专利名称：蛹虫草子实体水溶性肽多糖的快速分离纯化方法
技术领域：
本发明涉及生物活性物质的提取技术领域，尤其涉及一种从蛹虫草子实体 中快速提取、纯化水溶性肽多糖的方法。
背景技术：
虫草属(Cordyc印s)真菌感染寄主昆虫使其僵化，在适宜条件下从感染僵虫 上长出子座，从而形成具有虫(僵虫)草(真菌子座)复合体这一特定形态的子实 体结构。我国特有的冬虫夏草是虫草属的一个种，目前我国不少有名的虫草如 蛹虫草、蝉花和古尼虫草等的无性型都己有详细的报道。对虫草及其无性型的 药理学研究表明，虫草及其无性型具有多方面药理作用。虫草中含有多种生理 活性物质，虫草多糖是其中含量最高，也是其主要活性成分之一。虫草多糖不 仅具有抗肿瘤、降糖、抗放、抗肝纤维化作用，还能提高免疫功能及治疗肝的 病毒性感染。
据报道，目前有350余种虫草菌，然而虫草属子实体的人工培养并非易事。 近年来，仅蛹虫草人工培养比较成功，己经实现较大规模的生产，极大地改善了 我国虫草市场结构，满足国内外市场的需求。目前市场上的虫草制品多以人工 培养的蛹虫草为原料制成的，如虫草粉，虫草胶囊，虫草含片，虫草口服液等。 它们最大的优点是携带和服用方便，但只能作为保健食品，起到滋补强身的作 用。然而进一步研究其药理功能和开发能用于医疗的如免疫增强剂-虫草多糖针 剂，必需对虫草多糖进行人工提取并高度纯化。国内外虽然有关于虫草多糖制 备方法的报道，如虫草生物活性物质及其制备方法(200410052967.0),以人工培养的蛹虫草为原料，经提取、过滤、浓縮、液膜蒸发、喷雾干燥、高速离心 或硅藻土过滤，形成液形或固形物质化；于荣敏等的人工培养蛹虫草多糖的研究
(2000中国药学会学术年会论文集，宁波，969 972)和宾文等的人工培养蛹 虫草多糖的研究(2000沈阳药科大学学报，17: 361-364)也是采用干燥蛹虫草， 经粉碎，无水乙醚脱脂12h后，70—75。C水浴提取(10h/次，5次)，过滤，合并滤 液，减压浓縮，浓縮液以Sevag法除蛋白，透析48h，乙醇沉淀至含醇量70%，离 心(7000r/min， 15min)，收集沉淀，真空干燥，得粗多糖；分离纯化粗多糖经 S印hadexG—75柱层析，洗脱液为O. lmol/LNaCI溶液，流速为O. 8ml/min，苯酚 一硫酸法检侧，收集吸收度较大部分，透析48h，真空干燥，得精多精CMPS，分 子量约30000D左右。于荣敏等的人工培养蛹虫草多糖的分离纯化及结构分析(中 国药学会学术年会论文集，2002-11-01，桂林，323-325)首先采用乙醇分级沉 淀的方法进行了粗分离，再采用S印hadex G—100进行分离，得到五种精多糖 CPS-1， CPS-2， CPS-3， CPS-4， CPS-5。王蕾等(人工培养蛹虫草多糖的分离纯 化及其结构的初步研究，2003中国生化药物杂志，24: 23-25)用上述同样的方 法和S印hadex G-100分离得到了三种精多糖，CPS-1， CPS-2， CPS_3。车振明等
(人工蛹虫草子实体多糖分离最佳工艺研究，2004， 25: 78-79)通过正交实验 法对蛹虫草子实体多糖的提取和蛋白质去除的条件进行了优化。王英娟等的蛹 虫草中虫草素虫草多糖综合提取工艺研究(西北植物学报，2005， 25: 1863-1867) 采用超声波水提法、超声波醇提法、水热回流法和醇热回流法4种提取方法选择 虫草素和虫草多糖的提取方法。综上所述，目前国内外分离纯化菌类多糖大多 采用粉碎，脱脂，水提，浓縮，醇沉，离心，冻干，溶解，脱蛋白，脱色，上 柱纯化等步骤，工艺复杂，并需采用有机溶剂进行脱脂、脱蛋白，上柱纯化也 只使用了一种分子筛凝胶(S印hadex G-100或G-75)，分离样品需要手工收集，
实验检测多糖(苯酚-硫酸法)，工艺路线长，生产效率底，产品成本高，难以 实现大规模生产。
发明内容
本发明目的是，针对目前国内外分离纯化虫草菌子实体多糖方法中，所存在 工艺繁琐、成本高、有污染、效益低及难以实现大规模生产等的缺陷；提出一 种工艺简单、速度快、效率高、无污染、产品质量高、成本低的蛹虫草子实体 水溶性肽多糖快速分离纯化方法。
本发明目的通过以下技术方案得以实现。
蛹虫草子实体水溶性肽多糖的快速分离纯化方法，该方法按以下步骤进行
1. 取蛹虫草子实体，烘干粉碎，过200目筛，备用；
2. 超纯水提取将蛹虫草子实体粉与超纯水按重量l: 20 50比例，分3次
加水、提取，每次在50 100。C，提取4小时后，离心5000转/分、离心时间20 分钟，取上清液；合并3次上清液，用0.22um微滤膜过滤，过滤液为组分CF1;
3. 分子筛分离采用AKTA Purifier IOO蛋白质分离纯化系统设备配岛津 RID-10A示差检测器，滤液CF1直接上分子筛凝胶柱，以超纯水作流动相，流速 为L0ml/min，同时用三个波段280， 260， 215入m紫外检测和一个示差检测器 检测，收集第一峰经硫酸苯酚法和考马斯亮蓝法检测确认为是含肽链多糖物质 的组分CF1-1; CF1-1直接进入下一步骤或将其冻干呈灰白色，备用；
4. 离子交换柱分离、纯化将组分CF1-1上弱阴离子交换柱，先用超纯水作 流动相洗脱，流速为lml/min，得一峰组分CF1-1-1;然后用1M的NaCl作流动相 洗脱，流速为lml/min，得组分CF1-1-2;
5. 亲和层析柱分离、纯化将组分CF1-1-1上亲和层析柱，用20mMTris-HCl
pH 7.4 + 0.5M NaCl亲和缓冲液作流动相洗脱，流速为lml/min，没有峰出现； 再用p朋.5的0. 1M硼酸钠再生缓冲液作流动相洗脱，流速为lml/min，得一峰 CF1-1-l-l为肽多糖l;将组分CF1-1-2上亲和层析柱，用20mM Tris-HC1 pH 7.4 + 0. 5M NaCl亲和缓冲液作流动相洗脱，流速为lml/min，得CFl-l-2-l为肽多糖 2，再用pH6.5的0. 1M硼酸钠再生缓冲液作流动相洗脱，流速为lml/min，得 CFl-l-2-2为肽多糖3。
所述的分子筛凝胶柱为Superose 6、 Suphadex G-50、 S印hadex G-IOO或 S印hadex G-200中的任一种。
所述的弱离子交换柱为DEAE S印harose、 DEAE S印harose CL-6B、 DEAE cellulose D-32或DEAE cellulose D-52中的任一种。
所述的亲和层析柱为Con A S印harose 4B、 Con A S印harose CL-4B或Con A S印harose CL-6B中的任一种。
本发明的有益效果是
1. 工艺简单本发明根据肽链多糖与脂、蛋白、色素类分子结构、性质和 分子量不同的特点，在提取上采用了蛋白质分离纯化系统与示差检测系统相结 合的设备，在线筛选收集以大分子肽链多糖为主的第一峰物质，避免了对脂、 蛋白、色素等小分子类杂质的收集，因而在工艺上省略了常规提取中的脱脂、 已醇沉淀、脱蛋白和脱色的步骤，而采用水提取物直接上层析柱分离纯化，达 到工艺简化的目的。
2. 绿色分离，即不使用有机溶剂常规工艺中一般均需采用乙醚或石油醚 脱脂，乙醇沉淀多糖和蛋白质，再用氯仿丁醇或戊醇的Sevag法，三氟三氯乙烷 法或三氯醋酸法脱蛋白，然后用活性碳吸附法或双氧水氧化脱色；而本法不用 任何有机溶剂，在柱分离纯化过程中达到脱蛋白和脱色效果，因此无有机溶剂
污染，真正达到绿色分离纯化效果。
3. 效率高使用本法提取分离，因为省去了脱脂、已醇沉淀、脱蛋白和脱
色等步骤，使分离纯化过程时间减少三分之二以上；原来10克样品需要72小时 提取才可上柱层析，现在24小时就可以上柱层析。
4. 成本低使用本法节省了工艺和时间，且不使用有机溶剂，因此节省了 成本及后期处理包括脱有机溶剂和废弃物处理；使用本法仅使用水和无机盐， 因此总体成本很低，仅为传统常规方法的十分之一。
5. 产品纯度高已经报道的分离过程一般只有1至2次的柱层析分离，而本 方法经过分子筛凝胶柱、离子交换柱和亲和层析柱连续三次柱分离，最终获得3 个肽多糖CF1-1-1-1， CF1-1-2-l和CF1-1-2-2;这三个肽多糖在AKTA系统中紫外 检测和示差检测均呈现单一峰(见附图3)。
图l使用分子筛凝胶柱从组分CF1分离提取组分CF1-1曲线图； 图2使用离子交换柱从组分CFl-l分离提取组分CFl-l-l与CFl-l-2曲线图； 图3使用亲和层析柱从组分CF1-1-1分离提取CF1-1-1-1及从组分CF1-l-2中分 离提取CF1-l-2-l与CFl-l-2-2曲线具体实施例方式
通过以下实施例对本发明作进一步的详细说明，但本发明并不受此内容的 限制。 实施例1:
按以下步骤进行1) 将蛹虫草子实体烘干，粉碎，过200目筛，备用；
2) 超纯水提取按蛹虫草子实体粉超纯水二1:20的比例，分三次提取， 每次加水具体比例分别为l: 10， 1: 5， 1: 5，温度控制在100。C左右保持4小时，
离心5000转/分、离心时间20分钟，收集上清液；合并三次提取的上清液，过 0. 22 P m膜微滤得滤液组分CFl;
3) 分子筛分离将滤液CFl上层析胶为Superose 6的柱，层析仪器为AKTA Purifier IOO配岛津RID-IOA示差检测器，流动相为超纯水，流速为l. 0 ml/min, 同时用三个波段280， 260， 215Am紫外检测和一个示差检测器检测，收集第一 个峰组分CF1-1 (见附图l)，用硫酸苯酚法和考马斯亮蓝法检测确认组分CF1-1为 含肽链的多糖物质后，直接进入下一步骤或用Labconc冷冻干燥仪器冻干CFl-l， 呈灰白色，备用；
4) 离子交换柱分离、纯化将组分CF1-1上DEAE S印harose离子交换柱， 先用超纯水作流动相洗脱，流速为lml/min,得一峰CF1-1-1;然后用lM的NaCl 作流动相洗脱，流速为lml/min，得CF1-1-2 (见附图2);
5) 亲和层析柱分离、纯化将组分CF1-1-l上Con A S印harose 4B亲和层 析柱，用20mM Tris-HCl pH 7.4 + 0. 5M NaCl亲和缓冲液作流动相洗脱，流速 为lml/min，没有峰出现；再用p朋.5的0. 1M硼酸钠作流动相洗脱，流速为 lml/min，得一峰CF1-1-1-l为肽多糖l (见附图3);将组分CFl-l-2上Con A S印harose 4B亲和层析柱，用20mM Tris-HCl pH7. 4+0. 5M NaCl亲和缓冲液作流 动相洗脱，流速为lml/min，得CF1-1-2-l为肽多糖2;再用pH6. 5的0. 1M硼酸钠 作流动相洗脱，流速为lml/min，得CF1-1-2-2为肽多糖3 (见附图3)。 实施例2:
本例中，除蛹虫草子实体粉超纯水为1:30，分l: 10， 1: 10， 1: IO三次 加水并提取，温度控制在90。C左右；分子筛为S印hadex G-50柱；离子交换柱为 DEAE S印harose CL-6B柱外，其余工艺、条件、步骤、材料等均同于实施例l。 实施例3:
本例中，除蛹虫草子实体粉超纯水为1:40,分l: 15， 1: 15， 1: IO三次
加水并提取，温度控制在8(TC左右；分子筛为S印hadex G-IOO柱；离子交换柱 为DEAE cellulose D-32柱外，其余工艺、条件、步骤、材料等均同于实施例l。 实施例4:
本例中，除蛹虫草子实体粉超纯水为1:50，分l: 20， 1: 20， 1: IO三次 加水并提取，温度控制在7(TC左右；分子筛为S印hadex G-200柱；离子交换柱 为DEAE cellulose D-52柱外，其余工艺、条件、步骤、材料等均同于实施例l。 实施例5:
本例中，除蛹虫草子实体粉超纯水为1:30，分l: 10， 1: 10， 1: IO三次 加水并提取，温度控制在60。C左右外，亲和层析为Con A S印harose CL-4B柱， 其余工艺、条件、步骤、材料等均同于实施例l。
实施例6:
本例中，除蛹虫草子实体粉超纯水为1:30，分l: 10， 1: 10， 1: IO三次 加水并提取，温度控制在50。C左右；分子筛为S印hadexG-200柱；亲和层析为Con A S印harose CL-6B柱外，其余工艺、条件、步骤、材料等均同于实施例l。
权利要求
1、蛹虫草子实体水溶性肽多糖的快速分离纯化方法，其特征在于该方法按以下步骤进行(1)取蛹虫草子实体，烘干粉碎，过200目筛；(2)超纯水提取将蛹虫草子实体粉与超纯水按重量1∶20～50比例，分3次加水、提取，每次在50～100℃，提取4小时后，离心5000转/分、离心时间20分钟，取上清液；合并3次上清液，用0.22μm微滤膜过滤，过滤液为组分CF1；(3)分子筛分离采用AKTA Purifier 100蛋白质分离纯化系统设备配岛津RID-10A示差检测器，滤液CF1直接上分子筛凝胶柱，以超纯水作流动相，流速为1.0ml/min，同时用三个波段280，260，215λm紫外检测和一个示差检测器检测，收集第一峰经硫酸苯酚法和考马斯亮蓝法检测确认为是含肽链多糖物质的组分CF1-1；CF1-1直接进入下一步骤或将其冻干呈灰白色，备用；(4)离子交换柱分离、纯化将组分CF1-1上弱阴离子交换柱，先用超纯水作流动相洗脱，流速为1ml/min，得一峰组分CF1-1-1；然后用1M的NaCl作流动相洗脱，流速为1ml/min，得组分CF1-1-2；(5)亲和层析柱分离、纯化将组分CF1-1-1上亲和层析柱，用20mM Tris-HClpH 7.4+0.5M NaCl亲和缓冲液作流动相洗脱，流速为1ml/min，没有峰出现；再用pH6.5的0.1M硼酸钠再生缓冲液作流动相洗脱，流速为1ml/min，得一峰CF1-1-1-1为肽多糖1；将组分CF1-1-2上亲和层析柱，用20mM Tris-HCl pH 7.4+0.5M NaCl亲和缓冲液作流动相洗脱，流速为1ml/min，得CF1-1-2-1为肽多糖2，再用pH6.5的0.1M硼酸钠再生缓冲液作流动相洗脱，流速为1ml/min，得CF1-1-2-2为肽多糖3。
2、 按权利要求1所述的方法，其特征在于所述的分子筛凝胶柱为Superose 6、 Suphadex G-50、 Sephadex G-100或Sephadex G-200中的任一种。
3、 按权利要求l所述的方法，其特征在于所述的弱离子交换柱为DEAE Seharose、 DEAE Seharose CL-6B、 DEAE cellulose D-32或DEAE cellulose D-52 中的任一种。
4、 按权利要求l所述的方法，其特征在于所述的亲和层析柱为Con A Sepharose 4B、 Con A Seharose CL—4B或Con A Seharose CL—6B中的任一种。
全文摘要
本发明公开了蛹虫草子实体水溶性肽多糖的快速分离纯化方法，属于生物活性物质提取技术领域。方法包括取蛹虫草子实体烘干、粉碎；超纯水提取得组分CF1；分子筛分离得组分CF1-1；离子交换柱分离、纯化得组分CF1-1-1与CF1-1-2；亲和层析柱分离、纯化得肽多糖CF1-1-1-1、CF1-1-2-1与CF1-1-2-2。本发明采用蛹虫草子实体粉碎后水提取物直接上柱的纯化方法，极大地提高了效率，降低了成本，并且整个分离纯化过程不使用有机溶剂，真正使多糖提取分离纯化达到绿色、快速、高效的目的。本方法可在企业或实验室有关蛹虫草子实体水溶性肽多糖分离纯化的工艺中推广应用。
文档编号C07K1/14GK101200491SQ200710160380
公开日2008年6月18日 申请日期2007年12月18日 优先权日2007年12月18日
发明者C·R·索可, 吕国英, 吴永志, 李有贵, 潘慧娟, 范雷法, 计东风, 石 钟 申请人:浙江省农业科学院