专利名称：利用废渣和废水固态发酵生产果胶酶的制作方法
果胶酶是一种工业用酶制剂，它的主要性质是降解果胶物质。果胶酶这一性质主要应用于果汁加工和果酒酿造。此外，果胶酶在茶和咖啡的发酵、桔子脱囊衣、麻料脱胶、废水处理、造纸、榨油等领域也有应用。作者最近申请的一项发明专利成功地将其应用于诱导植物抗病。
目前生产果胶酶的培养基主要包括诱导物、碳源、氮源和微量元素。其中诱导物主要是果胶或富含果胶质的生物质，碳源以糖类和麦麸为主，氮源主要有蛋白胨、酵母膏、玉米汁及无机铵盐。本发明以果胶酶高产菌株黑曲霉CGMCC0455为生产菌，以废渣和废水为原料进行固态发酵生产果胶酶。该方法主要特点如下1.含果胶质的废渣作为诱导物和碳源；2.以味精废水作为氮源和水分，3.味精废水中还含有大量的有机质和一些微量元素，可以促进黑曲霉的生长。4.接种黑曲霉CGMCC0455，于温度30～32℃、环境湿度75％、接触空气条件下，静置培养4天达到产酶高峰。5.经水浸提，即得果胶酶溶液。6.脱胶法测定酶活力，果胶酶产率达到1.5×104单位/克甜菜渣。该方法制备果胶酶所用原料价廉，酶产率高，发酵周期短，工艺简单，具有很高的工业化开发价值；并且为高浓度有机废水的处理提供了一条新途径。
本发明所述的果胶酶制备方法内容如下1.本发明所用黑曲霉CGMCC0455菌株是从环境中分离、筛选获得。该菌株保存于甜菜渣废水培养基，其培养基组成如下甜菜渣20.0克，味精废水1.0升，琼脂15.0克。2.产酶培养基组成比例(w/w)如下甜菜渣45％，味精废水(浓缩至氨氮含量4.0％，pH调节到中性)54％，Na2HPO4·12H2O 0.8％，KH2PO40.2％。3.固态发酵操作方法如下按2所述的原料比配制备培养基；培养基分装于500mL的三角瓶中，每瓶30g，于0.1Mpa压力下蒸气灭菌20分钟，也可直接用生发酵；接种1所述方法制备的菌种，于温度30～32℃、环境湿度75％、接触空气条件下，静置培养4天，用水浸提，即得果胶酶溶液。4.果胶酶测定采用脱胶法，测定方法如下取5mL当天配制的1％果胶溶液(用pH4.2的0.05M柠檬酸/柠檬酸三钠缓冲溶液和柑橘果胶配制)置于25×250mm的试管中，加入pH4.2的0.05M柠檬酸/柠檬酸三钠缓冲溶液10mL，试管于40℃恒温水浴预热平衡5分钟，加入5mL稀释一定倍数的酶液，并立即开始计时，反应3分钟后取样1mL放入试管，立即加入2滴1％I2/KI溶液，摇匀，再加入2mL异丙醇，转动试管，观察沉淀是否消失，准确记录脱胶时间。酶活力单位定义在上述操作条件下，30分钟使1毫克果胶完全脱胶所需的酶量为一个酶活力单位。
实施例1不同氮源对产果胶酶的影响菌种黑曲霉CGMCC0455保存于4℃冰箱内甜菜渣废水培养基斜面，半年转接1次。
固态发酵产酶实验分别以废水、各种无机氮源和有机氮源与菜渣制备产酶培养基，各培养基的配比都是甜菜渣45％(w/w)，氮2％(w/w)，水分53％(w/w)左右，少量磷酸盐。接种黑曲霉CGMCC0455进行固态发酵，结果见表1。
表1氮源 酶产率(单位/克菜渣)(NH4)2SO41.50×104NH4Cl 5.98×103NH4NO32.90×103NaNO33.41×103柠檬酸三钠 8.42×103尿素9.46×103谷氨酸单钠 9.49×103大豆蛋白胨 1.46×104酵母粉 1.39×104麸皮5.45×103豆饼粉 1.50×104味精废水1.56×104不添加氮源 7.81×102实施例2不同废渣固态发酵果胶酶的产率分别以葵花盘、甜菜渣、苹果渣、橘皮、香蕉皮为碳源，用味精废水配制产酶培养基，各培养基的配比(w/w)都是废渣45％，味精废水(浓缩至氨氮含量4.0％，pH调节到中性)54％，Na2HPO4·12H2O 0.8％，KH2PO40.2％。接种黑曲霉CGMCC0455进行固态发酵，结果见表2。
表2废渣酶产率(单位/克废渣)葵花盘 1.4×104甜菜渣 1.5×104苹果渣 1.6×103橘皮2.1×103香蕉皮 6.5×10权利要求
1.以含果胶质的废弃物作为碳源，以较高氨氮含量的废水作为氮源和水分，接种黑曲霉CGMCC0455菌株，在一定的温度、湿度、通风条件下进行固态发酵，发酵产物用水浸提，过滤，滤液即果胶酶溶液。
2.在权利要求第1项所述的方法中，黑曲霉CGMCC0455菌株为产果胶酶菌株，该菌株从环境中分离、筛选获得，其发酵产酶效率因原料不同，控制条件不同而变化。
3.在权利要求第1项所述的方法中，制备果胶酶的碳源包括甜菜渣、葵花盘和果渣等富含果胶质的废弃物。所述的甜菜渣是指甜菜糖生产过程中产生的废渣(又称甜菜废粕或颗粒粕)；葵花盘是向日葵去掉葵花子后加工成易于发酵的状态；果渣是指水果加工过程产生的果皮和废渣。在发酵培养基中，碳源占培养基总重量的45％左右(w/w)。
4.在权利要求第1项所述的方法中，氮源可以用较高氨氮含量的废水(如味精废水)，也可用无机铵盐(如硫酸铵、尿素、硝酸铵等)或有机氮源(如豆饼粉、麸皮、酵母粉等)。在发酵培养基中，氮的含量占培养基总重量的1～2％(w/w)。
5.在权利要求第1项所述的方法中，水分可以用废水，也可以用净水。在发酵培养基中，水分的含量占培养基总重量的53％左右(w/w)。
6.在权利要求第1项所述的方法中，固态发酵的温度为30～32℃，环境相对湿度为75％左右。
7.在权利要求第1项所述的方法中，果胶酶液可根据使用要求，减压浓缩成高浓度果胶酶溶液或冷冻干燥成粉剂；也可以通过盐析、超滤、柱层析等分离纯化方法得到纯度较高的酶制剂。
全文摘要
本发明为一种以含果胶质的废弃物和含氨氮的废水为原料用黑曲霉固态发酵制备果胶酶的方法，属于微生物发酵领域。发明以甜菜废渣、葵花盘、果渣等作为碳源，以味精废水作为氮源和水分，接种黑曲霉CGMCC0455菌株，在接触空气条件下，于温度30～32℃，环境相对湿度75％左右固态发酵，培养4天达到产酶高峰。用水浸提培养物，过滤，滤液即果胶酶溶液。经脱胶法测定酶活力，果胶酶产率达到1.5×10
文档编号C12N1/14GK1398967SQ0212963
公开日2003年2月26日 申请日期2002年9月6日 优先权日2002年9月6日
发明者张洪勋, 白志辉, 顾红燕, 齐鸿雁 申请人:中国科学院生态环境研究中心