梓醇的制备新方法和含它的药物组合物及用途的制作方法

专利名称：梓醇的制备新方法和含它的药物组合物及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及梓醇的制备新方法以及它和含它的药物组合物在抗帕金森病和老年性痴呆病 方面的应用。
技术背景地黄(yfe力/ a/7/7ia ^7w"/7osa ^'力osc/ .)为玄参科植物，主要分布在河南省，辽宁、河 北、山东、浙江亦产。用地黄的新鲜或干燥块根入药始载于《神农本草经》，现代诸多典籍 也有记载。鲜地黄性大寒，味甘、苦，具有清热凉血，润燥生津的功能；干地黄性寒，味甘、 苦，具有清热养阴，凉血止血的功能。关于地黄化学成分的主要含有环烯醚萜类、水苏糖、 e-谷甾醇、甘露醇、油菜甾醇及精氨酸等。近年来，国内外学者对地黄中含有的梓醇的制备 方法亦有多种报道，但采用以80%乙醇溶液为溶剂进行平转式连续逆流提取与H103大孔吸附 树脂进行分离的方法未见报道。对该化合物和含它的药物组合物用于抗帕金森病和老年性痴 呆病方面的应用和机理研究未见报道。对地黄中梓醇提取制备方法的研究报道，主要有两种 其一为加60%乙醇溶液8倍量，回流提取2次，每次1.5小时；其二为加70%乙醇溶液12倍 量，回流提取4次，每次1.5小时。但因在加热提取过程中梓醇易氧化，造成收率下降；同 时因大量乙醇溶液的使用，使更多杂质被提出，增加了后期分离纯化的困难。地黄具有清热 养阴，凉血止血的功能，国内对其所含的梓醇的生物活性研究主要集中在对血糖的影响方面， 尚未见对帕金森病和老年性痴呆病方面的应用和机理研究的报道。 发明内容本发明的目在于提供梓醇的制备新方法。本发明的另一目的是提供一种从地黄中提取制 备梓醇的方法。本发明的进一步目的是提供本发明制备方法制备的梓醇和含它的药物组合物 在治疗帕金森病和老年性痴呆病方面的用途。本发明人采用以80%乙醇溶液为溶剂进行平转 式连续逆流提取、H103大孔吸附树脂进行分离纯化的新方法从地黄中制备梓醇，经证实该化 合物具有抗帕金森病和老年性痴呆病的药物活性。本发明的技术方案是1、梓醇的结构通式(I )如下<formula>formula see original document page 4</formula>其中Rt为单糖，R3， R4, R5， Rs为氢，Re为0H，尺7为-0CH20H。2 、制备权利要求1所述的梓醇的新方法，该方法包括以下步骤a将地黄(y e/M7a/7/^'a《7""/ osa h'力osc力.)的新鲜或干燥块根放置于平转式连续逆流 提取装置中在乙醇溶液中浸泡并渗漉；b将地黄的乙醇提取液浓縮后用水分散，依次用石油醚，乙酸乙酯萃取除去杂质；c将b中水溶液相用H103大孔吸附树脂柱层析，用水洗至色浅，换成10%、 20%、 30%、 50%、 .80%乙醇溶液梯度洗脱，收集80%乙醇馏分；d将c中收集馏分减压浓缩并干燥；f将d中的干燥物用甲醇-乙醇反复多次重结晶处理，得到纯度为99%的该化合物。本发明的化合物与水按质量百分比1: 1000000至1: 4的组合物； 本发明的化合物与植物油按质量百分l: 1000000至l: 5的组合物； 本发明的化合物与淀粉或/和蔗糖按质量百分l: 10000至100: l的组合物； 本发明的化合物化合物与左旋多巴或/和卡比多巴或/和司米吉兰或/和硝替卡朋按质量百分1: 10000至10000: 1的组合物；本发明的化合物与苯海索或/和丙环定或/和苯扎托品按质量百分1: 10000至10000: 1的组合物；本发明的化合物与金刚烷胺或/和溴隐亭或/和培高利特按质量百分1: 10000至10000: 1的组合物；本发明的化合物与他克林或/和哈伯因或/和美曲膦酯或/和加兰他敏按质量百分1:10000 至10000: 1的组合物；本发明的化合物与占诺美林或/和Sabcomedine hydrochloride按质量百分1: 10000至 10000: 1的组合物；本发明的化合物化合物化合物与AIT082或/和盐酸乙酰L肉碱或/和丙戊茶碱按质量百 分h 10000至10000: l的组合物；本发明的化合物及所述的组合物可作制备抗帕金森病和 老年性痴呆病药物的用途。本发明经过活性筛选，确定以地黄的新鲜或干燥块根为原料，采 用以80%乙醇溶液为溶剂进行平转式连续逆流提取、H103大孔吸附树脂进行分离纯化相结合 的方法，最终获得梓醇的高收率和高纯度；由体外神经细胞和体内动物模型实验结果表明， 梓醇具有抗帕金森病和老年性痴呆病的活性。本发明又从该化合物出发设计了一系列该化合 物的药物组合物。本发明为研究开发新的抗帕金森病和老年性痴呆病药物提供了梓醇的制备 新方法和含它的药物组合物，有利于进一步开发天然药物资源。本发明的有益效果是，为研究开发新的抗老年性痴呆和帕金森病药物提供了该化合物新 的制备方法和含它的药物组合物，有利于进一步开发天然药物资源。


下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步的说明。图1是梓醇在帕金森小鼠细胞模型上的作用(对照组)图2是梓醇在帕金森小鼠细胞模型上的作用(MPP+)图3是梓醇在帕金森小鼠细胞模型上的作用(梓醇组)图4是梓醇对帕金森模型鼠的活性作用(对照组)图5是梓醇对帕金森模型鼠的活性作用(帕金森模型)图6是梓醇对帕金森模型鼠的活性作用(梓醇治疗组)图7是梓醇对卜42诱导的大脑皮层神经元损伤的保护的作用(对照组)图8是梓醇对A 0卜42诱导的大脑皮层祌经元损伤的保护的作用(A P ,-,2组)图9是梓醇对A e H2诱导的大脑皮层神经元损伤的保护的作用(梓醇组)具体实施方式
下面的实施例可以使本专业人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。实施例1梓醇的制备方法将100千克干地黄(y e力/z 朋"ia ^""/7osa "Zjosc/ .)加入平转式连续逆流提取器的回 转格中，加入10倍80%乙醇溶液，常温渗漉，控制渗漉流速为20ml/min;将地黄的乙醇提取 液减压浓縮至浸膏状，按浸膏水(1: 2.5)的量用水分散，依次用5倍量石油醚、5倍量 乙酸乙酯萃取除去杂质；水溶液相加到H103大孔吸附树脂柱上，浸膏与干树脂的比例为l: 25，充分吸附2小时后，用水洗至色浅，换成10%、 20%、 30%、 50%、 80%乙醇溶液各5000ml 梯度洗脱，收集80%乙醇馏分；将收集镏分减压浓缩并至浸膏状，进行真空干燥；将干燥物 用甲醇-乙醇(2; 1)反复3次重结晶处理，得到纯度为9鄉的该化合物白色粉末。HPLC条件以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-水(0.6: 99.4， v/v)为流动相， 检测波长210nm;流速1.0ml/min;柱温25。C。TLC条件硅胶G薄层板，以氯仿-甲醇-水(14; 8; 1)为展开剂，10%硫酸乙醇为显色 剂，90'C加热至斑点清晰，365nm紫外灯下观察检测。分子式为Cl5H220i()，分子量362. 45， mp206-208。C 。ESI-MS m/z: 360.9 (M-1) 、 190 (M-1-苷元)、181 (M-1-苷元-0H) 一。'H-NMR (MeOH_d3， 400MHz) SH(ppm): 3. 87， 4. 10('H each, d.H-10)， 5. Ol(U d, J=9. 7Hz， H-19)， 5.04('H, t.H-4),6.33('H， d. J=5.9Hz， H-3)。 13C-NMR(Me0H-d3, 100MHz) S c(ppm):碳PPm1，141.83，104.04，39.05，77.66，62.57，66. 18，43.59，61.610，95.2r99. 62'74.83，79.54，71.75，78.66，62.9实施例2梓醇对帕金森病细胞模型的作用1细胞形态学分析和免疫组织化学方法①小鼠中脑纯神经元培养无菌操作下取出胎龄14天的KM小鼠胚胎，分离出腹侧中脑，然后在DMEM/F12中轻柔的 机械吹打以破碎组织。1500r离心机械分离后的细胞悬液10min,除去组织细胞碎片。弃上清 液，计数重悬后的细胞并接种到多聚赖氨酸(20Pg/ml)预包被的24孔培养板中，细胞接种密 度为5X107孔。本研究选用DMEM/F12外加10%灭活胎牛血清、100U/ml青霉素，100U/ml链 霉素作为细胞培养液。细胞培养48小时后，加入MP-阿拉伯糖呋喃糖苷(P -D-arabinofuranoside)以抑制胶质细胞增殖。再过48小时，用新鲜的细胞培养液置换出旧的培养液。最初接种的第7天，细胞用于实验。此时，纯神经元培养体系中神经元》95%。②免疫细胞化学染色与细胞计数加药处理后的细胞用以PBS为溶剂的4y。的多聚甲醛室温下固定20分钟，PBS洗3次，用 含W的过氧化氢的PBS处理20分钟以消除内源性过氧化氢酶；PBS洗3次，然后用固定剂固 定20分钟，勿洗；加入用抗体稀释液稀释的一抗(TH 1/300) 4。C过夜或37'C孵育2小时； 然后用PBS震荡漂洗10minX3，加入生物素化的二抗(TH羊抗大鼠抗体1:200) 37'C孵育1 小时，PBS震荡漂洗10minX3;加入ABC试剂孵育30分钟，PBS洗三次后用新鲜配置的0. 05 X的二氨基联苯胺(DAB)染色。适时终止反应。光学显微镜下观察、计数。细胞计数时，在 24孔培养板中每孔选取16个代表性区域，在100X放大倍数下计数。测量神经突起长度时， 每孔选50个代表性神经元，每个处理组有四孔。结果来自三次独立的实验，并表示为对照组 细胞数目(或平均突触长度)的百分比。(D实验结果-原代培养的中脑神经元体系用不同浓度的(0.01-0. 5 mM)梓醇预处理30分钟后，然后与 MPP+ (10 MM)共同作用48小时。从形态学分析，与对照组相比(图2),MPP+不仅极大的降低了 TH-IR细胞的密度，而且神经突触的长度也受损缩短(图3)。梓醇预处理30分钟可以(图4) 抑制.MPP+的作用，与MPP+处理组比较，TH-IR细胞的密度明显提高，神经突触长度受损程度 变低。此实验结果表明梓醇在帕金森病细胞模型上有效。实施例3梓醇对帕金森病动物模型的作用ICR小鼠滩性)，十周龄，随机分为3组。空白对照组、模型组和梓醇治疗组。在开始的 l-7天，空白对照组和梓醇治疗组小鼠腹腔注射生理盐水；帕金森模型组小鼠注射MPTP(30 mg/kg)。在8-14天，梓醇治疗组组小鼠腹腔注射梓醇(15mg/kg)，其它2组小鼠腹腔注射生理 盐水。在末次注射药物24小时后麻醉后开胸、灌注、取脑。.实验结果如所示，注射生理盐水的对照组ICR小鼠黑质致密部(图5)可见大量的TH-ir 阳性神经元，排列成致密的网状；与对照组相比，经注射MPTP的小鼠黑质致密部TH-ir阳性 神经元明显减少(图6)，表明经MPTP腹腔注射7天的ICR小鼠出现了PD特征。与MPTP组相 比，梓醇组小鼠黑质致密部TH-ir阳性神经元无明显减少，表明一定剂量的梓醇对MPTP导致 的TH-ir阳性神经元减少产生了拮抗作用(图7)。动物实验结果显示，梓醇对帕金森模型鼠 有一定治疗作用。实施例4梓醇对老年性痴呆细胞模型的作用1细胞形态学分析和免疫组织化学方法① 小鼠大脑皮层神经元细胞培养无菌操作下取出胎龄15/16天的KM小鼠胚胎，分离出两侧大脑皮层，然后在DMEM/F12 中轻柔的机械吹打以破碎组织。lOOOr离心机械分离后的细胞悬液10min，除去组织细胞碎片。 弃上清液，计数重悬后的细胞并接种到多聚赖氨酸(2(mg/ml)预包被的24孔培养板中，细胞 接种密度为1X 10V孔。本研究选用DMEM/F12外加1(^灭活胎牛血清、100U/ml青霉素，100U/ml链霉素作为细胞培养液。细胞培养48小时后，加入io幽e-阿拉伯糖呋喃糖苷(e-D-arabinofuranoside)以抑制胶质细胞增殖。再过48小时，用新鲜的细胞培养液置换出旧 的培养液。最初接种的第7天，细胞用于实验。此时，纯神经元培养体系中大脑皮层神经元 纯度》95%。② 免疫细胞化学染色加药处理后的细胞用以PBS为溶剂的4%的多聚甲醛室温下固定30分钟，PBS洗3次，用 含3l的过氧化氢的PBS处理30分钟以消除内源性过氧化氢酶；PBS洗3次，然后用封闭剂封 闭30分钟，勿洗；加入用抗体稀释液稀释的一抗MAP-2 (1: 200) 4"C过夜或37。C孵育2小 时；然后用PBS震荡漂洗10minX3，加入生物素化的羊抗兔二抗37t孵育1小时，PBS震荡 漂洗10minX3;加入ABC试剂孵育30分钟，PBS洗三次后用新鲜配置的0. 05%的二氨基联 苯胺(DAB)染色。适时终止反应['5]。光学显微镜下观察、计数。③ 实验结果大脑皮层神经-胶质细胞体外培养7天用于实验。先用梓醇500MM预处理神经细胞30分 钟，后用Ae^5刚共同作用72小时。药物处理完毕后，用抗MAP-2抗体对大脑皮层神经元 细胞进行免疫组化染色，与对照组相比(图7)，经5MM AP,-42作用72小时后，MAP-2-阳性皮 层神经元数目大大减少，其相应的树突也呈现明显的回縮、变短现象，由神经突触交错形成 的完整的神经网络结构遭到破坏(图8)。经500幽梓醇与处理后，受损的皮层神经元有所恢 复，MAP-2-阳性皮层神经元数目有所增加，而且回縮、弯曲变短的退化的树突也明显伸长， 逐渐重新形成交错连接的神经网络结构。至少从形态学意义上说明梓醇保护了 Ae,H2直接损 伤的床层神经元(图9)。此实验结果表明梓醇在老年痴呆细胞模型上有效。实施例5梓醇与水组合物的制备-取梓醇100nig加入1000ml注射用水，搅拌使溶解，用3号垂熔玻璃滤器滤过，再通过 0.6Pm微孔滤膜，分装入安瓿瓶中，每支2ml，灭菌，即得。实施例6梓醇与淀粉组合物的制备-取梓醇10g与淀粉990g混合，搅拌均匀，在湿法混合颗粒机上制成颗粒，于60'C热风 干燥至水分为4%左右，装胶囊，每粒0.25g,即得。实施例7梓醇与左旋多巴组合物的制备取梓醇10g、左旋多巴140g与淀粉850g混合，搅拌均匀，在湿法混合颗粒机上制成颗 粒，于6(TC热风干燥至水分为4《左右，装胶囊，每粒0.25g，即得。实施例8梓醇与左旋多巴和硝替卡朋组合物的制备取梓醇2g、左旋多巴10g、硝替卡朋8g与淀粉980g混合，搅拌均匀，在湿法混合颗粒 机上制成颗粒，于6(TC热风干燥至水分为4。/。左右，装入PE袋中，封口，每袋5g，即得。实施例9梓醇与苯海索和苯扎托品组合物的制备取梓醇10g、苯海索15g、苯扎托品25g与淀粉950g混合，搅拌均匀，在湿法混合颗粒 机上制成颗粒，于60匸热风干燥至水分为4%左右，压制成片，每片0.3g，包薄膜衣，即得。实施例10梓醇与他克林组合物的制备取梓醇50mg和他克林20 mg，加入1000ml注射用水，搅拌使溶解，用3号垂熔玻璃滤 器滤过，再通过0.6wm微孔滤膜，分装入安瓿瓶中，每支2ml，灭菌，即得。
权利要求
1、梓醇的结构通式(I)如下其中R1为单糖，R3，R4，R5，R8为氢，R6为OH，R7为-OCH2OH。
2 、制备权利要求1所述的梓醇的新方法，该方法包括以下步骤a将地黄的新鲜或干燥块根放置于平转式连续逆流提取装置中在乙醇溶液中浸泡并渗漉； b将地黄的乙醇提取液浓縮后用水分散，依次用石油醚，乙酸乙酯萃取除去杂质； c将b中水溶液相用H103大孔吸附树脂柱层析，用水洗至色浅，换成10%、 20%、 30%、 50%、 80%乙醇溶液梯度洗脱，收集80%乙醇馏分； d将c中收集馏分减压浓縮并干燥；f将d中的干燥物用甲醇-乙醇反复多次重结晶处理，得到纯度为99%的该化合物。
3、 按照权利要求1所述的梓醇，其特征在于，所述的化合物与水按质量百分比1: 1000000 至1: 4的组合物。
4、 按照权利要求1所述的梓醇，其特征在于，所述的化合物与植物油按质量百分1: 1000000至l: 5的组合物。
5、 按照权利要求1所述的梓醇，其特征在于，所述的化合物与淀粉或/和蔗糖按质量百 分l: 10000至100: l的组合物。
6、 按照权利要求1所述的梓醇，其特征在于，所述的化合物化合物与左旋多巴或/和卡 比多巴或/和司米吉兰或/和硝替卡朋按质量百分h 10000至10000: l的组合物。
7、 按照权利要求1所述的梓醇，其特征在于，所述的化合物与苯海索或/和丙环定或/和 苯扎托品按质量百分1: 10000至10000: 1的组合物。
8、 按照权利要求1所述的梓醇，其特征在于，所述的化合物与金刚烷胺或/和溴隐亭或/ 和培高利特按质量百分1: 10000至10000: 1的组合物。
9、 按照权利要求1所述的梓醇，其特征在于，所述的化合物化合物与他克林或/和哈伯 因或/和美曲膦酯或/和加兰他敏按质量百分l: 10000至10000: l的组合物b
10、 按照权利要求1所述的梓醇，其特征在于，所述的化合物化合物与占诺美林或/和Sabcomedine hydrochloride按质量百分1: 10000至10000: 1的组合物。
11、 按照权利要求1所述的梓醇，其特征在于，所述的化合物化合物与AIT082或/和盐 酸乙酰L肉碱或/和丙戊茶碱按质量百分1: 10000至10000: 1的组合物:。
12、 按照权利要求1所述的梓醇，其特征在于，所述的化合物用作制备抗帕金森病和老 年性痴呆病药物的用途。
13、 按照权利要求3-ll其中之一所述的梓醇，其特征在于，所述的组合物用作制备抗帕 金森病和老年性痴呆病药物的用途。
全文摘要
本发明涉及通式(I)的梓醇的制备新方法，其中R₁为单糖，R₃，R₄，R₅，R₈为氢，R₆为OH，R₇为-OCH₂OH。本发明还涉及该化合物和含它的药物组合物在预防和治疗老年性痴呆病和帕金森病方面的应用。本发明为研究开发新的抗老年性痴呆和帕金森病药物提供了该化合物新的制备方法和含它的药物组合物，有利于进一步开发天然药物资源。
文档编号C07H17/04GK101220063SQ20071015933
公开日2008年7月16日 申请日期2007年12月29日 优先权日2007年12月29日
发明者包永明, 波 姜, 涛 姜, 安利佳, 静 毕, 赵荣国 申请人:大连理工大学