用于hcv感染的组合物和方法

专利名称：用于hcv感染的组合物和方法
背景技术：
虽然丙型肝炎病毒(HCV)在受感染的人体中强力复制，但是在培养细胞中生长病毒的有力方法尚不理想。使用感染性血清体内感染培养的人肝细胞时，只有少量HCV复制，只能由逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)检测到。
对于外周血单核细胞、人B和T细胞系、人肝细胞系以及原发的人胎和成人细胞，利用HCV感染培养细胞的努力已有报道。然而，迄今报道的结果令人失望。病毒复制常常很少，以致于感染的细胞群体所产生的HCV即使存在，也只能通过RT-PCR检测到，因而只能观察到HCV RNA的少量拷贝。另外，相同的病毒和细胞在相同或不同时期的病毒产生具有偶发性，并且孔与孔之间不可重复。再有，给予病毒几天甚至一个月以后，才能观察到感染高峰，例如Iacovacci等人，Hepatology26(5)1328-1337(1997)。这些问题阻碍了可用于HCV患者治疗和/或HCV感染相关研究的化合物的鉴定和快速筛选。
因此，需要在细胞培养物中感染和复制HCV的方法。也需要快速有效的方法，用于确定在培养中抑制HCV产生的化合物。本申请提供包含可以有效复制HCV的细胞的组合物、制备细胞组合物、培养细胞所用培养基的方法、利用HCV感染细胞的方法、分析HCV感染的方法、以及利用本发明组合物和方法评价化合物影响HCV产生能力的方法，从而解决了这些问题。
发明概述本发明提供制备包含大量产生HCV的培养细胞的组合物的方法。本发明提供可以被HCV有效感染的组合物，其包含细胞混合物，其中含有来自妊娠之后三月龄或以上的人肝的细胞。本发明也提供包含利用本发明方法制备的细胞的组合物。在一个实施方案中，本发明的组合物包含含有表达甲胎蛋白的细胞、表达白蛋白的细胞、表达血型糖蛋白的细胞、但基本上不含表达CD34蛋白质的细胞的细胞混合物。在本发明另一实施方案中，细胞混合物中的细胞可以穿过约40微米大小的滤器。在本发明另一实施方案中，所述组合物与饲养细胞联用、或另外包含饲养细胞。在本发明又一实施方案中，所述饲养细胞是STO(Reid-99)细胞。
本发明提供用于培养细胞的组合物。在本发明的一个实施方案中，该用于培养细胞的组合物包含含钙的无血清培养基、游离脂肪酸(FFA)、高密度脂蛋白(HDL)、烟酰胺、微量元素、表皮生长因子(EGF)、胰岛素、转铁蛋白和氢化可的松。根据本发明另一实施方案，上述组合物不包含低密度脂蛋白。根据本发明另一实施方案，所述组合物另外包含下列成分的任何一种、组合、或全部胰高血糖素、肝生长因子、乙醇胺和促甲状腺素释放因子。
本发明提供通过将HCV给予本发明的组合物从而感染细胞混合物的方法。根据本发明的一个实施方案，该HCV是RNA898。在本发明的另一实施方案中，首先将HCV病毒与组合物(接种物)在约0.52ml/cm2的体积中约37℃温育约24小时，然后洗涤组合物中的细胞或利用细胞培养基替换接种物。
本发明提供分析HCV感染的方法将本发明的组合物与饲养细胞温育、将组合物中的细胞与HCV接触；并测定细胞和/或培养细胞的培养基相关联的HCV。
另外，本发明提供评价化合物影响HCV产生能力(即影响细胞组合物产生更多HCV的能力)的方法，其包含将本发明的组合物与饲养细胞温育、将组合物中的细胞与HCV病毒接触、以及在接触HCV前后给予该化合物的步骤。在一个实施方案中，该方法用于筛选抑制HCV产生的细胞。在另一实施方案中，该方法用于同时筛选多种化合物抑制HCV产生的能力。
在另一实施方案中，通过逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)测定HCV RNA的数量，从而确定HCV的存在。在一个实施方案中，将样品中的HCV RNA与用作内部对照的另一种病毒的RNA的量相比较。在另一实施方案中，所述另一种病毒是牛病毒性腹泻病毒(＂BVDV＂)。
附图简述

图1描述了利用RNA898(-□-)或无血清对照(-●-)感染以后，通过测定培养上清中存在的HCV RNA水平，对人胎肝细胞感染的时间过程分析。上清样品RT-PCR分析的定量极限值(----LOQ)是600个HCV RNA拷贝/样品。
给出了三次重复培养物的平均HCV RNA/ml值及其标准差。
图2描述了利用RNA898(-□-)或阴性对照血清(-×-)感染以后，通过测定培养上清中存在的HCV RNA水平，对人胎肝细胞感染的时间过程分析。阴性对照血清得自未患HCV感染的患者。上清样品RT-PCR分析的定量极限值(----LOQ)是600个HCV RNA拷贝/样品。给出了三次重复培养物的平均HCV RNA/ml值及其标准差。
图3描述了利用RNA898(-□-)或阴性对照血清(-×-)感染以后，通过测定培养上清中存在的HCV RNA水平，对人胎肝细胞感染的时间过程分析。阴性对照血清来自未患HCV感染的患者。上清样品RT-PCR分析的定量极限值(----LOQ)是600个HCV RNA拷贝/样品。给出了三次重复培养物的平均HCV RNA/ml值及其标准差。
图4描述了利用RNA898感染以后，通过测定细胞关联的HCVRNA水平，对人胎肝细胞感染的时间过程分析。阴性对照血清数据未显示。接种之后，在给予病毒1、2、3、6和8天后洗涤并收集培养物中的细胞。细胞关联的(cell-associated)RNA样品RT-PCR分析的定量极限值(----LOQ)是100个HCV RNA拷贝/样品。给出了三次重复培养物的平均HCV RNA/孔值及其标准差。
图5描述了利用一定浓度范围内的抗病毒剂VRT-106866抑制人胎肝细胞的HCV感染。利用多重HCV特异性RT-PCR定量分析，测定样品中的HCV RNA。细胞关联的RNA样品RT-PCR分析的定量极限值是100个HCV RNA拷贝/样品。结果表示为三次重复培养物的＂对照HCV RNA％＂(样品值/阳性对照平均值)的平均值和标准差。
发明详述本发明的组合物包含细胞混合物，其中包含从妊娠后三月龄或以上的人肝中释放的细胞。根据一个实施方案，所述人的年龄介于并包括妊娠后三个月直至出生后一年。在本发明另一实施方案中，所述人年龄为妊娠后三至六个月。在另一实施方案中，所述人年龄介于妊娠后18至22周。在本发明的一个实施方案中，所述细胞包含胎肝细胞和造血细胞。根据本发明的一个实施方案，所述肝细胞和造血细胞可以表达甲胎蛋白、白蛋白和/或血型糖蛋白。根据优选实施方案，如果所述人是成年人，则人的肝是健康的。
根据另一实施方案，本发明的组合物包含表达甲胎蛋白的细胞、表达白蛋白的细胞、以及表达血型糖蛋白的细胞，但基本上不含表达CD34蛋白质的细胞。细胞混合物的细胞可用特异性针对甲胎蛋白、白蛋白或血型糖蛋白的抗体进行免疫染色，但是该细胞混合物基本上不含可用特异性针对CD34蛋白质的抗体进行免疫染色的细胞。根据本发明，术语＂基本上不含表达CD34蛋白质的细胞＂是指利用碱性磷酸酶染料检测系统(例如Harlow等人，AntibodiesA Laboratory Manual(1988)Cold Spring Harbor Laboratory，349，406-407页；DAKOCorporation的LSAB2试剂盒)检测免疫结合时，细胞混合物中的细胞显示很少或没有可观测的CD34抗体免疫染色。根据本发明组合物的一个实施方案，细胞混合物中少于2％的细胞群体可以利用抗CD34特异性抗体染色。根据本发明的另一实施方案，细胞混合物中少于1％的细胞群体可以利用抗CD34特异性抗体染色。
本发明包括包含细胞的组合物，该细胞是非常适合HCV病毒RNA898(下文＂RNA898＂)感染和复制的宿主细胞。RNA898根据布达佩斯条约，于2001年3月27日保藏于美国典型培养物中心(＂ATCC＂，10801 University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209)(ATCC保藏号PTA-3237)。根据一个实施方案，本发明的组合物中存在4×105个细胞时，在给予病毒72小时之后，能够在培养基中产生多于约5,000个拷贝；多于约10,000个拷贝；或多于约50,000个拷贝的丙型肝炎病毒RNA。例如，根据本发明方法制备并根据实施例2和4所述方法分析的组合物，在给予病毒72小时之后，应能够在培养基中产生多于约5,000个拷贝、多于约10,000个拷贝、或多于约50,000个拷贝的丙型肝炎病毒RNA。
本领域技术人员应当容易理解，如果组合物中的细胞数目多于4×105细胞，那么所产生的病毒RNA总拷贝数将与组合物中增加的细胞数目同比增加。同样，本领域技术人员应当容易理解，如果组合物中的细胞数目少于4×105细胞，那么所产生的病毒RNA总拷贝数将与组合物中增加的细胞数目同比减少。因此，本发明涵盖包含少于或多于4×105细胞、将按比例产生相同拷贝数HCV RNA的组合物。本发明的组合物在给予病毒72小时以后，能够产生5,000-55,000拷贝的HCV RNA；10,000-55,000拷贝的HCV RNA以及25,000-55,000拷贝的HCV RNA。
根据本发明可用于免疫染色的抗体的例子为本领域已知。例如，可以使用DAKO Corporation，Carpinteria，CA的抗甲胎蛋白抗体、PharMingen，San Diego，CA的抗血型糖蛋白抗体(32591)、PharMingen，San Diego，CA的抗人CD34抗体(34371A)以及AccurateChemical Corp.，Westbury，NY的抗白蛋白抗体(YM5024)在本发明另一实施方案中，本发明组合物中的细胞混合物可以穿过约40微米大小的滤器。
在本发明另一实施方案中，本发明组合物与饲养细胞联用、或另外包含饲养细胞。饲养细胞提供细胞外基质以及可扩散因子，例如生长因子。在一个实施方案中，所述的饲养细胞几乎没有被HCV感染的能力。在另一实施方案中，所述的饲养细胞是成纤维细胞。在另一实施方案中，所述的饲养细胞是胚胎间充质成纤维细胞。
本发明饲养细胞的例子有小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)，例如STO细胞，以及大鼠胚胎成纤维细胞(REF)，例如Brigid Hogan等人，Manipulating The Mouse EmbryoA Laboratory Manual，第二版，Plainview，N.Y.Cold Spring Harbor Laboratory Press，1994；Robertson，E.J.(1987)Teratocarcinomas and Embryonic Stem CellsA Practical Approach，Robertson，E.J.编(IRS，Oxford)，71-112页。STO(Reid-99)细胞是一种有用的饲养细胞。STO(Reid-99)细胞按照布达佩斯条约，于2001年3月27日保藏于美国典型培养物中心，10801 University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209(ATCC保藏号PTA-3236)。培养和维持饲养细胞的方法为本领域已知。例如参见Methods for Tissue Engineering，Robert Lanza编，Academic Press，NY(2002)，151-202页。
根据本领域已知方法，饲养细胞可以生长停滞。例如，可使STO细胞在细胞培养板上附着2-48小时。接下来去除培养STO细胞的培养基，替换为包含2μg/ml丝裂霉素C的培养基。然后将STO细胞在约37℃温育约2小时。温育以后去除包含丝裂霉素C的培养基。洗涤细胞两次，然后维持STO细胞培养物0-48小时，再加入本发明的细胞混合物。
本发明组合物的细胞混合物可以按照以下方法制备，其中包含a.在包含EGTA的缓冲液中切碎妊娠后三月龄或以上的人肝；b.将切碎的肝在包含胶原酶的缓冲液中温育，从肝中分离细胞；c.从分离的细胞中去除约40微米或更大的物质；d.从分离的细胞中去除血红细胞；e.将步骤(d)的细胞重悬于包含0.1mM-0.6mM钙、牛血清白蛋白、游离脂肪酸(FFA)、高密度脂蛋白(HDL)、烟酰胺、微量元素、表皮生长因子(EGF)、胰岛素、转铁蛋白和氢化可的松的无血清培养基中；以及f.在步骤(e)的无血清培养基中培养所述细胞。
步骤(e)或(f)的培养基可以任选另外包含胰高血糖素、肝生长因子、乙醇胺和促甲状腺素释放因子中的任何一个、组合或全部。在一个实施方案中，该培养基另外包含胰高血糖素、肝生长因子、乙醇胺和促甲状腺素释放因子。
在另一实施方案中，该培养基不包含低密度脂蛋白(LDL)。
在一个实施方案中，所述的EGTA缓冲液包含0.1mM-1.0mM乙二醇双(β-氨基乙醚)-N，N，N′，N′-四乙酸(EGTA)。在本发明另一实施方案中，所述EGTA浓度为0.5mM。
在一个实施方案中，所述的胶原酶缓冲液包含0.1-5.0mg/ml的胶原酶。在本发明另一实施方案中，所述胶原酶浓度为2mg/mL。
本发明的大小排阻步骤是指去除不能通过约40微米大小滤器的物质，例如组织、碎片和细胞聚集物。因此，本发明涵盖例如使用约40-100微米大小的滤器以及其它方法去除大于40微米大小的碎片。在一个实施方案中，过滤步骤去除不能通过大于约40微米大小的滤器的物质。本发明滤器的例子包括尼龙滤器(例如Falcon的＂Cellstrainer＂(目录号2034、2350或2360))。
制备本发明组合物的方法包括从细胞混合物中去除血红细胞的步骤。应当理解，从肝中分离细胞之后，可以在制备过程的任何阶段去除血红细胞。
去除血红细胞的方法为本领域已知。根据本发明的一个实施方案，在离心机中通过连续低速离心去除血红细胞。例如，通过滤器分离的细胞在50xg(450rpm)离心4分钟，重悬细胞沉淀，相同过程重复数次。
可以利用本发明的培养基培养动物或人的原发细胞、细胞系和组织。在一个实施方案中，所述培养基包含无血清培养基、钙、FFA、HDL、烟酰胺、微量元素、EGF、胰岛素、转铁蛋白和氢化可的松。根据另一实施方案，所述培养基另外包含下列成分的任何一种、组合、或全部胰高血糖素、肝生长因子、乙醇胺和促甲状腺素释放因子。在另一实施方案中，所述培养基不包含低密度脂蛋白(LDL)。
按照上述过程制备细胞混合物之后，将细胞在适于维持细胞的培养基以及(如有必要)饲养细胞中培养。根据本发明的一个实施方案，为用于HCV感染的细胞混合物优化培养基。用于此目的的一种培养基包含无血清培养基(例如(Dulbecco′s modified Eagle′s medium(DMEM))，其含钙、牛血清白蛋白(BSA)、游离脂肪酸(FAA)、高密度脂蛋白(HDL)、烟酰胺、微量元素、表皮生长因子(EGF)、胰岛素、转铁蛋白、氢化可的松，并任选下列成分中的任何一种、组合或全部胰高血糖素、肝生长因子、乙醇胺和促甲状腺素释放因子。根据本发明的一个实施方案中，所述培养基不包含低密度脂蛋白(LDL)。
在一个实施方案中，培养基中钙的浓度为0.1mM-0.6mM。在另一实施方案中，钙浓度约为0.5mM。在一个实施方案中，BSA的浓度为500μg/ml。在另一实施方案中，烟酰胺的浓度为5mM。在一个实施方案中，胰岛素的浓度为10ng/ml。在一个实施方案中，游离脂肪酸的浓度为7.6uEq/L。在一个实施方案中，EGF的浓度为100ng/ml。在一个实施方案中，肝生长因子的浓度为20μg/ml。在一个实施方案中，乙醇胺的浓度为10-6M。在一个实施方案中，促甲状腺素释放因子的浓度为10-6M。在一个实施方案中，HDL的浓度为5μg/ml。在一个实施方案中，氢化可的松的浓度为10-6M。
在一个实施方案中，所述培养基为IM-HDM培养基，其中包含DMEM(高葡萄糖)、500μg/ml BSA、7.6uEq/L游离脂肪酸(FAA)、5μg/ml HDL、5mM烟酰胺、1x微量元素[1×10-7M铜、5×10-11M锌、3×10-10M硒]、100ng/ml EGF、10ng/ml胰岛素、5μg/ml转铁蛋白、10-6M氢化可的松、2μg/ml胰高血糖素、20μg/ml肝生长因子、10-6M乙醇胺、10-6M促甲状腺素释放因子]。在一个实施方案中，7.6uEq/L的总FFAs包含2.36μM棕榈酸(16:0)、0.21μM棕榈油酸(顺-16:1 n-7)、0.88μM硬脂酸(18:0)、1.02μM油酸(顺-18:1 n-9)、2.71μM亚油酸(顺-18:2 n-6)以及0.43μM亚麻酸(顺-18:3 n-3)的混合物。该培养基还可以包含抗生素，以阻止细菌生长，例如1x青霉素/链霉素。
本发明组合物的细胞混合物可以铺于包被细胞外基质的塑料基层(substrate)上。细胞外基质成分的例子包括但不限于胶原，例如IV型胶原，或粘附蛋白质，纤粘连蛋白和层粘连蛋白，或Matrigel(ICNBiochemicals Inc.)。使用胶原时，可以单独使用或与层粘连蛋白或纤粘连蛋白联用、或与蛋白聚糖联用、或与富含细胞外基质物质的组织提取物联用。细胞外基质还可以由下述饲养细胞提供。该细胞混合物和细胞外基质的组合物可用于本发明的HCV分析方法。
本发明的组合物可以与RNA898或其HCV感染性等价物接触。RNA898感染性等价物是RNA898以外的HCV菌株，所述HCV病毒与根据本发明方法制备的组合物的4×105细胞接触72小时以后，能够产生多于约5,000拷贝、多于约10,000拷贝或多于约50,000拷贝的HCV RNA。根据一个实施方案，通过RNA898或其感染性等价物在约0.52ml/cm2的体积中，与本发明的组合物37℃接触约24小时，进行细胞感染。根据本发明的一个实施方案，利用细胞外基质培养感染HCV的细胞。在本发明另一实施方案中，所述细胞外基质由饲养细胞(例如STO(Reid-99)细胞)提供。
可以通过测定例如HCV蛋白质或核酸产生，来确定本发明组合物中的细胞所产生的HCV数量。例如，可以定量细胞关联的(即在其中或附着其上)和/或在培养细胞的培养基中的HCV RNA的拷贝数。可用于观察是否产生HCV蛋白质或核酸分子的技术为本领域已知。例如，利用针对HCV蛋白质的抗体进行探测的蛋白质Western印迹，或利用标记的与HCV核酸序列互补的核酸分子进行探测的凝胶印迹。从细胞和细胞培养基中提取蛋白质和核酸分子的方法为本领域公知，可以获得用于该目的的商品化试剂盒。
为了更精确定量本发明产生的HCV颗粒的拷贝数，可使用逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)。根据本发明的一个实施方案，改进了RT-PCR方法，通过将其值与以另一种病毒或另一种核酸分子的形式加入待分析的细胞、细胞抽提物和/或培养基样品中的已知数量的另一种核酸分子比较，确定HCV RNA的拷贝数。最好是所述另一种病毒与HCV密切相关，或所述另一种核酸分子与HCV RNA密切相关(即，长度、核酸组成以及病毒衣壳结构相似)。在一个实施方案中，所述另一种核酸分子处于黄病毒衣壳中。在一个实施方案中，所述另一种RNA分子是牛病毒性腹泻病毒(＂BVDV＂)例如BVDV NADL菌株(ATCC保藏号VR-534)的RNA。
所述另一种病毒或核酸分子作为用于量化第一种核酸分子的内部对照，其存在是有益的。该内部对照用于监控和校正随机波动以及分析的变动性。
例如，本发明提供的方法包含以下步骤(a)将所述HCV与已知数量的牛病毒性腹泻病毒(＂BVDV＂)混合，其中所述BVDV包含本发明的组合物的另一种核酸分子；(b)从组合物的细胞或培养细胞的培养基中提取来源于HCV的第一种核酸分子以及来源于BVDV的所述另一种核酸分子，以形成混合的核酸提取物；(c)在所述混合核酸提取物中加入对所述第一种核酸特异性的第一种可检测的探针，以及对所述另一种核酸特异性的另一种可检测的探针；(d)利用PCR方法扩增所述混合的核酸提取物；(e)在扩增的各个循环中，定量分别从所述第一种和另一种可检测的探针释放的可检测信号；(f)外推步骤(e)的结果，计算HCV中第一种核酸分子以及BVDV中所述另一种核酸分子的数量；以及(g)将步骤(f)中所述另一种核酸分子的计算量与步骤(a)使用的所述另一种核酸的已知数量作比较，评价步骤(f)中确定的所述第一种核酸分子的计算量的准确性。
根据另一实施方案，上述方法包含利用系数校正步骤(f)确定的第一种核酸分子的计算量的另外步骤，通过比较步骤(f)中所述另一种核酸的计算量与步骤(a)使用的所述另一种核酸的已知数量，确定该系数。
根据另一实施方案，本发明提供了确定化合物影响HCV产生的方法，其包含下述步骤，在给予本发明组合物HCV的前后加入化合物，然后测定与组合物中细胞和/或培养受感染细胞的培养基关联的HCV。如果期望在HCV接触组合物之后给予该化合物，则优选在在HCV接触组合物后10天以内给予该化合物。本发明待测的化合物可以抑制或活化HCV的产生。因此，为了实现其影响，化合物可以抑制HCV生活周期的任何阶段。该化合物的例子包括但不限于合成或纯化的化合物、蛋白质以及核酸分子。加入化合物的样品可以与经相同条件下处理但没有暴露于该化合物、或暴露于已知对HCV几乎没有影响的另一化合物的其它样品相比较。
根据一个实施方案，上述方法用于同时筛选多个化合物对HCV产生的影响。例如，96孔板的每个孔可以包含将要根据本发明方法筛选的不同化合物。在另一实施方案中，本发明方法用于鉴别可抑制HCV产生的化合物。
在一个实施方案中，以HCV菌株的最保存区为基础，设计用于本发明方法的引物和探针。探针还可以基于以下附加的原则进行构建a)探针的解链温度比引物高8-10℃；b)5′端不出现G；c)没有多于4个G的片段；和/或d)探针不形成解链温度较高的内部结构、或自身或与任何引物形成双链。在一个实施方案中，整个PCR区长度约为150bp。
根据相同原则设计用于BVDV 5′UTR的引物和探针。此外，应注意保证HCV的引物或探针与BVDV的引物和探针具有最小量的同源性。可以从合成和制备改变的核酸分子的商业来源获得引物和探针(例如Oligo and PE Applied Biosystems)。BVDV可以通过感染MDBK细胞而维持。
在本发明的一个实施方案中，使用两种不同的双标记的荧光探针，各自特异性针对HCV核酸分子和另一种核酸分子其中之一，而非针对另一个。在另一实施方案中，每种荧光探针一般在5′端具有报告染料，而在3′端具有淬火染料。选择两种不同的荧光探针，使其产生可以检测的不同荧光峰，在两个峰之间没有交叉干扰。例如，如上所述，第一种可检测探针的5′端可标记报告染料，例如6-羧基-荧光素(＂6-FAM＂)，第二种可检测探针的5′端可标记报告染料例如VIC。两种可检测探针的3′端可以标记淬火染料，例如6-羧甲基-罗丹明(＂6-TAMRA＂)。因此，与第一种核酸和第二种核酸结合时，探针5′端的报告染料与3′端的淬火染料接近，引起荧光抑制。在扩增过程中，当Tth聚合酶沿着核酸序列移动时，通过5′-3′外切作用去除探针的淬火染料，而降解荧光探针。由此引起荧光发射，其与扩增循环有关。因此，监控荧光发射为测定实时扩增动力学提供了基础。
用于HCV基因型1的引物和探针的例子有(SEQ ID NO1)5′-CCATGAATCACTCCCCTGTG-3′(正向引物)，(SEQ ID NO2)5′-CCGGTCGTCCTGGCAATTC-3′(反向引物)，以及HCV探针，(SEQ ID NO5) 5′-6-FAMCCTGGAGGCTGCACGACACTCA-TAMRA-3′。用于BVDV的引物和探针包含正向引物，(SEQ ID NO3)5′-CAGGGTAGTCGTCAGTGGTTCG-3′，反向引物，(SEQ ID NO4)5′-GGCCTCTGCAGCACCCTATC-3′，以及探针，5′-VIC(SEQ IDNO6)CCCTCGTCCACGTGGCATCTCGA-TAMRA-3′。
可以在带盖的96孔板光盘的同一孔中进行RT和PCR反应(PEApplied Biosystems，Foster City，CA)。在本发明的一个实施方案中，使用多重RT-PCR反应(即，在同一管中的一个RT-PCR反应同时扩增和测定两种不同的RNA，例如HCV RNA和BVDV RNA)。多重反应的好处在于，可使操作者确定HCV的阴性结果是由于培养物确实是阴性，还是由于在提取或RT-PCR步骤中的某些技术失误。利用1xTaqman EZ缓冲液(PE Applied Biosystems)、3mM乙酸锰、300mM各种dATP、dCTP、dGTP和dUTP、5单位Tth聚合酶(Epicentre)、4.0％增强剂(Epicenter)、一定浓度的探针和引物，可以在50μl RT-PCR反应中扩增10或20μl病毒RNA或RNA标准物。Taqman RT-PCR分析可以运行60℃ 25分钟(RT)、95℃ 5分钟、继之以45个循环的两步PCR反应(60℃ 1分钟及95℃ 15秒)。为了分析HCV和另一种核酸(多重Taqman分析)，可以利用两套引物各种浓度的基质混合物优化HCV和BVDV引物的数量。最后的分析条件包括6-FAM标记的HCV探针和VIC标记的BVDV探针各200nM、HCV引物各400 nM以及BVDV引物各45nM。
贯穿本说明书和权利要求书，单词＂包含(comprise)＂或其变体(例如＂comprises＂或＂comprising＂)应当理解为，是指包含所述整体、或整体组，但不排除任何其它的整体、或整体组。
2001年3月27日申请的美国临时申请60/279,174以及引用的文章此处引入以供参考。
虽然已经提供了本发明的许多实施方案，但显然可以改变其基本结构，以提供利用本发明的组合物和方法其它的实施方案。因此，应当理解，由权利要求书和说明书、而非此处例示的特定实施方案定义本发明的范围。
实施例1分离和培养人胎肝细胞和造血细胞。
妊娠后18-22周龄的人胎肝脏组织在切碎之前冰上保存于RPMI中。利用PBS溶液清洗该组织。在50ml切碎缓冲液[HBSS(Cellgro目录号21-022-cv)、0.5mM EGTA、0.2mM MgSO4、10mM HEPES]中，利用解剖刀切碎组织。组织糜在37℃水浴中温育10分钟。去除从组织糜中脱离和悬浮的细胞。组织糜在胶原酶溶液(在胶原酶缓冲液[HBSS、1mM CaCl2、10mM HEPES]中的2m/ml胶原酶(SigmaC-5138))中37℃温育30分钟。收集悬浮于组织糜之上的脱离细胞，通过40微米尼龙滤器(Falcon号2034、2350或2360)。利用IM清洗液[DMEM(高葡萄糖JRH-51444)、500μg/ml BSA(Sigma A8806)、7.6uEq/L总的游离脂肪酸(FAA)、1x Penn/Strep、10ng/ml胰岛素、5μg/ml转铁蛋白]洗涤组织糜。
将穿过滤器的含细胞溶液混合，1000rpm旋转8分钟。弃上清。沉淀重悬于50mlIM清洗液，50xg(450rpm)旋转4分钟。弃上清。沉淀重悬于IM清洗液、重悬液50xg旋转4分钟以及弃上清的过程重复2-3次。然后将沉淀悬浮于20ml IM-HDM培养基[DMEM(高葡萄糖JRH-51444)，500ug/ml BSA(Sigma A8806)，7.6uEq/L游离脂肪酸(FFAs)[2.36uM棕榈酸(16:0，Sigma，P0500)，0.21uM棕榈油酸(顺-16:1n-7，Sigma，P9417)，0.88uM硬脂酸(18:0，Sigma，S4751)，1.02uM油酸(顺-18:1 n-9，Sigma，O1008)，2.71uM亚油酸(顺-18:2 n-6，Sigma，L1376)以及0.43uM亚麻酸(顺18:3 n-3，Sigma，L2376)]，5ug/ml HDL(Sigma L2014)，5mM烟酰胺(Sigma N0636)，1x Penn/Strep(Gibc0 1x)，1x微量元素[1×10-7M铜(C8027)，5×10-11M锌(Sigma 4750)，3×10-10M硒(Sigma S6663)]，100ng/ml EGF(Peprotech 100-15)，10ng/ml胰岛素(Sigma I5500)，5ug/ml转铁蛋白(Sigma T0665)，10-6M氢化可的松(Sigma I5500)，2ug/ml胰高血糖素(Sigma G3157)，20ug/ml肝生长因子(Sigma G1887)，10-6M乙醇胺(Sigma E0135)，10-6M促甲状腺素释放因子(Sigma T9146)]。
将沉淀的细胞按3×105个细胞/cm2的密度铺于IM-HDM培养基中。沉淀的细胞在细胞外基质上生长良好。沉淀的细胞可以在包被胶原的平板上生长。利用Salas-Prato，Invitro Cell.Dev.Biol24230，1988的方法包被平板。通常，平板与胶原I型储液(30ug/ml的DMEM溶液)37℃温育30分钟-1小时，用PBS漂洗两次，用PBS覆盖，在PBS中保存直至需要。
此外，可以用饲养细胞包被平板，然后加入沉淀的细胞。例如，将丝裂霉素C处理的STO(Reid-99)细胞用作饲养细胞。丝裂霉素C使STO细胞生长停滞，但细胞仍存活，提供了供肝细胞附着的表面。
如果使用STO细胞，将其铺于1.9cm2孔(24孔板为1.2×105/孔，96孔板为2.2×104/孔)的普通STO培养基中(RPMI-1640，10％FCS)，使其附着2-48小时。去除培养基，替换为包含2ug/ml丝裂霉素C的培养基，然后37℃培养2小时。去除培养基，将STO细胞用普通STO培养基洗涤两次，维持培养0-48小时，然后加入胎细胞。
24-48小时以后，通过轻柔吸取，去除未附着的胎细胞。一般每2-7天更换培养基。细胞已维持至少28天，细胞附着紧密，细胞形态良好。
在HCV感染后第11天，于24孔板或96孔板的孔中进行细胞混合物的免疫染色。甲胎蛋白-1抗体和阴性对照抗体得自DAKOCorporation(DAKO)，Carpinteria，CA。抗人CD34(34371A)和抗血型糖蛋白(32591A)小鼠单克隆抗体得自PharMingen，San Diego CA，与DAKO的小鼠阴性对照(N1537)抗体一起使用。利用DAKO的LSAB2或K0676(碱性磷酸酶)试剂盒，按照厂家说明书进行染色。免疫染色表明，该细胞混合物具有表达甲胎蛋白的细胞、表达血型糖蛋白的细胞、表达白蛋白的细胞，但没有表达CD34的细胞。
实施例2HCV感染。
利用实施例1的STO(Reid-99)饲养细胞包被96或24孔板。如实施例1所述制备的细胞铺于24孔板中的STO(Reid-99)细胞上。每孔利用购自ProMed Dx的滴度为9.3×106Chiron bDNA Eq/ml的丙型肝炎病毒RNA898感染细胞。选择接种物，使孔中终浓度为20％-30％添加的血清、或1.2×106-2.8×106Chiron bDNA Eq/ml。一般在20天内观察HCV感染和复制。在分析HCV产生以前的温育期间，每2-3天更换培养基。利用RT-PCR测定细胞和培养基中HCV RNA的拷贝数，对HCV感染和复制进行定量。
RT-PCR分析从细胞中利用Rneasy-96方法、或从细胞培养上清中利用QIAamp 96提取方法(试剂来自Qiagen，Valencia CA)提取HCVRNA。两种方法均使用离液剂连同能够在离液盐存在下结合核酸的石英玻璃，小规模分离和浓缩病毒RNA。在加入离液溶液之前，在细胞裂解物中加入牛病毒性腹泻病毒(BVDV)(约106BVDV拷贝/样品)。将玻璃纤维柱排成96孔形式。利用无RNase水将核酸分子洗脱到各孔中(约70-100ul)。BVDV最初得自ATCC(ATCC保藏号VR-534)。在使用本方法的测试之间，BVDV对照是不变的。
这些实验采用多重RT-PCR反应，即在同一管中同时扩增和测定两种或多种不同种类RNA。此处所用HCV RT-PCR分析对每反应低于10个拷贝敏感，线性范围100-107个拷贝。每个RT-PCR分析可测试10-20ul提取的HCV RNA样品。
利用下列试剂进行RT-PCR，EZ RT-PCR核心试剂盒(AppliedBiosystems)；3mM乙酸锰；300uM各种dATP，dCTP，dGTP，dUTP；400nM HCV正向引物(SEQ ID NO1)5′-ccatgaatcactcccctgtg-3′；400nM HCV反向引物(SEQ ID NO2)5′-ccggtcgtcctggcaattc-3′；45uM BVDV正向引物(SEQ ID NO3)5′-cagggtagtcgtcagtggttcg-3′；和45uM BVDV反向引物(SEQ ID NO4)5′-ggcctctgcagcaccctatc-3′，以及0.1U/ul Tth聚合酶(Epicentre)。以标有染料并包含来源于HCVRNA和BVDV RNA的核酸序列的DNA寡聚物为探针，用于探测RT-PCR产生的核酸产物(即200uM FAM HCV探针(SEQ ID NO5)5′-FAM cctggaggctgcacgacactca-TAMRA-3′和200uM VIC BVDV探针(SEQ ID NO6)5′-VIC-ccctcgtccacgtggcatctcga-TAMRA-3′)。利用ABI 7700热循环仪(Applied Biosystems)，在同一孔中进行逆转录酶和聚合酶链式反应。
将一组已知数量的HCV RNA与待RT-PCR分析的样品同时进行RT-PCR分析，由其结果产生标准曲线。
对每次实验确定定量的极限值。在提取并进行RT-PCR方法分析以后，通过测定在标准曲线线性部分内产生输出值的最低的RNA浓度，确定定量的极限值。所有阴性对照(即表明几乎没有HCV产生)一般应低于LOQ。
利用ABI 7700 Sequence Detector(Applied Biosystems)测量荧光。在所有样品中均存在对照RNA BVDV，证实该分析的RNA提取和RT-PCR步骤是成功的。BVDV结果是阳性。因此，有可能可信地解释阴性HCV结果。
实施例3感染之后培养基中HCV的时间过程分析如实施例1所述制备人胎细胞培养物，铺于经丝裂霉素C处理的STO(Reid-99)细胞饲养层。种植细胞的数目是2×105/孔。感染HCV(RNA898)的病人血清购自ProMed Dx。在待测的另一细胞样品中不加血清，作为对照。将300ul HCV患者血清的等分样品加入单独的0.7ml培养基中。培养物与病毒37℃温育24小时。去除接种物，用1ml培养基洗涤培养物，然后在新鲜培养基中培养。培养上清在每次更换培养基(每2-3天)之前取样，利用如实施例2所述的定量多重HCV特异性RT-PCR分析，测定HCV RNA。上清样品RT-PCR分析的定量极限值(----LOQ)是600个HCV RNA拷贝/样品。
图1描述了细胞培养上清的RT-PCR分析结果。图1表明，RNA898显示高度感染的迹象。阴性对照血清无HCV RNA产生。所有阴性对照均低于LOQ。
实施例4感染之后培养基中HCV的时间过程分析如实施例1所述制备人胎细胞培养物，铺于经丝裂霉素C处理的STO(Reid-99)细胞饲养层。种植细胞的数目为4×105/孔。感染以及未感染HCV(RNA898)的病人血清购自ProMed Dx(阴性对照血清)。将200 ul HCV患者血清的等分样品加入单独的0.8ml培养基中。这代表大约1.9×106Chiron bDNA Eq/孔。该细胞培养物与病毒37℃温育24小时。去除接种物，用1ml培养基洗涤该培养物，然后在新鲜培养基中培养。培养上清在每次更换培养基(每2-3天)之前取样，利用如实施例2所述的定量多重HCV特异性RT-PCR分析测定HCV RNA。上清样品RT-PCR分析的定量极限值(----LOQ)是600个HCV RNA拷贝/样品。
图2和图3描述了细胞培养上清的RT-PCR分析结果。RNA898显示高度感染的迹象。阴性对照培养物显示无HCV RNA产生。图2和3例证了该HCV分析的高度可重复性，类似的HCV分析无法得到。
实施例5HCV感染之后细胞关联的HCV RNA的时间过程分析如实施例1所述制备人胎细胞培养物，铺于经丝裂霉素C处理的STO(Reid-99)细胞饲养层。种植细胞的数目为4×105/孔。这代表大约1.9×106Chiron bDNA Eq/孔。将200ul RNA898血清(或阴性对照血清，未显示)的等分样品加入0.8ml培养基中。将培养物与病毒37℃温育24小时。去除接种物，用1ml IM-洗涤培养基洗涤培养物两次，然后培养物或添加新鲜的IM-HDM培养基，或利用裂解缓冲液破坏收集。在感染后第2、3、6和8天，将培养物同样洗涤、然后添加或收集。利用Rneasy方法(Qiagen)，从保存的裂解物中提取总RNA。利用多重HCV特异性RT-PCR定量分析，测定样品中的HCV RNA。RT-PCR分析细胞关联的RNA样品的定量极限值(----LOQ)是100个HCV RNA拷贝/样品。所有阴性对照培养物均显示无HCV RNA(数据未显示)。
图4描述了细胞关联的RNA的RT-PCR分析结果。在感染后第2和3天观察到最高水平的细胞关联的HCV RNA，感染后第6天仍然存在显著的HCV RNA。去除外部接种物以后，HCV RNA在第1-3天增加，因而表明HCV在细胞内复制。
实施例6通过抗病毒剂VRT-106866抑制HCV感染人胎肝细胞如实施例1所述制备人胎细胞培养物，铺于经丝裂霉素C处理的STO(Reid-99)细胞饲养层。种植细胞的数目为4×105/孔。将200ulRNA898血清(或阴性对照血清，未显示)的等分样品加入0.8ml培养基中，37℃温育24小时。24小时以后，去除培养基，洗涤培养物，将培养基替换为包含不同浓度化合物VRT-106866(0-10uM)的IM-HDM。每个抑制剂浓度按一式三份进行测试，阳性对照(无抑制剂)按一式六份进行。在抑制剂存在下温育48小时以后，去除上清，替换为包含相同浓度抑制剂的新鲜培养基。在另外三天之后，去除培养基，洗涤培养物，利用裂解缓冲液破坏细胞单层，使用Rneasy方法(Qiagen)如实施例2所述提取总RNA。利用多重HCV特异性RT-PCR定量分析，测定样品中的HCV RNA。RT-PCR分析细胞关联的RNA样品的定量极限值是100个HCV RNA拷贝/样品。
图5图解描述了结果，表示为三次重复培养物的＂对照HCV RNA％＂(样品值/阳性对照平均值)的平均值和标准差。图5表明，VRT-106866是HCV感染的有效抑制剂。
权利要求
1.包含细胞混合物的组合物，其包含妊娠后三月龄或以上的人肝中释放的肝细胞和造血细胞，其中对于4×105细胞组成的细胞混合物，在给予HCV病毒RNA898(＂RNA898＂，2001年3月27日保藏于美国典型培养物中心，10801 University Boulevard，Manassas，VA20110-2209；ATCC保藏号PTA-3237)72小时以后，该组合物连同饲养细胞可以在培养基中产生多于约5000个拷贝的丙型肝炎病毒(HCV)RNA。
2.权利要求1的组合物，其中对于4×105细胞组成的细胞混合物，在给予RNA898 72小时以后，所述组合物能够产生多于约10,000个拷贝的HCV RNA。
3.权利要求1-2中任一项的组合物，其中对于4×105细胞组成的细胞混合物，在给予RNA898 72小时以后，所述组合物能够产生多于约50,000个拷贝的HCV RNA。
4.包含按下列步骤制备的细胞混合物的组合物(a)在包含EGTA的缓冲液中切碎妊娠后三月龄或以上的人肝；(b)将切碎的肝在包含胶原酶的缓冲液中温育，从肝中分离细胞；(c)从分离的细胞中去除40微米或更大的物质；(d)从分离的细胞中去除血红细胞；(e)将步骤(d)的细胞重悬于包含钙、游离脂肪酸(FFAs)、高密度脂蛋白(HDL)、烟酰胺、微量元素、表皮生长因子(EGF)、胰岛素、转铁蛋白和氢化可的松以及任选的选自胰高血糖素、肝生长因子、乙醇胺和促甲状腺素释放因子中任一成分的无血清培养基中；以及(f)在步骤(e)的无血清培养基中培养所述细胞。
5.权利要求1的组合物，其中所述的饲养细胞是STO(Reid-99)细胞(＂STO(Reid-99)＂，2001年3月27日保藏于美国典型培养物中心，10801 University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209；ATCC保藏号PTA-3236)。
6.权利要求4的组合物，其中所述的组合物另外包含STO(Reid-99)细胞。
7.权利要求1-4中任一项的组合物，其中所述的细胞混合物中的细胞可以穿过40微米过滤器。
8.权利要求1-7中任一项的组合物，其中所述的细胞混合物包含表达甲胎蛋白的细胞、表达白蛋白的细胞以及表达血型糖蛋白的细胞，但基本上没有表达CD34蛋白质的细胞。
9.包含细胞混合物的组合物，其包含妊娠后三月龄或以上的人肝中释放的肝细胞和造血细胞，其中该组合物包含表达甲胎蛋白的细胞、表达白蛋白的细胞以及表达血型糖蛋白的细胞，但基本上没有表达CD34蛋白质的细胞。
10.权利要求1-9中任一项的组合物，其另外包含包含下列成分的培养基无血清培养基、钙、FFAs、HDL、烟酰胺、微量元素、EGF、胰岛素、转铁蛋白和氢化可的松以及任选的选自胰高血糖素、肝生长因子、乙醇胺和促甲状腺素释放因子中的任一成分。
11.权利要求10的组合物，其中所述的培养基不包含低密度脂蛋白(LDL)。
12.权利要求1-11中任一项的组合物，其另外包含细胞外基质。
13.权利要求9的组合物，其中利用选自免疫荧光或免疫过氧化物酶染色的方法检测CD34蛋白质的存在。
14.权利要求1-13中任一项的组合物，其另外包含HCV。
15.权利要求14的组合物，其中所述的HCV是RNA898。
16.一种组合物，其包含无血清培养基、钙、FFAs、HDL、烟酰胺、微量元素、EGF、胰岛素、转铁蛋白和氢化可的松和非低密度脂蛋白(LDL)，并任选另外包含选自胰高血糖素、肝生长因子、乙醇胺和促甲状腺素释放因子中的任一成分。
17.用于分离和培养细胞混合物的方法，其包含以下步骤a.在包含EGTA的缓冲液中切碎妊娠后三月龄或以上的人肝；b.将切碎的肝在包含胶原酶的缓冲液中温育，从肝中分离细胞；c.从分离的细胞中去除40微米或更大的物质；d.从分离的细胞中去除血红细胞；e.将步骤(d)的细胞重悬于包含钙、FFAs、HDL、烟酰胺、微量元素、EGF、胰岛素、转铁蛋白和氢化可的松、并任选另外包含选自胰高血糖素、肝生长因子、乙醇胺和促甲状腺素释放因子中任一成分的无血清培养基中；以及f.在步骤(e)的无血清培养基中培养所述细胞。
18.权利要求17的方法，其中通过低速离心(50xg)悬浮细胞约3-4分钟使较大的细胞沉淀、洗涤沉淀的细胞、并重复离心和洗涤步骤，从而去除血红细胞。
19.权利要求17的方法，其中所述的无血清培养基不包含低密度脂蛋白(LDL)。
20.利用HCV感染细胞的方法，其包含将权利要求1-13中任一项的组合物、或按照权利要求17或19的方法制备的细胞混合物与HCV病毒RNA898或其感染性等价物接触的步骤。
21.权利要求20的方法，其中将HCV病毒加入组合物中，在约0.52ml/cm2的体积中约37℃温育约24小时，然后洗涤组合物中的细胞。
22.分析HCV感染的方法，其包含以下步骤a.权利要求1-13中任一项的组合物或权利要求17或19的细胞混合物与饲养细胞温育；b.将所述组合物中的细胞与RNA898或其感染性等价物接触；以及c.测定组合物中的细胞、培养细胞的培养基、或细胞及培养基两者相关联的HCV RNA的存在。
23.权利要求22的方法，其中所述的饲养细胞是STO(Reid-99)细胞。
24.权利要求22的方法，其中通过比较(a)与细胞或培养细胞的培养基相关联存在的HCV RNA数量与(b)用作内部对照的另一种病毒的RNA数量，测定HCV RNA的数量。
25.权利要求24的方法，其中所述的另一种病毒RNA来自牛病毒性腹泻病毒(BVDV)。
26.评价化合物影响HCV产生的能力的方法，其包含以下步骤a.权利要求1-13中任一项的组合物或权利要求17或19的细胞混合物与饲养细胞温育；b.将组合物中的细胞与RNA898接触；c.在细胞接触RNA898或其感染性等价物前后，在组合物中给予该化合物；d.测定细胞、培养细胞的培养基、或细胞及培养基两者相关联的HCV。
27.权利要求26的方法，其中所述的化合物抑制HCV产生。
28.权利要求26的方法，其中同时筛选多种化合物抑制HCV产生的能力。
29.权利要求26的方法，其包含以下另外的步骤将步骤(d)的测定值与对照细胞、培养对照细胞的培养基或对照细胞和培养基两者相关联的HCV数量比较，其中对照细胞已经历步骤(a)-(d)，只是不给予化合物或已知的非活性化合物。
30.权利要求26的方法，其中所述的饲养细胞是STO(Reid-99)细胞。
31.权利要求26的方法，其中通过确定细胞或培养细胞的培养基相关联的HCV RNA数量，测定HCV的存在。
32.权利要求31的方法，其中通过逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)确定HCV RNA数量。
33.权利要求32的方法，其中通过比较(a)细胞或培养细胞的培养基相关联的HCV RNA数量与(b)用作内部对照的另一种病毒的RNA数量，测定HCV RNA的数量。
34.权利要求33的方法，其中所述的另一种病毒是牛病毒性腹泻病毒(BVDV)。
全文摘要
本发明提供包含在HCV感染之后可有效产生HCV的细胞的组合物、用于培养该细胞的组合物、制备该组合物的方法以及在该组合物的细胞中注射HCV的方法。本发明也提供了分析HCV产生的方法以及评价影响HCV产生的化合物的方法。
文档编号C12N15/09GK1511190SQ02807418
公开日2004年7月7日 申请日期2002年3月27日 优先权日2001年3月27日
发明者A·翁, A 翁, R·伯恩, 雷德, L·M·雷德 申请人:沃泰克斯药物股份有限公司