专利名称：细胞膜蛋白derlin-1及其制备和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的人肿瘤抗原细胞膜蛋白DERLIN-1 、其结合配体 以及它们在筛选和/或制备用于治疗和/或诊断肿瘤的药物中的用途。
背景技术：
肿瘤是人类最常见的疾病之一，其死亡率在世界和我国的各种疾 病中分别排在第二位和第三位，严重影响着人类的健康。在我国随着 社会的发展，肿瘤的发病率还在逐年上升。我国目前有肿瘤患者约 450万人，死亡率在30%以上，而且每年新增的患者人数高达200万 人以上。有效地医治肿瘤已是科学研究中的当务之急。临床治疗肿瘤 的方法主要是手术切除和放、化疗，但是，放、化疗在杀死癌细胞的 同时，给人体正常细胞也带来了严重的损伤。此外，目前治疗恶性肿 瘤的手术，放疗，化疗三大常规治疗手段并没有明显的降低肿瘤的死 亡率，其5年生存率仅达10-30e/。，因此全世界各国均在始终不懈的 探索，力图寻找出更有效的治疗手段。随着对肿瘤研究的不断深入， 人们开始尝试采用生物方法针对肿瘤发展进程中的不同层面进行治 疗并且已经取得了一定效果，肿瘤的生物靶向治疗必将成为最有前景 和最活跃的领域。
肿瘤的靶向治疗很重要，"靶向"是肿瘤治疗中必须遵守的原则， 高效、准确地命中肿瘤这个"耙"，实现有的放矢是肿瘤治疗的关键所 在。因此，找到高效、特异的靶点是肿瘤生物靶向治疗的关键。目前， 已经公开报道了一些肿瘤治疗耙点，它们或者参与了肿瘤的生长过 程，或者在肿瘤的转移、耐药性的诱导的过程中发挥作用，并且针对
4所述的靶点也设计了一些新的药物，例如针对CD20分子的抗体类抗 淋巴瘤靶向药物Rituxan，针对EGFR的小分子化合物类抗肺癌耙向药 物Iressa。但是，目前开发的抗肿瘤药物对临床的需要来说仍然是远 远不够的，因此仍然亟需发展更多的抗体类抗肿瘤药物。
现有技术中显示DERLIN-1是位于细胞内质网膜上的蛋白，它参 与了内质网内部错误折叠蛋白向胞浆中转运的过程(Yihong Yel, Yoko Shibatal, Chi Yun2， David Ron2 & Tom A. Rapoportl. A membrane protein complex mediates retro-translocation from the ER lumen into the cytosol NATURE. 2004; (429): 841-847)。由于人们仅仅 发现DERLIN-1位于内质网膜，且没有如上所述肿瘤靶标方面的研究， 因此目前本领域均认为该蛋白不能用作肿瘤治疗的靶点。
发明内容
本发明基于以下新发现DERLIN-1位于肿瘤的细胞膜上，并且 参与肿瘤的生长过程，因此可以作为肿瘤诊断和/或治疗中的靶点。
一方面，本发明涉及细胞膜蛋白形式的DERLIN-1及其制备，其 中DERLIN-1蛋白的序列为SEQIDNO:l。
另一方面，本发明涉及细胞膜DERLIN-1蛋白作为新的肿瘤诊断 和/或治疗耙点的用途。具体地，本发明的细胞膜DERLIN-1蛋白可 以作为肿瘤靶蛋白用来筛选用于治疗肿瘤的药物。
本发明还涉及DERLIN-1蛋白结合配体，其在制备肿瘤诊断剂和 /或治疗药物中的用途，以及包含抗DERLIN-1蛋白的单克隆抗体的 肿瘤诊断剂和/或治疗药物。具体地，所述DERLIN-1蛋白结合配体 是抗DERLIN-1蛋白的单克隆抗体，其可获自稳定分泌抗DERLIN-1 单克隆抗体的杂交瘤细胞克隆HEC252/9F12，所述杂交瘤细胞于2007 年11月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No. 2242。
此外，本发明还涉及利用DERLIN-1蛋白结合配体诊断和/或治 疗肿瘤的方法。
图1显示DERLIN-1蛋白的氨基酸序列(SEQIDNO: 1)。 图2显示用DERLIN-1蛋白多克隆抗体通过免疫组化方法检测肿
瘤组织及配对的癌旁正常组织中DERLIN-1蛋白表达情况。
图3和4分别显示用活细胞免疫荧光法检测肿瘤细胞和正常永生
化细胞中DERLIN-1蛋白基因的亚细胞定位的结果。
图5显示用激光共聚焦法检测DERLIN-1蛋白在肿瘤细胞膜表面
的表达的结果。
图6显示用DERLIN-1蛋白多克隆抗体通过免疫组化方法检测正 常人体组织中DERLIN-1蛋白表达情况。
图7是DERLIN-1蛋白多克隆抗体体内分布实验，显示DERLIN-1 蛋白特异分布于肿瘤细胞表面，而不在正常组织细胞表面
图8是DERLIN-1蛋白单克隆抗体体内显影的分子影像学实验， 耙向DERLIN-1蛋白的抗体在荷瘤小鼠的显像可以确定肿瘤的部位 及大小。
具体实施例方式
根据本发明的第一个方面，本发明涉及细胞膜DERLIN-1蛋白 (SEQIDNO:l)及其制备，例如可通过重组方法进行制备。 一个优 选的实施方案中，细胞膜DERLIN-1蛋白通过如下方法制备并纯化 (1)构建^W"-7基因的cDNA的表达序列；
6(2) 将所述cDNA克隆入表达载体，并将所述表达载体转入 原核细胞或真核细胞中；
(3) 使DERLIN-1蛋白在所述的宿主细胞中表达； (4 )纯化所表达的DERLIN-1蛋白。
其中，所述表达载体优选pET-30b载体或其他真核载体。所述宿主细
胞是本领域常用的原核或真核宿主细胞，优选原核宿主细胞，例如 BL21E3细菌，中国仓鼠卵巢癌细胞CHO。所述的蛋白的纯化方法可 采用本领域常规的方法，例如参见Novagen公司编写的pET系统操作手 册。
根据本发明的另一个方面，本发明涉及细胞膜DERLIN-1蛋白作 为新的肿瘤诊断和/或治疗靶点的用途。具体地，本发明的细胞膜 DERLIN-1蛋白可以作为肿瘤耙蛋白筛选用于诊断或治疗肿瘤的药 物。筛选药物的方法可以利用本领域技术人员已知的筛选方法，例如 参见"开发小肽，筛选新药"，王克夷等，中国生化药物杂志2003年 第24巻第1期，48-50页；"噬菌体随机肽库的应用"，免疫学杂志 2000年第5期第16巻，李华朱锡华等；"小分子活性肽筛选方法"， 《生命的化学》2004年24巻1期，第16-18页，罗以勤，王梁华， 焦炳华等。根据本发明上述筛选方法得到的抗肿瘤药物可以是例如单
克隆抗体，或者与DERLIN-1蛋白结合的其他类型的分子，如多肽或 其他小分子药物等。此外，可以将一些治疗性物质偶联于与细胞膜 DERLIN-1蛋白具有高亲和力的耙向药物上以达到治疗的效果，如将 放射性核素偶联于抗DERLIN-1蛋白单克隆抗体上。
根据本发明的又一方面，本发明涉及DERLIN-1蛋白结合配体， 在一个实施方案中，所述DERLIN-1蛋白结合配体是抗DERLIN-1蛋 白的单克隆抗体。本发明术语"DERLIN-1蛋白结合配体"与本领域
7技术人员通常理解的那样，意指能与DERLIN-1蛋白高效特异性结合 的配体分子，包括例如单克隆抗体、多肽或者小分子化合物等肿瘤耙 向药物。在一个实施方案中，所述DERLIN-1蛋白结合配体是单克隆 抗体，其可获自稳定分泌抗DERLIN-1单克隆抗体的杂交瘤细胞克隆 HEC252/9F12，所述杂交瘤细胞于2007年11月2日保藏于中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No. 2242。 在一个实施方案中，所述的单克隆抗体的制备和纯化包括如下步
骤
(1) 用通过本发明所述方法制备并纯化的DERLIN-1蛋白 免疫动物，获得免疫血清；
(2) 利用间接ELISA测定免疫血清中抗DERLIN-1蛋白抗
体的滴度；
(3) 收集其中所述抗体的滴度达到108以上的免疫血清；
(4) 通过亲和层析法纯化所得的免疫血清。 其中所述的动物为哺乳动物，包括例如鼠、猴、兔、马、牛、
羊、猪、人等。
根据本发明的一个优选的方面，本发明的DERLIN-1蛋白结合配 体可用于制备肿瘤的治疗药物。在一个优选实施方案中，所述 DERLIN-1蛋白结合配体是本发明的单克隆抗体，具体可为保藏号 CGMCCNo.2242的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体。所述的单克隆抗 体也可以包含在药物组合物中。所述组合物可包含治疗有效量的 DERLIN-1蛋白单克隆抗体及其他治疗性药物，从而提高治疗效果。 治疗效果的提高可体现为使得达到相同的治疗效果所用的DERLIN-1 蛋白单克隆抗体或其他治疗性药物的剂量更少或将DERLIN-1蛋白 单克隆抗体与其他治疗性药物组合后可以得到更好的肿瘤抑制效果。 本发明所述药物组合物可用于治疗肿瘤，在一个优选实施方案中，所述肿瘤是胰腺癌。在另一个优选实施方案中，所述肿瘤是结肠癌。本
发明所述的组合物还可以用于其他高表达DERLIN-1蛋白肿瘤的治
疗，包括卵巢癌、乳腺癌、皮肤癌、肝癌、肾癌、骨髓瘤、甲状腺
癌，肺癌、子宫癌、前列腺癌、脑癌、胸腺癌、胃肠道肿瘤等。所述 组合物可以通过常规给药途径给予受试者。所述的给药途径例如经胃 肠外给药，例如经静脉、经输注、口服等。
在另一优选的方面中，本发明涉及用DERLIN-1蛋白结合配体进 行肿瘤诊断。将包含DERLIN-1蛋白结合配体的药物导入人体后，由 于DERLIN-1蛋白特异的高表达于肿瘤细胞膜，因此药物能与肿瘤细 胞结合而不与正常细胞结合，因此通过分析药物在体内的滞留部位即
可知道肿瘤的分布，大小等信息，即分子显影。在一个实施方案中， 将DERLIN-1蛋白单克隆抗体标记1251后能够短时间内清楚的显示实 验动物体内的肿瘤影像。
本发明通过下述实施例进一步阐明，但任何实施例或其组合不应 当理解为对本发明的范围或实施方式的限定。本发明的范围由所附权 利要求书限定，结合本说明书和本领域一般常识，本领域普通技术人 员可以清楚地明白权利要求书所限定的范围。
实施例
实施例1:新的人肿瘤抗原DERLIN-1的制备
按照现有技术(分子克隆第三版)，克隆DERLIN-1基因的cDNA 编码序列，并将其构建在表达载体PET-30b(购自Novagen公司)上， 在BL21E3细菌(购自北京全事金生物技术有限公司)中表达 DERLIN-1蛋白。
表达得到的DERLIN-1蛋白氨基酸序列如下(SEQIDNO: 1) H2N-MSDIGD曹RSIPAITRYWFAATVAVPLVGKLGLISPAYLFL
9AQLNRDMIVSFWFGTRFKACYLPWVILGFNYIIGGSVINELIGNLV
ASMRRAADQNGGGGRHNWGQGFRLGDQ -COOH 实施例2 DERLIN-1蛋白多克隆抗体的制备
采用实施例1中表达的DERLIN-1蛋白免疫家兔(新西兰兔，购 置维通利华公司)制备抗DERLIN-1蛋白多克隆抗体。具体步骤如下 免疫前自兔耳缘静脉取血备检。第一次免疫DERLIN-1蛋白与弗氏 完全佐剂按1:1的比例充分混匀后经皮内注射免疫家兔，每只注射 200ng DERLIN-1蛋白的KLH偶联物。第二次免疫第一次免疫后 14天，取200pgDERLIN-1蛋白与弗氏不完全佐剂充分混匀后再次经 皮内注射免疫家兔。注射卡介苗第二次免疫后5天，按每只兔子 50mg卡介苗(购自北京市生物制品研究所)的剂量经趾皮下多点注 射免疫家兔，以进一步激活家兔免疫系统。第三次免疫自注射卡介 苗之日算起10天后，按每只兔子200pg DERLIN-1蛋白的剂量与弗 氏不完全佐剂充分混匀后皮内注射免疫家兔。效价测定第三次免疫 后10天自兔耳缘静脉取血，以测定免疫血清的抗体滴度。当免疫血 清中目标抗体的滴度达到108以上时，自兔颈动脉取血，并置于直径 为180mm的干净平皿中，4。C过夜。次日，离心分离血清.用偶联有 DERLIN-1蛋白的亲和层析柱(参照美国安玛西亚公司产品 CNBr-activated S印harose 4B使用说明书制备)纯化了得到的免疫 兔血清，从中分离出只与DERLIN-1蛋白结合的抗体。所得的多克隆 抗体为纯化的多克隆抗体，用于以下的实验中。
实施例3 DERLIN-1蛋白在多种肿瘤组织中表达的检测
1.免疫组化法
10石蜡包埋的肿瘤组织(肿瘤组织标本采集于中国医学科学院肿瘤 医院)进行常规石蜡切片，经二甲苯脱蜡，梯度酒精水化。3%过氧
化氢室温10min，阻断内源性过氧化物酶的活性。切片在枸橼酸缓冲 液(0.01M， pH6.0)中用微波加热法进行抗原修复。用10%正常山 羊血清(购自北京中杉金桥生物技术有限公司)室温封闭30min。弃 封闭液，加入lpg/ml的抗DERLIN-l蛋白多克隆抗体，4°C孵育过 夜。然后用PBS洗3遍，每遍5min。加入适当浓度生物素标记的羊 抗兔二抗室温孵育30min。然后PBS洗3遍，每遍5min，加入HRP 标记的链霉卵白素(购自北京中杉金桥生物技术有限公司)，室温孵 育30min。 DAB染色，苏木素复染，封片。设正常兔IgG为阴性对 照。显微镜下观察结果。在胰腺癌、肝癌、结肠癌、乳腺癌、食管癌、 前列腺癌中，DERLIN-1蛋白的表达明显高于对应的正常组织，且可 见一定程度的细胞膜表达，而在正常组织中弱表达的DERLIN-1不在 正常细胞的细胞膜表达(图2)。另外通过免疫组化还发现在肺癌中 DERLIN-1表达明显高于对应正常组织，且也见DERLIN-1蛋白表达 于肿瘤细胞膜(图2)。
2.活细胞免疫荧光和激光共聚焦检测法
应用实施例2中制备的DERLIN-1蛋白多克隆抗体检测了 DERLIN-1基因在正常细胞和肿瘤细胞中的表达的亚细胞定位。用活 细胞免疫荧光和激光共聚焦研究了 DERLIN-1蛋白在细胞膜的表达 情况。通过上述实验，发明人发现，DERLIN-1蛋白在卵巢癌细胞、 乳腺癌细胞、结肠癌细胞系、胰腺癌细胞、肺癌细胞的细胞膜上表达， 不在永生化细胞的细胞膜上表达。
通过活细胞免疫荧光法检测
细胞在存活时具有完整的细胞膜，抗体大分子不能直接透过细 胞膜而进入到细胞中，而仅能与位于细胞膜外膜面的蛋白分子的表位
ii反应，而用于对照的抗a -微管蛋白抗体不能与活细胞膜呈阳性反应， 仅当细胞不完整时抗a -微管蛋白抗体能进入细胞与细胞内的a -微 管蛋白反应。因此以抗ci -微管蛋白抗体为阴性对照可反映细胞膜的 完整性，而抗DERLIN-1蛋白抗体的活细胞免疫荧光研究阳性结果则 显示DERLIN-1蛋白位于细胞外膜面。具体的活细胞免疫荧光实验步 骤如下
将肿瘤细胞(人胰腺癌细胞Suitn，购自中国医学科学院基础医 学研究所)接种于培养皿，培养至70%满。将肿瘤细胞轻轻从培养皿 中刮下，细胞用PBS洗涤一次，再用含10%马血清(购自北京中杉 金桥生物技术有限公司)的PBS室温封闭，之后加入实施例2制备 的抗DERLIN-1蛋白兔多抗(liag/ml)和鼠抗a -微管蛋白抗体(sigma， 稀释1:1000)室温孵育lh，洗涤后加入Cy3标记的羊抗兔IgG (美 国Jackson免疫实验公司)和Cy2标记的羊抗小鼠IgG (美国Jackson 免疫实验公司)，室温孵育30min， PBS洗涤，用含10吗/mlDAPI (美 国SIGMA公司)和50%甘油的PBS覆盖细胞，将细胞封闭于载波片 上，在荧光显微镜下观察。
胰腺癌SuitII的活细胞免疫荧光为阳性表明DERLIN-1蛋白表达 于细胞外膜面(图3)，而正常永生化细胞HEK293活细胞免疫荧光 为阴性，表明DERLIN-1蛋白不表达于细胞外膜面(图4)。
通过激光共聚焦法检测DERLIN-1蛋白在肿瘤细胞膜表面的表
达
将上述的用活细胞免疫荧光检测的细胞置于激光共聚焦显微镜下 进行观察，通过激光共聚焦法检测DERLIN-1蛋白在胰腺癌细胞膜表 面的表达。结果显示免疫荧光在胰腺癌SuitII活细胞膜表面呈典型 的环状膜表达，如图5所示。另夕卜，在结肠癌细胞系HCT116， Lsl80， Swl16 (购自中国医学科学院基础医学研究所)等细胞中也能观察到 DERLIN-1蛋白表达于细胞外膜面(图5)。实施例4 DERLIN-1基因在人多种正常组织中的表达谱
用实施例2中制备的纯化的DERLIN-1蛋白多克隆抗体检测了 DERLIN-1基因在多种人体正常组织中的表达情况。正常组织中， DERLIN-1在十二指肠、睾丸、肝中均有表达，表达阳性率分别为 75%、 60%、 63.2%(图6)。其中多种组织中的表达情况总结如表1。 DERLIN-1虽然在这些正常组织中表达，表达强度明显较肿瘤组弱， 且不见细胞膜表达。
表1DERLIN-1在人体各种正常组织中的表达_
iii 检测例数 阳性例数 阳性率(％)
实施例5利用免疫荧光法检测DERLIN-1蛋白细胞在多种人肿 瘤细胞和正常细胞的细胞膜和细胞浆中的表达谱
利用实施例2制备的抗体，通过活细胞免疫荧光和固定细胞免疫 荧光的办法(胡海，冉宇靓，陈立钊，遇珑，孙立新，杨治华采用抗
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j丸 腺 管宫 直腺列肠 巴肤 髓腺巢状
十睾肝胰胃食子肺结乳前小脾肾淋皮脑骨胸卵里
13体库技术筛选抑制肺癌的功能性抗体肿瘤防治研究200736(6):395-8)，我们研究了 DERLIN-1蛋白在多种人肿瘤细胞和正常细胞膜和细胞浆中的表达。
活细胞免疫荧光的方法参见实施例3，固定细胞免疫荧光的方法如下按4xl0V孔将如表2中所列的肿瘤细胞(购自中国医学科学院基础医学研究所)接种入96孔细胞培养板(美国Axygen公司产品)培养。细胞汇合后以PBS洗三遍，用丙酮/甲醇(acetone/methanol)(l:l)室温下固定10min。用3。/。过氧化氢(hydrogen peroxide)作用10min以灭活内源性过氧化物酶，用10%正常马血清(购自北京中杉金桥生物技术有限公司)作用10min以阻断非特异结合位点。抗DERLIN-1蛋白多克隆抗体(l吗/ml)与细胞在室温下孵育lh，以PBS洗三遍。用5jiig/ml生物素标记的马抗小鼠IgG (美国Jackson免疫实验公司)(biotinylatedhorse anti-mouse IgG)作用30min后以以PBS洗三遍，用Cy3标记的Aviding (美国Jackson免疫实验公司)(lpg/ml)作用30min， PBS洗三遍。加入含有10)ig/mlDAPI (美国SIGMA公司)的50。/。的甘油/PBS作用10min。
实验结果总结在表2中。从表中我们可以发现，在正常的永生化细胞如HEK293中，DERUN-1蛋白仅表达于细胞浆， 一般不表达于细胞膜，而在肿瘤细胞中DERLIN-1蛋白在细胞膜有一定阳性比例的表达，其阳性率从100%到18%不等，在检测的细胞中以卵巢癌细胞系SKOV3最高达98%，乳腺癌细胞系MDA-MB-453次之约90%，结肠癌细胞系LS180约70%，胰腺癌细胞SuitII约50%左右。
表2 DERLIN-1在各种细胞中的表达情况
细胞类型_细胞膜表达阳性率 细胞浆表达阳性率
SKOV3 (卵巢癌细胞) ++ 98 ++ 100
MDA-MB-453 (乳腺癌细胞)++ 卯 ++ 100
14LS180 (结肠癌细胞) ++ 70 +++ 100
Suit II (胰腺癌) ++ 50 +++ 100
ASPC1 (胰腺癌) ++ 32 +++ 100
PANC1 (胰腺癌) + 18 +++ 100
HEK293 _ 0 +++ 100
实施例6DERLIN-1蛋白在肿瘤病人血清中的表达
利用Western方法检测10例结肠癌患者血清，每例结肠癌上样约5pl，同时以结肠癌细胞Ls180 (中国医学科学院基础医学研究所)中提取的蛋白上样10pg作为阳性对照。结果，所有肿瘤病人血清中不能检测到DERLIN-1蛋白的表达，而Lsl80细胞中能够检测到DERLIN-1的表达。由于Western检测敏感性达纳克级，因此可以推断，结肠癌患者血清中DERLIN-1含量低于每毫升l吗。采用同样的方法，我们还检测了肝癌、胰腺癌、胃癌、肺腺癌、肺鳞癌、食管癌、前列腺癌和乳癌患者血清中DERLIN-1蛋白的含量。通过上述实验，本发明人发现，DERLIN-1在肝癌、胰腺癌、胃癌、肺腺癌、肺鳞癌、食管癌、前列腺癌和乳癌患者血清中均不能被检测到，推测其含量均低于每毫升l吗。
实施例7 DERLIN-1蛋白的体内分布实验
己有研究表明人DERLIN-1蛋白与小鼠DERLIN-1蛋白具有98%的同一性并且DERLIN-1的C末端在物种间完全保守。如预期那样，抗DERLIN-1蛋白抗体也识别小鼠DERLIN-1。因此，荷有人源肿瘤的小鼠可以看作人的同源基因模型，用来检测DERLIN-1蛋白在体内作为肿瘤治疗靶点的能力。将1251-放射标记的实施例2制备的抗DERLIN-1蛋白多克隆兔抗体经静脉内给药于荷有LS-180人结肠癌细胞系移植瘤的裸鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)。给药后第1， 3， 5和7天处死小鼠，用于分析注射的剂量每克的百分比
15(n/。ID/g)以及肿瘤:正常组织比(T/NT)。肿瘤中的。/。ID/g增加而所有正常器官和血液中的。/。ID/g随时间降低。注射后7天，所有观察到的器官中的。/。ID/g明显低于肿瘤中的情况(图7A)。 T/NT也指示体内抗DERLIN-1蛋白多克隆兔抗体能够特异性免疫靶向肿瘤，因为这些值在七天中持续增加(图7B)。将正常兔IgG用1251-放射标记后作为对照用IgG于所述分析。所有观察的器官中的MID/g包括肿瘤中的情况，随时间减小。从未免疫过的新西兰兔(购买于北京维通利华实验动物技术有限公司)血清中纯化获得对照IgG。将1251-放射标记的对照IgG的T/NT不随时间增加；表明使用正常兔IgG不能特异的靶向肿瘤细胞。这些体内研究表明DERLIN-1蛋白能够作为肿瘤靶向治疗的耙，耙向DERLIN-1蛋白的选择性亲和DERLIN-1蛋白的药物如抗
体等能够在活体内特异地聚积于肿瘤局部。
实施例8 DERLIN-1蛋白单克隆抗体的制备
采用实施例1得到100吗人肿瘤抗原蛋白DERLIN-1，混合完全弗氏佐剂皮下免疫BALB/C小鼠(5-6周龄的雌性BALB/c裸小鼠(nu/nu)，
购于维通利华生物公司，清洁饲养于中国协和医科大学实验动物研究所)，4周后采用50^ig抗原蛋白混合完全弗氏佐剂腹腔加强免疫，4周后再次采用50)ag抗原蛋白混合完全弗氏佐剂腹腔加强免疫，总共3次加强免疫。IO天后，利用间接ELISA法测定免疫血清抗体滴度，测定所述抗体的效价>1:106。处死动物，收集脾组织，使其通过100目的筛网分离为单细胞。采用50n/。的PEG促融合法将500万脾细胞与100万SP2/0细胞(购自ATCC)融合，融合后釆用HAT培养基对杂交瘤细胞进行筛选培养。培养1周后采用人肿瘤抗原蛋白DERLIN-1包被的ELISA进行筛选，对阳性克隆连续进行亚克隆，筛选稳定分泌特异抗体的克隆，从而获得了稳定分泌抗DERLIN-1单克隆抗体的杂交瘤细胞克隆HEC252/9F12，其于2007年11月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCCNo. 2242。实施例9:抗DERLINDERLIN-1蛋白单克隆抗体HEC252/9F12的衍生物的制备
核素-抗体偶联物的制备
(1) 188Re标记的HEC252/9F12单抗
SnC12直接还原法(杨志，刘元方，王祥云，吴永慧，王东琪，范莉。^Re直接法标记抗人结肠癌单克隆抗体CL-3的研究。同位素2000年，第02期，13巻，83-87页)标记抗DERLIN-1歪白单克隆抗体HEC252/9F12，立即通过快速薄层层析(ITLC)测定抗体的标记效率及放化纯度。标记后，ITLC实验表明^Re-抗体标记率为90%，放化纯度大于95。/。。哪Re-抗体比活为356MBq/mg。ELISA测得188Re-抗体免疫活性为65%。标记抗体的体外稳定性实验表明，抗体在37。C孵育24小时，无论是在生理盐水还是人血清白蛋白中，放射性脱落都小于5%，示其在体外稳定。
(2) 1311标记的HEC252/9F12单抗
氯胺T法(Fraker， P丄，and Speck， J.C., Jr. 1978. Protein and cellmembrane iodinations with a sparingly soluble chloroamide，l,3,4，6-tetrachloro-3a， 6a-diphrenylglycoluril. Biochem Biophys ResCommun 80:849-857.)标记抗DERLIN-1蛋白单克隆抗体HEC252/9F12，立即快速薄层层析(ITLC)测定抗体的标记效率及放化纯度。标记后，ITLC实验表明mI-抗体标记率为90%，放化纯度大于95%。 '"I-抗体比活为74MBq/mg， ELISA测得1311-抗体免疫活性67.3%。
纳米磁性颗粒-HEC252/9F12单抗偶联物的制备以纯水将直径约20-50nm的铁氧化物磁性颗粒(中科院化学所提供)超声分散，形成胶体状。按0.2g纳米磁性颗粒加入16mg抗DERLIN-1蛋白单克隆抗体HEC252/9F12的比例加入溶于纯水的所
17述抗体，迅速搅拌混合，5min后加入终浓度为1。/。的BSA，离心并采用P/。的BSA洗涤后备用。
实施例10:采用HEC252/9F12抗体对肿瘤进行治疗
取荷人结肠癌裸小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)24只，测量并计算肿瘤体积后，按肿瘤体积随机分为3组，每组8只。第一组为PBS对照组，每只腹腔注射200|il PBS;第二组为正常鼠IgG对照组，每只腹腔注射0.2mg正常小鼠IgG (购自北京中杉金桥生物技术有限公司)；第三组为HEC252/9F12单克隆抗体治疗组，每只腹腔注射0.2mg HEC252/9F12单克隆抗体。每两天给药一次，治疗后IO次后，处死动物，分离肿瘤，称取肿瘤重量，计算抑瘤率，抑瘤率^对照组瘤重量一治疗组瘤重量)/对照组瘤重量X 100%。显著性检验釆用t检验。
结果PBS组瘤重1.62士0.81g，正常小鼠IgG对照组瘤重1.53 ±0.67g， HEC252/9F12单克隆抗体治疗组瘤重0.84 ± 0.21g ，HEC252/9F12单克隆抗体的抑瘤率为45.1。/。， P值小于O.Ol。这些结果显示HEC252/9F12单克隆抗体在免疫导向治疗结肠癌中有重要的应用价值。
实施例11:抗DERLIN-1抗体治疗肿瘤无明显副作用携带LS180人结肠癌异种移植物的裸鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)用DERLIN-1靶向型抗体包括抗-DERLIN-l多克隆兔抗体和HEC252/9F12单克隆抗体进行治疗。用抗-DERLIN-l多克隆兔抗体或HEC252/9F12治疗后平均肿瘤体积明显低于用正常兔抗体或PBS的对照中的情况(参照实施例10)。在完成上述治疗后对器官，包括心、肺、肾、和肠进行病理学分析。在治疗的小鼠的器官中没有观察到明显的系统性副作用。治疗组和对照组的平均小鼠体重，除了肿瘤体重以外，在治疗结束时没有明显差异。
18实施例12:采用抗DERLIN-1相应抗体衍生物体内导向治疗肿
瘤
取荷人结肠癌裸小鼠24只，测量并计算肿瘤体积后，按肿瘤体积随机分为3组，每组8只。第一组为PBS对照组，每只腹腔注射200pl PBS ;第二组为正常鼠IgG对照组，每只腹腔注射9.25MBq(200jil) 1311-正常鼠IgG (购自北京中杉金桥生物技术有限公司)；第三组为偶联^I的HEC252/9F12单克隆抗体治疗组，每只腹腔注射9.25MBq(200|il) 1311-抗体。治疗后10天，处死动物，分离肿瘤，称取肿瘤重量，计算抑瘤率，抑瘤率=(对照组瘤重量_治疗组瘤重量)/对照组瘤重量X100n/。。显著性检验采用t检验。
结果PBS组瘤重1.26士0.57g，鼠IgG对照组瘤重1.20士0.51g，标记抗体治疗组瘤重0.32士0.13g，标记抗体的抑瘤率为73.3%, P值小于0.01。这些结果显示HEC252/9F12单克隆抗体偶联核素在免疫
导向治疗结肠癌中有重要的应用价值。
实施例13利用DERLIN-1蛋白作为肿瘤靶标诊断肿瘤(分子显影)
将1251-标记的抗DERLIN-1蛋白单克隆兔抗体经由尾静脉注入取荷人结肠癌裸鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)用于闪烁显像。给药后24， 72， 120和168小时记录自动放射摄影(图8)。生物分布显像显示肿瘤中的抗DERLIN-1蛋白单克隆兔抗体的累积增加，肿瘤被显现出来。，-标记的抗DERLIN-l蛋白单克隆兔抗体的肿瘤耙向可通过过量10倍的未标记抗DERLIN-1蛋白单克隆兔抗体竞争来抑制，而不会受到正常兔IgG的抑制。
19序列表
〈110>中国医学科学院肿瘤医院
〈120〉细胞膜蛋白DERLIN-1及其制备和用途
<130〉 I200701722CB
〈160〉 1
〈170> Patentln version 3.3
〈210〉<2U〉<212〉〈213〉
1
251PRT
Artificial
<400> 1
Met Ser Asp lie Gly Asp Trp Phe Arg Ser lie Pro1 5 10
Tyr Trp Phe Ala Ala Thr Val Ala Val Pro Leu Val20 25
Leu lie Ser Pro Ala Tyr Leu Phe Leu Trp Pro Glu35 40
Arg Phe Gin lie Trp Arg Pro lie Thr Ala Thr Phe50 55 60
Gly Pro Gly Thr Gly Phe Leu Tyr Leu Val Asn Leu65' 70 75
Gin Tvi" Ser Thr Ai'g Leu Glu Thr Gly Ala Phe Asp' 85 90
Asp Tvr Leu Phe Met Leu Leu Phe Asn Trp lie Cys100 105
Glv Leu Ala Met Asp Met Gin Leu Leu Met lie Pro115 120
Val Leu Tyr Val Ti-p Ala Gin Leu Asn Arg Asp Met130 135 140
Trp Phe Gly Thr Arg Phe Lvs Ala Cys Tvr Leu Pro145 150 155
Gly Phe Asn Tyr lie lie Gly Glv Ser Val lie Asn165 170
Asn Leu Val Gly His Leu Tvr Phe Phe Leu Met Phe180 185
Ala lie Thr Arg15
Gly Lys Leu Gly30
Ala Plie Leu Tyr45
Tyr Phe Pro Val
Tyr Phe Leu Tyr80
Gly Arg Pro Al395
lie Val lie Thr110
Leu lie Met Ser125
lie Val Ser Phe
Trp Val lie Leu160
Glu Leu lie Gly175
Arg Tyr Pro Met190
Asp Leu Gly Gly Arg Asn Phe Leu Ser Thr Pro Gin Phe Leu Tyr Arg195 200 205
Trp Leu Pro Ser Arg Arg Gly Gly Val Ser Gly Phe Gly Val Pro Pro21021^ 220
Ala Ser Met Arg Arg Ala Ala Asp Gin Asn Gly Gly Gly Gly Arg His225230 235 240
Asn Trp Glv Gin Gly Phe Arg Leu Gly Asp Gin245 250
20
权利要求
1. 如SEQ ID NO1所示的细胞膜蛋白形式的DERLIN-1蛋白。
2. 包含权利要求1所述的DERLIN-1蛋白的编码基因的载体。
3. 包含权利要求3所述的载体的宿主细胞，优选所述宿主细胞 可为真核或原核细胞。
4. 权利要求1中所述DERLIN-1蛋白的制备方法，其通过使权 利要求3所述的宿主细胞表达而获得。
5. 细胞膜蛋白形式的DERLIN-1蛋白在筛选抗肿瘤药物中的用 途，优选其中所述DERLIN-1蛋白如SEQ ID NO:l所示，并且优选 其中所述的抗肿瘤药物是DERLIN-1蛋白结合配体，例如抗 DERLIN-1蛋白的单克隆抗体。
6. 权利要求5的用途，其中所述的肿瘤是表达细胞膜形式的 DERLIN-1蛋白的肿瘤，优选为胰腺癌或结肠癌。
7. 保藏号为CGMCC No. 2242的杂交瘤细胞，其产生抗 DERLIN-1蛋白的单克隆抗体。
8. 用于治疗对象中的肿瘤的药物组合物，其包含DERLIN-1蛋 白结合配体，例如抗DERLIN-1蛋白的单克隆抗体，并任选包含适宜 的载体或赋形剂。
9. 权利要求8的药物组合物，其可为与其他抗肿瘤药剂的组合的 形式，其中所述DERLIN-1蛋白结合配体是抗DERLIN-1蛋白的单克 隆抗体，其他抗肿瘤药剂为放射性核素。
10. 权利要求9的药物组合物，其中所述对象是哺乳动物，优选 是人。
11. 权利要求9的药物组合物，其中所述的肿瘤是表达细胞膜形 式的DERLIN-1蛋白的肿瘤，优选为胰腺癌或结肠癌。
12. DERLIN-1蛋白结合配体例如抗DERLIN-1蛋白的单克隆抗体在制备用于治疗对象中的肿瘤的药物组合物中的用途.
13. 权利要求12的用途，其中所述的肿瘤是表达细胞膜形式的 DERLIN-1蛋白的肿瘤，优选为胰腺癌或结肠癌。
14. 权利要求12的用途，其中所述对象是哺乳动物，优选是人。
15. 用于诊断对象中的肿瘤的诊断剂，其包含DERLIN-1蛋白结 合配体例如抗DERLIN-1蛋白的单克隆抗体，优选所述DERLIN-1蛋 白结合配体用放射性同位素例如1251标记。
16. DERLIN-1蛋白结合配体例如抗DERLIN-1蛋白的单克隆抗 体在制备用于诊断对象中的肿瘤的诊断剂中的用途，其中所述 DERLIN-1蛋白结合配体优选用放射性同位素例如1251标记。
17. 权利要求16的用途，其中所述的肿瘤是表达细胞膜形式的 DERLIN-1蛋白的肿瘤，优选为胰腺癌或结肠癌。
18. 权利要求16的用途，其中所述对象是哺乳动物，优选是人。
全文摘要
本发明涉及新的人肿瘤抗原细胞膜蛋白DERLIN-1以及其在筛选和/或制备用于治疗和/或诊断肿瘤的药物中的用途。其中，DERLIN-1蛋白作为新的肿瘤治疗靶蛋白，其特征在于其作为肿瘤诊断和/或治疗中的靶蛋白的高效性以及特异性。
文档编号C07K14/705GK101469019SQ20071016019
公开日2009年7月1日 申请日期2007年12月26日 优先权日2007年12月26日
发明者冉宇靓, 杨治华, 海 胡 申请人:中国医学科学院肿瘤医院