专利名称：将蛋白定位于细胞膜的多肽及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及将蛋白定位于细胞膜的多肽及其应用。
背景技术：
真核细胞内蛋白质的GPI(glycosylphosphatidylinositol)修饰是一种保守的 翻译后糖基化修饰，可将蛋白质定位于细胞膜上，同时也是蛋白质转运的一种途径。GPI修 饰的蛋白质通常带有一段疏水的N-端信号肽和一段C-端疏水信号肽；其中N-端信号肽 是蛋白质外泌所必需的，而C-端信号肽则GPI修饰的信号，含有_个位于C-端17-25位的 "-氨基酸。在内质网中由转氨酶复合体催化将GPI共价连接到"-位点。高等真核生物 的GPI蛋白最终定位于细胞膜上，而在真菌中许多GPI蛋白还被定位于细胞壁上，细胞膜和 细胞壁定位的蛋白质有着不同的功能。 目前已对酵母GPI蛋白的细胞定位信号有一定了解，对模式生物啤酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)的研究表明，定位于细胞膜的某些GPI蛋白可在GPI的糖链 部分发生断裂，然后通过残留的在蛋白上的糖残基使蛋白与细胞壁上的P-l，6-葡聚糖连 接，从而将蛋白定位到细胞壁上。研究发现，酵母GPI信号肽中"-位点上游的4个氨基酸 残基中如果有2个碱性氨基酸，则蛋白质将被定位于细胞膜；如果没有碱性氨基酸或碱性 氨基酸被疏水氨基酸代替，蛋白质就会被定位到细胞壁上；如果GPI蛋白的C-端富含丝氨 酸和苏氨酸(高于30% )也会使蛋白定位于细胞壁，说明GPI蛋白的定位信号可能不止一 种。另外，一些GPI蛋白往往在细胞膜和细胞壁上均有分布，对这些蛋白的定位目前还有争 议。尽管对酵母GPI蛋白的定位信号还需进行深入的研究，但GPI信号肽的细胞定位功能 已被成功应用于外源蛋白在酵母细胞表面的定位表达。 与酵母GPI蛋白相比，对丝状真菌的GPI蛋白的了解还非常有限。烟曲霉 (Aspergillus fumigatus)是一种广泛存在于自然界中的丝状真菌，其细胞壁合成与GPI 蛋白密切相关。有证据表明丝状真菌的GPI蛋白也与酵母一样参与蛋白质的转运和定位， 但又与酵母有显著的不同。
发明内容
本发明的目的是提供一种将蛋白定位于细胞膜的多肽及其应用。 本发明所述提供的多肽，其氨基酸序列为序列表中的序列l，所述多肽命名为
AfEcm33。 编码所述多肽的DNA分子也属于本发明的保护范围。
编码所述多肽的DNA分子具体可为如下的1)或2)或3):
1)其核苷酸序列是序列表中的序列2 ; 2)在严格条件下可与序列表中序列2限定的DNA序列杂交且编码权利要求1所述 多肽的DNA分子； 3)与1)的DNA分子具有90%以上的同源性，且编码权利要求1所述多肽的DNA分子。 所述步骤3)中的基因，与1)的基因最好有95%以上的同源性。 上述严格条件可为在6 X SSC， 0. 5% SDS的溶液中，在68°C下杂交，然后用2 X SSC，
0. 1 % SDS和1 X SSC， 0. 1 % SDS各洗膜一次。 含有所述DNA分子的重组表达载体或重组菌、扩增所述DNA分子全长或其任意片 段的引物对也属于本发明的保护范围。 本发明的多肽与GFP蛋白融合的，成功的将GFP蛋白定位于细胞膜上。本发明的 多肽不仅为外源蛋白提供了定向表达的方法，而且为在细胞表面定位表达蛋白用于生物转 化提供工具。本发明的将蛋白定位于细胞膜的多肽为研究烟曲霉基因蛋白功能提供了一个 很好的平台。
图l为菌株鉴定结果。 图2为烟曲霉中GFP蛋白的表达。 图3为荧光显微镜观察GFP蛋白的定位。
具体实施例方式
实施例1、融合AfEcm33多肽的GFP蛋白定位在细胞膜上
—、构建pchiGFP表达载体 提取烟曲霉YJ407 CGMCC 0386 (ZL99105415. 6)的基因组DNA。基因组DNA的提取 方法参照《分子克隆实验指南》。 设计引物ChiG-N和ChiG-C， ChiG-N和chiG-C的核苷酸序列如下 引物ChiG-N :5' -GGAATTCGAGCCATTGCCTACATCCTTCAC-3'(划线部分为EcoRI酶识
别位点)； 引物ChiG-C :5' -GGGGTACCGCGCGCGCCTCCAGATCAGTAC_3，(划线部分为Kpnl酶识 别位点)。 以烟曲霉基因组DNA为模板PCR扩增片段A，片段A包含烟曲霉几丁质酶基因 (AfchiBl)的1. 5kb启动子(PehiB1)和N-端信号肽。 PCR反应体系10Xpyrobest Buffer 5 ii L，弓| 物ChiG-N和ChiG-C 各1 ii L(20 ii mol/L) ， DNA模板0. 5 ii L (1 ii g/ ii L) ， dNTPs (各2. 5mM) 4 ii L， pyrobestenzyme (TAKARA， 5U/ u L) 0. 5 u L，最后补水至50 u L。 反应条件94。C热变性3min ;94。C变性lmin，50。C退火45s，72。C延伸lmin30s，共 30个循环；72。C最后延伸10min。 PCR产物(片段A)用DNA凝胶回收试剂盒回收，方法参考其说明书。
片段A连接到pGEM-T Easy载体上，构建重组质粒pGEM-ChiBl，并转化大肠杆菌 DH5 a ，对重组质粒pGEM-ChiBl进行测序，测序结果表明片段A的核苷酸序列如序列表中序 列3所示。 用Kpnl和BamHI双酶切消化pMCB17载体(Fernandez-Abalos， J. M. ， et al.，
Plant—ad即ted green fluorescent protein is a versatile vital reporter forgeneexpression， protein localization and mitosis in the filamentous fungus, Aspergillus nidulans. Mol Microbiol, 1998. 27 (1) :p. 121-30)(中国科学院微生物研究 所)，用北京博大泰克生物技术公司胶回收试剂盒购回收800bp左右的片段，得到经Kpnl/ BamHI消化的片段B，片段B包含GFP2-5基因。 片段B连接到pGEM-T Easy载体上，构建重组质粒并转化大肠杆菌DH5 a ，对重组 质粒进行测序，测序结果表明片段B的核苷酸序列如序列表中序列5自5'末端第1到第 714位所示。 用BamHI禾P HindIII双酶切消化PAN7-1载体(Punt， P.J. ， et al.，
Transformationof Aspergillus based on the hygromycin B resistance marker from Escherichiacoli.Gene，1987. 56(1) :p. 117-24)(中国科学院微生物研究所)，回收其中 700bp左右的片段，得到经BamHI/Hindlll消化的片段C，片段C包含构巢曲霉的TrpC终止 区。 片段C连接到pGEM-T Easy载体上，构建重组质粒并转化大肠杆菌DH5 a ，对重组
质粒进行测序，测序结果表明片段B的核苷酸序列如序列表中序列4所示。用EcoRI/Kpnl双酶切的片段A，用KpnI/BamHI消化的片段B以及BamHI/Hindlll
消化的片段C与EcoRI/Hindlll酶切的pUC19载体连接，构建重组载体pchiGFP。 二、构建pchiGFP-AfEcm33表达载体 提取烟曲霉YJ407 CGMCC 0386的基因组DNA，烟曲霉基因组DNA的提取方法参照 《分子克隆实验指南》。 弓I物GFP-N-1 :GGGTACCATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCAC (划线部分为Kpnl酶识别位 点)； 引物Ecm33-mid-5 :5' -GGCATGGATGAACTATACAAAGGATCTTCTGGCACCACCAC_3，；
引物Ecm33-mid-3 :5' -GTGGTGGTGCCAGAAGATCCTTTGTATAGTTCATCCATGCC-3';
弓I物Ecm33-C :5' -CGGGATCC TTACAAAACGTACTGCAC-3'(划线部分为BamHI酶识别 位点)。 以烟曲霉基因组DNA为模板，Ecm33-mid-5和Ecm33_C为引物，PCR扩增片段D，片 段D包含140bp烟曲霉AfEcm33基因的C端部分。 PCR反应体系10Xpyrobest Buffer 5 ii L，弓|物各1 ii L(20 ii mol/L) ， DNA模板 0. 5ii L(l ii g/ii L) ，d證s(各2. 5mM)4ii L，pyrobest enzyme (TAKARA， 5U/ii L) 0. 5 ii L，最后 补水至50ii L。 反应条件94t:热变性3min ;94"C变性lmin，56t:退火lmin，72t:延伸lmin，共30 个循环；72t:最后延伸10min。 PCR产物(片段D)用DNA凝胶回收试剂盒回收，方法参考其说明书。
片段D连接到pGEM-T Easy载体上，构建重组质粒并转化大肠杆菌DH5 a ，对重组 质粒进行测序，测序结果表明片段D的核苷酸序列如序列表中序列2所示，编码序列表中序 列l所示的蛋白。 以pchiGFP质粒为模板，GFP-N-1和Ecm33-mid-3为引物，PCR扩增片段E，片段E 包含714bp GFP2-5基因片段。 PCR反应体系10Xpyrobest Buffer 5 ii L，弓|物各1 ii L(20 ii mol/L) ， DNA模板0. 1 ii L(l ii g/ii L) ，d證s(各2. 5mM)4ii L，pyrobest enzyme (TAKARA， 5U/ii L) 0. 5 ii L，最后 补水至50ii L。 反应条件94。C热变性3min ;94。C变性lmin，58。C退火45s，72。C延伸lmin30s，共 30个循环；72。C最后延伸10min。 PCR产物(片段E)用DNA凝胶回收试剂盒回收，方法参考其说明书。 以片段D和片段E为模板PCR扩增片段F，片段F包含855bp GFP和Ecm33融合片段。 PCR反应体系10Xpyrobest Buffer 5 ii L，引物各1 ii L，片段D liiL(O. liig/ y L)，片段E 1 ii L (0. 1 ii g/ ii L) ， dNTPs (各2. 5mM) 4 ii L， pyrobest enzyme (TAKARA， 5U/ y L) 0. 5 ii L，最后补水至50 ii L。 反应条件94。C热变性3min ;94。C变性lmin，60。C退火45s，72。C延伸lmin，共20 个循环；72t:最后延伸10min。 片段F连接到pGEM-T Easy载体上，构建重组质粒并转化大肠杆菌DH5 a ，对重组 质粒进行测序，测序结果表明片段F的核苷酸序列如序列表中序列5所示，编码序列表中序 列5所示的蛋白，自5'末端第1到第714位编码GFP蛋白，自5'末端第715到第855位 编码序列表中序列1所示的蛋白。 PCR产物(片段F)用DNA凝胶回收试剂盒回收，方法参考其说明书。用Kpnl/BamHI双酶切的片段F与Kpnl/BamHI双酶切的pchiGFP载体连接，构建
重组载体pchiGFP-AfEcm33。 三、烟曲霉中GFP的表达 pCDA14(d' Enfert， C. ， Selection of multiple disruption events inAspergillus fumigatus using the orotidine-5' -decarboxylase gene， pyrG， as aunique transformation marker. Curr Genet， 1996. 30 (1) :p. 76-82)(中国科学院微生物 研究所)与pchiGFP-AfEcm33共转化烟曲霉CEA17 (d' Enfert， CurrentGenetics， 1996， J皿；30(1) :76-82.)(中国科学院微生物研究所)，方法如下 接种1()8-l(f烟曲霉CEA17孢子于50ml YG培养基(酵母提取物5g/L、葡萄糖 20g/L，琼脂15g/L)中，37。C，培养5小时，离心6000rpm， 10分钟，回收孢子，用灭菌水洗二 次，加入40ml细胞壁消化液(硫酸铵52. 8g/L，柠檬酸钾16. 2g/L，酵母提取物5g/L，蔗糖 5g/L，4g/L Lysing enzyme (Sigma) ， pH 6. 0) ， 33°C ， 100rpm缓慢裂解3小时。离心去上清， 用洗涤液(硫酸铵52. 8g/L、蔗糖10g/L， pH 6. 0)洗二次。原生质体悬于lml储存液(KC1 44. 4g/L、CaCl2 7. 35g/L、M0PS 2g/L，pH 6. 0) ， 4。C保存。取100 ii 1原生质体与4 ii g pCDA14 禾口 4 ii g pchiGFP (或者pChiGFP-S)再加入50 ii 1 PEG 6000溶液(PEG6000250g/L、 CaCl2 7.35g/L、KCl 44.4g/L、Tris 1.21g/L，pH 7. 5)，冰上放置15分钟后，加入lml PEG 6000溶 液，室温20分钟。37。C保温Plate溶液(琼脂糖3. 5g/L、硫酸铵52. 8g/L、蔗糖342g/L，溶 于lOOml匪)，保持液体状态，加入3. 5ml混匀，铺在高渗固体选择培养基(琼脂15g/L，硫酸 铵52. 8g/L，蔗糖340g/L，溶于lOOOml匪)上，30。C培养2_3天，看到明显的菌落后，用匪再 筛选，快速提取DNA进行PCR，扩增AfEcm33片段进行鉴定(图1A)。以pCDA14与pChiGFP 载体共转化烟曲霉CEA17作为对照。 匪葡萄糖10g/L、谷氨酸钠lg/L、盐溶液20ml/L[氯化钾26g/L、七水合硫酸镁26g/L、磷酸氢二钾76g/L，微量元素(50ml/L十水合硼酸钠40mg/L，五水合硫酸铜400mg/ L， 二水合硫酸亚铁800mg/L， 二水合硫酸锰800mg/L， 二水合钼酸钠800mg/L，七水合硫酸锌 8g/L)]， p朋.8。 图1A中，"1"为分子量标准，"2"为扩增的AfEcm33片段。 四、Southern blot鉴定转化株 Southern blot具体实验方法见《分子克隆》。 质粒pchiGFP-Ecm33与pCDA14共转化CEA17菌株后，筛选获得阳性克隆，其中一 个命名为Ecm33-1 。 Southern杂交结果如图IB所示，经分析证实融合基因已整合到Ecm33-l 菌株的基因组DNA中。 五、Western blot检测GFP的表达。 Western blot检测GFP的表达。Western blot使用的抗体anti-GFP抗体购自 Clontech公司，目录号632375。 Ecm33-1菌株在37。C培养48小时后提取膜蛋白，用anti-GFP抗体可检测到GFP 条带，Western blot结果如图2所示表明，GFP可以在Ecm33_l菌株中正常表达。Ecm33-l 的Western blot结果上出现两条蛋白带，可能是GPI糖基化修饰所致，因为与GFP融合的 AfEcm33肽段上含有潜在的GPI糖基化位点(序列表中序列1自氮末端第20-22位)。
图2中1为SDS-PAGE电泳结果，2为蛋白分子量标准，3为Western blot结果。
六、荧光显微镜下观察Ecm33-l菌株将Ecm33-1菌株在200ml CM中37°C ， 200rpm培养，荧光显微镜观察。
CM :葡萄糖10g/L，蛋白胨2g/L，酵母提取物lg/L，酶水解酪素1. 5g/L，盐溶液 20ml/L[氯化钾26g/L、七水合硫酸镁26g/L、磷酸氢二钾76g/L，微量元素(50ml/L十水合 硼酸钠40mg/L，五水合硫酸铜400mg/L， 二水合硫酸亚铁800mg/L， 二水合硫酸锰800mg/L， 二水合钼酸钠800mg/L，七水合硫酸锌8g/L) ] ， pH 6. 8。 荧光显微镜观察结果如图3所示，融合蛋白能在烟曲霉中稳定表达。对Ecm33-l 菌株在菌丝生长初期(8h)、对数生长中期(30h)、平台期(60h)和衰亡期(140h)的菌丝用 0. 5M山梨醇处理使菌丝细胞脱水，细胞膜细胞壁分离后发现GFP/Ecmm33的荧光信号主要 分布在细胞膜上且不随培养时间的延长而发生分布的改变，而pCDA14与pchiGPF共转化的 烟曲霉表达的GFP蛋白分布在胞外。 图3中"-"表示未用山梨醇处理；"+ "表示山梨醇处理。图上数字8h、24、30h、60h 和140h为菌丝生长的不同时间。
序列表 〈110〉中国科学院微生物研究所 〈120〉将蛋白定位于细胞膜的多肽及其应用 〈130〉CGGNARW82097 〈160>5 〈210>1 〈211>46 〈212>PRT 〈213〉曲霉属烟曲霉(Aspergillus fumigatus)
〈400〉1Asp Gly Ser Ser Gly Thr Thr ThrSer Ser Gly Ser Ser Ala Ser Ala151015Ser Lys Ser Asn Ala Ala Asp LeuAsn Ala Ala Asn LeuPro Ala Leu202530Gly Phe Ala Ala Val Phe Gly AlaLeu Val Gin Tyr ValLeu354045〈210〉2〈211〉141〈212〉DNA〈213〉曲霉属烟曲霉(Aspergillus fumigatus)〈400〉2gatggatcttctggcaccaccactegcagcggcagctctg cttccgcttccaagtccaat60gctgctgacctcaacgctgcteacctccctgctctcggattcgccgccgtttttggagct120ctggtgcagtacgttttgte141〈210〉3〈211〉1817〈212〉DNA〈213〉曲霉属烟曲霉(Aspergillus fumigatus)〈400〉33朋gCg3C3Cctecggategaagtgttcteatgac^gcggcttgttcaagctetttegc60tgtcctcaactgg^agattcagaratteactegatetgcctccctgcaa120cagcctcgctattggg皿gttgaacatcgcagccttttctaatctectcc180gtatccttccctctecttetgacttgtttttccataactg3g皿gCg3C3tga朋cggac240tttetggattcacteg皿皿gcteatggatacagaatctcgacatccagc300accctggtttateatgagccattgcctecatccttcacaactcaattgtgtttttettet360tcctgctttctcttccggtegcaggccgacgratgagtgcgtgtcgtctc420tggcteactetttcctgattacggcctcgtggtcatcggtgtgattctca■tcatctggacggtttectggtttetcaaggggc卿卿gattctcacgtcagcatgtcc540tctcgacaacgttaactcatctgcatcgctgtg皿3C3gCggC3g3CC皿600tctgcactgatgcactggatgtg郷tectctctttctgtgccattgacggacteggtet660caaatcggttC3gCgg3g皿gttctcaacttcatgagtetgacacgtgcgagctactcca720tetgttcgcctctcagacattactgactccg3C3CgC皿3gte朋ccteg780atgg皿tggcgtccccccatatttcgactgacacgtetgcatcgg皿tegCtg3CC3gg3840皿teggggttcggcagcatcaccccgtectgcactccatcgcgcggggtcaaccccagtg■tgtcttcaagaccctgtcagg皿gatettetetgttecattecattectc960皿gggttg皿朋gccgteatctcggctgttgccaattctectgcccagttgac朋皿tga1020tegcgggagtgategtgacatcccttgggctcggcggc皿cggtcacgtcgcatagcgtc1080acgctccctttcagctgctgcaaaccccttttgacccattatgateaccc1140
C朋3gggC3tgtgcttcgatatecacgtcctcatgtcgtt acatcgaact gagattecgg1200agacccctcacgcgacteagcgccttggcgaccctccacg cggggagtca cattgccttt1260tctgcaccaagtgaagctctateagcccag ctccctttca tctgccgacg1320tcgcatgcaggatggtc郷tecgtga皿cctggcctgtg actcgagatt actgcaagat1380cgacggccgtcggatcaccggaacctggttcttcactgaa tcgctgcctt atctcttcat1440ctgatttgatccctetcttgtgacacgttgccatcagggttectegtgat agggctctgg1500atctecaacgcgacgatggg3cttg3ccag ggagcgacgc tgtgtggtga1560gtgttgt卿tgtcg皿tgag^gaccagg 3g3ttcag3g ate皿teggg1620agcgtttcttgtggtettteC皿tgC3C3gaacgactcatccgacaagct catecatcga1680caagctcgacacaatgcgctttgcaacttccaccatcgtc aaggtcgccc1740ttctgcttegcagtctttgtgtcgacgccgcagtgatgtg g皿tcgtgat 3ccagtegte1800ctgatctggaggcgcgc1817〈210〉4〈211〉769〈212〉DNA〈213〉曲霉属烟曲霉(Aspergillus fumigatus)〈400〉4actteacgtttgacgaatctggateteaga tcgttggtgt60cgatgtcagctCCgg3gttg 3g3C3朋tg g tgttcaggatctcgateaga tecgttcatt120tgtccaagcagC皿3g3gtgccttctegtgattteategctccatgtc皿c皿g皿te皿180acgcgttttcgggtttecctcttccagatecagctcatctgc皿tgcatt皿tgC3ttg3240ctgcaacctegteacgccttcaggctccggcg皿gag皿g皿tegctteg cagagctett300ttcattttcggg卿cg卿tc^gcagatcaacggtcgtC皿g3g3CCt 3Cg3g3Ctg3360ggaatccgctcttggctccacgcgactetetetttgtctcteattgtect ttgacatgct420cctcttctttactctgategcttgactetgaaaattccgtcaccagccct gggttcgcaa■agateattgcatgtttcttccttgaactctcaagcctecagg3C3C3cat tcatcgtegg540teteaacctcgaaatcattcctecteagatggtetec皿tagteaccatg gttgcctegt600gaatgctccgtecgccggccgaaacttttttecaactctc ctetgagtcg660tttecccagaacacttgtttagaggteatccttctttcte gaagtcctcg720tgtectgtgtaagcgcccactccacatctccactcgacct769〈210〉5〈211〉855〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈230〉〈400〉5atgagte皿g gag皿g皿cttttcactggagttgtcccaattcttgttga attegatggt60gatgtteatg ggrac3皿ttttctgtcagtgg卿gggtg皿ggtgatgc皿catecgg3120
9
aaacttecccttgcactectgg皿皿ctecctgttccatggccaacactt180gtcactectttcacctetggtgttcaatgcttttcaagatacccagatcatetg皿gcgg240cacgacttcttc皿gagcgccatgcctgagggatecgtgc郷卿ggaccatcttcttc300皿ggacgacggg皿ctec皿gacacgtgctg皿gtc皿gtttg郷g卿caccctcgtc360agctte郷gaatcgatttc皿gg郷3Cggaaacatcctcggccac皿g420ttgg皿tecaactecaactcccacaacgtetecatcatggCCg3C皿gC3a皿g皿cggc■acttcaagacccgccac皿catcg皿gacggcggcgtgcaactcgctgat540cattetcaac皿ttggcgatggccctgtcctttteccagacaaccattec600ctgtccacacaatctgccctttcg^agatCCC皿Cg皿3catggtcctt660cttgagtttgteacagctgcatg皿ctete720tcttctggcaccaccactegC3gCggC3gCtctgcttccgcttccaagtccaatgctgct780gacctcaacgctgcteacctccctgctctcggattcgccgccgtttttggagctctggtg840cagtecgttttgtea855
10
权利要求
一种多肽，其氨基酸序列为序列表中的序列1。
2. 编码权利要求1所述多肽的DNA分子。
3. 根据权利要求2所述的DNA分子，其特征在于所述DNA分子为如下的1)或2)或3):1) 其核苷酸序列是序列表中的序列2 ;2) 在严格条件下可与序列表中序列2限定的DNA序列杂交且编码权利要求1所述多肽 的DNA分子；3) 与l)的DNA分子具有90X以上的同源性，且编码权利要求1所述多肽的DNA分子。
4. 含有权利要求2或3所述DNA分子的重组表达载体。
5. 含有权利要求2或3所述DNA分子的重组菌。
6. 扩增权利要求2或3所述DNA分子全长或其任意片段的引物对。
7. 权利要求1所述多肽在将目的蛋白定位到细胞膜中的应用。
8. 权利要求2或3所述DNA分子在将目的蛋白定位到细胞膜中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种将蛋白定位于细胞膜的多肽及其应用。将蛋白定位于细胞膜的多肽的氨基酸序列为序列表中的序列1。编码所述多肽的DNA分子的核苷酸序列是序列表中的序列2。本发明的多肽与GFP蛋白融合的，成功的将GFP蛋白定位于细胞膜上。本发明的多肽不仅为外源蛋白提供了定向表达的方法，而且为在细胞表面定位表达蛋白用于生物转化提供工具。本发明的将蛋白定位于细胞膜的多肽为研究烟曲霉基因蛋白功能提供了一个很好的平台。
文档编号C12N1/15GK101759783SQ200810241009
公开日2010年6月30日 申请日期2008年12月24日 优先权日2008年12月24日
发明者欧阳浩淼, 金城, 陈晓敏 申请人:中国科学院微生物研究所