专利名称：用于鉴别活性氧类物质清除剂的方法和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及鉴别和/或测定具有ROS清除功能的化合物的ROS清除能力的方法。
背景技术：
活生物体中的需氧代谢能够引起活性氧类物质(reactive oxygenspecies)(ROS)的生成，它们包括羟基自由基、超氧化物阴离子、过氧化氢和一氧化氮。ROS的产生可能是由于各种酶的和非酶的过程。在需氧生物体中，ROS是由氧化代谢期间从分子氧到水的部分还原作用所生成的。当氧被用作末端电子受体时，细菌细胞从超氧化物或羟基自由基的歧化作用产生内源性过氧化氢，作为呼吸链的产物。肠细菌(例如鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌)遭遇巨噬细胞在吞噬期间所产生的中毒水平的过氧化氢。
在正常条件下，ROS可以在不同的生物学过程中扮演重要角色。不过，当ROS在某些不寻常条件下被过度产生时，它们可能对DNA、蛋白质和脂质导致氧化性损伤。
ROS在很多不同的疾病发病机理以及有害条件中都有牵连。它们包括衰老、AIDS、动脉粥样硬化、癌症、白内障、充血性心力衰竭、糖尿病、炎症、类风湿性关节炎、和神经变性疾病，例如阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、多发性硬化和唐氏综合征，以及接触污染物和电离辐射。
活生物体已经发展了不同应付ROS的方式。酶或非酶抗氧化剂猝灭ROS的能力有助于细胞防御氧化性应激反应。因此，抗氧化剂已经与疾病预防联系在一起，并且已经用于疾病预防。
抗氧化剂可以是蛋白质，例如铁蛋白、乳铁蛋白和转铁蛋白，或酶，例如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱苷肽过氧化物酶。非酶抗氧化剂可以是大分子，例如白蛋白、铜结合性血浆铜蓝蛋白和血红蛋白，或小分子，它们可以是水溶性抗氧化剂，例如维生素C、尿酸和胆红素，或脂溶性抗氧化剂，例如维生素E、类胡萝卜素、类视色素和泛醇-10。
不过，这些天然的防御可能在很多病理状态中受到压制。为了对付氧化性应激反应，应当补充更多有力的抗氧化剂。需要筛选和测定方法来鉴别有力的抗氧化剂；但是目前的方法既费时间又费资金。另外，它们不能测量细胞内抗氧化剂活性，这些与生物学应用更有关。因此，能够测量细胞内抗氧化剂活性、由此能够用于寻找更好的氧化剂清除分子的简单方法对药学和营养药学领域具有重要意义。
人们对含有在饮食添加剂中的天然抗氧化剂所表现出来的兴趣日益增加，因为抗氧化剂能够通过防止由ROS导致的氧化性损伤而有益健康。用以评估抗氧化剂活性和区分不同抗氧化剂的标准化测定法是有用的。这类测定方法可用于恰当地评估和标注抗氧化剂产品。这类测定法还可用于测量抗氧化剂用作食品添加剂、天然产物和药物的活性。
Farr(美国专利5,585,252、5,811,231和5,589,337)已经描述了与报道基因融合的应激反应启动子测定毒性的用途。
过氧化氢酶是一种蛋白质抗氧化剂。过氧化氢酶催化从过氧化氢到水和氧的歧化作用。过氧化氢酶的主要作用是保护细胞免受活性氧类物质对细胞成分，包括核酸，蛋白和细胞膜的损害。过氧化氢酶潜在的对于在感染中一些病原细菌的存活和多细胞生物的生命周期是重要的。
根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)是土壤中植物病原体，其引起许多植物品种的根癌肿瘤。编码过氧化氢酶的染色体基因katA已被证实参与在土壤杆菌-植物相互作用中释放的H2O2的解毒(Xu和Pan，2000)。
发明简述本发明涉及测定化合物除去ROS的能力的方法。该方法一般包含a)提供含有ROS诱导性启动子(RIP)的细胞，该启动子驱动报道基因的表达。报道基因与其可操作连接的启动子是异源的。b)使该细胞暴露于潜在能够除去ROS的化合物。c)在细胞暴露于化合物时，测量细胞中ROS诱导性报道基因表达水平的变化。报道蛋白水平的降低预示着该化合物能够除去ROS。
本发明进一步涉及选择核酸的方法，该核酸编码潜在能够除去ROS的蛋白质。该方法一般包含a)提供含有ROS诱导的启动子的细胞，该启动子驱动报道基因的表达。报道基因与其可操作连接的启动子是异源的。b)向细胞内引入含有不同核酸的表达载体，例如见于cDNA文库、或其中核酸已被诱变的文库中的那些。这些核酸编码潜在能够除去ROS的蛋白质。c)在核酸被表达时，测量细胞中ROS诱导性报道基因表达的变化。d)选择ROS诱导性报道基因表达降低的细胞。e)从ROS诱导性报道基因表达降低的细胞中分离核酸。通过这样一种工艺所分离的核酸很可能编码能够除去ROS的蛋白质。
在一种实施方式中，不同的核酸都编码能够除去ROS的蛋白质。通过选择最大程度降低报道蛋白水平的细胞，可以鉴别最有效的ROS除去剂。
本发明的方法不要求细胞暴露于外部来源ROS。相反，诱导ROS诱导性启动子的ROS可以是细胞内的。在一种实施方式中，可以通过本领域已知的方法升高细胞内ROS水平。细胞内ROS、例如H2O2的水平也可以受到酸性pH的诱导，尤其是在细菌中，例如根癌土壤杆菌。在另一种实施方式中，使用经过基因修饰的细胞可以组成型地升高细胞内ROS水平。
含有这类基因修饰的细胞是本领域已知的，例如细胞可以具有经过修饰的呼吸链基因，以便扰乱细胞的氧化还原平衡。其他基因修饰可能牵涉敲除细胞内分解或除去ROS的功能酶，例如过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、烷基氢过氧化物酶和谷胱苷肽还原酶。
由上可知，本发明的方法也不要求潜在的去除ROS化合物在细胞外暴露于细胞。相反，化合物——在这种情况下是一种基因产物——可以被细胞内部的核酸所表达。
在优选的实施方式中，表达RIP-报道基因的细胞不会表达功能性天然基因产物，也就是被与报道基因连接的启动子自然表达的基因产物。天然基因功能的不存在确保了没有复杂的机理、例如反馈回路干扰化合物除去ROS的能力与RIP-报道基因表达水平之间的相互关系。
在一种实施方式中，ROS诱导性启动子来自选自下组的基因AhpCF、Bcp、Dps、gor、KatA、KatB/AnkB、KatG、TrxB、人MAP激酶磷酸酶1(MKP-1)基因；哺乳动物hic-5基因，isc操纵子；大肠杆菌zwf、fpr、fumC、micF、nfo和sodA基因；维涅兰德固氮菌spr基因；水稻黄单胞菌水稻致病变种katX基因；大鼠和人血红素(haem)加氧酶-1(HO-1)；酵母2-脱氧葡萄糖-6-磷酸酯(phophate)磷酸酶(DOG2)；过氧化氢酶；人超氧化锰歧化酶(MnSOD)；大鼠谷胱苷肽S-转移酶(GST)；人间质胶原酶(MMP-1)；人谷胱苷肽过氧化物酶(GPX2)；鱼金属硫蛋白(MT)；大鼠多药耐受性(multidrug resistence)1型(mdr1)。
在另一种实施方式中，ROS是H2O2。在需要鉴别或选择去除H2O2化合物时，使用H2O2诱导性启动子。这样一种启动子可以来自下列基因AhpCF、Bcp、Dps、gor、KatA、KatB/AnkB、KatG、TrxB、人MAP激酶磷酸酶1(MKP1)基因；哺乳动物hic-5基因和isc操纵子。
在另一种实施方式中，用在上述方法中的细胞是一种细菌细胞。不言而喻，如果使用细菌细胞，那么ROS响应性启动子必须照此在细菌中发挥其功能，报道基因必须编码细菌中的功能性蛋白质。同样，如果使用植物细胞、酵母细胞或哺乳动物细胞，那么ROS响应性启动子和报道蛋白必须在所选择的特定细胞类型中是功能性的。
本发明还涉及用于测定基因产物除去ROS的能力的诊断试剂盒。这样一种试剂盒一般包含a)含有驱动报道基因表达的ROS诱导性启动子的细胞，该报道基因被理解为与其可操作连接的启动子是异源的；b)用于在细胞中引入编码基因产物的核酸的装置或方式；和c)用于一旦核酸被表达、测定细胞中ROS诱导性报道基因表达的降低的指导。这将指示该基因产物是否能够除去ROS。
本发明的试剂盒提供用于实施本发明方法的组分。因此，在一种实施方式中，试剂盒进一步含有用于测量报道基因产物水平的装置。试剂盒可以进一步包含用于升高细胞内ROS水平的装置。在试剂盒中所提供的细胞经过基因修饰，可以含有升高了的细胞内ROS水平，或者可以缺乏至少一种天然存在的ROS除去活性。试剂盒的细胞还可以缺乏编码活性酶的基因，酶例如过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、烷基氢过氧化物酶和谷胱苷肽还原酶。
在试剂盒中所含有的ROS诱导性启动子可以来自这样一种基因，例如AhpCF、Bcp、Dps、gor、KatA、KatB/AnkB、KatG、TrxB、人MAP激酶磷酸酶1(MKP-1)基因；哺乳动物hic-5基因，细菌isc操纵子；大肠杆菌zwf、fpr、fumC、micF、nfo、soi28和sodA基因；维涅兰德固氮菌spr基因；水稻黄单胞菌水稻致病变种katX基因；大鼠和人血红素加氧酶-1(HO-1)；酵母2-脱氧葡萄糖-6-磷酸盐(phophate)磷酸酶(DOG2)；过氧化氢酶；人超氧化锰歧化酶(MnSOD)；大鼠谷胱苷肽S-转移酶(GST)；人间质胶原酶(MMP-1)；人谷胱苷肽过氧化物酶(GPX2)；鱼金属硫蛋白(MT)；大鼠多药耐受性1型(mdr1)。
在一种实施方式中，试剂盒用于测定某种化合物除去H2O2的能力。优选地，试剂盒提供来自这样一种基因的H2O2诱导性启动子，例如AhpCF、Bcp、Dps、gor、KatA、KatB/AnkB、KatG、TrxB、人MAP激酶磷酸酶1(MKP1)基因；哺乳动物hic-5基因和isc操纵子。
在另一种实施方式中，由试剂盒所提供的细胞是一种细菌细胞，报道基因编码细菌中的功能性蛋白质。在优选的实施方式中，该细菌细胞是根癌土壤杆菌。
在本发明方法或试剂盒的优选实施方式中，ROS诱导性启动子来自根癌土壤杆菌的KatA基因。
附图的简要说明
图1同源性过氧化氢酶序列与根癌土壤杆菌katA基因产物的氨基酸序列的排列。排列是利用DNAsis程序完成的。Atu KatA代表根癌土壤杆菌katA基因产物；Lpn KatB代表侵肺军团菌katB基因产物；Bst Cat代表嗜热脂肪芽孢杆菌过氧化氢酶。
图2过氧化氢酶同功酶测定。A.使根癌土壤杆菌菌株A348(第1泳道)、AG6(pXQ9)(第2泳道)和AG6(第3泳道)在28℃ MG/L液体培养基中生长过夜。粗细胞提取物是如“材料和方法”所述制备的。对于每种菌株，加载20μl粗细胞提取物，在7.5％非变性凝胶上电泳。B.加载40μl(第1泳道)和20μl(第2泳道)A348细胞粗提取物(已在“材料和方法”所述稀释之后进一步稀释2x)，电泳。利用Clare，et al.，1984的活性染色法显现过氧化氢酶同功酶。
图3不同生长培养基中的katA-gfp表达。使根癌土壤杆菌菌株A348和AG6在28℃ MG/L，AB，IB(pH 5.5)与IB(pH 7.0)和新鲜伽蓝菜(Kalanchoe)叶组织与茎组织切片的琼脂板上生长24小时。收获细胞，然后重悬在dH2O中。利用发光光度计LS50B(Perkin Elmer)测量每种细胞悬液的荧光，如“材料和方法”所述，使用A348作为空白。
图4不同基因背景中的katA-gfp表达对比。使根癌土壤杆菌菌株A348、AG6、AG6(pSW172)、AG6(pXQ9)、AG613、CGI1和CGI1(pXQ9)在28℃ IB(pH 5.5)琼脂板上生长24小时。收获细胞，然后重悬在dH2O中。利用荧光光度计LS50B(Perkin Elmer)测量每种细胞悬液的荧光，如“材料和方法”所述，使用A348作为空白。
图5野生型与突变的katA基因的示意简图。直线代表DNA序列；方框代表KatA开放式读码框(ORF)。垂直线表示限制位点或氨基酸位置。菱形表示mini-Tn5转座子插入位置。所用关键的限制内切核酸酶位点和引物也表示出来。三角形下的DNA序列是关于定点诱变的ORF序列。-代表第二密码子的G的缺失；*代表在第五密码子处引入的终止密码子。pXQ9中的野生型katA和编码KatAΔ50与KatAΔ86的突变katA基因受到katA启动子的驱动。pXQ23中的野生型katA和编码KatA(98H/D)、KatA(94R/Q)(98H/D)、ΔkatA(-2)与ΔkatA(*5)的突变基因受到katA和lac启动子的驱动。
图6katA突变对KatA蛋白稳定性的影响。使根癌土壤杆菌菌株A348(图A，第2泳道；图B，第1泳道)、AG6(图A，第3泳道)、AG6(pXQ23)(图A，第4泳道)、AG6(pXQ26)(图A，第5泳道)、AG6(pXQ27)(图A，第6泳道)、AG6(pXQ30)(图A，第7泳道)、AG6(pXQ31)(图A，第8泳道)、AG6(pXQ9)(图B，第2泳道)、AG6(pXQ11)(图B，第3泳道)和AG6(pXQ22)(图B，第4泳道)在28℃ IB板上生长过夜。收获细胞，洗涤，稀释至OD600＝0.3的浓度。离心收获500μl细胞悬液中的细胞，重悬在Laemmli(1970)样本缓冲液中。将每一样本2μl等分试样在SDS/10％PAGE凝胶上电泳。将蛋白质转移到Immobilon-P膜上，用(His)6-KatA抗体显现。使用纯化的(His)6-KatA作为对照。
图7katA-gfp融合物的GFP蛋白表达的检测。使根癌土壤杆菌菌株A348(第1泳道)、AG6(第2泳道)、AG6(pSW172)(第3泳道)、AG6(pXQ23)(第4泳道)、AG6(pXQ26)(第5泳道)、AG6(pXQ27)(第6泳道)、AG6(pXQ30)(第7泳道)、AG6(pXQ31)(第8泳道)、AG6(pXQ11)(第9泳道)、and AG6(pXQ22)(第10泳道)在28℃ IB板上生长过夜。收获细胞，然后重悬在dH2O中。每种细胞悬液的一部分用于利用荧光光度计LS50B(Perkin Elmer)测量荧光，如“材料和方法”所述，使用A348作为空白(上栏)。将另一部分每种细胞悬液稀释至OD600＝0.3的浓度。离心收获500μl细胞悬液中的细胞，重悬在Laemmli(1970)样本缓冲液中。将每一样本2μl等分试样在SDS/15％PAGE凝胶上电泳。将蛋白质转移到Immobilon-P膜上，用GFP抗体显现GFP(下栏)。
图8过氧化氢酶活性带的测定。使根癌土壤杆菌菌株A348(第1泳道)、AG6(第2泳道)、AG6(pXQ23)(第3泳道)、AG6(pXQ26)(第4泳道)、AG6(pXQ27)(第5泳道)、AG6(pXQ11)(第6泳道)和AG6(pXQ22)(第7泳道)在28℃ MG/L液体培养基中生长过夜。制备粗细胞提取物的样本，在7.5％非变性凝胶上电泳，如前人所述(Xu and Pan，2000)。利用Clare等(1984)的活性染色法显现过氧化氢酶同功酶。由于AG6(pXQ23)是过度表达的KatA，将该样本在加载前稀释8倍。
图9H2O2对katA-gfp融合的诱导。使生长在MG/L中(OD600＝0.5)的根癌土壤杆菌AG6细胞与0、30μM、60μM和120μM H2O2接触。将细胞悬液在28℃下培育2小时。离心收获1ml细胞培养物的等分试样，重悬在Laemmli(1970)样本缓冲液中。将10μl每份样本的等分试样在SDS/15％PAGE凝胶上电泳。将蛋白质转移到Immobilon-P膜上；用GFP抗体显现GFP。
图10周围细菌细胞对katA-gfp表达的抑制。将AG6细胞按1∶1与来自细菌菌株A348、苜蓿中华根瘤菌RCR2011或大肠杆菌DH5α的细胞混合；将混合物点在IB板上。将来自单一菌株A348、AG6(pXQ9)、苜蓿中华根瘤菌RCR2011或大肠杆菌DH5α的等量细菌细胞也点在IB板上。将平板在28℃下培育过夜。拍摄UV光下的细菌荧光(上栏)。如“材料和方法”所述测量荧光强度(下栏)。
实施方式的详细说明为了测定化合物是否能够除去ROS，将ROS诱导性启动子(RIP)与报道基因融合，以驱动它的表达。报道基因与其可操作连接的启动子是异源的。然后将RIP-报道基因构建体稳定地转化到细胞内。为了测试某种化合物是否是ROS除去剂，使该细胞暴露于供试化合物。优选地，使该细胞在细胞内暴露于供试化合物。如果必要的话，诱导ROS的细胞内水平，再测量细胞中的ROS诱导性报道基因表达水平。在细胞暴露于化合物时，报道蛋白水平的降低预示着该化合物能够除去ROS。
在邻近细胞中表达，而不是在含有RIP的细胞中表达，也可以提供供试化合物。
本文所用的术语“活性氧类物质(ROS)”和“氧化剂”是可互换使用的，包括羟基自由基、超氧化物阴离子、过氧化氢和一氧化氮。
去除ROS化合物是抗氧化剂或氧化剂清除剂。也就是说，这些化合物通过化学分解或从溶液中螯合出来，具有除去ROS的能力。已知的去除ROS化合物包括蛋白质，例如铁蛋白、乳铁蛋白和转铁蛋白，或酶，例如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱苷肽过氧化物酶。非酶抗氧化剂可以是大分子，例如白蛋白、铜结合性血浆铜蓝蛋白和血红蛋白，或小分子，例如水溶性抗氧化剂(例如维生素C、尿酸和胆红素)或脂溶性抗氧化剂(例如维生素E、类胡萝卜素、类视色素和泛醇-10)。
在优选的实施方式中，具有潜在ROS除去能力的供试化合物是被细胞内表达的蛋白质。它们与含有RIP-报道基因构建体的细胞经常是异源的蛋白质。不过，天然存在于这类细胞中的多肽也可以被视为去除ROS化合物而测试，只要编码该功能性多肽的基因已经从细胞中敲除即可。
术语“异源的”在本发明的上下文中意味着组分没有被一起自然地发现。例如，报道基因与其可操作连接的启动子是异源的，不是衍生出该启动子的基因的天然编码序列。
术语“载体”表示这样一种核酸序列，它能够在特定的宿主细胞中繁殖，并且能够容纳外来核酸的插入片段。通常，可以体外操纵载体插入外来核酸，并且可以向宿主细胞引入载体，以便所插入的核酸短暂或稳定地存在于宿主细胞中。
术语“表达载体”表示被设计为表达所插入的核酸序列的载体。这类载体可以含有位于插入位点上游的强大的启动子。
术语“表达”在核酸的背景中表示核酸向mRNA和/或蛋白质产物中的转录和/或转译。
术语“表达文库”表示作为插入片段包含在表达载体中的核酸片段的文库。
术语“稳定的转化”表示核酸序列在宿主细胞中持续存在一段时间，至少是实施本发明方法所需的时间长度。稳定的转化可以这样实现，将构建体整合到宿主细胞染色体中，或者加工构建体，使它具有确保其在宿主内持续复制与分离的元素(也就是人工染色体)，或者作为替代选择，构建体可以含有可选择的标志(例如耐药性基因)，以便使宿主细胞生长在选择性条件下(例如在含有药物的培养基中)可以确保构建体留存在细胞中。
术语“细胞”或“宿主细胞”在本发明中表示原核生物或真核生物来源的细胞，它们能够充当所引入的载体的接受者。宿主细胞经常允许居留其中的载体的复制和分离。不过在某些情况下，复制和/或分离是无关的；载体或插入DNA的表达才是目的。典型的细菌宿主细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌和根癌土壤杆菌；真菌宿主细胞包括S.cerevisiae和S.pombe；植物细胞包括从A.thaliana和Z.maize分离的那些；昆虫宿主细胞包括从D.melanogaster、A.aegypti和S.frugiperda分离的那些；哺乳动物细胞包括从人组织和癌分离的那些，包括黑素细胞(黑素瘤)、结肠(癌)、前列腺(癌)、脑(神经胶质瘤、成神经细胞瘤、星形细胞瘤)和肝(肝细胞瘤)。
ROS诱导性启动子响应于细胞内部ROS的存在，增加启动子的表达。大量ROS诱导性启动子是本领域已知的。它们包括AhpCF、Bcp、Dps、gor、KatA、KatB/AnkB、KatG、TrxB、人MAP激酶磷酸酶1(MKP-1)基因；哺乳动物hic-5基因，isc操纵子；大肠杆菌zwf、fpr、fumC、micF、nfo和sodA基因；维涅兰德固氮菌spr基因；水稻黄单胞菌水稻致病变种katX基因；大鼠和人血红素加氧酶-1(HO-1)；酵母2-脱氧葡萄糖-6-磷酸酯磷酸酶(DOG2)；过氧化氢酶；人超氧化锰歧化酶(MnSOD)；大鼠谷胱苷肽S-转移酶(GST)；人间质胶原酶(MMP-1)；人谷胱苷肽过氧化物酶(GPX2)；鱼金属硫蛋白(MT)；大鼠多药耐受性1型(mdr1)。
预期上述大多数启动子都将在异源细胞类型中发挥一定功能。不过优选的是按照本发明的方法，天然见于细菌中的启动子将用在细菌中，酵母启动子将用在酵母细胞中，哺乳动物启动子将用在哺乳动物细胞中。
在优选的实施方式中，ROS是H2O2，H2O2诱导性启动子来自下列基因AhpCF、Bcp、Dps、gor、KatA、KatB/AnkB、KatG、TrxB、人MAP激酶磷酸酶1(MKP1)基因；哺乳动物hic-5基因和isc操纵子。
对RIP-报道基因载体加以定制，以便报道蛋白的表达尽可能密切地反映宿主细胞的ROS水平。因而，对表达载体加以设计，以便报道基因处于宿主细胞中的功能性ROS应答cis调节元素的控制之下。优选地，报道蛋白是在没有ROS的存在下被低水平表达的；也就是说，启动子的基础活性应当是低的，以便ROS的诱导容易被检测。
下面提供一部分基因、它们的来源生物和Genbank入藏号。还提供了有些基因的简要说明和参考文献。
烷基氢过氧化物酶和NADH氧化酶/烷基氢过氧化物酶还原酶的变异链球菌ahpC和noxl基因，入藏号AB010712.
瘰疠分枝杆菌烷基过氧化氢还原酶(ahpC)基因，入藏号AF034861.
脆弱拟杆菌烷基过氧化氢还原酶亚单位C(ahpC)和烷基过氧化氢还原酶亚单位F(ahpF)基因，入藏号AF129406.
鼠伤寒沙门氏菌烷基过氧化氢还原酶(ahpC)和(ahpF)基因，入藏号J05478.
鸟分枝杆菌烷基氢过氧化物酶C(ahpC)基因，入藏号U18263.
结核分枝杆菌烷基氢过氧化物酶C(ahpC)基因，入藏号U18264.
耻垢分枝杆菌烷基过氧化氢还原酶C(ahpC)基因，入藏号U43719.
胞内分枝杆菌烷基氢过氧化物酶C(ahpC)，入藏号U71061.
金黄色葡萄球菌烷基过氧化氢还原酶亚单位C(aphC)和亚单位F(aphF)基因，入藏号U92441 X85029.
大肠杆菌细菌铁蛋白comigratory蛋白(bcp)，入藏号M63654 M37689.
大肠杆菌DNA结合蛋白Dps(dps)基因，入藏号AF140030.
脆弱拟杆菌非特异性DNA-结合蛋白Dps(dps)，入藏号AF206033.
聚球蓝细菌营养素-应激反应诱导性DNA结合蛋白(dpsA)基因，入藏号U19762.
唾液链球菌嗜热亚种谷胱苷肽还原酶(gor)基因，入藏号L27672.
编码谷胱苷肽还原酶的大肠杆菌gor基因，入藏号M13141.
谷胱苷肽还原酶的铜绿假单胞菌gor基因(EC 1.6.4.2)，入藏号X54201.
根癌土壤杆菌过氧化氢酶(KatA)，SEQ ID NO1.
费氏弧菌过氧化氢酶(katA)基因，入藏号AF011784.
铜绿假单胞菌过氧化氢酶同功酶A(katA)基因，入藏号AF047025.
伴放线放线杆菌过氧化氢酶(katA)基因，入藏号AF162654.
侵肺军团菌过氧化氢酶-过氧化物酶(katA)基因，入藏号AF276752.
金黄色葡萄球菌过氧化氢酶基因，ATCC12600菌株.入藏号AJ000472.
清酒乳杆菌过氧化氢酶(katA)基因，入藏号M84015.
苜蓿中华根瘤菌过氧化氢酶(katA)基因，入藏号U59271.
荧光假单胞菌质粒pAM10.6过氧化氢酶同功酶(katA)，入藏号U72068.
H.pylori katA基因，入藏号Z70679.
枯草杆菌25kb基因组DNA节段(从sspE到katA)，入藏号Z82044.
铜绿假单胞菌百草枯诱导性过氧化氢酶同功酶B(katB)，锚蛋白(ankB)，入藏号U89384.
新月柄杆菌过氧化氢酶-过氧化物酶(katG)基因，入藏号AF027168.
耻垢分枝杆菌过氧化氢酶-过氧化物酶(katG)基因，入藏号AF196484.
聚球蓝细菌属PCC6301过氧化氢酶-过氧化物酶基因，入藏号AF197161.
过氧化氢酶-过氧化物酶的麻风分枝杆菌DNA，入藏号D89336.
编码过氧化氢酶HP1的大肠杆菌katG基因，入藏号M21516.
氢过氧化物酶I的鼠伤寒沙门氏菌Kat G基因.入藏号X53001.
过氧化氢酶-过氧化物酶的结核分枝杆菌katG基因.入藏号X68081S42739.
牛分枝杆菌katG基因.入藏号X83277.
耻垢分枝杆菌katG基因.入藏号X98718.
偶发分枝杆菌katGI基因.入藏号Y07865.
偶发分枝杆菌katGII基因.入藏号Y07866.
耻垢分枝杆菌硫氧还蛋白还原酶(trxB)和硫氧还蛋白(trxA)基因，入藏号AF023161.
天蓝色链霉菌sigT，trxB和trxA基因，入藏号AJ007313.
海滨梭菌硫氧还蛋白还原酶(trxB)和硫氧还蛋白(trxA)基因，入藏号U24268.
肺炎枝原体硫氧还蛋白还原酶K04_orf315(trxB)基因，入藏号U51988.sodA基因编码超氧化物歧化酶，当细胞暴露于在细胞中产生超氧化物自由基的化学品时被强烈地诱导，例如百草枯、蓝茉莉素、甲萘醌、链黑霉素、亚甲蓝和吩嗪甲基硫酸盐。sodA基因的诱导作用取决于稳态超氧化物浓度的增加，不必取决于由超氧化物导致的细胞损伤。
soi28基因编码丙酮酸黄素氧还蛋白氧化还原酶。该基因仅受产生超氧化物的试剂的诱导。具体而言，当两种小分子的含有巯基的蛋白质黄素氧还蛋白和铁氧还蛋白被氧化时，soi28基因被诱导。
ahp基因受过氧化氢和有机氢过氧化物的诱导，二者都是外源性的，由蛋白质和脂肪酸的过氧化作用所生成。
soi17和soi19响应于超氧化物[T.Kogoma，et al.，(1988)]。zwf编码葡萄糖-6-氢化酶，受产生超氧化物的化合物和一氧化氮的诱导[Greenberg，et al.，(1990)]。
micF编码截断porin基因ompF的转译的反义RNA，受超氧化物的诱导[Greenberg，et al.，(1990)]。
nfo基因编码DNA修复酶，具体受氧化还原活性剂的诱导，例如百草枯和甲萘醌[Farr，et al.，(1991)]。
如果ROS诱导性基因的核苷酸序列是已知的，可以利用聚合酶链反应与启动子融合。具体而言，合成引物，它们与基因的ROS诱导性启动子部分的5’与3’末端是互补的，在适当条件下杂交这些引物与变性的全DNA，进行PCR。按照这种方式，可以得到可克隆量的任意序列启动子。一旦已经得到启动子DNA。在适当的载体中连接它与编码报道基因的DNA，大肠杆菌的载体例如pRS415，它含有多个恰好位于lacZ基因上游的克隆位点。大量用于表达报道基因的载体是本领域已知的或商业上可得到的。方法是本领域熟知的。
用于本发明的报道基因本质上编码任意能够在有关细胞中被表达并且可测定、可检测的基因产物。报道基因必须是足够特征化的，以便它能够与启动子连接。用于本领域的报道基因包括来自大肠杆菌的LacZ基因(Shapiro S.K.，Chou J.，et al.，Gene Nov.；2571-82(1983))、来自细菌的CAT基因(Thiel G.，Petersohn D.and Schoch S.，Gene Feb.12；168173-176(1996))、来自萤火虫的荧光素酶基因(Gould S.J.and Subramani S.，1988)、来自水母的GFP基因(Chalfie M.and Prashner D.C.，美国专利No.5,491,084)、半乳糖激酶(被galK基因编码)和β-葡糖苷酶(被gus基因编码)。它们已经主要用于监测基因在细胞质中的表达。为了监测在细胞表面上的表达，可以使用与细胞表面标志结合的标记抗体(例如CD20)量化报道蛋白的水平(Koh J.，Enders G.H.，et al.，1995)。
在这些报道蛋白中，自荧光蛋白质(例如GFP)和细胞表面报道蛋白优选地用于监测活细胞，因为它们充当“活的染剂”。在活细胞中可以评价它们的表达，并且可以回收完整的细胞，用于随后的分析。不过，本发明的方法不是特别地需要活的染剂。采用其表达能够被迅速和灵敏地量化的报道蛋白也是非常有用的。因而，荧光报道蛋白(或或者能够直接或间接用荧光团标记的报道蛋白)是尤其优选的。这种特征允许在流式分类机上进行高产量的筛选，例如荧光活化细胞分类器(FACS)。
GFP是天然存在的荧光蛋白质家族成员，它的荧光主要位于光谱的绿色区域。GFP已被广泛地开发用作报道蛋白，该蛋白质的若干突变形式已被鉴定为具有改变了的光谱性质。从酵母到人类细胞，都已经获得高水平的GFP表达。它是一种稳健的通用报道蛋白，它在细胞质中的表达可以利用流式分类仪器加以定量测量，例如FACS。
本发明的诊断试剂盒和方法依赖于特异性ROS诱导性启动子的诱导作用，以改变报道基因的表达。定性和定量测量这种表达水平上的变化。为了在这些试剂盒和方法中是有用的，特定的应激反应启动子必须与编码报道蛋白产物的基因可操作连接。
术语“可操作连接”表示启动子相对于编码报道蛋白产物的基因的定位，以便基因的转录受启动子的调节。这类定位是本领域熟知的，涉及启动子定位于基因的上游(5’)，以便额外的终止信号不会强加于转录，并且启动子引发位点与启动子调节序列之间的间隔最适合于转录。
在本发明的范围内还有构建体，其中报道蛋白产物与天然基因产物、也就是与报道蛋白融合的启动子的基因产物的N末端部分融合。重要的是与报道蛋白融合的天然基因产物的部分不保留全长天然基因产物的功能。
表达特定RIP-报道基因构建体的细菌菌株的选择和在本发明方法与试剂盒中的有用性仅受该菌株产生功能性报道蛋白的能力和它以未转化状态合成报道蛋白的无能力的限制。最优选地，所用菌株应当欠缺内源性细胞内除去ROS的基因。这类基因包括编码过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、烷基氢过氧化物酶和谷胱苷肽还原酶的那些。例如，若使用H2O2诱导性启动子，则优选的是内源性过氧化氢酶基因在细胞中被敲除或突变，以便细胞丧失或者减少内源性分解H2O2的能力。
可用于本发明方法和试剂盒的真核细胞包括从原代组织建立的细胞系以及可从美国典型菌种保藏中心(ATCC，Rockville，Md.)得到的那些细胞系和培养物。
本发明的方法和试剂盒依赖于可检测的ROS诱导性报道蛋白表达的降低，以测试化合物是否能够除去ROS。这要求报道蛋白表达的水平在没有去除ROS化合物的存在下是足够高的，以便减少是可检测的。在有些实施方式中，该方法涉及升高细胞内ROS水平。用于升高各种细胞内ROS浓度的方法是已知的。
在细菌中，使用葡萄糖/葡萄糖氧化酶(GOX)或还原了的谷胱苷肽(GSH)作为H2O2生成系统(Saliim，et al.，2001)，可以升高细胞内H2O2水平。在土壤杆菌属中，酸性条件可以升高细胞内H2O2水平。在哺乳动物细胞和酵母中，细胞内谷胱苷肽的消耗升高细胞内ROS。至少在哺乳动物细胞中，应用buthionine sulfoximine可以消耗谷胱苷肽。胰岛素刺激也引起胰岛素敏感性肝细胞瘤与脂肪细胞中的细胞内H2O2激增(Mahadev，et al.，2001)。在Arabidopsis中，应用地塞米松激活MAP激酶，导致H2O2的生成(Ren，et al.，2002)。
在其他实施方式中，该方法涉及使用这样的细胞，其中该细胞已经经过基因修饰，以便存在升高了的细胞内ROS水平。在细菌中，调节大肠杆菌超氧化物歧化酶的表达，导致细胞内超氧化物的变化(Gort和Imlay，1998)。在酵母中，可以调节细胞色素过氧化物酶、超氧化物歧化酶或GSH1基因的表达。在成纤维细胞中，稳定表达Nox1的细胞引起细胞内H2O2的显著增加，以及超氧化物水平的一定增加(Arnold，et al.，2001)。
在示范性实施方式中，测试化合物除去H2O2的能力的测定法将如下进行。在H2O2诱导性启动子的控制下，向含有报道基因的细胞系、例如根癌土壤杆菌菌株AG6引入表达潜在H2O2除去剂的表达构建体。例如使细胞暴露于低pH介质，可以诱导细胞内H2O2的产生。如果报道蛋白是GFP，报道蛋白的水平以荧光的水平表示，与其中不存在H2O2除去性化合物的对照细胞相比，在表达该化合物的细胞中的荧光水平将降低。
本发明的一个方面涉及选择核酸的方法，该核酸编码潜在能够除去ROS的蛋白质。在这种方法中，提供含有上述RIP-报道基因构建体的细胞。使用含有不同核酸的表达载体转化细胞，核酸例如见于cDNA文库或其中核酸已被诱变的文库中的那些。这些核酸编码潜在能够除去ROS的蛋白质。如上所述，在核酸被表达时，测量ROS诱导性报道基因表达的任何减少。然后选择ROS诱导性报道基因表达降低的细胞，分离用于转化细胞的核酸。这种核酸将很可能编码ROS除去性蛋白质。
术语“文库”表示核酸片段的集合，它们各自的大小可以从几个碱基对到大约一百万个碱基对。这些片段作为插入片段包含在能够在某些宿主细胞中繁殖的载体中，例如细菌、真菌、植物、昆虫或哺乳动物细胞。
术语“大量核酸”表示来自任意来源的一组核酸分子。例如，大量核酸可以包含全基因组DNA、来自一种或多种染色体的基因组DNA、已从全细胞RNA或信使RNA(mRNA)逆转录的cDNA、全细胞RNA、mRNA或者单独或利用组合方法体外合成的一组核酸分子。大量核酸被理解为例如包括表达文库。
术语“明亮”和“暗淡”在细胞分类机的上下文中表示由特定细胞所表现的荧光(或其他光发射的模式)强度水平。明亮的细胞相对于细胞群体具有高强度的发射，据此推断为高水平的报道基因表达；暗淡的细胞相对于细胞群体具有低强度的发射。
术语“流式分类机(flow sorter)”表示这样一种机器，它分析来自细胞或其他对象的光发射强度，根据光发射强度等参数区分细胞或对象。
在一种实施方式中，该方法如下，使用GFP作为报道蛋白选择ROS除去性蛋白质。向选定的宿主细胞中引入ROS诱导性启动子-GFP表达构建体，选择稳定的表达系统。克隆这种GFP表达系，生成亮绿色的群体。向宿主细胞中引入编码潜在ROS除去剂的文库，生成含有GFP的细胞群，其中一些还表达ROS除去剂。利用流式分类设备检查该群体，将细胞分为两群继续表达GFP的细胞，水平类似于引入文库插入片段之前的细胞；和表达降低水平了的GFP的细胞。分离来自这类“暗淡”细胞的编码ROS除去剂的插入片段，用于测定它们的DNA序列，或者再次引入到含有GFP的宿主细胞中，进行下一循环的选择和富集。
可以设想上述选择工艺的流式分类轮廓图。含有文库插入片段的宿主细胞群的荧光强度在插入之前将具有正态分布。该分类前的群体用于选择分布曲线左侧的细胞。选择分布曲线左侧的暗淡细胞，将来自这些细胞的插入片段再次引入到原始宿主细胞中。用这样一种子文库序列转化的细胞的荧光强度分布将向左侧倾斜(也就是说平均荧光强度降低)。
本发明可以使用一种流式分类机、例如FACS或等价设备来筛选大量含有编码潜在ROS除去性蛋白质的表达文库插入片段的宿主细胞，以鉴别能够除去ROS的那些；也就是报道蛋白分子表达水平降低的细胞。具有升高水平了的ROS并且使报道蛋白(例如GFP)处于ROS诱导性启动子控制之下的宿主细胞将具有高水平的报道蛋白表达。当表达文库插入片段在这些细胞中被表达时，预期被FACS分析的大多数细胞保留了这种高水平。不过，少量可能表现减少了的表达，在FACS上被检测为落在细胞荧光分布暗淡一侧的细胞。可以收集这些暗淡细胞，与其他细胞隔离生长。这样一种工艺导致从起始细胞群富集含有ROS除去剂的那些，有效地降低诱导剂ROS的水平，从而降低报道蛋白表达的水平。这些所选择的暗淡细胞可以用于再次分离perturbagen片段，例如通过PCR，使用攻击文库插入片段侧面的引物位点，目的是建立文库插入片段富集了导致报道蛋白表达降低的那些的子文库。可以将片段的子文库再次克隆(例如使用相同的表达载体)，并且再次引入到宿主细胞中，根据需要可以重复多次筛选/选择过程。
经过足够次数的循环之后，与隐匿所富集的ROS除去性子文库插入片段的宿主细胞相比，应当观察到含有原始报道蛋白的宿主细胞在荧光强度分布上有实质性差异。优选地，应当重复该工艺，直至在这两种荧光强度分布之间观察到微小的重叠。最终，FACS分类与循环的过程应当得到编码ROS除去剂的核酸群，它们抑制报道蛋白的表达。可以分离它们，利用分子克隆和DNA序列分析进行单独研究。
为了更充分地理解本文所述发明，提供下列实施例。不言而喻，这些实施例仅供阐述的目的，决不被解释为限制本发明。
实施例1材料、技术和测定条件菌株、质粒和生长条件表1列举和描述了用于本研究的菌株和质粒。使根癌土壤杆菌菌株生长在28℃ MG/L、IB或AB培养基中(Cangelosi，etal.，1991)，根据需要，培养基中补充有100μg/ml卡那霉素、5μg/ml四环素或100μg/ml羧苄青霉素。使大肠杆菌菌株生长在37℃ Luria-Bertani(LB)培养基中(Sambrook，et al.，1989)，根据需要，培养基中补充有50μg/ml卡那霉素、10μg/ml四环素或50μg/ml氨苄西林。利用pAG408进行根癌土壤杆菌菌株A348的mini-Tn5转座子诱变，如文献所述(Suarez，et al.，1997)。
DNA印迹分析如前人所述(Charles和Nester，1993)从根癌土壤杆菌突变体AG6中提取全DNA。将大约1μg全DNA用ClaI或NruI消化，然后在0.9％琼脂糖凝胶上电泳。然后利用转移仪器PosiBlot(Stratagene)将DNA片段转移到尼龙膜Zeta-Probe GT(Bio-Rad)上。通过强化化学发光试剂盒(Amersham)的随机引发，将质粒pAG408标记为探针。按照厂商指导进行标记、杂交和信号检测。
过氧化氢酶同功酶测定使根癌土壤杆菌菌株A348、AG6、AG6(pXQ23)、AG6(pXQ26)、AG6(pXQ27)、AG6(pXQ11)和AG6(pXQ22)在28℃ MG/L液体培养基上生长过夜，至1.4OD600。在4℃下以4000rpm离心10min，收获细胞。将细胞团洗涤，重悬在5ml提取缓冲液中，其中含有0.05mM磷酸盐和0.4mM EDTA(pH 7.8)。在冰上，将细胞用声波处理30sec达6次，两次处理之间在冰上冷却2min。在4℃下以1100rpm离心10min，除去细胞碎片。将无细胞上清液用提取缓冲液稀释2x，将20μl每份所稀释的提取液在7.5％天然聚丙烯酰胺凝胶上电泳。制备拆分凝胶缓冲液，pH用8.1代替pH 8.9。在150V下进行电泳达3小时。利用Clare等(1984)的活性染色工艺显现过氧化氢酶同功酶。
蛋白质分析在10％或15％聚丙烯酰胺凝胶中进行SDS/PAGE，分别分析KatA或GFP的表达。将蛋白质转移到Immobilon-P膜(Millipore)上。按照厂商(Amersham)的推荐，用强化化学发光(ECL)蛋白质印迹检测系统显现KatA或GFP蛋白。
表1用于本研究的细菌菌株和质粒
Km卡那霉素；Tc四环素；Amp氨苄西林；Gm庆大霉素细胞内H2O2浓度的测量细胞内H2O2浓度是利用前人所述工艺测量的(Gonzalez-Flecha and Demple，1995；1997)，并加以修正。
简言之，使根癌土壤杆菌菌株A348、AG6和AG6(pXQ9)在28℃ AB或IB琼脂板上生长24小时。收获细胞，洗涤，按OD600＝1.0重悬在50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中。在细胞内所生成的H2O2穿过膜，与缓冲液平衡。本测定法中，细胞内与细胞外H2O2水平在10min内达到完全平衡(Gonzalez-Flecha and Demple，1997)。平衡20min后，在4℃下将细胞悬液在6000rpm下离心1min。
然后利用Amplex Red过氧化氢测定试剂盒(Molecular Probes Inc.，USA)测量上清液中的H2O2浓度，试剂盒含有高度敏感性与特异性H2O2荧光探针(N-乙酰基-3，7-二羟基吩噁嗪)和辣根过氧化物酶(HRP)(Mohanty，et al.，1997)。简言之，将100μl上清液与100μl 100μM探针和1U/ml HRP混合。在96孔微量平板中进行荧光测定，利用发光光度计LS50B(Perkin Elmer)测量。激发波长为540nm，发射波长为590nm。测定重复进行四次；然后基于同时生成的H2O2标准曲线计算浓度。
过氧化氢酶活性测定完整细菌细胞中的过氧化氢酶活性是如前人所述测定的(Maciver and Hansen，1996)，但是使用Amplex Red过氧化氢酶测定试剂盒(Molecular Probes Inc.，USA)。简言之，使根癌土壤杆菌菌株在28℃ IB平板上生长24小时。收获细胞，洗涤，按OD600＝1.0重悬在50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中。对于含有野生型katA的菌株[A348，AG6(pXQ9)和AG6(pXQ23)]，将每份样本的100μl细胞悬液用50μl 40μMH2O2培育，时间间隔为0、30sec、1min和2min。
对于含有katA突变体的菌株[AG6，AG6(pXQ11)，AG6(pXQ22)，AG6(pXQ26)和AG6(pXQ27)]，将每份样本的100μl细胞悬液用50μl 5μMH2O2培育，时间间隔为0、1、2直至6min。然后加入由试剂盒提供的50μl25μM Amplex Red试剂N-乙酰基-3，7-二羟基吩噁嗪和0.4U/ml辣根过氧化物酶，测定细菌过氧化氢酶降解作用后的H2O2余量。利用与上述细胞内H2O2测量相同的工艺进行荧光测定。使用没有加入H2O2的细胞悬液作为空白。使用结晶性牛过氧化氢酶溶液(Sigma)标准化本测定。
实施例2来自土壤杆菌属的编码过氧化氢酶的katA基因的克隆、测序和特征鉴定从在katA基因含有mini-Tn5插入的AG6提取全DNA。DNA印迹分析揭示，6kb ClaI DNA片段在katA基因mini-Tn5插入物下游含有序列，5kb NruI DNA片段插入物上游含有序列。从琼脂糖凝胶中提取这些DNA片段，用GENECLEAN II试剂盒(BIO 101)净化。将ClaI DNA片段克隆到pBluescript II KS(-)中的ClaI位点，将NruI DNA片段克隆到pTZ19R中的SmaI位点。
所得质粒分别被称为pXQ6和pXQ7。使用mini-Tn5特异性引物和M13反向与-40通用引物进行pXQ6和pXQ7测序。所得序列数据然后用于生成进一步测序用引物。DNA测序是利用ABI PRISM 377 DNA序列分析仪进行的。
为了克隆全长katA基因，设计引物p83(5′-GGTGCGCTAGCCAAATTCGTCACCAAGC-3′)和n84(5′-CAATCGCTAGCGTTCGGCCCTCTG-3′)，它们分别能够reanneal katA基因的上游和下游序列。两种引物都具有NheI位点，有利于随后的克隆。使用来自根癌土壤杆菌菌株A348的全DNA作为PCR模板，以扩增2.9kbDNA片段。将PCR产物用NheI消化，连接到pSW172上(Chen and Winans，1991)，后者已经用XbaI消化。将所得质粒pXQ9独立地在两个方向上测序，得到清晰的序列数据。基于对补充有100μg/ml卡那霉素和5μg/ml四环素的MG/L培养基的选择，通过三亲交配(triparental mating)(Ditta，etal.，1980)，向mini-Tn5突变体AG6引入质粒pXQ9，创建AG6(pXQ9)。
下面是来自土壤杆菌属的编码过氧化氢酶的katA的特征鉴定。将根癌土壤杆菌A348用mini-Tn5转座子诱变，后者含有编码绿荧光蛋白(GFP)变体的缺少启动子(promoter-less)的基因，该蛋白变体在UV光下产生亮绿色荧光。mini-Tn5转座子是在质粒pAG408上携带的(Suarez et al.，1997)。突变体AG6之一在被基本培养基pH有差别诱导的基因上含有转座子插入。
在植物伽蓝菜叶子上接种这种突变菌株AG6，并与亲本菌株A348对比。与A348相比，AG6导致植物肿瘤的能力大大减弱。为了分离含有mini-Tn5的DNA片段，进行DNA印迹分析，以估计它们的大小。将含有转座子插入位点下游序列的6kb ClaI DNA片段和含有插入位点上游序列的5kb NruI DNA片段克隆到载体中，分别得到质粒pXQ6和pXQ7。pXQ6和pXQ7的序列分析揭示，转座子被插入在与细菌编码过氧化氢酶的基因同源的基因上。该基因被称为katA。
为了测定完整的基因序列，通过聚合酶链反应(PCR)从A348扩增DNA片段。得到2.9kb的片段，含有katA的上游和下游序列。将所得片段克隆到pSW172中(Chen and Winans，1991)，生成质粒pXQ9。在向AG6引入pXQ9时，它可能完全恢复突变体导致肿瘤的能力，提示了pXQ9携带全长katA基因。序列分析表明，katA基因座携带单一的开放式读码框(ORF)，它编码723个氨基酸的推定蛋白质，分子量为78.7kDa。这种推定蛋白质与其他细菌过氧化氢酶是高度同源性的(图1)。
为了确定katA基因是否编码功能性过氧化氢酶，利用过氧化氢酶活性染色工艺分析过氧化氢酶同功酶模型的突变体、亲本菌株和互补菌株。如图2A所示，亲本菌株A348和互补菌株AG6(pXQ9)都具有三条不同的过氧化氢酶活性带(I，II和III)，而突变体AG6仅具有一条带(I)。这证明了转座子插入在AG6中的katA基因敲除两条过氧化氢酶活性带。
为了研究这两条过氧化氢酶活性带是否来源于同一katA基因，在聚丙烯酰胺凝胶上加载不同量的细菌细胞提取物，进行过氧化氢酶活性染色。发现在加载较少量细胞提取物时，过氧化氢酶活性带III即使在A348中也消失了(图2B)。这提示了过氧化氢酶活性带II和III来源于同一katA基因产物。过氧化氢酶活性带III似乎仅在加载足量细胞提取物时才出现，提示了带III是过氧化氢酶活性带II的聚集形式。
重要的是确定这种katA基因是否象有些过氧化氢酶基因一样编码既具有过氧化氢酶活性也具有过氧化物酶活性的蛋白质(Loewen，1997)。在将具有过氧化物酶活性的相同细胞提取物染色时(Gregory and Fridovich，1974)，发现没有过氧化物酶活性与过氧化氢酶活性带有关。综上，这些提示了katA基因编码根癌土壤杆菌细胞中的过氧化氢酶同功酶。
实施例3基于GFP的katA-gfp表达的测定为了研究在不同生长条件中的katA基因表达，使根癌土壤杆菌菌株A348和AG6在28℃ MG/L，AB，IB琼脂板上生长24小时(Cangelosi et al.，1991)，将无菌的新鲜伽蓝菜叶组织和茎组织切片置于MS培养基上(Murashige and Skoog，1962)。收获细胞，洗涤，稀释至大约OD600＝0.5的浓度。利用发光光度计LS50B(Perkin Elmer)测量每种细胞悬液的荧光，使用A348作为空白。激发波长为423nm，发射波长为509nm。荧光水平以荧光值除以对应的OD600表示。
为了研究在不同基因背景中的katA基因表达，使根癌土壤杆菌菌株A348、AG6、AG6(pSW172)、AG6(pXQ9)、A613、CGI1和CGI1(pXQ9)在28℃ IB(pH 5.5)琼脂板上生长24小时。如上所述测定每种菌株的荧光。
为了确定H2O2是否能够诱导katA表达，使AG6生长在28℃ MG/L液体培养基中。收获细胞，重悬在新鲜MG/L液体培养基中，至最终浓度为OD600＝0.5。将培养物等分试样(2ml)转移到无菌试管内，向试管加入H2O2至最终浓度为30μM、60μM和120μM。将细胞悬液在28℃下培育2小时。然后将1ml每种细胞悬液离心，洗涤，重悬在Laemmli(1970)样本缓冲液中，进行蛋白质印迹分析，如下所述。
实施例4诱变通过PCR删去KatA的C末端，生成pXQ11和pXQ22。通过重叠延长PCR进行katA的定点诱变(Ho et al，1989)。设计四种寡核苷酸，使KatA蛋白的单一氨基酸突变。假定过氧化氢酶基序中的两个残基Arg94和His98是高度保守性的。His98变为Asp；作为替代选择，Arg94变为Gln，His98变为Asp。使用在His98含有单一突变或者在His98和Arg94含有双突变的450bp NsiI-AatII PCR片段代替对应的含有野生型katA的pXQ13的NsiI-AatII片段，目的是分别生成pXQ24或pXQ25。利用ABIPRISM 377 DNA序列分析仪进行DNA测序，确认NsiI-AatII片段中的预期点突变的存在。类似地，使用在Ser5含有所引入的终止密码子或者在katA ORF第二密码子含有移码缺失的670bp MfeI-AatII PCR片段代替对应的含有野生型katA的pXQ13的MfeI-AatII片段，分别生成pXQ28和pXQ29。
实施例5His-KatA融合蛋白的纯化和KatA抗体的生成为了生成(His)6-KatA融合构建体，使用与KatA ORF起点互补的低聚物(含有XhoI位点)和低聚物(含有KphI位点)扩增KatA ORF片段。在隐匿在pRSETA上的(His)6下游框内插入2.17kb XhoI-KphI片段。通过转化作用向BL21引入所得pXQ15。在100μg/ml羧苄青霉素的存在下，使BL 21(pXQ15)在37℃ LB培养基中生长过夜。收获细胞培养物。按照厂商指导(Clontech)利用TALON金属亲合树脂进行(His)6-KatA的纯化。将纯化后的蛋白质注射给兔子，产生初次抗体。如上所述进行KatA或GFP的蛋白质分析。
实施例6互补作用将质粒pXQ13、pXQ24、pXQ25、pXQ28和pXQ29用ClaI消化，与被ClaI消化的pSW172连接，生成pXQ23、pXQ26、pXQ27、pXQ30和pXQ31。通过三亲交配(Ditta et al.，1980)或电穿孔(Cangelosi et al.，1991)向mini-Tn5突变体AG6引入质粒pSW172、pXQ11、pXQ22、pXQ23、pXQ26、pXQ27、pXQ30和pXQ31。通过电穿孔向AG6引入质粒pXQ13，然后在羧苄青霉素的存在下进行选择。所得菌株AG613在katA基因座经历单一交叉同源性重组；这得到DNA印迹分析的确认。分析这些转化菌株的GFP与KatA表达水平。
按照实施例1所述工艺(“细胞内H2O2浓度的测量”)测量细胞内H2O2浓度。
如上实施例1所述(“过氧化氢酶活性测定”)测定全细菌细胞中的过氧化氢酶活性。
实施例7细胞间的katA-gfp表达抑制为了确定一个细菌细胞的过氧化氢酶活性是否能够影响另一个细胞的katA-gfp基因表达，将AG6与其他含有过氧化氢酶活性的细菌共同培养。生长过夜后，将细菌细胞悬浮在IB液体中，调至OD600＝1.0。将AG6细胞悬液与另一种细菌悬液按1∶1混合。将单一菌株或两种菌株混合物的12μl细菌悬液等分试样点在IB平板上。将平板在28℃下培育过夜。
拍摄UV光下的细菌荧光，利用前述工艺测量GFP表达强度。为了检查每种菌株在共同培养物中的生长活力，收获每种共同培养物的一部分，测试在MG/L(总活细胞数)和补充有100μg/ml卡那霉素的MG/L(AG6活细胞数)上的活细胞数。
实施例8katA被酸性pH诱导根癌土壤杆菌突变体AG6含有mini-Tn5转座子，后者含有缺少启动子的绿荧光蛋白(GFP)变体；该mini-Tn5转座子插入在katA起始密码子下游995bp处。由于gfp基因处于katA启动子的控制之下(被称为katA-gfp)，katA表达将引起GFP的蓄积，这在UV光下可以见到亮绿色荧光。因此，通过测量突变体AG6在不同条件中的GFP表达，可以测定katA在根癌土壤杆菌中的不同表达。
使AG6生长在不同的生长培养基上，检查katA-gfp表达MG/L(富集培养基pH 7.0)、AB(基本培养基pH 7.0)和IB(基本培养基pH 5.5)，以及新鲜的伽蓝菜叶组织和茎组织切片。如图3所示，生长在IB上的细菌的荧光水平高于中性pH培养基约10-20倍，包括AB和MG/L。伽蓝菜叶组织和茎组织切片上的荧光水平高于中性pH培养基约5-10倍。这表明katA可能受酸性pH的诱导，因为植物组织也具有酸性pH和最低营养(Li et al.，1999)。
前面的实验已经证明，IB培养基是细菌在感染过程中在植物组织内部所遇到的生长条件的代表(Li et al.，1999)。为了确认酸性pH能够诱导katA表达，将IB(pH 5.5)上的荧光水平与具有相同IB成分但是pH调至pH 7.0的培养基(IB pH 7.0)进行对比。如图3所示，IB(pH 7.0)上的荧光水平降低至与其他中性培养基相似的水平，包括AB和MG/L。这证明酸性pH能够诱导katA表达。
实施例9katA对katA-gfp表达的抑制如上所示，携带全长katA基因的质粒pXQ9能够完全补充katA突变。在分析互补菌株AG6(pXQ9)中的荧光水平时，惊人地发现这种菌株具有大大减少了的荧光(减少60-70倍，如图4所示)。似乎野生型katA能够抑制katA-gfp表达。
为了确定katA是否能够特异地抑制katA-gfp，向不同的mini-Tn5转座子突变菌株CGI1引入pXQ9，该菌株在染色体基因aopB含有转座子插入，能够在UV光下产生亮绿色荧光。如图4所示，katA基因没有抑制aopB-gfp表达。这提示了katA能够特异地抑制katA-gfp表达。
令人感兴趣的是确定katA的拷贝数量和位置是否能够影响抑制的能力。通过单一交叉同源性重组，将katA整合到AG6的染色体中。所得菌株AG613含有野生型katA的单一拷贝和katA-gfp融合物的单一拷贝，这得到DNA印迹分析的验证。AG613具有非常低水平的katA-gfp表达，正象在质粒上隐匿katA基因的AG6(pXQ9)一样(图4)。这提示了仅有一个katA拷贝足以抑制katA-gfp表达，而无论katA位于质粒还是染色体上。
实施例10katA-gfp抑制的要求令人感兴趣的是确定katA的抑制作用是发生在mRNA水平还是在蛋白质水平上。进行定位诱变，生成突变体，不产生KatA蛋白或者产生截短的KatA蛋白。katA开放式读码框(ORF)内14位核苷酸的C变为G。这在Ser5创建了终止密码子(被称为ΔkatA(*5))；所得质粒被命名为(pXQ31)(图5；表1)。然后删去katA ORF中第二密码子的G，创建katA上的移码缺失(被称为ΔkatA(-2))；所得质粒被命名为pXQ30(图5)。
如图6所示，pXQ31构建体没有生成任何KatA蛋白。pXQ30生成痕量KatA样蛋白，设想产生自起始密码子下游的替代转译位点或者罕见的核糖体移码，这可能恢复蛋白质的翻译。这两种构建体没有抑制katA-gfp表达，如通过GFP荧光和使用GFP抗体的蛋白质印迹分析加以测定的(图7)。这提示了KatA蛋白的产生是抑制作用需要的。
然后重要的是确定全长KatA多肽是否是抑制作用所需的。删去KatA的C末端的86个氨基酸(被称为KatAΔ86)和50个氨基酸(KatAΔ50)，分别生成pXQ11和pXQ22(图5)。这些构建体产生更小的KatA蛋白，正如所预期的(图6B第3和4泳道)。不过，这些截短KatA蛋白的量大大少于野生型KatA(隐匿在pXQ9上)(第2泳道)，说明这些截短的KatA蛋白是不稳定的。这些截短蛋白质没有在显著水平上抑制katA-gfp表达(图7第9和10泳道)，假定这是因为它们没有表现任何显著的过氧化氢酶活性(图8，表2)。
表2含有野生型或突变体katA基因的全细菌细胞中的过氧化氢酶活性a
a使根癌土壤杆菌细胞生长在IB平板上，然后收获。如“材料和方法”所述测量全细菌细胞中的过氧化氢酶活性。
b基于斯氏t检验，AG6(pXQ26)的过氧化氢酶活性显著不同于AG6(P＜0.05)。
c基于斯氏t检验，AG6(pXQ11)、AG6/(pXQ27)或AG6/(pXQ22)的过氧化氢酶活性显著不同于AG6。
由于根据同功酶染色工艺的检测，截短KatA蛋白不具有任何过氧化氢酶活性(图8)，因此重要的是知道功能性过氧化氢酶活性是否是这种反馈性抑制作用所需的。利用基序检索程序分析根癌土壤杆菌过氧化氢酶KatA的氨基酸序列(http//www.motif.genome.ad.jp)。结果揭示了位于自起始密码子第89至100氨基酸的12个氨基酸的基序(VGMMARVTWHAA)具有过氧化物活性位点signature的资格。该基序可能参与过氧化氢酶活性。
进行定点诱变，使过氧化氢酶活性失活。计算机分析揭示了KatA的保守基序中的Arg94和His98可能对过氧化氢酶活性而言是决定性的。前人的研究已经表明，大肠杆菌同源物HPI的对应残基Arg102和His106对过氧化氢酶活性而言是重要的(Hillar et al.，2000)。His98变为Asp(被称为KatA(98H/D))；Arg94变为Gln，His98变为Asp(被称为KatA(94R/Q)(98H/D))。所得质粒分别被命名为pXQ26和pXQ27。
如图8所示，野生型菌株A348和互补菌株AG6(pXQ23)都具有KatA过氧化氢酶活性带，而在突变体AG6、AG6(pXQ26)和AG6(pXQ27)中缺少这些活性带。这提示了在KatA的保守基序中His98或Arg94与His98的改变消除了KatA过氧化氢酶活性，这是利用染色工艺检测到的。进行蛋白质印迹分析，以检查突变蛋白质的稳定性。如图6A所示，AG6(pXQ26)和AG6(pXQ27)产生与野生型相同大小的KatA蛋白，高水平的点突变蛋白质蓄积在细胞中。如图7所示，这些两点突变蛋白质能够轻微地抑制katA-gfp表达。GFP表达事实上在AG6(pXQ23)中是不可检测的(第4泳道)，但是与不表达或表达截短蛋白质KatA的菌株相比(第7、8、9和10泳道)，GFP表达在AG6(pXQ26)和AG6(pXQ27)中减少了(第5和6泳道)。
重要的是确定突变KatA蛋白是否具有任何痕量的过氧化氢酶活性。向缺乏katA的AG6引入编码那些突变蛋白质的基因。然后测量全细菌细胞中的过氧化氢酶活性，因为假定这能够避免过氧化氢酶活性因细胞破裂过程而有任何失活。
如表2所示，含有突变蛋白质KatAΔ86、KatA(94R/Q)(98H/D)或KatAΔ50的细菌中的过氧化氢酶活性略高于AG6，但是不是统计学上显著的水平。这提示了这些突变KatA蛋白不具有任何显著的过氧化氢酶活性。这些全细菌细胞中的活性明显是由于除KatA以外的过氧化氢酶，因为AG6(缺乏katA)具有过氧化氢酶活性(图8和表2)。AG6(pXQ26)中的过氧化氢酶活性％在统计学上高于AG6，提示了KatA(98H/D)具有低水平的过氧化氢酶活性。这种低活性假定导致了有助于katA-gfp的低表达抑制(图7)。
有趣的是注意到KatA(94R/Q)(98H/D)(在菌株AG6(pXQ27)中)在低水平上抑制katA-gfp的表达(图7)，因为这种蛋白质的活性不是统计学上显著的，(即使有的话也)低于KatAΔ86(表2)，后者不在显著水平上抑制katA-gfp(图7)。这提示了KatA过氧化氢酶活性和蛋白质本身都参与katA-gfp的抑制。
总之，katA-gfp表达的抑制作用要求具有过氧化氢酶活性的功能性KatA蛋白的产生。另外，在突变KatA蛋白中，只有KatA(98H/D)和KatA(94R/Q)(98H/D)才能显著抑制katA-gfp表达，抑制水平大大低于野生型KatA(图7)。附带地，只有这两种突变KatA蛋白在非常高的水平上蓄积在细菌中(图6)。这提示了存在于细胞中的KatA蛋白的绝对量可能有助于抑制作用，大概是因为突变KatA蛋白仍然能够与H2O2结合，降低诱导katA-gfp表达的细胞内H2O2的可利用性。KatA(98H/D)在略高于KatA(94R/Q)(98H/D)的水平上抑制katA-gfp表达(图7)，大概是由于它有低过氧化氢酶活性，而KatA(94R/Q)(98H/D)不具有任何显著的过氧化氢酶活性(表2)，因为这两种重要的残基都已在假定活性位点上被改变(图5)。
实施例11katA能够被过氧化氢诱导然后，重要的是确定过氧化氢酶活性如何抑制katA-gfp表达。一种可能性是过氧化氢酶可以降低细胞内H2O2水平，抑制katA-gfp表达。为了确定katA的表达是否能够快被H2O2所诱导，象有些其他细菌的过氧化氢酶一样(Loewen，1997)，在液体MG/L培养基中将AG6用低浓度H2O2(30-120μM)处理，然后测定katA-gfp表达水平。
如图9所示，katA-gfp表达水平在H2O2的存在下显著增加，提示了katA表达可能受H2O2的诱导。这说明了过氧化氢酶活性能够抑制katA-gfp表达的原因是过氧化氢酶能够消耗katA诱导剂的水平。这意味着内源性H2O2在根癌土壤杆菌细胞内部充当细胞内katA表达诱导剂，酸性pH对katA的诱导作用涉及细胞内H2O2水平的增加。
实施例12酸性pH能够提高细胞内H2O2在katA-细胞中的蓄积由于katA能够被H2O2诱导，重要的是确定酸性pH对KatA的诱导作用是否真正是由于细菌细胞中内源性H2O2水平的提高。使细菌生长在酸性IB平板(pH 5.5)或中性AB平板(pH 7.0)上，测量细胞内H2O2浓度，工艺按照前人所述(Gonzalez-Flecha and Demple，1995；1997)，基于生长在IB或AB上的细菌细胞的细胞内与细胞外H2O2水平的完全平衡，然后重悬在磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中(参见“材料和方法”)。
如表3所示，生长在IB上的AG6细胞的细胞内H2O2浓度高于含有野生型katA的细菌细胞[A348和AG6(pXQ9)]大约10倍。生长在AB上的AG6细胞的水平高于具有野生型katA的细菌大约4倍。当AG6细胞的pH从7.0转变为5.5时，细胞内H2O2水平增加约3倍。具有野生型katA的细菌的细胞内H2O2浓度事实上是恒定的，与它们生长在AB或IB平板上无关。这些都说明了katA上的突变提高在酸性pH下生长的细菌的细胞内H2O2蓄积。在没有功能性katA的存在下由酸性pH所导致的细胞内H2O2水平升高诱导katA-gfp的表达。
表3生长在IB和AB平板上的细菌的细胞内H2O2浓度a
a使根癌土壤杆菌细胞生长在AB或IB平板上。如“材料和方法”所述测量细胞内H2O2浓度，基于生长在IB或AB上的细菌细胞的细胞内与细胞外H2O2水平的完全平衡，然后重悬在磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中。
实施例13细胞内H2O2清除测定技术这些研究表明，katA的突变能够提高生长在酸性pH下的细菌细胞的细胞内H2O2蓄积。在没有功能性katA的存在下由酸性pH所导致的细胞内H2O2水平升高诱导katA-gfp的表达。当向缺乏katA基因的细胞引入编码功能性过氧化氢酶的katA基因时，katA-gfp的表达被显著地抑制了(图4、7、8和10)。
在C末端截短的两种突变KatA蛋白表现非常低水平的细胞内蓄积，并且没有显著的过氧化氢酶活性；两种突变体都不在任何显著水平上抑制katA-gfp表达(图7和8，表2)。这些都说明了katA-gfp表达水平能够反映细胞的细胞内H2O2清除能力。如果向细胞引入了能够清除细胞内H2O2水平的大分子或小分子，那么katA-gfp表达将被抑制。因此，测量katA-gfp表达能够监测被引入到细胞中的分子的细胞内H2O2清除能力。
本研究中，全功能过氧化氢酶基因katA在最高水平上抑制katA-gfp表达；因而它具有最高的清除细胞内H2O2的能力(图4、7和10)。在C末端截短的两种突变KatA蛋白表现非常低水平的细胞内蓄积，没有显著的过氧化氢酶活性；它们都不在任何显著水平上抑制katA-gfp表达(图7和8，表2)。因而，它们没有显著的清除细胞内H2O2的能力。两种其他突变KatA蛋白KatA(98H/D)和KatA(94R/Q)(98H/D)能够显著抑制katA-gfp表达，抑制水平大大低于野生型KatA(图7)。
附带地，只有这两种突变KatA蛋白在非常高的水平上蓄积在细菌中(图6)。这提示了存在于细胞中的KatA蛋白的绝对量(sheer amount)可能有助于抑制作用，大概是因为突变KatA蛋白仍然能够与H2O2结合，降低细胞内H2O2的可利用性。KatA(98H/D)在略高于KatA(94R/Q)(98H/D)的水平上抑制katA-gfp表达(图7)，大概是由于它有低过氧化氢酶活性，而KatA(94R/Q)(98H/D)不具有任何显著的过氧化氢酶活性(表2)。所有这些都说明了本测定技术在测定不同分子的细胞内H2O2清除能力上是极其敏感的，本测定法能够分析直接或间接清除细胞内H2O2的分子。
实施例14周围细菌细胞对katA-gfp表达的抑制为了研究katA-gfp表达的抑制是否能够发生在细胞之间，将AG6与野生型菌株A348共同培养(见实施例7)。如图10所示，当A348与AG6混合时，A348的确能够抑制katA-gfp在周围AG6细胞中的表达(上栏)。A348+AG6混合物的荧光水平比单独的AG6减少约20倍(下栏)。AG6+A348混合物的活细胞数评价显示，AG6占总细胞的50％，正如所预期的，这提示了对混合物的抑制作用发生于细胞之间，不仅仅是由于非荧光性A348细胞的稀释效果。
在将AG6与R.meliloti和大肠杆菌共同培养时，也观察到了这种细胞间的抑制现象，这些细菌含有过氧化氢酶基因(Herouart et al，1996；Loewen，1997)，根据过氧化氢酶活性测定法的测量，具有过氧化氢酶活性。R.meliloti和大肠杆菌对katA-gfp表达的抑制作用弱于A348(图10)，设想这是因为它们在IB平板上的生长慢于AG6，这得到活细胞数实验的证实。这些都说明了在AG6中所生成的H2O2能够穿过细菌细胞膜，进入具有等价于KatA的过氧化氢酶活性的周围细胞。来自其他细菌种类的过氧化氢酶能够实现对katA-gfp表达的抑制。这说明在氧化性应激反应下，可以将细胞内H2O2清除剂应用于活细胞或非生命系统形式的细胞以外和附近，只要它们能够在氧化性应激反应下从邻近细胞接受H2O2即可。
有趣的是，加入到AG6细胞培养基中的活性过氧化氢酶没有抑制katA-gfp表达。向IB平板加入购自Sigma的过氧化氢酶，最终浓度为每ml 1或5微克。然后使AG6细胞(携带katA-gfp融合物)生长在IB平板上。细菌细胞表现与生长在没有过氧化氢酶的存在下的AG6细胞相同水平的GFP表达。为了确保IB培养基中的过氧化氢酶仍然是有活性的，向含有过氧化氢酶的平板上滴加过氧化氢。在含有过氧化氢酶的平板中立即见到气泡；在不含过氧化氢酶的对照平板中没有见到气泡。这证明了培养基中的过氧化氢酶是有活性的。因此能够得出结论，细胞外过氧化氢酶不能除去细胞内的过氧化氢。
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尽管已经提供了大量实施方式，不过显然利用本发明的方法和试剂盒可以改变基本构造，以提供其他实施方式。本发明的范围受附后的权利要求书的限定，而不是这里所提供的具体实施方式
，它们仅供举例说明。
序列表<110>潘申权(Pan，Shen Quan)<120>用于鉴别活性氧类物质清除剂的方法和试剂盒<130>79612-19<150>US60/266,657<151>2001-02-05<160>5<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>522<212>DNA<213>根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)<400>1ggcacgatcg cctatgacgt cgcgggtctg aagaccttcg gcttcgcctt cggccgcgaa60gacatctggg cgccggaaaa ggacacctat tggggtgacg aaaaggaatg gctggcgccg120agcgacggcc gttatggcga cgtgagcaag cccgagacgc tggaaaaccc gcttgccgcc180gtgcagatgg gcctgatcta cgtcaacccg gaaggtgtca acggcaagtc cgatccgctg240gcgacggcgg cgcagatgcg cgaaaccttt gcccgcatgg ggatggatga cgaggaaacc300gttgccctga cggccggcgg ccacaccatc ggcaagtccc atggcaatgg cagtgctgcc360aatctcagcc ccgatccgga agctgctggc ccggaatatc agggtctcgg ctggatcaat420accaagggcc gcggcattgg ccgtgacacc gtggtgtcgg gtatcgaagg cgcatggaca480agcgaaccaa ccaagtggga caacggcttc ttcgacatgc tg 522<210>2<211>2839<212>DNA<213>根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)<220>
<221>CDS
<222>(308)..(2476)<400>2aggctgggag atggcgcagg cttccgccgc gcgcccgaaa tggccgattt tggccagcgc60atcgaaataa cggagatgtt tcatggagag ggcaatcata agctcagcat atcgcagcct120ttagaatata caattggaaa ttatggaacc cggctgttag tcatcttcat gacagaaaga180agctgtagct gtggatgatc atcggcatcg cagcaggtcg tttgagacct gccgctgcct240ctggctcgga atgctgcaca tgtcgaactg ataatttgtt taattgctaa tcccatcgga300gggcgaa atg gac gca act tca aaa ccg gct ggc aag tgt ccc gtc atg 349Met Asp Ala Thr Ser Lys Pro Ala Gly Lys Cys Pro Val Met1 5 10cat gga ggc aat acg gcc tcc ggc aaa tcg gtg acc gaa tgg tgg ccg 397His Gly Gly Asn Thr Ala Ser Gly Lys Ser Val Thr Glu Trp Trp Pro15 20 25 30aac gcg cta aac ctc gac atc ctg cat cag cac gac acc aag acc aat 445Asn Ala Leu Asn Leu Asp Ile Leu His Gln His Asp Thr Lys Thr Asn35 40 45ccg ctc ggc acc tcc ttc aac tac cgc gaa gcg ctg aag acg ctt gat 493Pro Leu Gly Thr Ser Phe Asn Tyr Arg Glu Ala Leu Lys Thr Leu Asp50 55 60gtc gaa gcc ctc aag gcc gat ctg cgc gcg ctt atg acc gac agc cag 541Val Glu Ala Leu Lys Ala Asp Leu Arg Ala Leu Met Thr Asp Ser Gln65 70 75gaa tgg tgg ccg gcc gac tgg ggc agt tat gtc ggc atg atg gcc cgt 589Glu Trp Trp Pro Ala Asp Trp Gly Ser Tyr Val Gly Met Met Ala Arg80 85 90gtt acc tgg cat gcc gcc ggt tcc tat cgt gtc aca gac ggt cgc ggc 637Val Thr Trp His Ala Ala Gly Ser Tyr Arg Val Thr Asp Gly Arg Gly95 100 105 110ggc gcc aat acc ggc aac cag cgt ttt gca ccg ctc aat tcc tgg ccg 685Gly Ala Asn Thr Gly Asn Gln Arg Phe Ala Pro Leu Asn Ser Trp Pro115 120 125gac aac gtc aac acc gac aag ggc cgc cgc ctg ctg tgg ccg atc aag 733Asp Asn Val Asn Thr Asp Lys Gly Arg Arg Leu Leu Trp Pro Ile Lys130 135 140aag aaa tac ggc aac aag att tcc tgg gcc gac ctt atc gcg ctc gcc 781Lys Lys Tyr Gly Asn Lys Ile Ser Trp Ala Asp Leu Ile Ala Leu Ala145 150 155ggc acg atc gcc tat gac gtc gcg ggt ctg aag acc ttc ggc ttc gcc 829Gly Thr Ile Ala Tyr Asp Val Ala Gly Leu Lys Thr Phe Gly Phe Ala160 165 170ttc ggc cgc gaa gac atc tgg gcg ccg gaa aag gac acc tat tgg ggt 877
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<213>根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)<400>4ggtgcgctag ccaaattcgt caccaagc 28<210>5<211>24<212>DNA<213>根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)<400>5caatcgctag cgttcggccc tctg 2权利要求
1.测定化合物除去ROS的能力的方法，包含a)提供包含与报道基因可操作连接的ROS诱导性启动子的细胞，其中该报道基因与其可操作连接的启动子是异源的；b)使该细胞暴露于潜在能够除去ROS的化合物；c)在暴露于化合物时，测量细胞中ROS诱导性报道基因表达的变化；其中ROS诱导性报道蛋白表达的降低表明该化合物能够除去ROS。
2.从大量核酸中选择编码能够除去ROS的蛋白质的核酸的方法，该方法包含a)提供包含与报道基因可操作连接的ROS诱导性启动子的细胞，其中该报道基因与其可操作连接的启动子是异源的；b)向该细胞内引入包含大量核酸的表达载体，这些核酸编码潜在能够除去ROS的蛋白质；c)测量在核酸被表达时，细胞中ROS诱导性报道基因表达的变化；d)选择ROS诱导性报道基因表达降低的细胞；e)从报道基因表达降低的细胞中分离核酸；其中所分离的核酸编码能够除去ROS的蛋白质。
3.权利要求1或2的方法，进一步在步骤(c)之前包含用于升高细胞内ROS水平的步骤。
4.权利要求1或2的方法，其中该细胞已经被基因修饰过，含有升高了的细胞内ROS水平。
5.权利要求1至4任意一项的方法，其中该细胞缺乏至少一种天然存在的ROS除去活性。
6.权利要求1至5任意一项的方法，其中使细胞暴露于化合物的步骤包含从外部向细胞提供化合物。
7.权利要求1至5任意一项的方法，其中使细胞暴露于化合物的步骤包含从细胞内部的核酸表达该化合物。
8.权利要求1至7任意一项的方法，其中该ROS诱导性启动子来自选自下组的基因AhpCF、Bcp、Dps、gor、KatA、KatB/AnkB、KatG、TrxB、人MAP激酶磷酸酶1(MKP-1)基因；哺乳动物hic-5基因，细菌isc操纵子；大肠杆菌zwf、fpr、fumC、micF、nfo，soi28和sodA基因；维涅兰德固氮菌spr基因；水稻黄单胞菌水稻致病变种katX基因；大鼠和人血红素加氧酶-1(HO-1)；酵母2-脱氧葡萄糖-6-phophate磷酸酶(DOG2)；过氧化氢酶；人超氧化锰歧化酶(MnSOD)；大鼠谷胱苷肽S-转移酶(GST)；人间质胶原酶(MMP-1)；人谷胱苷肽过氧化物酶(GPX2)；鱼金属硫蛋白(MT)；大鼠多药耐受性1型(mdr1)。
9.权利要求5的方法，其中该细胞缺乏编码活性酶的基因，所述酶选自过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、烷基氢过氧化物酶和谷胱甘肽还原酶。
10.权利要求9的方法，其中该活性酶是过氧化氢酶。
11.权利要求1至10任意一项的方法，其中该ROS是H2O2。
12.权利要求11的方法，其中该H2O2诱导性启动子来自选自下组的基因AhpCF、Bcp、Dps、gor、KatA、KatB/AnkB、KatG、TrxB、人MAP激酶磷酸酶1(MKP1)基因；哺乳动物hic-5基因和isc操纵子。
13.权利要求1至12任意一项的方法，其中该细胞是细菌细胞。
14.权利要求13的方法，其中该报道基因编码对细菌而言有功能性的蛋白质。
15.权利要求13或14的方法，进一步在步骤(c)之前包含使细胞暴露于酸性培养条件来诱导该H2O2诱导性启动子的步骤。
16.权利要求13至15任意一项的方法，其中该细菌细胞是根癌土壤杆菌。
17.用于测定基因产物除去ROS的能力的诊断试剂盒，该试剂盒包含a)包含与报道基因可操作连接的ROS诱导性启动子的细胞，其中该报道基因与其可操作连接的启动子是异源的；b)用于在细胞中引入编码基因产物的核酸的装置；c)用于在核酸被表达时测定细胞中报道基因表达的降低的指导，由此测定该基因产物是否能够除去ROS。
18.权利要求17的诊断试剂盒，其中该报道基因编码报道基因产物，其中该试剂盒进一步包含用于测量报道基因产物的装置。
19.权利要求17或18的试剂盒，进一步包含用于升高细胞内ROS水平的装置。
20.权利要求17至19任意一项的试剂盒，其中该细胞已经经过基因修饰，含有升高了的细胞内ROS水平。
21.权利要求17至20任意一项的试剂盒，其中该细胞缺乏至少一种天然存在的ROS除去活性。
22.权利要求17至21任意一项的试剂盒，其中该ROS诱导性启动子来自选自下组的基因AhpCF、Bcp、Dps、gor、KatA、KatB/AnkB、KatG、TrxB、人MAP激酶磷酸酶1(MKP-1)基因；哺乳动物hic-5基因，细菌isc操纵子；大肠杆菌zwf、fpr、fumC、micF、nfo、soi28和sodA基因；维涅兰德固氮菌spr基因；水稻黄单胞菌水稻致病变种katX基因；大鼠和人血红素加氧酶-1(HO-1)；酵母2-脱氧葡萄糖-6-phophate磷酸酶(DOG2)；过氧化氢酶；人超氧化锰歧化酶(MnSOD)；大鼠谷胱苷肽S-转移酶(GST)；人间质胶原酶(MMP-1)；人谷胱苷肽过氧化物酶(GPX2)；鱼金属硫蛋白(MT)；大鼠多药耐受性1型(mdr1)。
23.权利要求21的试剂盒，其中该细胞缺乏编码活性酶的基因，所述酶选自过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、烷基氢过氧化物酶和谷胱甘肽还原酶。
24.权利要求21的试剂盒，其中该活性酶是过氧化氢酶。
25.权利要求17至24任意一项的试剂盒，其中该ROS是H2O2。
26.权利要求25的试剂盒，其中该H2O2诱导性启动子来自选自下组的基因AhpCF、Bcp、Dps、gor、KatA、KatB/AnkB、KatG、TrxB、人MAP激酶磷酸酶1(MKP1)基因；哺乳动物hic-5基因和isc操纵子。
27.权利要求17至26任意一项的试剂盒，其中该细胞是细菌细胞。
28.权利要求27的试剂盒，其中该报道基因编码对细菌而言有功能性的蛋白质。
29.权利要求27或28的试剂盒，其中该细菌细胞是根癌土壤杆菌。
30.权利要求1至29任意一项的方法或试剂盒，其中该ROS诱导性启动子来自根癌土壤杆菌的KatA基因。
全文摘要
本发明涉及用于测定细胞内H
文档编号C12Q1/02GK1500149SQ02807428
公开日2004年5月26日 申请日期2002年2月5日 优先权日2001年2月5日
发明者潘申权 申请人:潘申权