基因盒子。凝胶纯化2.8kb片段，平末端处理并连接进入pRS416以产生Kp131。共转化Kp118和Kp131进入KY113以产生酵母株系KY117。
通过共转化空表达质粒Kp46和报道分子质粒Kp131进入KY103以产生酵母株系Ky116，和进入株系KY113以产生株系KY118，来制备对照酵母株系。
为了检测是否RGS4蛋白质干扰了信息素诱导的荧光素酶蛋白质的转录，用α因子(25nM)处理具有RGS4构建体的酵母和具有空载体的对照酵母。图3表示用基于KY113株系的KY117(RGS4)和KY118(对照)的结果。该图表示RGS4蛋白质可能与酵母Gα亚基(Gpalp)相互作用，引起了α因子诱导的荧光素酶信号降低。在缺少RGS4蛋白质的对照株系中观察到了强发光。相反，在表达RGS4蛋白质的酵母株系中观察到了弱发光。在从基础酵母株系KY103和KY113产生的酵母株系中观察到了信息素应答荧光素酶的活性。然而，基于KY113的酵母株系的应答稍微强一些(未示出数据)，因此这些株系更敏感。
这些发现与实施例1所阐述的发现相关联，其中在实施例1中我们监测了β-gal活性。在图4A和4B中示出了荧光素酶系统的剂量应答曲线，表明荧光素酶作为报道基因象lacZ一样起作用。此外，因为倍数的增加更高(未示出数据)，所以荧光素酶报道基因比β-半乳糖苷酶更敏感。
实施例3 FUS1荧光素酶报道分子的低拷贝形式作为前述FUS1荧光素酶报道基因构建体的2μm可选择形式，制备实施例2的低拷贝数(CEN)形式的荧光素酶构建体。通过用KpnI和SacIEN消化质粒Kp120以分离2.8kb含有FUS1启动子和荧光素酶基因报道分子盒子的片段，来产生信息素途径应答FUS1荧光素酶报道基因的CEN形式。分别用KpnI和SacI消化质粒pRS414和pRS416(Stragagene)，凝胶纯化。进行标准连接以产生两个另外的FUS1荧光素酶重组质粒；Kp133(TRP1标记的)和Kp135/Kp131*(URA3标记的)。通过标准方法进行细菌转化和产生质粒DNAs。通过DNA测序证实质粒。质粒Kp131*代表Kp135的类似构建体，但是其是用不同的克隆策略独立产生的。
在信息素应答测定中检测报道基因的CEN形式。发现这些形式在信息素应答测定中起作用，而且提供了适合的信噪比(未示出数据)。
实施例4引入可选的报道基因可以在该系统应用各种报道基因。可以用在本发明中的示例性报道基因是报道基因，如来源于除了萤火虫以外物种的荧光素酶基因，绿色荧光蛋白质基因，或CAT。例如海肾荧光素酶基因的报道分子可以用做萤火虫荧光素酶报道分子的替代。为了构建它们，克隆编码海肾荧光素酶的开放可读框架进入实施例1或2所述的信息素应答报道分子质粒以产生FUS1-RenLuc。通过与所述萤火虫报道基因类似的方法产生高(2微米)和低(CEN)拷贝数质粒。
实施例5 RGS测定单点药物筛选上述证实的株系用于小分子的鉴定，所述小分子调节共表达的哺乳动物RGS蛋白质的活性。图5表示筛选示意图。用具有RGS表达质粒的酵母株系和对照株系检测调节RGS4功能的小分子，引起了荧光素酶活性的增加。以分子模型化为基础，在单点测定中检测实验化学试剂库中子集分子。在实验(RGS4)株系中显示了比在对照株系中增加的荧光素酶活性的化合物是“阳性”，而且认为是用于进一步研究的感兴趣的候选物。
具体地，接种含有RGS表达质粒(KY117)或对照骨架载体(株系KY118)的酵母株系到适合培养基中(SC-leu-trp)，在30℃，温育过夜。通过OD600测定这些新鲜酵母培养物的细胞密度，在适合的生长培养基(SC-leu-trp)中稀释细胞到OD600为0.05。接种150μl细胞悬浮液到96孔微滴定板的孔中，利用复制器转移约1μl贮存实验化合物(10mg/ml)到每个孔中。
在30℃，温育实验化合物与细胞3小时。然后用配体刺激细胞(10μl终浓度20nM的α因子(200nM的10X母液))刺激细胞。短暂地振荡平板，在30℃温育2小时。向每个孔加入100μl LucLite底物(Packard)，密封板，室温，黑暗中振荡1小时。用Top Count(Packard)测定发光2秒。
图6表示的是96种化合物的单剂量测定结果。向两个酵母株系RGS4株系(图6A)和对照载体株系(图6B)加入每种化合物。计算发光差异(倍数)为每秒计数(RGS)/每秒计数(载体)(图6C)。认为发光比平均值倍增的化合物是作为RGS阻断剂的候选物。
实施例6潜在药物的RGS测定剂量的应答测定然后在剂量应答测定中，检测引起实验株系中荧光素酶活性比单点测定法中对照株系所观察的荧光素酶活性增加约50％的化合物。
在适合培养基(SC-leu-trp)中接种含有RGS表达质粒(KY117)的酵母株系和含有骨架载体(KY118)的对照酵母株系，在30℃温育过夜。通过OD600测定新鲜酵母培养物的细胞密度，在适合的生长培养基(SC-LT)中稀释细胞到OD600为0.05。分配等量份的150μl悬浮细胞到96孔微滴定板的A排。加DMSO到剩余酵母细胞至终浓度为3％，接种100μl细胞到96孔板的剩余孔中。向A排中细胞加实验化合物(4.5μl)，产生900μM的终浓度，混合，从A排移出50μl到B排中，混合孔。随后从B排移出50μl到C排中等等直到G排，以在96孔板一列内产生系列稀释。这样，用含有3％DMSO的所有孔设置了8点剂量应答曲线。
在30℃，温育细胞和实验化合物4小时，然后加10μl配体(α因子，200nM的10X母液)到20nM的终浓度。短暂地振荡平板，在30℃温育2小时。向每个孔加入100μl LucLite底物，密封板，室温，黑暗中振荡1小时。用Top Count(Packard)测定发光2秒。图7A-D表示4种实验化合物的结果。证明了化合物SBQ8/B1具有很大地影响RGS4功能的能力。
实施例7通过添加哺乳动物RGS蛋白质的功能互补以前，证实哺乳动物RGS4能互补SST2p，以使酿酒酵母从不引起生产性交配的α因子刺激恢复。RGS蛋白质加速了酵母Gα蛋白质，Gpal的内源GTPase活性。以前的数据仅仅支持RGS4具有功能上置换SST2的能力。为了研究利用信息素应答途径检测哺乳动物RGS蛋白质功能的全面用途，在含有前述信息素应答荧光素酶报道基因(FUS1-luc)的sst2敲出株系中也表达RGSZ1和RGSZ2。
总的克隆亚克隆编码各种哺乳动物RGSZ1和RGSZ2蛋白质的cDNA到载体p426-TEF(ATCC#87669)中。该载体[6359 bp，URA3，2mu-ori，TEFp-CYC1t，REP3，AmpR]含有酿酒酵母延伸因子1-α启动子(该序列参见Genbank的YSCEF1AB)，表明该启动子比ADH启动子强5倍(Mumberg等，Gene，156119)。用聚合酶链式反应，限制性消化，连接和转化进入DH5α大肠杆菌细胞的标准方法产生指定cDNA插入物。用Qiagen制剂制备DNA，通过限制消化和DNA测序证实DNA。由此产生的构建体在5’-末端接头位点测序。测序引物是Kx655’-TCAGTTTCATTTTTCTTGTTCTAT(SEQ.ID.NO14)该引物与TEF启动子区域杂交。
人RGSZ1用26bp含有内含BAM HI限制位点的5’正向寡核苷酸引物5’-GCggatccATGGGATCAGAGCGGATG(SEQ.ID.NO15)和27bp含有内含ClaI限制位点和终止密码子的3’反向寡核苷酸引物
5’-CGatcgattaCTATGCTTCAATAGATT(SEQ.ID.NO16)制备RGSZ1的cDNA。
用前述RGSZ1-pACT重组载体作为模板，在标准PCR反应中利用这些引物。获得编码全长RGSZ1(Genbank AF079479)的650bp片段，其含有内源起始和终止密码子。凝胶纯化PCR产物，用BamHI和ClaI限制酶消化，连接到制备的p426TEF的BamHI和ClaI位点。用单独HincII，单独SphI，或SalI+SphI限制消化分析，证实cDNA插入的方向。由此产生的质粒，pTEF426-RGSZ1命名为Kp140(作为pKHY55也是已知的)和Kp141(作为pKHY56也是已知的)。
人RGS2用21bp具有内含NotI位点的正向5’寡核苷酸引物5’-CCAGCGGGAGAACGATAATGC(SEQ.ID.NO17)和19bp具有内含BamHI位点的3’反向寡核苷酸引物5’-CCCCTCAGGAAAAGAATG(SEQ.ID.NO18)通过从人整个大脑文库中PCR扩增获得人RGS2 cDNA(Genbank NM002923)。
在pCRII载体(Invitrogen)中连接705bp的PCR产物，以产生pKHY146(hRGS2-pCRII)。根据销售商说明，转化pKHY146进入细菌细胞，制备质粒DNA和证实序列。用NotI和BamHI从pKHY146切割hRGS2 cDNA，亚克隆到制备的pcDNA3.1(Invitrogen)的NotI和BamHI位点。由此得到的重组质粒(hRGS2-pcDNA3.1)命名为pKHY150。用PmeI消化pKHY150，并且分离650bp的片段，凝胶纯化，用平末端连接到制备的p426TEF的SamI位点，以产生重组质粒hRGS2-pTEF426和两个由此产生的(同胞)重组质粒，命名为Kp138(作为pKHY53也是已知的)和Kp139(作为pKHY54也是已知的)。用PstI或HindIII，通过限制消化分析检测hRGS2 cDNA插入的方向。
株系的产生转化这些RGS构建体到酵母KY113中；也共转化FUS1-荧光素酶报道分子(Kp120)到KY113中。由此产生的酵母株系命名如下
表1

从每个酵母转化中挑选3个菌落，并在SC-Ura-Trp平板上划线。在信息素应答测定中检测3个菌落中的2个(如前述)以测定荧光素酶报道基因的活性。简而言之，在30℃，用浓度为25或225ng的α因子刺激100μl 0.1 OD600的过夜培养物2小时。也对相同的培养物进行信息素应答的晕圈测定(如前述)。用每个斑点25或250ng浓度的α因子刺激SC-Ura-Trp琼脂平板上的细胞坪苔(cell lawn，制备于0.3 OD600培养物)。在30℃，温育平板约40个小时，然后观察晕圈形成。
结果图8描绘了晕圈测定的结果，图9A和9B描绘了荧光素酶报道分子测定的结果。表达RGSZ1的酵母株系比表达空载体的酵母株系证明显示小的晕圈和降低的发光，因此表明酵母中sst的互补。对这些株系进行了其它剂量应答曲线和更详细的晕圈测定(每个斑点α因子浓度为431、48、5.3或0.6ng，或每个斑点α因子浓度为431、144、48或16ng)。RGSZ1表达株系的应答没有前面观察到的表达RGS4株系的应答强。这表明RGSZ1显示了用RGS4观察到应答的33％(当与其对照载体比较时，1/8对1/27倍)。
表达RGS2的酵母株系显示了比仅表达载体株系所观察到晕圈稍微小的晕圈。然而，表达RGS2的株系与对照株系相比，显示了降低的发光(尤其在62nM时)，这表明了sst2的功能互补。
人RGS7用20个碱基具有内含NotI位点的正向寡核苷酸引物，5’-CTTGGCGGAGGAGGGCACAC(SEQ ID NO19)和具有内含BamHI位点的反向22个碱基寡核苷酸引物
5’-TGGAGGCATTGAGACGGAAGA(SEQ ID NO20)从人大脑cDNA文库(Clontech)，通过PCR扩增获得全长人RGS7(Genbank AF090116)。
用适合的酶限制消化由此产生的1698bp的PCR产物，并连接到pcDNA3.1的NotI和BamHI位点。由此产生的重组载体(hRGS7-pcDNA3.1)命名为pKHY126，通过限制消化和序列分析证实。用PmeI消化pKHY126，并且分离1.5kb的片段，凝胶纯化，用平末端连接到p426TEF的SamI位点。用XbaI，HindIII，或ClaI和SacI，通过限制消化检测hRGS7 cDNA插入的方向。证实的hRGS7-pTEF426质粒的两个同胞分离物命名为Kp144(作为pKHY59是已知的)和Kp145(作为pKHY60是已知的)。
产生了编码Gγ样(“GGL”)结构域到蛋白质末端的第二个hRGS7克隆。用含有内含BamHI位点和起始密码子的27个碱基正向寡核苷酸引物5’-GCGGATCCATGAAACCTCCAACAGAAG(SEQ ID NO21)和含有内含ClaI位点和外源终止子的26个碱基反向寡核苷酸引物5’-CGATCGATTATTAGTAAGACTGAGCA(SEQ ID NO22)及pKHY126作模板，通过PCR产生该GGL-hRGS7 cDNA。由此产生的PCR产物660bp，编码氨基酸序列KPPT到末端氨基酸。用适合的酶消化650bp的PCR产物，分离，凝胶纯化和定向连接到制备的p426TEF载体(ATCC)的BamHI和ClaI位点。通过用NcoI和XhoI，单独XbaI，或ClaI和NcoI限制消化证实重组质粒。该重组质粒(GGL-hRGS7-p426TEF)的两个同胞分离物命名为Kp142(作为pKHY57也是已知的)和Kp143(作为pKHY58也是已知的)。
人RGS9用40个碱基具有内含HindIII位点的正向寡核苷酸引物，5’-GCAAGCTTCCACCATGACAATCCGACACCAAGGCCAGCAG(SEQ ID NO23)和具有内含XbaI位点的39个碱基反向寡核苷酸引物5’-GCTCTAGATTACAGGCTCTCCCAGGGGCAGATGACC(SEQ ID NO24)从人大脑cDNA文库(Clontech)，通过PCR扩增获得全长人RGS9(Genbank AF071476)。
用适合的酶限制消化由此产生的2.0kb的PCR产物，连接到pWE3的HindIII和XbaI位点，以产生重组载体hRGS9-pWE3。通过限制消化和序列分析证实构建体。用标准PCR方法，用hRGS9-pWE3作模板和含有内含BamHI位点的正向寡核苷酸引物5’-CCGGATCCAGATGACAATCCGACACCAAGGCCAGC(SEQ ID NO25)和含有内含XhoI位点的反向寡核苷酸引物5’-CGCTCGAGTTACAGGCTCTCCCAGGGGCAGATGACC(SEQ ID NO26)以产生2.0kb的片段。用BamHI和XhoI消化hRGS9 PCR产物，纯化和定向连接到制备的pACT2的BamHI和XhoI位点以产生质粒pACT-hRGS9，通过序列分析证实。用BamHI和XhoI限制酶，从pACT-hRGS9切割编码含有内源起始和终止密码子的全长hRGS9的cDNA以获得2.0kb片段。分离2.0kb的片段，凝胶纯化，定向连接到制备的载体p426TEF的BamHI和XhoI位点。通过用BamHI和SphI限制消化证实由此产生的重组质粒(hRGS9-TEF426)，命名为Kp148(作为pKHY63也是已知的)和Kp149(作为pKHY62也是已知的)。
产生了编码Gγ样(GGL)结构域到蛋白质末端的第二个hRGS9克隆。用含有内含BamHI位点和起始密码子的28个碱基正向寡核苷酸引物5’-GCGGATCCATGAAGAAACAAACAGTCGT(SEQ ID NO27)和含有内含ClaI位点和外源终止子的26个碱基反向寡核苷酸引物5’-CGATCGAATTATTACAGGCTCTCCCAG(SEQ ID NO28)及Kp148作模板，通过PCR产生该GGL-hRGS9 cDNA。
由此产生的PCR产物是1.4kb片段。克隆策略同用于GGL-RGS7所述的类似，因此用适合的酶消化1400bp的PCR产物，分离，凝胶纯化和定向连接到制备的p426TEF载体(ATCC)的BamHI和ClaI位点。通过用单独SacI，单独EcoRI，单独SalI，或BamHI和SphI限制消化证实方向而证实重组质粒。该重组质粒(GGL-hRGS9-p426TEF)的两个同胞分离物命名为Kp146(作为pKHY61也是已知的)和Kp147(作为pKHY62也是已知的)。
株系的产生转化上面的RGS构建体到酵母KY113中；也共转化FUS1-荧光素酶报道分子(Kp120)到该酵母株系中。由此产生的酵母株系命名如下表2

从每个酵母转化中挑选3个菌落，在SC-Ura-Trp平板上划线。检测3个菌落中的2个的信息素应答测定(如前述)以测定荧光素酶报道基因的活性。简而言之，在30℃，用浓度为25或225ng的α因子刺激100μl 0.1OD600的过夜培养物2小时。也对相同的培养物进行信息素应答的晕圈测定(如前述)。用每个斑点50或250ng浓度的α因子刺激SC-Ura-Trp平板上的细胞坪苔(制备于0.3 OD600培养物)。在30℃，温育平板约40个小时，然后观察晕圈形成。
结果图9A-D描绘了荧光素酶报道基因测定的结果。图8描绘了晕圈测定结果。表达RGSZ1的酵母株系比表达空载体的酵母株系证明显示小的晕圈和降低的发光，表明酵母中sst2的互补。对这些株系进行了其它剂量应答曲线和更详细的晕圈测定(每个斑点α因子浓度为431，48，5.3或0.6ng，或每个斑点α因子浓度为431，144，48，或16ng)。RGSZ1表达株系的应答没有前面观察到的表达RGS4株系的应答强。这表明RGSZ1显示了用RGS4观察到应答的33％(当与其对照载体比较时，1/8对1/27倍)。
表达RGS2的酵母株系显示了比仅表达载体株系所观察到晕圈稍微小的晕圈。然而，表达RGS2的株系与对照株系相比，显示了降低的发光(尤其在62nM时)，这表明了sst的功能互补。表达RGS7全长或GGL+RGS C-末端的酵母株系显示了与阴性对照株系相似的晕圈和发光，表明这种形式RGS不容易提供sst2的功能互补。表达RGS9全长或GGL+RGS C-末端的酵母株系显示了与阴性对照株系相似的晕圈。然而，表达全长RGS9株系与阴性对照株系相比，存在一些降低发光的迹象。
实施例8人Gβ5的共表达RGS7和RGS9是较长的RGS蛋白质，分别是469和673个氨基酸，而且与RGS6和RGS11一起属于RGS蛋白质家族的一个亚类，其包含DEP结构域，和结合Gβ5的高度保守的GGL结构域(Snow等，1999)。RGS7和RGS9在GGL结构域内显示了高水平的同源性。RGS6和RGS7在DEP结构域中有80％的同源性，而RGS7和RGS9仅有50％同源性。在RGS领域目前的研究表明该含有GGL-结构域的RGS蛋白质亚类起功能上类似作用。然而，我们的发现表明这些和其它亚类RGS蛋白质的潜在成员可以不显示相同的功能性。已证明GGL结构域结合异源三聚体G蛋白质的Gβ5，表明GGL-RGS/Gβ5相互作用可能对于两种蛋白质的正确折叠是重要的，而且是功能相关的。Gβ5是Gβ蛋白质最明显的同种型，在大脑中高度表达。在Gβ5和酵母Gβ(STE4)间的同源性＜40％。因此，我们在酵母中共表达了人Gβ5和RGS7或RGS9(或RGS4作为对照)，以检测是否人Gβ5将能实现含有GGL-结构域的RGS蛋白质对sst2的功能互补。
用39个碱基含有内含HindIII位点的正向寡核苷酸引物5’-GCCCAAGCTTCCGCCAGCCATGGCAACCGAGGGGCTGCA(SEQ ID NO29)和24个碱基含有内含XhoI位点的反向寡核苷酸引物5’-CCGCTCGAGTTAGGCCCAGACTCT(SEQ ID NO30)及hGβ5重组载体作模板，通过PCR，获得编码人Gβ5的cDNA(Liang等，2000)。用HindIII和XhoI消化hGβ5的PCR产物，凝胶纯化，及连接到HindIII和XhoI消化的p425TEF。通过序列分析证实由此得到的重组载体，命名为hGβ5-p425TEF。共转化该载体与FUS1-荧光素酶报道分子质粒(Kp120)，和前述编码RGS2、RGS4、RGS7、RGS9和RGSZ1的重组质粒或空质粒载体进入酵母株系KY113中。在下表中概括了由此产生的含有质粒联合的酵母株系。
表3

如前述，在信息素应答晕圈测定和荧光素报道分子测定中检测这些株系。图10描绘了晕圈测定的RGS7的结果，图11是RGS9的结果。作为对照，我们检测hGβ5对RGS4互补sst2能力的影响。RGS4是206个氨基酸的短RGS蛋白质，不含有GGL结构域。共表达hGβ5和RGS4株系与表达RGS4和空对照载体.0结构域，所以能够预测Gβ5共表达将类似地影响这些RGS蛋白质。然而，hGβ5和RGS9的共表达对RGS7没有影响，因为晕圈与载体对照株系类似。然而，hGβ5的共表达与载体对照株系相比，引起了晕圈大小的增加(而不是通过RGS表达出现的降低)。hGβ5单独的表达没有影响，与仅有对照的载体类似。这是意外的结果，表明尽管RGS7和RGS9结构域的相似性，但实际上两个RGS蛋白质可以是功能不相同。
实施例9嵌合RGS蛋白质为了进一步研究测定的用途，检测了多个嵌合RGS蛋白质。具体的RGS嵌合蛋白质如下所述，但是总的说来，我们研究了N-末端和C-末端RGS蛋白质联合，或已证明互补sst2敲除的RGS蛋白质(例如RGS4)N-末端区域的添加对不同但全长RGS蛋白质的作用。
用在嵌合基因构建中的克隆策略1.RGS4N/RGS7C用大鼠RGS4的cDNA作模板，通过PCR获得编码RGS4氨基酸1-57的171bp RGS4 N-末端区。正向引物含有内含BamHI位点chiRgs4 Nterm 5’-CGCGGATCCATGTGCAAAGGGCTTGCA(SEQ ID NO31)而反向引物含有内含SmaI位点chiRgs4r Nterm 5’-TCCCCCGGGCTTGACTTCCTCTTGGCT(SEQ ID NO32)RGS7 C-末端区域起始于全长人RGS7的GGL结构域直到最后一个氨基酸，对其进行扩增以产生编码RGS7氨基酸255-470的645bp产物。正向引物含有内含SamI位点chiRgs7 Cterm 5’-TCCCCCGGGGATGAGTTACAACAACAG(SEQ ID NO33)反向引物含有内含ClaI位点chiRgs7r Cterm 5’-CCCATCGATTTAGTAAGACTGAGC(SEQ ID NO34)凝胶纯化两个PCR产物，用SmaI切割，连接。然后用连接混合物作为模板以产生816bp的全长嵌合PCR产物。用在PCR反应中的正向引物是chiRgs4 Nterm(SEQ ID NO31)和反向引物chiRgs7r Cterm(SEQ ID NO34)。凝胶纯化得到的嵌合基因，再次扩增，用适合的限制性酶切割，克隆进入载体p426TEF的BamHI和ClaI位点，其编码N-末端HA标签。
2.RGS7N/RGS4CRGS7的N-末端区域包含RGS7的GGL结构域，用人RGS7 cDNA作模板，扩增以产生996bp编码1-332氨基酸的PCR产物。正向引物含有内含BamHI位点chiRgs7 Nterm 5’-CGCGGATCCATGGCCCAGGGGAAT(SEQ ID NO35)而反向引物含有内含SmaI位点chiRgs7r Nterm 5’-TCCCCCGGGAAAACCCCATCGTTT(SEQ ID NO36)RGS4C区域仅含有RGS4核心结构域，用RGS4 cDNA作为模板，扩增以产生447bp编码58-206氨基酸的PCR产物。正向引物含有内含SmaI位点chiRgs4 Cterm 5’-TCCCCCGGGAAATGGGCTGAATCACTG(SEQ ID No37)
反向引物含有内含ClaI位点chiRgs4r Cterm 5’-CCCATCGATTTAGGCACACTGAGGGAC(SEQ ID NO38)凝胶纯化两个PCR产物，用SmaI切割，连接。然后用连接混合物作为模板用于1443bp嵌合基因产物的PCR扩增。所用引物如上所述。正向引物是chiRgs7 Nterm(SEQ ID NO35)，而反向引物是chiRgs4r Cterm(SEQ ID NO38)。凝胶纯化得到的嵌合基因，再次扩增，用适合的限制性酶切割，克隆进入载体p426TEF的BamHI和ClaI位点，其编码N-末端HA标签。
3.RGS4N/RGS10(全长)RGS4区域与上述RGS4N/RGS7C嵌合体所述RGS4区域相同。
用SmaI和XhoI，通过限制消化从p426-RGS10获得用于该嵌合体的RGS10(全长)。用人RGS10的cDNA(Genbank no.XM_049797)作模板，通过PCR扩增构建质粒p426-RGS10。正向引物含有内含HindIII位点RGS10 fwd 5’-CCCAAGCTTATGGAACACATCCACGACAGC(SEQ ID NO39)反向引物含有内含XhoI位点RGS10 rev5’-CCGCTCGAGTCATGTGTTATAAATTCTGGA(SEQ ID NO40)凝胶纯化504bp编码全长RGS10的PCR产物，并克隆进入p426TEF的HindIII和XhoI位点。
如上所述，用SmaI切割上述RGS4 N-末端区域PGR产物，与凝胶纯化的RGS10的SmaI和XhoI限制性片段连接。用连接混合物作为PCR模板以获得嵌合RGS4/RGS10。所用正向引物是chiRgs4r Nterm(SEQ ID NO32)，而反向引物是RGS10 rev(SEQ ID NO40)，两者如上所述。凝胶纯化得到的嵌合基因，再次扩增，克隆进入载体p426TEF的BamHI和XhoI位点，其编码N-末端HA标签。
4.RGS4N/RGS7全长如上所述，获得RGS4的N-末端区域。用克隆的人RGS7作模板扩增全长RGS7的cDNA以产生1410bp编码1-470氨基酸的PCR产物。正向引物含有内含SmaI位点RGS7N fwd 5’-TCCCCCGGGATGGCCCAGGGGAAT(SEQ ID NO41)
反向引物含有内含ClaI位点Rgs7r Cterm 5’-CCCATCGATTTAGTAAGACTGAGC(SEQ ID NO42)凝胶纯化两个PCR产物，用SmaI切割，连接。然后用连接混合物作为PCR模板以获得RGS4N/RGS7全长嵌合基因。正向引物是chiRgs4 Nterm(SEQ ID NO31)，反向引物是Rgs7r Cterm(SEQ ID NO42))。凝胶纯化得到的嵌合基因，再次扩增和克隆进入载体p426TEF的BamHI和ClaI位点，其编码N-末端HA标签。
5.RGS4N/RGS9C构建两个不同RGS4N/RGS9C嵌合体，其中一个在RGS9的C-末端区域含有GGL结构域，而另一个在RGS9的C-末端区域内不含有GGL结构域。
5a.RGS4N/RGS9C(减去GGL结构域)如前述，通过PCR扩增RGS4的N-末端区域，用BamHI和HindIII消化，凝胶纯化。
用人RGS9的cDNA作模板扩增RGS9的C-末端区域(减去GGL结构域)，以获得1125bp编码302-675氨基酸的产物。正向引物含有内含HindIII位点RGS9RGS fwd(减去GGL结构域)5’-CCCAAGCTTATGAACTTCAGCGAA(SEQID NO43)反向引物含有内含的XhoI位点RGS9RGS rev 5’-CCGCTCGAGTTACAGGCTCTCCCA(SEQ ID NO44)纯化RGS9C(减去GGL结构域)的PCR产物，用HindIII和XhoI切割，并克隆进入载体p426TEF的HindIII和XhoI位点。用BamHI和HindIII消化得到的质粒，用BamHI和HindIII连接RGS4的N-末端片段以产生减去GGL结构域的RGS4N/RGS9C嵌合质粒。
5b.RGS4N/RGS9C(加上GGL结构域)用RGS9的cDNA作模板，扩增包含GGL结构域片段的RGS9的C-末端区域，以产生1356bp编码人RGS9的223-675氨基酸的PCR产物。正向引物，RGS9chi Cterm HindIII fwd(加上GGL结构域)含有内含的HindII位点
5’-CCCAAGCTTGCTGTCAAAAAAGAGATC(SEQ ID NO45)反向引物含有内含的XhoI位点RGS9RGS rev 5’-CCGCTCGAGTTACAGGCTCTCCCA(SEQ ID NO46)。
用HindII和XhoI切割RGS4N/RGS9C(减去GGL结构域)嵌合质粒(上述)，凝胶纯化含有RGS4N的载体的cDNA带。然后连接载体-RGS4N cDNA到HindIII和XhoI RGS9C(加上GGL)制备的PCR产物以产生RGS4N/RGS9C加上GGL结构域的嵌合质粒。
6.RGS4N/axinPCR扩增存在于人axin中的RGS结构域以产生441bp编码199-345氨基酸的片段。正向引物，AxinSmaI fwd，含有内含SmaI位点5’-TCCCCCGGGGGCAGTGCCTCCCCCACCCCACCAT(SEQ ID NO47)反向引物，AxinXhoI rev，含有内含XhoI位点5’-CCGCTCGAGTTAGACTTTGGGGCTCTCCGA(SEQ ID NO48)用SmaI和XhoI切割含有RGS4N/RGS7C嵌合体的p426TEF质粒以除去RGS7C片段，然后凝胶纯化。然后载体-RGS4 DNA与编码axin基因RGS结构域的SmaI和XhoI片段连接以产生RGS4N/Axin嵌合质粒。
7.RGS11用cDNA(GenBank no.NM_003834)作模板，扩增人RGS11以产生1341bp编码1-447氨基酸的PCR产物。正向引物包含内含EcoRI位点RGS11 fwd 5’-CCGGAATTCATGGCCGCCGGCCCCGCGCCG(SEQ ID NO49)反向引物包含内含的HindIII位点RGS11 rev 5’-CCCAAGCTTCTAGGCCACCCCATCTCCACC(SEQ ID NO50)用EcoRI和HindIII消化得到的PCR产物，亚克隆进入p426TEF载体的类似位点。
8.RGS6从cDNA(GenBank no.AF156932)扩增人RGS6，以获得1419bp编码1-473氨基酸全长蛋白质的PCR产物。正向引物含有内含HindIII位点RGS6 fwd 5’-CCCAAGCTTATGGCTCAAGGATCCGGGGAT(SEQ ID NO51)反向引物包含内含XhoI位点RGS6 rev 5’-CCGCTCGAGTCAGGAGGACTGCATCAG(SEQ ID NO52)。
用HindIII和XhoI消化PCR产物，克隆进入p426TEF载体的类似位点。
株系的产生产生酵母株系以评估各种RGS嵌合蛋白质互补sst2敲除的能力。在人Gβ5存在和缺失的情况下，转化RGS嵌合质粒进入基础株系KY113中。所有株系含有对照或表达质粒和萤火虫荧光素酶报道基因以实现在相似介质条件下的研究。在下表中概括了株系表4

结果用信息素应答报道基因在信息素应答测定中，检测这些株系的功能互补。例如，在定量测定中利用荧光素酶报道基因。在信息素应答的定量测定中，在“晕圈测定”中也检测了株系对暴露于α因子2天的应答。
在剂量曲线测定中检测所有株系。对于基于荧光素酶的测定，检测的α因子剂量是0、100pmol、1nmol、10nmol、100nmol、1μmol、10μmol和100μmol。
如前述进行晕圈测定。为了比较大量的剂量应答曲线，测定应答为曲线内α因子的单剂量。然后测定应答为对不含有RGS和不含有Gβ5阴性对照株系的百分比应答。例如，将类似于含有空载体的sst2敲除株系的没有作用的构建体评分为100，而功能互补高的RGS蛋白质，例如RGS4，将评分为0。
我们实验了多个短的，即相对低分子量的RGS蛋白质。先前检测了RGS2和RGSz，尽管其不如RGS4有效，但是显示了一些互补sst2敲除表现型的能力。RGS10也是短的RGS蛋白质，然而当作为野生型蛋白质表达时，在荧光素酶或晕圈测定中，其没有显示互补作用。然而，RGS4/RGS10嵌合体恢复了RGS功能，达到非常接近单独RGS4表达所观察到的值。图12显示这些结果。
从这些数据中，RGS4是sst2敲除表现型互补作用中最有效的RGS蛋白质。RGS7是无功能的，而且通过缺失N-末端区域也没有很大程度的改进。图14显示这些数据。加RGS4N-1末端区域到RGS7 C-末端区域或加RGS4N-末端区域到全长RGS7蛋白质能实现一些水平的功能互补。而且，在晕圈测定中注意到了一些改进。
RGS9天然状态显示了互补sst2敲除表现型的中等能力。在缺失RGS9N-末端区域时，该互补作用无效。然而，加RGS4N-末端到RGS9-ggl的非功能性C-末端改进了互补作用，通过RGS9的ggl结构的除去进一步改进了互补作用。
此外，我们观察了RGS6(值是25)和RGS11(值是50)的一些中等互补作用，该中等互补作用不受Gβ5共表达的影响。
我们观察了表达RGS9株系的应答差异，其中野生型蛋白质有一些作用；而与Gβ5共表达常常观察到增强的信息素应答。通过Gβ5和其它含有GGL的RGS蛋白质，即RGS6，RGS7和RGA11的表达，没有观察到类似的作用。这些发现表明RGS9交替(alternate)的功能。
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因此，整体并入所有引用的出版物，专利和专利申请为参考文献。
尽管上述说明书和为示例性目提供的实施例教授了本发明的原理，但是从阅读该说明，本领域技术人员将理解在不背离本发明实质范围内可以进行各种形式和细节的变化。
序列表<110>WYETH公司<120>用于检测RGS蛋白质调节物的方法和细胞<130>P03US051823<150>US 60/250，147<151>2000-12-01<160>52<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>26<212>DNA<213>黑家鼠(Rattus rattus)<400>1gacgtctccc atgtgcaaag gactcg 26<210>2<211>37<212>DNA<213>黑家鼠(Rattus rattus)<400>2cgggatcctt attaggcaca ctgagggact agggaag 37<210>3<211>31<212>DNA<213>黑家鼠(Rattus rattus)<400>3gaggatccgg cacactgagg gactagggaa g 31<210>4<211>20<212>DNA<213>黑家鼠(Rattus rattus)<400>4tttttacaga tcatcaagga 20<210>5<211>20<212>DNA<213>黑家鼠(Rattus rattus)<400>5tgcgtcttca gagcgctttt20<210>6<211>23<212>DNA<213>黑家鼠(Rattus rattus)<400>6gagccaagaa gaagtcaaga aat23<210>7<211>19<212>DNA<213>黑家鼠(Rattus rattus)<400>7tgggcttcat caaaacagg 19<210>8<211>21<212>DNA<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)<400>8tatcgagtca atggggcagg c 21<210>9<211>21<212>DNA<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)<400>9cgaaacgtgg attggtgaaa g 21<210>10<211>23<212>DNA<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)<400>10attcggctat gactgggcac aac23<210>11<211>23<212>DNA<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)<400>11gtaaagcacg aggaagcggt cag23<210>12<211>21<212>DNA<213>北美萤火虫(Photinus pyralis)<400>12atataagcca tcaagtttct g 21<210>13<211>20<212>DNA<213>北美萤火虫(Photinus pyralis)<400>13ctcactaaag ggaacaaaag20<210>14<211>24<212>DNA<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)<400>14tcagtttcat ttttcttgtt ctat 24<210>15<211>24<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>15ggatccatgg gatcagagcg gatg 24<210>16<211>27<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>16cgatcgatta ctatgcttca atagatt27<210>17<211>21<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>17ccagcgggag aacgataatg c 21<210>18<211>18<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>18cccctcagga aaagaatg 18<210>19<211>20<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>19cttggcggag gagggcacac20<210>20<211>21<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>20tggaggcatt gagacggaag a 21<210>21<211>27<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>21gcggatccat gaaacctcca acagaag27<210>22<211>26<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>22cgatcgatta ttagtaagac tgagca 26<210>23<211>40<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>23gcaagcttcc accatgacaa tccgacacca aggccagcag 40<210>24<211>36<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>24gctctagatt acaggctctc ccaggggcag atgacc 36<210>25<211>35<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>25ccggatccag atgacaatcc gacaccaagg ccagc 35<210>26<211>36<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>26cgctcgagtt acaggctctc ccaggggcag atgacc 36<210>27<211>28<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>27gcggatccat gaagaaacaa acagtcgt 28<210>28<211>27<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>28cgatcgaatt attacaggct ctcccag27<210>29<211>39<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>29gcccaagctt ccgccagcca tggcaaccga ggggctgca 39<210>30<211>24<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>30ccgctcgagt taggcccaga ctct 24<210>31<211>27<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>31cgcggatcca tgtgcaaagg gcttgca27<210>32<211>27<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>32tcccccgggc ttgacttcct cttggct27<210>33<211>27<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>33tcccccgggg atgagttaca acaacag27<210>34<211>24<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>34cccatcgatt tagtaagact gagc 24<210>35<211>24<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>35cgcggatcca tggcccaggg gaat 24<210>36<211>24<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>36tcccccggga aaaccccatc gttt 24<210>37<211>27<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>37tcccccggga aatgggctga atcactg27<210>38<211>27<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>38cccatcgatt taggcacact gagggac27<210>39<211>30<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>39cccaagctta tggaacacat ccacgacagc 30<210>40<211>30<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>40ccgctcgagt catgtgttat aaattctgga 30<210>41<211>24<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>41tcccccggga tggcccaggg gaat 24<210>42<211>24<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>42cccatcgatt tagtaagact gagc 24<210>43<211>24<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>43cccaagctta tgaacttcag cgaa 24<210>44<211>24<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>44ccgctcgagt tacaggctct ccca 24<210>45<211>27<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>45cccaagcttg ctgtcaaaaa agagatc27<210>46<211>24<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>46ccgctcgagt tacaggctct ccca 24<210>47<211>34<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>47tcccccgggg gcagtgcctc ccccacccca ccat34<210>48<211>30<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>48ccgctcgagt tagactttgg ggctctccga 30<210>49<211>30<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>49ccggaattca tggccgccgg ccccgcgccg 30<210>50<211>30<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>50cccaagcttc taggccaccc catctccacc 30<210>51<211>30<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>51cccaagctta tggctcaagg atccggggat 30<210>52<211>27<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>52ccgctcgagt caggaggact gcatcag2权利要求
1.一种对信息素应答的细胞，该细胞包含与信息素应答启动子可操作地连接的编码报道分子的异源核酸，其中报道分子是海肾荧光素酶(Renilla luciferase)，虫荧光素酶(Photinus luciferase)，绿色荧光蛋白质，或绿色荧光蛋白质的衍生物。
2.如权利要求1的所述细胞，该细胞是哺乳动物细胞或酵母细胞。
3.如权利要求2的所述细胞，该细胞是酵母细胞。
4.如权利要求1的所述细胞，其中所述异源核酸在质粒中。
5.如权利要求1的所述细胞，其中所述异源核酸整合进入细胞基因组。
6.如权利要求1的所述细胞，其中所述的信息素应答启动子是LUC1、FUS1、FUS2、KAR3、FUS3、STE3、STE13、STE12、CHS1、FAR1、AGA1、AGA2、AGα1、GPA1、STE2、STE3、STE6、MFA1、MFA2、MFα1、MFα2、CIK1或BAR1。
7.如权利要求3所述的细胞，其中所述的酵母细胞是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)，或巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)。
8.如权利要求7所述的细胞，其中所述酵母细胞是酿酒酵母。
9.如权利要求1所述的细胞，该细胞还包含编码RGS蛋白质的异源核酸。
10.如权利要求9的所述细胞，其中所述的RGS蛋白质缺少GGL或DEP结构域。
11.如权利要求9的所述细胞，该细胞还包含编码与异源RGS蛋白质对应的天然RGS蛋白质的内源核酸，其中突变该内源核酸，使其不产生功能性天然RGS蛋白质。
12.如权利要求11的所述细胞，其中所述突变是缺失、插入或置换中的一种。
13.如权利要求9所述的细胞，其中所述的RGS蛋白质是RGSZ1、RGSZ2、Ret-RGS1、RGS1、RGS2、RGS3、RGS4、RGS5、RGS6、RGS7、RGS8、RGS9-1、RGS9-2、RGS10、RGS11、RGS12、RGS13、RGS14、RGS16、RGS-PX1、GAIP、Axin、Conductin、egl-10、eat-16、p115RhoGEF，和其同种型，或含有RGS-样(RGL)结构域的蛋白质。
14.如权利要求13所述的细胞，其中所述的RGS-样(RGL)结构域是PLCB或cGMP PDE的γ亚基。
15.如权利要求13所述的所述细胞，其中所述的RGS蛋白质是RGS2、RGS4、RGS6、RGS11或RGSZ。
16.如权利要求9所述的细胞，其中所述的RGS蛋白质是嵌合体。
17.如权利要求16所述的细胞，其中所述的嵌合体包含RGS4的N-末端和RGS7的C-末端，RGS7的N-末端和RGS4的C-末端，RGS4的N-末端和完整RGS10，RGS4的N-末端和完整RGS7，RGS4的N-末端和缺少GGL结构域的RGS9的C-末端，RGS4的N-末端和具有GGL结构域的RGS9的C-末端，RGS4的N-末端和axin的RGS结构域，或其部分。
18.如权利要求17所述的细胞，其中所述的RGS4的N-末端包含RGS4的氨基酸1-57。
19.如权利要求17所述的细胞，其中所述的RGS7的C-末端包含RGS7的氨基酸255-470。
20.如权利要求17所述的细胞，其中所述的RGS7的N-末端包含RGS7的氨基酸1-332。
21.如权利要求17所述的细胞，其中所述的RGS4的C-末端包含RGS4的氨基酸58-206。
22.如权利要求17所述的细胞，其中所述的axin RGS结构域包含axin的氨基酸199-345。
23.一种包含编码嵌合的RGS蛋白质的异源核酸的细胞。
24.如权利要求24所述的细胞，该细胞是哺乳动物细胞或酵母细胞。
25.如权利要求5所述的细胞，该细胞是酵母细胞。
26.如权利要求24所述的细胞，其中所述异源核酸在质粒中。
27.如权利要求24所述的细胞，其中所述异源核酸整合进入细胞的基因组。
28.如权利要求24所述的细胞，其中所述嵌合体包含RGS4的N-末端和RGS7的C-末端，RGS7的N-末端和RGS4的C-末端，RGS4的N-末端和完整RGS10，RGS4的N-末端和完整RGS7，RGS4的N-末端和缺少GGL结构域的RGS9的C-末端，RGS4的N-末端和具有GGL结构域的RGS9的C-末端，RGS4的N-末端和axin的RGS结构域。
29.如权利要求29所述的细胞，其中所述的RGS4的N-末端包含RGS4的氨基酸1-57。
30.如权利要求29所述的细胞，其中所述的RGS7的C-末端包含RGS7的氨基酸255-470。
31.如权利要求29所述的细胞，其中所述的RGS7的N-末端包含RGS7的氨基酸1-332。
32.如权利要求29所述的细胞，其中所述的RGS4的C-末端包含RGS4的氨基酸58-206。
33.如权利要求29所述的细胞，其中所述axin RGS结构域包含axin的氨基酸199-345。
34.一种编码嵌合的RGS蛋白质的分离核酸。
35.如权利要求35所述的分离核酸，其中所述嵌合体包含RGS4的N-末端和RGS7的C-末端，RGS7的N-末端和RGS4的C-末端，RGS4的N-末端和完整RGS10，RGS4的N-末端和完整RGS7，RGS4的N-末端和缺少GGL结构域的RGS9的C-末端，RGS4的N-末端和具有GGL结构域的RGS9的C-末端，RGS4的N-末端和axin的RGS结构域，或其部分。
36.如权利要求36所述的分离核酸，其中所述的RGS4的N-末端包含RGS4的氨基酸1-57。
37.如权利要求36所述的分离核酸，其中所述的RGS7的C-末端包含RGS7的氨基酸255-470。
38.如权利要求36所述的分离核酸，其中所述的RGS7的N-末端包含RGS7的氨基酸1-332。
39.如权利要求36所述的分离核酸，其中所述的R6S4的C-末端包含RGS4的氨基酸58-206。
40.如权利要求36所述的分离核酸，其中所述axin RGS结构域包含axin的氨基酸199-345。
41.一种包含有如权利要求35所述的分离核酸的载体。
42.如权利要求42的载体，该载体是质粒或病毒。
43.如权利要求43的载体，该载体是质粒。
44.如权利要求44的载体，其中所述的质粒是低拷贝数的质粒。
45.一种包含有如权利要求42所述的载体的细胞。
46.如权利要求9所述的细胞，该细胞还包含编码Gβ5的异源核酸。
47.如权利要求47所述的细胞，其中Gβ5是人Gβ5。
48.一种检测实验样品改变RGS蛋白质介导的报道基因表达能力的方法，该方法包括(a)提供至少一种对信息素应答的第一细胞，其中该第一细胞包含编码报道分子的异源核酸，该异源核酸可操作地与信息素应答启动子连接，其中异源核酸的表达产生可检测的信号；(b)提供至少一种对信息素应答的第二细胞，其中该第二细胞包含编码报道分子的异源核酸和编码RGS蛋白质的第二异源核酸，所述编码报道分子的异源核酸可操作地与信息素应答启动子连接，并且该异源核酸的表达产生可检测的信号；(b)在信息素存在的情况下和在适合检测可检测信号的条件下，将实验样品与第一或第二细胞一起温育；(c)检测编码报道分子的异源核酸表达的水平；和(d)比较第一细胞和第二细胞中的表达水平，其中表达水平的差异表明实验样品改变了RGS蛋白质介导的报道基因的表达。
49.如权利要求49所述的方法，其中以单一浓度使用实验样品。
50.如权利要求49所述的方法，其中在一个浓度范围内使用实验样品。
51.如权利要求49所述的方法，其中在晕圈测定中检测报道分子的表达水平。
52.如权利要求49所述的方法，其中用分光光度计测量检测报道分子的表达水平。
53.如权利要求53所述的方法，其中所述检测是自动化的。
54.如权利要求49所述的方法，其中所述的异源核酸编码海肾荧光素酶，虫荧光素酶，绿色荧光蛋白质，或绿色荧光蛋白质的衍生物。
55.如权利要求49所述的方法，其中所述的第一和第二细胞是哺乳动物细胞或酵母细胞。
56.如权利要求56所述的方法，其中所述的第一和第二细胞是酵母细胞。
57.如权利要求49所述的方法，其中所述的编码报道基因的异源核酸在质粒中。
58.如权利要求49所述的方法，其中所述的编码报道基因的异源核酸整合进入细胞的基因组。
59.如权利要求49所述的方法，其中所述的编码RGS蛋白质的第二异源核酸在质粒中。
60.如权利要求49所述的方法，其中所述的编码RGS蛋白质的第二异源核酸整合进入细胞的基因组。
61.如权利要求49所述的方法，其中所述的信息素应答启动子是LUC1、FUS1、FUS2、KAR3、FUS3、STE3、STE13、STE12、CHS1、FAR1、AGA1、AGA2、AGα1、GPA1、STE2、STE3、STE6、MFA1、MFA2、MFα1、MFα2、CIK1或BAR1。
62.如权利要求57所述的方法，其中所述的酵母细胞是酿酒酵母，裂殖酵母或巴斯德毕赤酵母。
63.如权利要求63所述的方法，其中所述的酵母细胞是酿酒酵母。
64.如权利要求49所述的方法，其中所述的RGS蛋白质缺少GGL或DEP结构域。
65.如权利要求49所述的方法，该方法还包括编码与异源RGS蛋白质对应的天然RGS蛋白质的内源核酸，其中突变该内源核酸，使其不产生功能的天然RGS蛋白质。
66.如权利要求66所述的方法，其中所述突变是缺失、插入或置换中的一种。
67.如权利要求49所述的方法，其中所述的RGS蛋白质是RGSZ1、RGSZ2、Ret-RGS1、RGS1、RGS2、RGS3、RGS4、RGS5、RGS6、RGS7、RGS8、RGS9-1、RGS9-2、RGS10、RGS11、RGS12、RGS13、RGS14、RGS16、RGS-PX1、GAIP、Axin、Conductin、egl-10、eat-16、p115RhoGEF，和其同种型，或含有RGS-样(RGL)结构域的蛋白质。
68.如权利要求68所述的方法，其中所述的RGS-样(RGL)结构域是PLCB或cGMP PDE的γ亚基。
69.如权利要求68所述的方法，其中所述的RGS蛋白质是RGS2、RGS4、RGS6、RGS11或RGSZ。
70.如权利要求49所述的方法，其中所述RGS蛋白质是嵌合体。
71.如权利要求71所述的方法，其中所述嵌合体包含RGS4的N-末端和RGS7的C-末端，RGS7的N-末端和RGS4的C-末端，RGS4的N-末端和完整RGS10，RGS4的N-末端和完整RGS7，RGS4的N-末端和缺少GGL结构域的RGS9的C-末端，RGS4的N-末端和具有GGL结构域的RGS9的C-末端，RGS4的N-末端和axin的RGS结构域，或其部分。
72.如权利要求72所述的方法，其中所述的RGS4的N-末端包含RGS4的氨基酸1-57。
73.如权利要求72所述的方法，其中所述的RGS7的C-末端包含RGS7的氨基酸255-470。
74.如权利要求72所述的方法，其中所述的RGS7的N-末端包含RGS7的氨基酸1-332。
75.如权利要求72所述的方法，其中所述的RGS4的C-末端包含RGS4的氨基酸58-206。
76.如权利要求72所述的方法，其中所述的axin RGS结构域包含axin的氨基酸199-345。
77.一种检测实验样品改变RGS蛋白质介导的报道基因表达能力的方法，该方法包括(a)提供至少两等量份对信息素应答的细胞，其中该细胞包含编码报道分子的异源核酸和编码RGS蛋白质的第二异源核酸，所述编码报道分子的异源核酸可操作地与信息素应答启动子连接，并且该异源核酸的表达产生可检测的信号；(b)在信息素存在情况下和在适合检测可检测信号条件下，温育的所述等量份细胞，其中一等量份含有实验样品；(c)检测等量份中编码报道分子的异源核酸的表达水平；和(d)比较等量份中报道分子的表达水平，其中等量份间表达水平的差异表明实验样品改变了RGS蛋白质介导的报道基因的表达。
78.如权利要求78所述的方法，其中以单一浓度使用实验样品。
79.如权利要求78所述的方法，其中在一个浓度范围内使用实验样品。
80.如权利要求78所述的方法，其中在晕圈测定中检测报道分子的表达水平。
81.如权利要求78所述的方法，其中用分光光度计测量检测报道分子的表达水平。
82.如权利要求82所述的方法，其中所述的检测是自动化的。
83.如权利要求78所述的方法，其中所述的异源核酸编码海肾荧光素酶，虫荧光素酶，绿色荧光蛋白质，或绿色荧光蛋白质的衍生物。
84.如权利要求78所述的方法，其中所述的细胞是哺乳动物细胞或酵母细胞。
85.如权利要求85所述的方法，其中所述的细胞是酵母细胞。
86.如权利要求78所述的方法，其中所述的编码报道基因的异源核酸在质粒中。
87.如权利要求78所述的方法，其中所述的编码报道基因的异源核酸整合进入细胞的基因组。
88.如权利要求78所述的方法，其中所述的编码RGS蛋白质的第二异源核酸在质粒中。
89.如权利要求78所述的方法，其中所述的编码RGS蛋白质的第二异源核酸整合进入细胞的基因组。
90.如权利要求78所述的方法，其中所述的信息素应答启动子是LUC1、FUS1、FUS2、KAR3、FUS3、STE3、STE13、STE12、CHS1、FAR1、AGA1、AGA2、AGα1、GPA1、STE2、STE3、STE6、MFA1、MFA2、MFα1、MFα2、CIK1或BAR1。
91.如权利要求86所述的方法，其中所述的酵母细胞是酿酒酵母，裂殖酵母或巴斯德毕赤酵母。
92.如权利要求92所述的方法，其中所述的酵母细胞是酿酒酵母。
93.如权利要求78所述的方法，其中所述的RGS蛋白质缺少GGL或DEP结构域。
94.如权利要求78所述的方法，该方法还包括编码与异源RGS蛋白质对应的天然RGS蛋白质的内源核酸，其中突变该内源核酸，使其不产生功能性天然RGS蛋白质。
95.如权利要求95所述的方法，其中所述的突变是缺失、插入或置换中的一种。
96.如权利要求78所述的方法，其中所述的RGS蛋白质是RGSZ1、RGSZ2、Ret-RGS1、RGS1、RGS2、RGS3、RGS4、RGS5、RGS6、RGS7、RGS8、RGS9-1、RGS9-2、RGS10、RGS11、RGS12、RGS13、RGS14、RGS16、RGS-PX1、GAIP、Axin、Conductin、egl-10、eat-16、p115RhoGEF，和其同种型，或含有RGS-样(RGL)结构域的蛋白质。
97.如权利要求97所述的方法，其中所述的RGS-样(RGL)结构域是PLCB或cGMP PDE的γ亚基。
98.如权利要求97所述的方法，其中所述的RGS蛋白质是RGS2、RGS4、RGS6、RGS11或RGSZ。
99.如权利要求78所述的方法，其中所述的RGS蛋白质是嵌合体。
100.如权利要求100所述的方法，其中所述的嵌合体包含RGS4的N-末端和RGS7的C-末端，RGS7的N-末端和RGS4的C-末端，RGS4的N-末端和完整RGS10，RGS4的N-末端和完整RGS7，RGS4的N-末端和缺少GGL结构域的RGS9的C-末端，RGS4的N-末端和具有GGL结构域的RGS9的C-末端，RGS4的N-末端和axin的RGS结构域，或其部分。
101.如权利要求101所述的方法，其中所述的RGS4的N-末端包含RGS4的氨基酸1-57。
102.如权利要求101所述的方法，其中所述的RGS7的C-末端包含RGS7的氨基酸255-470。
103.如权利要求101所述的方法，其中所述的RGS7的N-末端包含RGS7的氨基酸1-332。
104.如权利要求101所述的方法，其中所述的RGS4的C-末端包含RGS4的氨基酸58-206。
105.如权利要求101所述的方法，其中所述的axin RGS结构域包含axin的氨基酸199-345。
全文摘要
本申请描述了对信息素应答的新的细胞，其包含与信息素应答启动子可操作地连接的编码报道分子的异源核酸。所述细胞还可以进一步包含编码RGS蛋白质的第二异源核酸。还描述了涉及利用这些细胞检测实验样品改变RGS蛋白质介导的报道基因表达能力的方法。
文档编号C12N15/62GK1478097SQ01819911
公开日2004年2月25日 申请日期2001年12月3日 优先权日2000年12月1日
发明者凯思琳·H·杨, 曹健, 大卫·谢瓦, 凯思琳 H 杨, 谢瓦 申请人:Wyeth公司