专利名称：必特螺旋霉素的基因工程菌株螺旋霉素链霉菌wsj－195的制作方法
技术领域：
本发明涉及产生抗生素的基因工程菌菌株。
背景技术：
必特螺旋霉素(原名生技霉素)为利用基因重组技术将碳霉素产生菌4”异戊酰基转移酶基因p66B转入螺旋霉素链霉菌获得的克隆菌株(Streptomycesspiramyceticus p66B-F21)的发酵产物，必特螺旋霉素是以异戊酰螺旋霉素III、异戊酰螺旋霉素II、异戊酰螺旋霉素I三个组分为主的混合物，含有一定量的(异)丁酰、丙酰、乙酰螺旋霉素III及(异)丁酰、丙酰、乙酰螺旋霉素II，其化学结构及组分如下 异戊酰螺旋霉素III R＝COCH2CH3R’＝COCH2CH(CH3)2异戊酰螺旋霉素II R＝COCH3R’＝COCH2CH(CH3)2异戊酰螺旋霉素I R＝H R’＝COCH2CH(CH3)2异丁酰螺旋霉素III， R＝COCH2CH3R’＝COCH(CH3)2异丁酰螺旋霉素II R＝COCH3R’＝COCH(CH3)2丁酰螺旋霉素III R＝COCH2CH3R’＝COCH2CH2CH3丁酰螺旋霉素IIR＝COCH3R’＝COCH2CH2CH3丙酰螺旋霉素III R＝COCH2CH3R’＝COCH2CH3丙酰螺旋霉素IIR＝COCH3R’＝COCH2CH3
乙酰螺旋霉素IIIR＝COCH2CH3R’＝COCH3乙酰螺旋霉素II R＝COCH3R’＝COCH3其中异戊酰螺旋霉素III应不低于30％；异戊酰螺旋霉素(I+II+III)应不低于65％。
临床前药理毒理研究表明，必特螺旋霉素对革兰氏阳性菌，尤其是对耐红霉素、耐β内酰胺酶的金葡菌、肺炎链球菌、化脓性链球菌有较好的抗菌活性，对部分阴性菌如卡他球菌、淋球菌、流感杆菌和部分军团菌及厌氧菌有效，尤其对肺炎支原体的活性显著；药代动力学试验表明，必特螺旋霉素口服有较好的生物利用度，组织渗透性好，组织分布广、维持时间长；急、慢性及生殖毒性和致突变等研究显示，在新一代大环内酯类抗生素中必特螺旋霉素的毒性最低。以上特点说明必特螺旋霉素有较好的临床应用前景。必特螺旋霉素于2001年7月已获国家药品监督管理局进行临床试验的批文(批准文号为2001XL0292)。
利用基因工程技术制造生技霉素(必特螺旋霉素)的方法已于2000年获中国发明专利(ZL97104440.6)。该克隆菌株所含有的4”异戊酰基转移酶基因p66B是以质粒状态存在，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.0304。质粒型p66B-F21菌种的发酵单位平均为每毫升450微克，为了在螺旋霉素产生菌维持外源4”异戊酰基转移酶基因的稳定性，在菌种传代斜面中必须加入硫链丝菌素以保持质粒的存在，这些缺点影响了基因工程必特螺旋霉素的实际应用。为了获得产生必特螺旋霉素的基因稳定型菌株，本发明人利用基因整合技术，通过基因同源重组将4”异戊酰基转移酶基因整合在螺旋霉素链霉菌染色体上，获得了基因整合型菌株螺旋霉素链霉菌WSJ1，WSJ1菌株在不加压情况下连续传代，发酵效价及所产生的必特螺旋霉素组分稳定，而且发酵效价比质粒型菌株提高1倍以上(生物工程学报15卷2期171-176，1999)，但是这样的发酵水平仍不符合生产的需求。
本发明的目的是提供稳定的必特螺旋霉素高产菌株，以满足制药工业规模化生产的要求。
发明内容
在维持4”异戊酰基转移酶基因整合状态下，通过紫外、微波、甲基磺酸乙酯等化学诱变剂处理、并应用自然分离手段提高WSJ-1发酵产生必特螺旋霉素的能力，获得高产菌株WSJ-195及其突变体，该菌株或其突变体连续多次在黄豆饼粉—淀粉—琼脂孢子斜面培养基传代，经种子培养和在淀粉—鱼粉—玉米浆发酵培养基进行发酵实验验证；以藤黄微球菌为检定菌，用微生物法测定发酵液效价；发酵液在微硷性条件下用乙酸乙酯等溶媒提取，提取物经薄层色谱分析或高压液相色谱进行分析；以遗传标记的方法对4”异戊酰基转移酶基因在染色体的整合状态进行考察。结果显示，WSJ—195及其突变体的发酵水平稳定(平均发酵效价为3020微克/毫升)，所产生必特螺旋霉素组分符合质量标准的要求，可进入试生产工艺的研究。本发明获得的高产菌株WSJ-195已于2002年9月27日送中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCCNo.0801。本发明将提供高产菌株发酵条件；提供多次传代菌株发酵单位稳定、所产生的必特螺旋霉素组分稳定的试验证明，并对该菌株的形态及生理生化特征进行描述。
发明效果本发明提供了必特螺旋霉素基因工程高产菌株，其发酵水平较原始质粒型菌株提高了6倍多，比整合型原株提高了3倍多，该菌株发酵效价及所产生的必特螺旋霉素组分稳定，可应用于制药工业规模化生产。
表一 WSJ-195菌株发酵效价
实施例3WSJ-195菌株的发酵产物必特螺旋霉素组分的验证取实施例2中得到的发酵液，用氢氧化钠(1％)调节pH至8.0-9.0，加入1/2体积的乙酸乙酯混合、静止，分离乙酸乙酯层，在用0.1％氢氧化钠处理过的碱性硅胶薄层板上点样后，在苯∶甲醇2∶1中展开，用碘蒸汽显迹，以螺旋霉素为对照，Rf值高于螺旋霉素的显迹点，即为必特螺旋霉素(图2)。利用ShimadzuLC-6A高压液相色谱仪及Shimadzu Shim-pack CLC-ODS Φ6.0×150mm分析柱，进行WSJ-195的发酵产物必特螺旋霉素组分的反相高效液相分析，流动相为CH3OH∶1％NaH2PO4(53∶47)，检测波长231nm，流速1ml/min，必特螺旋霉素的组分分析结果见高压液相色谱(图3)。
表二 螺旋霉素链霉菌WSJ-195生理生化特征
WSJ-195显示能降解黄嘌呤、水解淀粉、在0.1％酚中生长，并能还原硝酸盐，在3-7％的氯化钠中生长良好。WSJ-195能利用多种碳源，仅在棉籽糖、木糖和D-Saccharic acid上不生长。WSJ-195菌种生理生化特征见表二。
本发明WSJ-195菌株与螺旋霉素链霉菌原株(微生物学报22(1)13-16，1982)及文献报道的螺旋霉素产生菌-生二素链霉菌(Pinnert-Sindico，SAnn.Inst.Pasteur.，87703-709，1954)形态学及生理生化差异见表三、四。
表三 WSJ-195和螺旋霉素链霉菌原株及生二素链霉菌形态学差异
表四 WSJ-195和螺旋霉素链霉菌原株及生二素链霉菌生理生化学差异
权利要求
1.一株基因工程螺旋霉素链霉菌(Streptomyces spiramyceticus)WSJ-195CGMCC No.0801及其变异体。
2.如权利要求1所述的基因工程螺旋霉素链霉菌WSJ-195及其变异体，其特征在于经孢子斜面、种子及发酵培养产生以异戊酰螺旋霉素III、异戊酰螺旋霉素II、异戊酰螺旋霉素I三个组分为主的酰化螺旋霉素混合物-必特螺旋霉素。
全文摘要
本发明涉及抗生素基因工程菌株螺旋霉素链霉菌WSJ－195，它是在维持4”－异戊酰基转移酶基因整合状态下通过诱变、自然分离等手段提高整合型原始菌株WSJ－1发酵产生必特螺旋霉素的能力，获得高产菌株WSJ－195，其平均发酵效价3020微克/豪升，比质粒型p66B－F21菌株发酵效价高6倍多，比整合型原始菌株WSJ－1的发酵效价高3倍多，不仅发酵单位稳定，所产生的必特螺旋霉素的化学组分也稳定，从而为工业化生产奠定了基础。
文档编号C12P19/62GK1405299SQ0214877
公开日2003年3月26日 申请日期2002年11月19日 优先权日2002年11月19日
发明者王以光, 戴剑漉, 尚广东 申请人:中国医学科学院医药生物技术研究所, 北京京泰投资管理中心, 北京首科集团公司, 北京宝亿通商贸有限责任公司