专利名称：一种二维毛细管电泳装置及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及二维毛细管电泳装置，具体地说是一种新型二维毛细管电
泳(2D-CE)分离装置及其应用。
背景技术：
毛细管电泳(CE)具有分离效率高、分析速度快和样品用量少等优点。 但是常规的CE方法，由于受到应用电压的限制，所采用分离柱的长度有限， 进而影响了实际柱效和可能达到的峰容量。此外，由于毛细管的光程短， 所以CE的检测灵敏度较低。这些缺点都限制了 CE在复杂生物样品分析中 的应用。因此，通过选择正交的CE模式，发展具有高峰容量和高检测灵敏 度的2D-CE具有重要意义。
目前，2D-CE在分离蛋白质方面已有诸多报道[文献1: Michels， D. A.; Hu, S.; Schoenherr, R. M.; Eggertson, M. J.; Dovichi, N. J. Mol. Cell. Proteomics 2002, 7, 69-74. 文献2: S. Hu, D. Michels， M.A. Fazal, C. Ratisoontom, M丄.Cunningham, N.J. Dovichi, Anal. Chem.,2004, 76, 4044-4049. 文献3: Sheng, L.; Pawliszyn， J. Analyst 2002, 127, 1159-1163.]。 由于C正F具有较强的富集能力(Shen, Y.等[文献4: Shen， Y.; Berger, S. J.; Anderson, G. A.; Smith, R. D. Anal. Chem. 2000, 72， 2154-2159.]报道C正F的 富集倍数高达540倍)，是2D-CE的最佳第一维分离模式。目前已被用于 CIEF-CZE分离核糖核酸酶[文献5: C. Yang， L. Zhang， H. Liu, W. Zhang， Y. Zhang, J.Chromatog.A, 2003， 1018， 97—103.]和肌红蛋白、血红蛋白的混合 物[文献6: H. Liu, L. Zhang, G. Zhu, W. Zhang, and Y. Zhang, Anal. Chem. 2004,76,6506-6512.]、 CIEF-CGE分离血红蛋白[文献7: C. Yang, H. Liu, Q. Yang, L. Zhang, W. Zhang, and Y. Zhang, Anal. Chem. 2003, 75, 215-218.]、 C正F-CNGSE分离小鼠肺癌细胞的分泌蛋白提取物[文献8: H. Liu, C. Yang, Q. Yang, W. Zhang, Y. Zhang, J. Chromatogr. B, 2005, 817 , 119—126.]、 CIEF-CITP/CZE分离细胞色素C、核糖核酸酶A和碳酸酐酶的酶解产物[文献 9 : Mohan, D., Lee, C. S., Electrophoresis 2002, 23, 3160—3167.]、 CIEF-HFF1FFF分离人的尿蛋白[文献10: Dukjin Kang and Myeong Hee Moon, Anal. Chem. 2006, 78, 5789-5798.]和CIEF-CEC分离去除白蛋白的人血清[文 献l 1: M. Zhang and Rassi Z. E.， J. Proteome Res., 2006, 5, 2001-2008.] 。 CIEF 使用的两性电解质不仅具有较高的缓冲能力，并且有助于建立稳定的pH梯 度。然而，两性电解质在低紫外波长处吸收较强，会降低样品的检测灵敏 度。尽管在上述构建的二维系统中均有去除两性电解质的接口，但是去除 效果不是很完全，会影响后续的分离检测。ChunYang等[文献12: C.Yang,G. Zhu， L. Zhang, W. Zhang, Y. Zhang, Electrophoresis 2004, 25， 1729—1734.]
通过将两性电解质共价键合到毛细管整体柱中形成固定化pH梯度可以有效 地解决上述问题，但尚未用于2D-CE的构建。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可显著提高蛋白质分离能力的二维毛细管 电泳(2D-CE)分离装置(图1)及其应用；利用该装置，第一维使用固定 化pH梯度毛细管整体(M-IPG)柱不仅可以起到富集分离样品的作用，而 且在缓冲液中不用添加两性电解质，避免了对第二维分离的干扰。此外， 采用2D-CE的分离模式，可以显著提高系统的峰容量，从而满足复杂生物 样品的分析需要。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为
一种二维毛细管电泳装置，可用于蛋白质样品的分离，包括一个2D-CE 接口； 一根固定化pH梯度毛细管整体(M-IPG)柱作为2D-CE的第一维 分离柱，其出口端通过连接管与2D-CE接口的一端相连，其进样端置于装 有碱性缓冲液的入口贮槽中或与一个注射泵相连； 一根毛细管作为2D-CE 的第二维分离柱，其进样端通过连接管与2D-CE接口的另一端相连，其出 口端置于装有酸性缓冲液的贮槽中；2D-CE接口置于装有酸性缓冲液贮槽 中。
所述2D-CE接口为聚四氟乙烯接口、膜接口和毛细管刻蚀接口；固定 化pH梯度整体柱的内径可以为100 jim 250 (am，长度为10 40 cm;第 二维分离柱毛细管的内径为50或75 |im，长度为10 50 cm;所述第二维 分离柱毛细管为内壁涂层毛细管或者非涂层毛细管。
应用本发明时，在第一维毛细管等电聚焦(CIEF)分离完成后，生物 大分子组分流经接口分段地进入第二维毛细管进行分离，实现2D-CE。由 于该二维系统采用M-IPG柱作为第一维，不仅可以起到富集分离样品的作 用，而且在缓冲液中不用添加两性电解质，避免了对第二维分离的干扰。 此外，由于该柱可产生较大的反压，需要采用恒流泵为系统提供驱动力。 当生物大分子组分流经接口时，在较大驱动力存在的情况下不会向接口外 扩散，因此不会引起样品的损失和稀释。
具体的操作如下
在聚焦前，首先将蛋白质样品溶液灌满第一维分离柱(D);
1) 在聚焦时，第一维分离柱的进样端置于装有碱性缓冲液的入口lt槽 中，2D-CE接口置于酸性缓冲液贮槽中，第二维分离柱出口端与一装有酸 性缓冲液的出口贮槽相连接； 一台工作高压直流电源的地线插入2D-CE接 口处的贮槽中，负极插入第一维分离柱进样端入口贮槽中；入口贮槽中加 负高压，2D-CE接口处接地，蛋白质样品在第一维分离柱屮聚焦；
2) 在分离时，将第一维分离柱从入口贮槽中取出，第一维分离柱的进 样端与一个注射泵相连，其他连接方式不变；在不加电的情况下用注射泵将第一维聚焦的组分区带分段送入第二维分离柱中；
3)待样品组分进入第二维时，停止注射泵， 一台工作高压直流电源的
地线插入2D-CE接口处的酸性缓冲液贮槽中和注射泵处，负极插入第二维分离柱出口端缓冲液的出口贮槽中；出口贮槽加负高压，2D-CE接口和注射泵处接地，进行蛋白质样品的2D-CE分离。
所述第二维分离柱的分离模式可以为毛细管区带电泳、毛细管胶束电动色谱、毛细管凝胶电泳或者毛细管电色谱；恒流泵的流速可以为0.25 1.0 (Al/min;所述直流电源于第一维或第二维分离柱施加的电压为5 20kV。
所述碱性缓冲可以为PH>10的氢氧化钠水溶液或者氨水；酸性缓冲可以为PH<3.5甲酸、磷酸或者谷氨酸水溶液；本发明具有如下优点
1、 具有不同CE模式联用的特点。本发明可通过在2D-CE接口处向分离系统中添加小分子(包括酸、碱或盐)等，实现不同CE模式的组合，即构建多种2D-CE分离模式。
2、 接口简单。本发明采用的M-IPG柱解决了在缓冲溶液中添加两性载体带来的干扰问题，降低了对接口置换能力的要求，使接口制作简单，容易实现。
3、 检测灵敏度高。本发明采用M-IPG柱，可有效避免两性电解质对214 nm波长下进行紫外检测的干扰；此外，M-IPG-C正F本身具有样品富集作用。因此，该系统具有较高的检测灵敏度。
4、 峰容量高。在分离模式正交的情况下，2D-CE系统的峰容量应该为每一维峰容量的乘积。因此，该系统具有较高的分离能力，可满足复杂样品的分离需要。
图1为本发明的固定化pH梯度整体柱等电聚焦一毛细管区带电泳(2D-M-IPG-CIEF-CZE)分离平台结构示意图，(1)聚焦时，(2)分离时；图2为本发明一个实施例中7个标准蛋白的一维分离谱图，A: CZE谱
图；B: M-IPG-CIEF谱图3为本发明一个实施例中7个标准蛋白的固2D-M-IPG-CIEF-CZE分
离谱图；各图的标号为所处的组分数；
图4为本发明一个实施例中7个标准蛋白的二维投影图5为本发明一个实施例中牛奶蛋白的一维分离谱图6为本发明一个实施例中牛奶蛋白的2D-M-IPG-CIEF-CZE分离谱
图；各图的标号为所处的组分数；
图7为本发明一个实施例中牛奶蛋白的二维投影图。
具体实施例方式
一种二维毛细管电泳装置，可用于蛋白质样品的分离，包括一个2D-CE接口；
一根固定化pH梯度毛细管整体柱作为2D-CE的第一维分离柱，其出口端通过连接管与2D-CE接口的一端相连，其进样端置于装有碱性缓冲液的入口贮槽中或与一个注射泵相连；
一根毛细管作为2D-CE的第二维分离柱，其进样端通过连接管与2D-CE接口的另一端相连，其出口端置于装有酸性缓冲液的贮槽中；
2D-CE接口置于装有酸性缓冲液贮槽中。
所述2D-CE接口为聚四氟乙烯接口 。
如图l所示，具体操作过程为
在聚焦前，首先将蛋白质样品溶液灌满第一维分离柱(D);
1) 在聚焦时，第一维分离柱D的进样端置于装有碱性缓冲液的入口贮槽A中，2D-CE接口B置于酸性缓冲液贮槽中，第二维分离柱G出口端与一装有酸性缓冲液的出口贮槽C相连接； 一台工作高压直流电源I的地线插入2D-CE接口 B处的贮槽中，负极插入第一维分离柱D进样端入口贮槽A中；在入口贮槽A处加负高压，2D-CE接口B处接地，蛋白质样品在第一维分离柱(D)中聚焦；
2) 在分离时，将第一维分离柱D从入口贮槽A中取出，第一维分离柱D的进样端与一个注射泵J相连，其他连接方式不变；在不加电的情况
下用注射泵J将第一维聚焦的组分区带分段送入第二维分离柱G中；
3) 待样品组分进入第二维时，停止注射泵J， 一台工作高压直流电源I的地线插入2D-CE接口 B处的酸性缓冲液贮槽中和注射泵J处，负极插入第二维分离柱G出口端缓冲液的出口贮槽C中；出口贮槽C加负高压，注射泵J和2D-CE接口 B处接地，进行蛋白质样品的2D-CE分离。
其中E为聚四氟乙烯连接管，F为连接毛细管，H为检测窗口；实施例1 一 一
如图1所示，第一维采用M-IPG CIEF的方法，正极缓冲液为20 mmol/L谷氨酸，负极缓冲液为j0mmol/LNaOH。将样品充满整个M-IPG柱，整体柱长20cm (本发明中釆用过的长度为15， 20， 30禾Q40cm)，内径100)im(可以为100， 200和250 pm)。第二维采用CZE分离，分离缓冲为20 mmol/L谷氨酸，毛细管总长为30cm (本发明中采用的过长度为20和30cm)，有效长为20cm (本发明中采用的过长度为10和20cm)，内径50iLim (可以为75拜)。
样品为7种标准蛋白的混合液分别为胰蛋白酶抑制剂(trypsininhibitor, pi 4.5)、牛血清白蛋白(BSA， pi 4.8)、白蛋白(albumin, pi 4.9)、卩-乳球蛋白(卩-lactoglobulin， pi 5.0)、血红蛋白(Hemoglobin, pi 7.1)、尿素酶(urease, pi 9.0)和核糖核酸酶A (Ribonuclease A， pi 9.5)。样品溶于10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)，各标准蛋白浓度相同，总浓度为0.033mg/mL。在聚焦前，首先将蛋白质样品溶液灌满第一维分离柱(D);
一在第一维M-IPG-CIEF分离时给第一维毛细管柱上施加14 kV (本发明 中采用的过的电压为12、 14和16 kV)电压。聚焦完成后，固定化pH梯 度整体柱(D)从装有碱性缓冲液的入口贮槽(A)中取出，接上恒流泵(J)， 缓冲液贮槽(C)加负高压，恒流泵和二维毛细管电泳接口 (B)中接地， 恒流泵(J)，将第一维聚焦的组分分段地送入第二维分离毛细管(G)，此 时不加电。待样品组分进入第二维时，停止恒流泵(J)，第二维施加电压， 进行二维分离，;到第一维组分输送完全。具体操作是恒流泵流速0.5 ^L/min (本发明采用过的流速为0.2， 0.3， 0.5和1.0 |uL/min)，输送1.5min (本发明采用过的时间0.5， 1， 1.5禾P2min)。将第一维的一段样品区带送 入第二维，这相当于进样过程，然后停泵，第二维施加电压14kV，分离时 间为8min。如此循环，直到第一维组分输送完全，第二维不出峰为止，从 而实现2D-M-IPG-CIEF-CZE分离。 一共切换了22个组分，平均峰宽0.063 min，分离时间8min，峰容量2794。
如图2A所示，采用CZE方式，7个标准蛋白只分成了两个峰，分离效 果较差；如图2B所示，M-IPG-CIEF分离了大约7个小峰，但分离度较小， 没有实现基线分离。如图3所示，采用2D-M-IPG-CIEF-CZE，蛋白质的分 离结果得到了明显的改善。由图4可以看出，7个标准蛋白获得了较好的分 离。
实施例2
与实施例1不同处在于所采用的样品为牛奶中提取的蛋白，实验操作与 实施例1相同。
如图5所示，采用一维M-IPG-CIEF分离牛奶蛋白的效果很差，蛋白没 有分开。如图6所示，釆用2D-M-IPG-CIEF-CZE，牛奶中蛋白质的分离结 果得到了明显的改善。由图7可以看出，牛奶蛋白获得了较好的分离。
权利要求
1. 一种二维毛细管电泳装置，可用于蛋白质样品的分离，包括一个2D-CE接口；其特征在于一根固定化pH梯度毛细管整体柱作为2D-CE的第一维分离柱，其出口端通过连接管与2D-CE接口的一端相连，其进样端置于装有碱性缓冲液的入口贮槽中或与一个注射泵相连；一根毛细管作为2D-CE的第二维分离柱，其进样端通过连接管与2D-CE接口的另一端相连，其出口端置于装有酸性缓冲液的贮槽中；2D-CE接口置于装有酸性缓冲液贮槽中。
2. 按照权利要求1所述二维毛细管电泳装置，其特征在于所述的 2D-CE接口为聚四氟乙烯接口 、膜接口和毛细管刻蚀接口 。
3. 按照权利要求1所述二维毛细管电泳装置，其特征在于所述的固 定化pH梯度整体柱的内径可以为100 |Lim 250 |Lim，长度为10 40cm。
4. 按照权利要求l所述二维毛细管电泳装置，其特征在于所述第二 维分离柱毛细管的内径为50或者75pm，长度为10 50cm。
5. 按照权利要求l所述二维毛细管电泳装置，其特征在于所述第二 维分离柱毛细管为内壁涂层毛细管或者非涂层毛细管。
6. —种权利要求l所述二维毛细管电泳装置的应用，其特征在于 在聚焦前，首先将蛋白质样品溶液灌满第一维分离柱(D);1) 在聚焦时，第一维分离柱(D)的进样端置于装有碱性缓冲液的入 口贮槽(A)中，2D-CE接口 (B)贮槽中装有酸性缓冲液，第二维分离柱(G)出口端与一装有酸性缓冲液的出口贮槽(C)相连接； 一台工作高压 直流电源(I)的地线插入2D-CE接口 (B)处的贮槽中，负极插入第一维 分离柱(D)进样端入口贮槽(A)中；在入口贮槽(A)处加负高压，2D-CE 接口 (B)处接地，蛋白质样品在第--维分离柱(D)中聚焦；2) 在分离时，将第一维分离柱(D)从入口贮槽(A)中取出，第一 维分离柱(D)的进样端与一个注射泵(J)相连，其他连接方式不变；在 不加电的情况下用注射泵(J)将第一维聚焦的组分区带分段送入第二维分离柱(G)中；3) 待样品组分进入第二维时，停止注射泵(J)， 一台工作高压直流电 源(I)的两根地线分别插入2D-CE接口 (B)处的酸性缓冲液贮槽中和注 射泵(J)处，负极插入第二维分离柱(G)出口端缓冲液的出口贮槽(C) 中；出口贮槽(C)加负高压，注射泵(J)禾Q 2D-CE接口 (B)处接地， 进行蛋白质样品的2D-CE分离。
7. 按照权利要求6所述二维毛细管电泳装置的应用，其特征在于 所述第二维分离柱的分离模式可以为毛细管区带电泳、毛细管胶束电动色 谱、毛细管凝胶电泳或者毛细管电色谱。
8 二按照权利要求6所述二维毛细管电泳装置的应用，其特征在于所述恒流泵的流速可以为0.25 1.0 |jl/min。
9. 按照权利要求6所述二维毛细管电泳装置的应用，其特征在于 所述直流电源于第一维或第二维分离柱施加的电压为5 20kV。
10. 按照权利要求6所述二维毛细管电泳装置的应用，其特征在于 所述碱性缓冲为PH〉10的氢氧化钠水溶液或者氨水；酸性缓冲为PH<3.5 甲酸、磷酸或者谷氨酸水溶液。
全文摘要
本发明涉及二维毛细管电泳装置，具体地说是一种新型二维毛细管电泳分离装置及其应用，可用于蛋白质样品的分离，包括一个2D-CE接口；一根固定化pH梯度毛细管整体柱作为2D-CE的第一维分离柱，其出口端通过连接管与2D-CE接口的一端相连，其进样端置于装有碱性缓冲液的入口贮槽中或与一个注射泵相连；一根毛细管作为2D-CE的第二维分离柱，其进样端通过连接管与2D-CE接口的另一端相连，其出口端置于装有缓冲液的贮槽中；2D-CE接口置于装有酸性缓冲液贮槽中。采用本发明可以显著提高系统的峰容量，从而满足复杂生物样品的分析需要。
文档编号C07K1/00GK101469015SQ20071015929
公开日2009年7月1日 申请日期2007年12月28日 优先权日2007年12月28日
发明者孙良亮, 张丽华, 张玉奎, 朱贵杰, 振 梁, 王婷婷, 邓启良 申请人:中国科学院大连化学物理研究所