专利名称：含硫原花色素寡聚物的组合物及其制造方法
技术领域：
本发明涉及含硫原花色素寡聚物及其组合物、它们的制造方法和用途。更具体地说，本发明提供了将植物中原花色素的分子量降低至使其成为容易被生物体肠道吸收的程度而制造原花色素寡聚物的方法，并提供了以该方法得到的含硫原花色素寡聚物作为有效成分的健康食品和药品的组合物，其用于治疗和预防由活性氧类物质的生成所引起的各种生活习惯疾病和脑疾病。
背景技术：
随着饮食生活的改变使脂肪摄取过多、环境的改变、臭氧层的破坏使紫外线暴露量增多、环境污染物的增多等，高脂血症、高胆固醇血症、高血压、糖尿病、癌症等所谓的生活习惯疾病逐渐增加，过敏症、痴呆症等脑疾病的患者也逐渐增加。今后，伴随高龄化社会的发展，痴呆、阿尔茨海默综合征等疾病的患者恐怕也将会增加，这些疾病的主要原因被指出都与体内生成的活性氧类物质有关(Bioorganic & MedicinalChemistry，10(2002)，2497-2509)。但是，由于完全抑制和控制活性氧类物质生成的技术尚未开发，所以目前针对生活习惯疾病和脑疾病等的有效确实的预防治疗技术没有充分建立起来。
近年来，存在于植物中的具有生理活性的天然物质，特别是多酚类化合物受到关注。多酚类物质通常存在于茶叶、蔬菜、水果、草本植物类等中，可望成为能够作为食品或者嗜好品长期摄取的无副作用的治疗预防剂。
已知多酚化合物是植物的二次代谢产物，普遍而且大量地存在于植物界中，显示出各种生理活性，过去在药学、植物化学等领域以及近年来在健康食品领域都受到瞩目。例如，已知茶叶中的多酚类，特别是儿茶素类，具有抗菌、抗病毒、抗突变、抗氧化、降血压、降血脂、抗龋齿、抗过敏、改善肠道菌群和除臭等广泛的生理活性。
在多酚之中，原花色素类是在植物中普遍含有的一类多酚类物质。原花色素类必须由肠道吸收至生物体内才能显示出上述的各种生理活性。但是，原花色素类的分子量很大，通常在数千乃至数万的数量级。这样的大分子物质很难通过肠道吸收，往往即使摄取了也很难被生物体吸收利用。
本发明者已经发现由荞麦种子提取出来的多酚类物质具有改善脂质代谢、改善脑功能等作用，并获得专利(特开平10-218786号公报)，其有效成分是原花色素的多聚体，不能充分被生物体吸收。
发明内容
本发明将不易通过肠道被生物体吸收的原花色素化合物改变为容易吸收的形式，充分发挥了原花色素化合物所显示出来的各种生理活性从而提高了生物体的抗氧化活性，提供了对治疗和预防以活性氧类物质为原因所引起的生活习惯疾病和脑疾病的有用的医药品和健康食品等。
本发明者发现，将含有原花色素类的植物或其提取物与含有SH基的化合物反应而得到的低分子量的含硫原花色素寡聚物，易于经肠道被生物体吸收，通过口服而发挥多种生理活性，从而完成了本发明。
即，本发明涉及作为药品和健康食品有用的以下的含硫原花色素寡聚物及其组合物，以及它们的制造方法。
1.一种含有含硫原花色素寡聚物作为主要成分的组合物，其中所述寡聚物是通过使含有原花色素类的植物或其提取物与含有SH基的化合物反应制得的反应溶液进行浓缩和干燥而得到。
2.根据上述1所述的含硫原花色素寡聚物的组合物，其中所述寡聚物是原花色素的二聚体到五聚体。
3.根据上述1所述的含硫原花色素寡聚物的组合物，其中所述含有原花色素类的植物是从蔬菜水果类、茶类、草本植物及香料类、木材及树皮类之中选择的一种或以上。
4.根据上述1所述的含硫原花色素寡聚物的组合物，其中所述含有SH基的化合物是从半胱氨酸、胱氨酸、谷胱甘肽、含有SH基的肽和它们的盐类之中选择的至少一种。
5.根据上述1～4中任一项所述的组合物，其是用于治疗和/或预防生活习惯疾病的医药组合物。
6.根据上述1～4中任一项所述的组合物，其是用于预防衰老的医药组合物。
7.根据上述1～4中任一项所述的组合物，其是用于改善和/或预防生活习惯疾病的健康食品组合物。
8.根据上述1～4中任一项所述的组合物，其是用于预防衰老的健康食品组合物。
9.一种含硫原花色素寡聚物，其是通过使含有原花色素类的植物或其提取物与含有SH基的化合物反应制得的含有含硫原花色素寡聚物的成分进行分馏而得到。
10.根据上述9所述的含硫原花色素寡聚物，其中所述寡聚物是含硫原花色素的二聚体到五聚体。
11.含硫原花色素寡聚物组合物的制造方法，其特征在于，在酸性条件下使含有原花色素类的植物或其提取物与含有SH基的化合物反应，将所得的反应溶液浓缩和干燥。
12.含硫原花色素寡聚物的制造方法，其特征在于，在酸性条件下使含有原花色素类的植物或其提取物与含有SH基的化合物反应，将所得的反应溶液进行浓缩和分馏处理。
13.根据上述11或12所述的制造方法，其中所述含有原花色素类的植物是从蔬菜水果类、茶类、草本植物及香料类、木材及树皮类之中选择的一种或以上。
14.根据上述11或12所述的制造方法，其中所述含有SH基的化合物是从半胱氨酸、胱氨酸、谷胱甘肽、含有SH基的肽和它们的盐类之中选择的至少一种。
15.根据上述11或12所述的制造方法，其中使用无机酸、有机酸或它们两者得到所述酸性条件。
16.根据上述15所述的制造方法，其中使用盐酸、硫酸、硝酸、醋酸、柠檬酸、抗坏血酸、苹果酸之中选择的至少一种。
17.由下述式(4)所示的原花色素化合物。
18.由下述式(5)所示的原花色素化合物。
19.由下述式(6)所示的原花色素化合物。
20.由下述式(7)所示的原花色素化合物。
21.由下述式(8)所示的原花色素化合物。
图1所示为根据本发明的实施例1，分别给药了含硫原花色素寡聚物组合物(分馏前的粉末；物质1)和其原料(葡萄籽多酚提取物；比较物质1)的小鼠血清中的LPO浓度。(A)是低剂量给药组，(B)是高剂量给药组。
图2所示为根据本发明的实施例1，分别给予含硫原花色素寡聚物组合物(物质1)和其原料(比较物质1)的小鼠肝脏(A)、肾脏(B)和脑(C)中的LPO浓度。
图3所示为分别给药了实施例1中的本发明组合物(物质1)和实施例1的原料(比较物质1)的人血清LPO浓度，其中(A)是LPO浓度初期值正常者；(B)是LPO浓度初期值异常者。
图4所示为分别给药了实施例1中的本发明组合物(物质1)和实施例1的原料(比较物质1)的人血清SOD活性浓度，其中(A)是SOD浓度初期值正常者；(B)是SOD浓度初期值异常者。
图5所示为实施例1中的本发明物质1和比较物质1对β淀粉状蛋白引起PC-12细胞死亡的抑制效果。
图6的(A)和(B)所示的照片和图表是实施例1中的本发明物质1和比较物质1对β淀粉状蛋白降低线粒体膜电位的抑制效果。
图7的(A)和(B)所示的照片和图表是本发明物质1和比较物质1对β淀粉状蛋白引起的PC-12细胞内活性氧蓄积的降低效果。
图8所示为本发明物质1和比较物质1的细胞内抗氧化活性效果。
图9所示为本发明物质1和比较物质1对β淀粉状蛋白引起的细胞膜过氧化的抑制效果。
图10所示为本发明物质1和比较物质1在STZ诱发糖尿病小鼠中降低空腹血糖值的效果。
图11所示为本发明物质1和比较物质1在STZ诱发糖尿病小鼠中降低尿糖值的效果。
图12所示为本发明物质1和比较物质1在STZ诱发糖尿病小鼠中降低尿蛋白值的效果。
图13所示为本发明物质1和比较物质1在STZ诱发糖尿病小鼠中降低血中LPO值的效果。
图14所示为本发明物质1和比较物质1在STZ诱发糖尿病小鼠中升高血中TEAC值(抗氧化能力)的效果。
图15所示为本发明物质1在溴酸钾诱发大鼠急性肾功能障碍模型中升高血液多酚浓度的效果。
图16所示为本发明物质1在溴酸钾诱发大鼠急性肾功能障碍模型中升高血中TEAC值(抗氧化能力)的效果。
图17所示为本发明物质1在溴酸钾诱发大鼠急性肾功能障碍模型中抑制血液过氧化脂质浓度升高的效果。
图18所示为本发明物质1在溴酸钾诱发大鼠急性肾功能障碍模型中抑制尿素氮升高的效果。
图19所示为本发明物质1在溴酸钾诱发大鼠急性肾功能障碍模型中抑制血肌酸酐升高的效果。
具体实施例方式 本发明的含硫寡聚物通常是原花色素的二聚体到五聚体，分子量通常为1500或以下。
含有原花色素类的植物或其提取物与含有SH基的化合物的反应优选在酸性条件下进行。使用从盐酸、硫酸、硝酸等无机酸，或者醋酸、柠檬酸、抗坏血酸、苹果酸等有机酸之中选择的合适的酸，浓度为0.1N～1.0N左右，优选为0.5N。
在本说明书中的“原花色素”是指儿茶素多聚体，具体来讲，是指儿茶素、表儿茶素、表没食子儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯、没食子儿茶素和没食子儿茶素没食子酸酯。
含有原花色素的植物包括广泛而种类繁多的植物，包括柿子、梨、葡萄、草莓、香蕉、鳄梨、越桔、藕、荞麦等水果蔬菜类，和绿茶、红茶、乌龙茶等一般的茶类，草本植物和香料、木材和松树皮等。上述这些含有原花色素的植物或其提取物(包括榨汁、果汁、蔬菜汁)是适用的。
作为本发明所使用的含有SH基的化合物，可以列举出半胱氨酸、胱氨酸、谷胱甘肽、含有SH基的肽和它们的盐类等，此外还有洋葱和大蒜等含硫的天然物质。也可以使用硫醇类，当考虑到本发明的含硫原花色素寡聚物要应用于食品和医药品，所以优选使用允许用于食品和医药品的含SH基化合物。
含原花色素类的植物或其提取物与含有SH基的化合物的反应在室温～80℃下进行，优选在40～60℃下，反应持续数小时到一周，优选为24～48小时。
反应溶剂使用水、甲醇、乙醇等一种或多种的混合物，若考虑到要应用于食品和医药品，则优选使用水和乙醇。
反应结束后将残渣过滤，滤液浓缩后以常规方法纯化(或称为提纯、精制)。
即，可以通过对抽提出的提取物进行膜处理(超滤、反透析等)或者应用吸附剂而达到对浓缩液的纯化。吸附剂使用苯乙烯-二乙烯基苯类吸附剂、甲基丙烯酸类吸附剂、亲水性乙烯基聚合物、改性的右旋糖酐凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、反相类硅胶、离子交换树脂等。在应用这些吸附剂时，所吸附的级分(后文统称吸附级分)含有与含SH基反应了的分子量降低的多酚化合物(含硫原花色素寡聚物)。以乙醇水溶液、乙醇、丙酮等对该吸附级分洗提，可以得到不同分子量的级分。
此方法得到的含硫原花色素寡聚物通过正相HPLC和NMR测定，确定为以下通式(9)所示的原花色素的二聚体到五聚体。
通式中的n是0或者1～3的整数，R1代表氢原子或者下式所示的没食子酰基，R2和R3分别独立地代表氢原子或者羟基，R4代表半胱氨酸、胱氨酸、谷胱甘肽或者是含有SH基的肽残基。
由于含硫原花色素寡聚物是分子量在1500或以下的小分子，所以易于经肠道被生物体吸收，如后述的试验所证实，其具有很强的DPPH基消减作用(即去除作用)、增加SOD样活性的作用、抑制P450类脂质过氧化的作用、保护FNT氧化应激的作用、对抗β淀粉状蛋白诱导的氧化细胞死亡的神经细胞保护作用、对链脲菌素(STZ)诱发糖尿病的预防作用等，与其他的多酚物质相比有更高的抗氧化能力。而且，在对人体的抗氧化指标的监测试验中，也得到了证明其抗氧化效果的数据。
所以，以本发明的原花色素寡聚物为有效成分的组合物不仅有抑制生物体过氧化脂质生成的作用，还具有对以活性氧生成引起氧化损伤为原因的疾病的疗效，因此具有对因过氧化脂质或者活性氧生成所引起的各脏器机能障碍和衰老的预防作用，对上述原因所引起的各种疾病具有治疗和预防作用。而且，该组合物也被认为对抑制、预防和治疗因为脑衰老所引起的痴呆等脑功能障碍有效。同时，由于脑功能的改善，所以可望具有提高学习能力、减少注意力分散、消除失眠症和镇静的作用。所以，以本发明的原花色素寡聚物为有效成分的组合物，可以用作医药组合物和健康食品组合物。
以本发明的含硫原花色素寡聚物为有效成分的组合物没有任何毒性，可以非常安全地使用。该组合物可以口服或者非口服，口服时的剂量要根据年龄、体重、治疗目的和服用方法的不同而变化，通常，成人每人每次在100～2000mg的范围内。本发明的组合物口服给药时一般使用片剂、丸剂、胶囊、粉剂、颗粒、糖浆等，非口服给药时使用注射剂、擦剂等。造粒、片剂化或制成糖浆的时候，可以根据需要使用适当的辅助材料(淀粉、糊精、甜味剂、色素、香料等)。
实施本发明的最佳方案 以下是通过列举本发明的含硫原花色素寡聚物的实施例和试验例来具体说明本发明，但本发明并非只局限于此范围内。
实施例1葡萄籽来源的含硫原花色素寡聚物的制造 (1)葡萄籽多酚的抽提 8kg干燥的葡萄籽在室温下于80％甲醇(30L)抽提3天，将残渣过滤，滤液通过减压浓缩而得到浓缩液，通过以下的条件进行纯化。
[纯化条件] 全部溶液装入DIAION HP-20(三菱化学)200mmφ×30cm(约25L)中，用100L水洗涤。用50L甲醇洗提，得到的物质通过减压浓缩和冻干，回收到456g粉末状组合物。
(2)与半胱氨酸的降低分子量的反应 用上述(1)的方法得到的葡萄籽多酚400g，与L-半胱氨酸(和光纯药工业(株)生产)400g，抗坏血酸(纯正化学(株)生产)4g，柠檬酸(和光纯药工业(株)生产)0.8kg和水4L混合，在40℃反应48小时。将反应溶液装入以直径200mm、高800mm的DIAION HP-20(三菱化学(株)生产)为载体而充填的柱子(容量约25L)上，用100L水将非吸附级分洗去之后，以40％乙醇50L洗提，回收洗提的级分，通过减压浓缩、冻干，得到易溶于水、甲醇、乙醇的红褐色粉末(产量408g)。使用以Sephadex LH-20(Pharmacia Co.，Ltd.生产)为载体而充填的柱子(直径50mm，高500mm，容积约1L)，用乙醇-水混合溶液将该粉末分馏，应用野中等的方法(Chem.Pharm.Bull.，34(2)，633-642(1986))分析分馏(分级)物质的寡聚物组成，其组成如下 半胱氨酸结合的表儿茶素单体级分 19％ 半胱氨酸结合的表儿茶素二聚体级分21％ 半胱氨酸结合的表儿茶素三聚体级分11％ 半胱氨酸结合的表儿茶素四聚体～六聚体级分16％ (3)半胱氨酸结合的表儿茶素单体 以使用茚三酮-醋酸试剂的喷雾在加热下而呈现桃褐色的斑点作为对象，使用Sephadex LH-20凝胶做柱色谱层析(水-甲醇-丙酮)，将得到的半胱氨酸结合的表儿茶素单体级分进行纯化，分离得到下述分子式(1)～(3)所示的化合物(以下简称为化合物1～3)。
分子式(1)的化合物(化合物1)通过HR-FAB-MS(High ResolutionFast Atom Bombardment Mass Spectroscopy高分辨率快速原子轰击质谱)测定的分子离子峰[M+H]+(m/z)为410.0925，与分子式C18H20O8NS相应的计算值410.0910和3.6ppm(10ppm以内)的误差一致。所以，推定化合物1具有分子式C18H19O8NS，认为其化学构造是儿茶素或表儿茶素与L-半胱氨酸的硫原子结合。而且，化合物1用1H-NMR(氢核磁共振波谱，参照表1)测定时，在儿茶素或表儿茶素共同的芳香环上的5个质子信号以外，还观察到具有氧原子或硫原子基团的信号群δ5.09(br.s)、δ4.07(m)和δ3.86(d，J＝2Hz)，各为一个质子。前者提示具有表儿茶素的立体构型。δ3.86(d，J＝2Hz)的质子信号来自4α排列，相当于硫原子排列于4β的硫解产物的信号。此外，δ4.13(1H，dd，J＝9，4Hz、δ2.95(1H，dd，J＝15，9Hz)和δ3.43(1H，dd，J＝15，4Hz)确认是ABX型的信号群，提示亚甲基与半胱氨酸的甲川基邻接。以这些信息为基础，推定化合物1的化学结构为分子式(1)所示的4β-(S-L-半胱氨酰基)-(-)-表儿茶素。在化合物1的13C-NMR(碳-13核磁共振波谱，参照表2)(DEPT法)中也观察到的包含各碳原子级数在内的共18个碳原子信号，支持了这一结构。
分子式(2)的化合物(化合物2)应用1H-NMR(参照表1)，观察到具有氧原子或硫原子基团的信号群δ4.86(1H，d，J＝9，6Hz)、δ4.22(1H，dd，J＝9.6，4.3Hz)和δ4.23(1H，d，J＝4.3Hz)，各为一个质子。前两者分别来自儿茶素的2β、3β排列，δ4.23(1H，d，J＝4.3Hz)来自4α排列，相当于硫原子排列于4β的硫解产物的信号。所以，认为化合物1和化合物2只在三维立体结构上存在差异，推定化合物2的化学构造为分子式(2)所示的4β-(S-L-半胱氨酰基)-(+)-儿茶素。
分子式(3)的化合物(化合物3)通过HR-FAB-MS测定的分子离子峰[M+H]+(m/z)为426.0844，与比化合物1多一个氧原子的分子式C18H20O9NS相应的计算值426.0859和3.5ppm的误差一致。而且，除了在1H-NMR(参照表1)的测定中，在芳香环区域的δ6.57(2H，s)2′和6′位的氢被确定为等价信号以外，化合物3与化合物1是对应和相类似的。根据表2所示的13C-NMR信号来源加以分析，推定化合物3的结构为分子式(3)所示的4β-(S-L-半胱氨酰基)-(-)-表没食子儿茶素。
表1 化合物1、2和3的1H-NMR信号来源(δ单位ppm) 注)化合物1是在丙酮-d6-D2O中测定的， 化合物2和3是在CD3OD中分别测定的。
表2化合物1和3的13C-NMR信号来源(δ单位ppm) 注1)化合物1和3是在丙酮-d6-D2O和CD3OD中分别测定的 注2)同一栏内的右上角标有a)、b)的值能互相交换 (4)半胱氨酸结合的表儿茶素二聚体 用同样的方法纯化半胱氨酸结合的表儿茶素二聚体级分以分离出下述分子式(4)所示的化合物(以下有时简称为化合物4)。
化合物4在FAB-MS的测定中，显示其分子的离子峰[M+H]+(m/z)为698，认为是比化合物1多一个儿茶素单元的结构。尽管在TCL和HPLC中均显示单一行为，但是化合物4的1H-NMR显示了在宽的信号群中混杂有较尖锐信号的波谱。根据该特点的1H-NMR信号分布，认为缩合的结合位置在4→6或4→8之间，是具有较强旋转障碍的后者。认为4→8的直接结合使各个苯并吡喃来源的信号群变宽。即，δ4.22、δ4.54和δ4.96(各自分别为1H，br.m，C-3，-4，和-2)来源自上方的单元，相对更强的δ3.83和δ3.90(各自分别为1H，s，c-4′和-3′)、5,20(1H，br.m，C-2′)来源自与硫原子结合的单元(下方)。对分子模型的考察也提示下方的单元与上方的相比无旋转障碍。在δ5.92的芳香环区域，来源于C-6、-8和-6′的3个质子信号认为是包络(envelope)。从δ6.60到δ7.09认为是来源于两个单元B环上的质子群，其中结合常数8.3Hz的强双重线(doublet)信号来源于无旋转障碍的下端单元的5位。推测剩下的信号δ2.95、δ3.44(各自为1H，br.m，cys-C-3)、δ4.14(1H，dd，J＝9，4Hz，cys-C-2)分别来自半胱氨酸残基。化合物4的13C-NMR(参照表3)观察到与化合物1相当的信号群，支持了分子式(4)所示的化合物4的结构。所以，推定化合物4的结构是4β(S-L-半胱氨酰基)-(-)-表儿茶素-(4β→8)-(-)-表儿茶素。
表3化合物4的13C-NMR信号来源(δ单位ppm) 注1)各样品在acetone-d6-D2O中测定。
注2)右上角标有a)、b)和c)的化学转换值可以互相交换。
(5)半胱氨酸结合的表儿茶素三聚体 同样地纯化半胱氨酸结合的表儿茶素三聚体级分粉末，分离出以下分子式(5)所示的化合物(以下有时简称为化合物5)。
化合物5在HR-FAB-MS的测定中，显示分子的离子峰[M-H]+(m/z)为984.1956，与分子式C48H42O20NS相应的计算值984.2011和5.5ppm的误差一致。所以，推定化合物5具有分子式C48H43O20NS，认为其化学结构是儿茶素或者表儿茶素构成的3分子缩合体与L-半胱氨酸结合的。而且，化合物5的1H-NMR信号整体很宽，提示3个单元都以4→8结合直线状缩合，L-半胱氨酸与下方的单元结合。作为芳香环上的信号在δ5.98观察到的单线态，来源于A环6-H、8-H，A′环6-H，A″环-6-H。在较低磁场下观察到的信号群(δ6.04，s；δ6.91，7.01，s；δ7.11，s)，高度比约为3∶2∶1∶3，是来源自B环、B′环和B″环上产生的2-H的信号，δ6.91和δ7.01(2∶1)信号被认为为中间位置的B′-2-H因为受到旋转障碍而出现分裂产生的。以这些信息为基础，推定化合物5的平面结构暂定为分子式(5)。
实施例2葡萄籽来源的含硫原花色素寡聚物的生产 使用与实施例1相同的原料和条件抽提葡萄籽多酚，使用与实施例1相同的条件纯化。纯化物用以下条件与谷光甘肽反应，降低分子量。
即，将得到的葡萄籽多酚1.0g、谷光甘肽(和光纯药工业(株)生产)3.0g、抗坏血酸(纯正化学(株)生产)0.5g、1N盐酸50.0ml混合，40℃反应48小时。该反应液通过DIAION HP-20(三菱化学(株)生产)、MCIgel CHP-20(三菱化学(株)生产)、Sephadex LH-20(PharmaciaCo.，Ltd.生产)等进行纯化、减压浓缩、冻干，得到红褐色的粉末(产量120mg)。
1)谷光甘肽结合的单体 以聚苯乙烯凝胶、Sephadex LH-20凝胶、以及ODS类硅胶作为载体，以水和甲醇的混合液作为流动相，对得到的红褐色粉末反复进行柱色谱层析，得到分子式(6)所示的化合物(化合物6)。
化合物6通过HR-ESI-MS(High Resolution Electro-Spray IonizationMass Spectroscopy高分辨率电洒法质谱)测定显示其分子的离子峰[M+H]+(m/z)为596.1550，与分子式C25H30O12N3S相应的计算值596.1551和0.17ppm的误差一致。所以，认为化合物6的化学结构是儿茶素或者表儿茶素与来源于谷光甘肽的L-半胱氨酸的硫原子结合。在化合物6的1H-NMR测定中，除了儿茶素或表儿茶素在共同的芳香环上的5个质子信号群(δ5.84，5.96，6.91(各自分别为1H，8-，6-，2′-H)；δ6.73-6.78(2H，m，5′-，6′-H))以外，还确认具有氧原子或硫原子基团的信号群δ3.90，3.91，5.15(各自分别为1H，3-，4-，5-H)，推测是与化合物1相同、在表儿茶素的4位硫原子在4β结合的结构。此外，观察到半胱氨酸部分(δ3.63(1H，br.t，J＝9，4Hz，cys-2-H)，3.72，3.80(各自为1H，d，J＝17.6Hz，cys-3-H2))、谷氨酸部分(δ1.72(2H，m，glu-4-H2)，1.78(2H，m，glu-3-H2))，3.05(1H，br.d，J＝5.4Hz，glu-2-H))和甘氨酸部分(δ3.20(2H，s，gly-2-H2))相应的信号群。该结构也通过化合物6的13C-NMR中测定(参照表4)观察到25个碳的信号而得到支持。
所以，推定化合物6的结构是来自谷光甘肽分子的半胱氨酸部分的硫原子与表儿茶素的4β结合，如分子式(6)所示的4β-(谷光甘肽酰基)-(-)-表儿茶素。
表4 化合物6的13C-NMR信号来源(δ单位ppm) 注1)样品是溶解在CD3OD中测定的。
注2)右上角标有*的化学转换值可以互相交换 实施例3松树来源的含硫原花色素寡聚物的生产 (1)松树皮多酚的抽提 400g冷杉树皮在室温下于1.5L的80％甲醇抽提3天，将残渣过滤，滤液通过减压浓缩得到浓缩液，通过以下的条件进行纯化。
[纯化条件] 全部溶液装入DIAION HP-20(三菱(株)化学制)50mmφ×30cm(约600mL)中，用2500mL水洗涤。用1200mL甲醇洗提，得到的物质通过减压浓缩和冻干，回收到18.4g粉末状组合物。
(2)与半胱氨酸的降低分子量的反应 上述(1)的方法得到的松树皮多酚1.0g，与L-半胱氨酸(和光纯药工业(株)生产)1.7g，抗坏血酸(纯正化学(株)生产)0.25g和1N盐酸20.0mL混合，在40℃反应48小时。将反应溶液装入以直径25mm，高150mm的DIAION HP-20(三菱(株)化学制)为载体而充填的柱子(容积约100mL)中，用400mL水将非吸附级分洗去之后，用甲醇400mL洗提，回收洗提的级分，通过减压浓缩、冻干，得到红褐色粉末(产量0.95g)。
原花色素在试管内(体外)显示出很强的抗氧化活性，但是口服摄取未必能够在体内发挥充分的效果。考虑其原因是，大分子的原花色素很难经肠道吸收。对此，本发明用含有SH基的物质降低其分子量而得到的含硫原花色素寡聚物，不但在体外显示出与大分子原花色素相同的抗氧化活性，而且在体内显示出比大分子原花色素更优越的抗氧化活性。
实施例4杨梅来源的含硫原花色素寡聚物的制造 (1)杨梅多酚的抽提 400g杨梅树皮在室温下于1.5L 80％的甲醇抽提3天，将残渣过滤，滤液通过减压浓缩得到浓缩液，用于以下条件的纯化。
[纯化条件] 全部浓缩液装入DIAION HP-20(三菱化学(株)制)50mmφ×30cm(约600mL)中，用2500mL水洗涤后，用1200mL甲醇洗提，回收得到的物质，通过减压浓缩和冻干，回收到38.0g粉末状的组合物。
(2)与半胱氨酸的降低分子量的反应 用上述(1)的方法得到的杨梅树皮多酚1.0g，与L-半胱氨酸(和光纯药(株)生产)1.7g，抗坏血酸(纯正化学(株)生产)0.25g和1N盐酸20.0mL混合，在40℃反应48小时。将反应溶液装入DIAIONHP-20(三菱化学(株)制)25mmφ×150mm(约100mL)内，用400mL水将非吸附级分洗去之后，用甲醇400mL洗提，回收洗提的级分，通过减压浓缩、冻干，得到红褐色粉末0.95g。
(3)关于杨梅树皮多酚与L-半胱氨酸的结合体 1)L-半胱氨酸结合的表没食子儿茶素没食子酸酯单体 以聚苯乙烯凝胶、Sephadex LH-20凝胶、ODS硅胶作为载体，以水、甲醇、丙酮的任意混合液作为流动相，对上述(2)所得到的红褐色粉末反复进行柱色谱法纯化，分离得到表儿茶素没食子酸酯(epicatechin gallate)、表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechingallate)、(4β→8)表没食子儿茶素没食子酸酯以及上述化合物3，此外还有以下分子式(7)和(8)所示的化合物(化合物7和化合物8)。
化合物7通过ESI-MS测定，显示其分子的离子峰[M-H]+(m/z)为575。此外，1H-NMR(参照表5)的测定结果显示与化合物1和化合物3类似，但是可观察到向低磁场移动约1.3ppm的3-βH(1H，5.29，s)、且在芳香环区域的A环上的6、8位、以及6.68和6.69各为两个质子的两组很尖锐的等价的单线态信号(来自1，3，4，5位已被取代的苯环上的2和6位的氢)。这些信号提示其为表没食子儿茶素的没食子酸酯。
综合这些信息和表6所示的13C-NMR信号群的来源，推定化合物7的结构为分子式(7)所示的4β-(S-L-半胱氨酰基)-(-)-表儿茶素没食子酸酯。
2)L-半胱氨酸结合的表没食子儿茶素没食子酸酯二聚体 化合物8通过HR-ESI-MS测定，显示其分子的离子峰[M-H]+(m/z)为1032.1517，与分子式C25H30O12N3S相应的计算值1032.1503和1.4ppm的误差一致。所以，认为其化学结构是比化合物7多一个表儿茶素没食子酸酯单元。化合物8的1H-NMR与化合物4相同，显示在较宽的信号群中混有较尖锐的信号的波谱，认为其为4→8缩合型。1H-和13C-NMR的信号群来源与化合物4相同(分别见表5和表6)，推定化合物8的结构是分子式(8)所示的4β-(S-L-半胱氨酰基)-(-)-表儿茶素没食子酸酯-(4β→8)-(-)-表儿茶素没食子酸酯。
表5 化合物7和化合物8的1H-NMR信号来源(δ单位ppm) 注)化合物7和化合物8分别在25℃和40℃，在丙酮-d6-D2O中测定 表6化合物7和化合物8的13C-NMR信号来源(δ单位ppm) 注1)化合物1在丙酮-d6-D2O中测定， 化合物3在CD3OD中测定。
注2)右上角标有a)和b)的化学转换值可以互相交换 试验例1DPPH基消减作用 针对实施例1的分馏(分级)前的粉末(物质1)、将物质1分馏得到的单体级分(物质2)、将物质1分馏得到的三聚体级分(物质3)、将物质1分馏得到的四聚体～六聚体级分(物质4)、实施例1的原料(葡萄籽多酚提取物)(比较物质1)和市售的儿茶素(和光纯药(株)生产)(比较物质2)，用以下方法测定1，1-二苯基-2-苦基偕腙肼(DPPH)基的消减作用。
在96孔的微型板内加入100μL的DPPH溶液(60μM乙醇溶液)，分别加入试验试样的乙醇溶液100μL和作为对照的乙醇100μL，轻微混合后在室温放置30min，之后测定520nm的吸光度值，用以下公式计算出DPPH基消减能力。通过逐渐稀释的试验试样的DPPH基消减能力和浓度计算出50％有效浓度(EC50)。
DPPH基消减能力(％)＝[(1-(试验试样的吸光度)/(对照的吸光度)]×100 根据各试验试样不同浓度的DPPH基消减能力，计算出50％有效浓度。结果如表7所示。
在低浓度时，物质4的DPPH基消减作用相对较高。其他的试样显示了同样的活性，在高浓度时，各试样均显示了较高的活性。
表7 试验例2超氧物歧化酶(SOD)样活性 针对与试验例1相同的物质1～4和比较物质1～2，使用血液SOD检测试剂盒(SOD Test Wako和光纯药(株)生产)测定SOD样活性。应用下式计算SOD样活性，根据试验试样浓度与SOD样活性的关系计算出50％有效浓度(EC50)。
SOD样活性(％)＝[(1-(试验试样的吸光度)/(对照的吸光度))×100 根据各试样不同浓度的SOD样活性计算EC50，结果如表8所示。物质2～4的各分馏级分都显示了与比较物质1～2相比更高的SOD样活性。
表8 试验例3对亚急性FeNTA诱导多器官衰竭模型的作用 使用FeNTA(硝酸铁(Fe(NO3)3和次氮基三醋酸钠(NTA3Na)的混合物)进行试验，已知其被生物体摄取后将产生大量的活性氧，诱发多器官衰竭的体内氧化模型。
即，硝酸铁九水合物(关东化学(株)生产)240mg溶解于40ml冷水中，次氮基三醋酸钠一水合物390mg溶解于40ml冷水中，将二者在冰冷条件下混合，用1N的盐酸调节pH值为7.5，定容到100ml，以配制成FeNTA溶液。调制后10分钟之内，将相当于每kg体重22.5mg Fe的FeNTA溶液每隔一天在腹腔内给药于7周龄的雄性ddY系小鼠(平均体重30g)。每天分别强制口服相当于每kg体重25mg(低剂量组)和每kg体重50mg(高剂量组)物质1和比较物质1。让对照组摄取自来水，设置了不使用FeNTA的阴性对照组和使用FeNTA的阳性对照组。自由摄取饮水和食物。从给药开始第7、14、21、28天采血，测定血清中的过氧化脂质(LPO)浓度。从给药开始第28天解剖，取肝脏、肾脏、脑，测定各脏器的组织匀浆液的LPO浓度。
[试验结果] (1)血清中的LPO浓度如图1(A)和(B)所示。在低剂量组，物质1第21天的血清中的LPO浓度与比较物质1和阳性对照组相比显著降低(图1(A))。在高剂量组，物质1从给药开始到第28天也都显著降低(图1(B))。虽然比较物质在第21天也显示了低值，但是本发明物质显示了更强的效果。
(2)各脏器中的LPO浓度 肝脏、肾脏和脑中的LPO浓度如图2(A)～(C)所示。
肝脏在给药FeNTA后，LPO浓度没有明显升高，各给药组也没有变化。肾脏和脑在给药FeNTA后，组织匀浆液中的LPO浓度升高。物质1和比较物质1给药后，LPO浓度降低。肾脏和脑都是在物质1的高剂量组显示了最低值。特别是脑，虽然比较物质1给药后也显示了低值，但是物质1高剂量组与其他组相比显示了显著更低的值。
[结果总结] 给予FeNTA后使血清中的LPO浓度升高。物质1和比较物质1相比，在低用量和短期内发挥了效果。由此得出，物质1由于已经降低了分子量，口服后容易经肠道吸收，所以在低用量和短期内发挥了功效。特别是明确了物质1在肾脏和脑发挥很强的抗氧化活性。
试验例4人体监测试验 [试验方法] 健康男女34人(平均年龄41.2岁，男性21人，女性13人)如表9所示分为两组，28天内每天分别给药500mg物质1和比较物质1。给药开始前和给药28天后采血，测定血清中的LPO浓度和SOD样活性。
表9 [结果] 给药前后的LPO浓度和SOD样活性如图3和图4所示。图3(A)所示为初期值正常者的LPO浓度，图3(B)所示为初期值异常者的LPO浓度，图4(A)所示为初期值正常者的SOD样活性，图4(B)所示为初期值异常者的SOD样活性的结果。
比较物质1和物质1给药28天后，可观察到LPO浓度降低、SOD样活性升高的倾向。在初期值异常的受检者中，LPO浓度的初期值比较高的人(LPO浓度为8.0或以上)和SOD样活性比较低的人(SOD样活性为12.0或以下)在物质1给药组可观察到LPO浓度有统计学上显著的降低(图3(B))。同样，SOD样活性也在物质1给药组观察到有统计学上显著的升高(图4(B))。由此可以确认，物质1比等量的比较物质1对改善生物体的氧化状态更加有效。
试验例5保护神经细胞不受β-淀粉状蛋白诱导的氧化细胞死亡的效果 由神经再生异常引起的阿尔茨海默综合征以β-淀粉状蛋白蓄积而形成老年斑为特征。β-淀粉状蛋白是由于产生活性氧类物质而对神经细胞有细胞毒性，从而在阿尔茨海默综合征的发生和发展中起重要作用的物质。检测了降低了分子量的多酚(下文有时略称为GSM)保护神经细胞在神经细胞毒性试验中广泛使用的PC-12细胞不受调亡诱导的细胞损伤活性的作用。
[试验方法] 于含有10％热灭活的马血清和5％胎牛血清的DMEM培养基中，10％的二氧化碳气氛下培养PC-12细胞。事先调整细胞浓度为4×104细胞/300μL，培养24小时后，在不含血清的N-2培养基中加入GSM或者葡萄籽多酚(下文有时略称为GSP)1、1.5、5、10μg/mL浓度，培养于48孔的微型板。
(1)细胞存活试验 处理后，以终浓度为1mg/mL的MTT溶液处理细胞，以缓冲液溶解深蓝色的产物甲臢(formazan)，测定540～595nm的吸光度值。结果显示为与未处理的对照细胞的吸光度值的比值(％)。
[结果] MTT试验证明，GSM抑制了依赖于浓度的β-淀粉状蛋白引起的PC-12细胞死亡。特别是在1和1.5μg/mL的低浓度区域，该效果比GSP更强(图5)。
(2)线粒体膜电位测定试验 使用脂溶性阳离子探针TMRE测定线粒体膜电位。在GSM或GSP存在或不存在下以25μM的β-淀粉状蛋白处理PC-12细胞(1×104cell/mL)之后，以磷酸盐缓冲生理盐水清洗，37℃下用TMRE(150nM)处理30分钟。以激发波长488nm、发光波长590nm的荧光检测出依存于线粒体膜电位并蓄积在线粒体内的TMRE。
[结果] 在细胞死亡的症状之前，线粒体首先发生膜的完整性改变。该变化同时发生于线粒体的内膜和外膜，最终引起细胞色素C等可溶性跨膜蛋白质的释放，导致膜电位的释放和膜通透性的变化。PC-12细胞暴露于β-淀粉状蛋白后线粒体的跨膜电位急剧下降，应用TMRE使膜电位依存的细胞色素显红色荧光(图6(A))。GSM预处理显著减少了β-淀粉状蛋白引起的跨膜电位降低，该效果比GSP强(图6(A)和(B))。
(3)测定细胞内活性氧类物质的蓄积 为了观察活性氧类物质在细胞内的蓄积，应用了荧光探针DCF-DA(2′，7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯)。在GSM或GSP存在或不存在下以25μM的β-淀粉状蛋白处理PC-12细胞(1×106cell/3mL)之后，以克雷布斯-林格液清洗，加入10μM的DCF-DA。在37℃培养15分钟后用激光共聚焦显微镜观察，使用激发波长为488nm、发射波长为530nm的氩激光。
[结果] 为了阐明β-淀粉状蛋白引起PC-12细胞死亡的氧化应激，应用了能够透过细胞膜的DCF-DA来检测细胞内活性氧类物质的蓄积。在细胞内，DCF-DA被细胞的酯酶活性水解为DCF，并与过氧化物反应生成荧光物质。β-淀粉状蛋白处理的PC-12细胞因被DCF所染色而显示出来(图7(A))。GSM减少了β-淀粉状蛋白引起的细胞内活性氧类物质的蓄积，该效果也比GSP强(图7(A)和(B))。
(4)细胞内谷光甘肽浓度 细胞内谷光甘肽浓度采用市售的试剂盒(BIOXYTECH GSH-400OXIS Research公司生产，美国)来测定。收集在GSM或GSP存在或不存在下培养的以β-淀粉状蛋白处理过的PC-12细胞，在偏磷酸溶液内匀浆化，在离心分离的上清液中加入色原体盐酸溶液，搅拌后加入30％氢氧化钠溶液，在25℃孵育10分钟。然后测定离心分离的澄清上清液的400nm吸光度值。应用BCA蛋白质测定试剂盒测定蛋白质含量，与未处理的对照物比较蛋白质每单位重量相应的谷光甘肽浓度。
[结果] β-淀粉状蛋白引起的细胞死亡与氧化损伤有关。在β-淀粉状蛋白处理过的细胞中，细胞内的谷光甘肽浓度降低。在GSP处理过的细胞中，细胞内谷光甘肽浓度恢复到了正常水平，GSM的处理显示了比正常水平高的细胞内谷光甘肽浓度，显示了在细胞内更强的抗氧化活性(图8)。
(5)过氧化脂质浓度 过氧化脂质浓度采用市售的试剂盒(BIOXYTECH LPO-586OXISResearch公司生产，美国)来测定。收集在GSM或GSP存在或不存在下培养的以β-淀粉状蛋白处理过的PC-12细胞，在含有0.5mM丁基化羟基甲苯的20mM三盐酸盐缓冲液中匀浆化，用10.3mM的N-甲基-2-苯基吲哚的乙腈溶液稀释混合离心分离的上清液。加入37％的盐酸，在45℃孵育60分钟。冷却后，离心分离，测定澄清上清液的590nm吸光度值。应用BCA蛋白质测定试剂盒测定蛋白质含量，与未处理的对照物比较蛋白质每单位重量相应的过氧化脂质浓度。
[结果] 过氧化脂质生成的丙二酰二醛(MDA)显示了β-淀粉状蛋白处理引起的细胞膜过氧化。GSM或GSP预处理抑制了β-淀粉状蛋白引起的脂质过氧化，GSM的该效果较强，将过氧化脂质抑制到了未处理的对照水平以下(图9)。
[结果总结] 在神经细胞的模型细胞株PC-12细胞中，GSM因减少了神经细胞内活性氧类物质的蓄积而抑制了β-淀粉状蛋白毒性引起的神经细胞死亡。该效果比GSP强。β-淀粉状蛋白毒性引起的神经细胞死亡与细胞的氧化损伤有关，GSM抑制了细胞的氧化损伤，该效果比GSP强。
GSM的抗氧化作用抑制了与阿尔茨海默综合征的发病和发展密切相关的β-淀粉状蛋白所引起的神经细胞死亡，所以，提示GSM能够抑制阿尔茨海默综合征的发病和发展。
试验例6对链脲菌素(STZ)诱发糖尿病的预防效果 为了探讨物质1对STZ诱发糖尿病小鼠的预防效果，使用了STZ小剂量多次(multiple low doseMLD)给药诱发的相当于糖尿病初期的疾病模型。
[方法] 测定Jladdy小鼠(雄性，7周龄)的体重、血糖值和血中LPO值，使各组均等地分为以下组。
(1)阴性对照组STZ(-)(n＝5，1笼)， (2)阳性对照组STZ(+)(n＝5，3笼)， (3)物质1组STZ(+)+物质1(n＝10，2笼)， (4)比较物质1组STZ(+)+比较物质1(n＝10，2笼)。
STZ以20mg/kg的用量连续在腹腔内给药4天(此步骤做2轮)后，以40mg/kg的用量连续在腹腔内给药4天。将物质1或比较物质1各以0.06％的量混合在饲料中，使该饲料被自由摄取(根据每天的饲料摄取量，每天的物质1或比较物质1的摄取量大约为100mg/kg)。另外，给药时间是从STZ给药的5天前到第65天。
给药期间采集血液和尿液，测定了血糖、尿糖、尿蛋白、血尿素氮(BUN)、血中LPO/TEAC(Trolox等价抗氧化能力)。测定结果如图10～14所示。
[结果总结] (1)空腹血糖值 如图10所示，对于糖尿病，在空腹时血糖值显示高值，在STZ给药后第35天、49天和66天，阳性对照组的血糖值明显高于阴性对照组，确认了通过STZ小剂量多次给药制成了轻度糖尿病模型。物质1组和比较物质1组的血糖值比阳性对照明显降低，物质1和比较物质1相比显示了更强的降血糖效果。
(2)尿糖值 对于糖尿病，排泄到尿液的糖量增加。STZ处理使排泄至尿液的糖量大幅增加，能够确认小鼠已经诱发了糖尿病。如图11所示，可观察到物质1组和比较物质1组对STZ增加尿糖值有改善效果，在第49天，与阳性对照组相比分别都有明显的差异。而且，物质1和比较物质1相比显示了若干更低的值。
(3)尿蛋白值 对于糖尿病，排泄到尿液的蛋白质量增加。如图12所示，物质1和比较物质1能够抑制STZ引起的尿蛋白漏出到尿中，STZ给药后第49天，两物质和阳性对照组相比都明显降低了蛋白量。而且预测，和比较物质1相比，物质1从本疾病模型的早期开始就可表现出所起的作用。
(4)抗氧化指标 (4-1)血中LPO值 如图13所示，物质1组与阳性对照组和比较物质1组相比，观察到血中LPO值较低的倾向。
(4-2)血中TEAC值 TEAC(Trolox等价抗氧化能力)法是将某化合物的抗氧化活性换算为α-维生素E的衍生物Trolox的抗氧化能力的相对评价抗氧化强度的方法，通常作为抗氧化指标被广泛使用。如图14所示，血液的抗氧化活性在第49天和第66天中，比较物质1和阳性对照都显示了大致相同程度的抗氧化能力，与此相对，物质1给药组显示了较高的值，抗氧化能力最高。
[总结] STZ小剂量多次给药模型能够诱发小鼠的轻度糖尿病，和高剂量单次给药模型相比血糖值个体差异较少，所以认为是用于研究糖尿病预防效果的更加方便的模型。物质1能够抑制本糖尿病模型中和疾病发展相伴的血糖值和尿糖值的升高，提示其具有预防糖尿病的效果。
在STZ所引起的糖尿病中，在胰腺的β细胞内产生了特异的基团，该基团使β细胞受到损伤致死，从而诱发了糖尿病。推测由于物质1和比较物质1是在STZ给药5天前开始给药的，所以能够事先提高体内的抗氧化活性，减轻了STZ引起的β细胞损伤。
血中LPO和TEAC结果说明物质1明显升高了血液的抗氧化能力。一氧化碳或活性氧等基团与胰岛素依赖性糖尿病的胰岛的破坏有关是众所周知的事实，通过人体试验已经逐渐明确，只要抑制这些自由基对细胞的损伤就可以改善糖尿病。所以，提示物质1可谓是糖尿病的预备军，对健康人有预防效果，对早期糖尿病患者有抑制疾病发展的效果。
试验例7溴酸钾诱发大鼠急性肾功能障碍模型的比较试验 为了阐明物质1和其他的抗氧化多酚物质相比有多大程度的抗氧化能力，进行了溴酸钾诱发大鼠急性肾功能障碍模型的比较试验。
[方法] Wistar大鼠(雄性，12周龄)分组如下。
阴性对照组溴酸钾(-)(n＝5)， 阳性对照组溴酸钾(+)(n＝5)， 物质1组(葡萄籽来源)溴酸钾(+)+物质1(n＝5)， 物质5组(松树皮来源)溴酸钾(+)+物质5(n＝5)， 比较物质2组(儿茶素)溴酸钾(+)+比较物质2(n＝5)， 比较物质3组(银杏叶提取物)溴酸钾(+)+比较物质3(n＝5)， 比较物质4组(松树皮提取物)溴酸钾(+)+比较物质4(n＝5)， 比较物质5组(可可提取物)溴酸钾(+)+比较物质5(n＝5)。
溴酸钾以65mg/kg体重进行腹腔内单次给药。物质1、物质5和各比较物质是从溴酸钾给药开始(第0天)的一周前(第-7天)开始到第二天以10mg/kg体重的用量每天一次口服。在溴酸钾给药当天，在溴酸钾给药的30分钟前或后进行所述物质给药。在第-7天、第0天和第2天经颈静脉采血，测定血液的多酚浓度、过氧化脂质浓度、TEAC、尿素氮和肌酸酐。
[结果] 由于物质1和各比较物质是通过抗氧化作用而在溴酸钾诱发的大鼠急性肾功能障碍中发挥作用的，所以检测了作为抗氧化指标的血液多酚浓度、血液抗氧化能力(TEAC)、血液过氧化脂质浓度，和作为肾功能障碍疾病指标的血液尿素氮浓度、血液肌酸酐浓度。该测定结果如图15～19所示。
(1)抗氧化指标 (1-1)血液多酚浓度 如图15所示，溴酸钾给药前各组的血液多酚浓度的初期值都是一定的，而在物质1和各比较物质在给药7天以后溴酸钾给药第0天，物质1组显示了最高的值，其次是比较物质2组。物质1的给药升高了血液多酚浓度，确认其升高率明显高于各比较物质。
(1-2)血液抗氧化能力(TEAC) 如图16所示，物质1和各比较物质的一周预先给药使血液抗氧化能力表现出升高的倾向，和各比较物质相比，物质1的给药显著提高了抗氧化能力。
(1-3)血液过氧化脂质浓度 物质1和各比较物质的一周预先给药抑制了溴酸钾给药引起的血液过氧化脂质浓度的升高。如图17所示，该效果在物质1组最高，和各比较物质给药组相比显示了明显的低值。
(2)疾病指标 (2-1)血液尿素氮浓度 如图18所示，溴酸钾给药后血液尿素氮浓度和未处理的相比明显升高。物质1和各比较物质的给药抑制了溴酸钾给药引起的血液尿素氮浓度的升高。和各比较物质相比，物质1的给药对抑制血液尿素氮浓度的升高是显著的。
(2-2)血液肌酸酐浓度 如图19所示，溴酸钾给药后血液肌酸酐浓度和未处理的相比明显升高。物质1和各比较物质的给药抑制了溴酸钾给药引起的血液肌酸酐浓度的升高。和各比较物质相比，物质1给药显著抑制了血液肌酸酐浓度的升高。
[总结] 比较物质3、比较物质4和比较物质5是富含原花色素多聚体(大分子)的物质，虽然在试管内(体外)显示很高的抗氧化活性，但是被生物体摄取时，低分子化的物质1显示了更高的抗氧化活性。虽然比较物质2是单体(儿茶素)，但是仍然是物质1的活性更高，从血液中的多酚含量来看，也证明物质1由于降低了分子量而易于被生物体吸收，在生物体内也显示了很高的抗氧化活性。物质1的预先给药能够升高血液的抗氧化能力，发挥抗氧化活性。其结果是抑制了溴酸钾给药引起的血液过氧化脂质浓度的升高，抑制了肾功能障碍，抑制了尿素氮、肌酸酐向血液的渗漏。该效果显著高于各比较物质，明确了和迄今已知的以大分子多酚为主体的多酚物质和单体(儿茶素)相比，在被生物体吸收时其抗氧化性能更加优越。
[本发明物质的安全性] 通过单次给药毒性试验来评价安全性。即，物质1以每kg体重为2.5、5.0、7.5、10.0g的给药量，分别对8、7、3、18只ddY系小鼠(9周龄，雄性)强制口服。给药后观察行为变化、死亡的情况，计算出LC50。其结果，物质1的50％致死浓度(LC50)是5.0g/kg体重(95％置信区间3.5～6.4g/kg体重)。而且，未观察到给药后的行为异常，试验结束时的解剖观察也未见异常。所以，确认物质1作为食品是安全性极高的物质。
在上述的试验例4(人体监测试验)中，以问卷的方式收集了被检者的评论。其中，与睡眠相关的内容如表10所示，关于疲劳感、头脑清晰、胃功能，通过5个阶段的评价得出的结果如表11所示。
表10 表11 (数值越大代表状态越良好，括号内是给药前的数值)
权利要求
1.由下述式(6)所示的原花色素化合物，
全文摘要
本发明提供一种制造含硫原花色素寡聚物的方法，其是将植物中原花色素类的分子量降低至成为容易被生物体的肠道吸收的程度，并提供以该方法得到的含硫原花色素寡聚物作为有效成分的健康食品组合物和医药品组合物，其用于治疗和预防由于活性氧的生成等原因所产生的各种生活习惯疾病和脑疾病、以及用于预防衰老。
文档编号C07D311/22GK101182317SQ20071016188
公开日2008年5月21日 申请日期2004年5月25日 优先权日2003年5月26日
发明者野中源一郎, 孙步祥, 岚 袁, 中川乔, 藤井创, 徐荣俊 申请人:阿明诺化学株式会社, 鸟犀圆制药株式会社