一种提高蛹虫草子实体中虫草菌素含量的方法
【专利摘要】本发明公开了一种提高蛹虫草子实体中虫草菌素含量的方法，该方法是：在蛹虫草子实体人工培养的第10～25天期间，引入热胁迫，其热胁迫的条件为：蛹虫草培养温度为28～35℃；然后将培养物的培养温度调至常规培养温度18～25℃，进行常规培养，直到收获。本发明在蛹虫草特定生长时期引入热胁迫，使蛹虫草子实体中的虫草菌素含量成倍增加；该方法可以在蛹虫草人工培养中大规模应用，提高蛹虫草子实体的药效成分，具有极高的经济价值。
【专利说明】一种提高蛹虫草子实体中虫草菌素含量的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及蛹虫草人工栽培【技术领域】，具体地说是ー种人工调控培养条件以提高蛹虫草子实体中虫草菌素含量的方法。
【背景技术】 [0002]蛹虫草(Cbroycep1S又名北冬虫夏草,在真菌分类学上属子囊菌亚门，核菌纲，麦角菌目，麦角菌科，虫草属，与冬虫夏草(Cbrみceps sinensis )同为虫草属真菌的ー种。虫草属真菌是寄生于昆虫、蜘蛛或大团囊属植物的地下子实体上形成的ー类虫菌复合物的统称。蛹虫草是虫草属真菌的模式种，在野外主要寄主于鳞翅目、鞘翅目和双翅目的ー些昆虫的幼虫和蛹上，中医典籍记载它的功效为“味甘、性平，有益肺肾，补精髄，止血化痰”，与冬虫夏草的功能基本一致。过去，由于蛹虫草在野外产量稀少，其开发利用并没有被人们所重视。但自上世纪九十年代末，其大規模人工培养获得成功以来，其开发利用价值便越来越被人们认识，所开发的产品越来越多，市场需求也越来越大，蛹虫草子实体的人エ栽培正成为ー个具有极大经济价值的新兴产业。
[0003]虫草菌素(cordycepin)又称虫草素、3 ' _脱氧腺苷(3' -deoxyadenosine),是第一个从真菌中分离出来的核苷类抗菌素，是蛹虫草中最主要的活性成分之一。早在1950年，Cunningham等观察到被蛹虫草Cordyceps militaris寄生的昆虫组织不易腐烂,进而从中分离出ー种抗菌性物质，定名为虫草菌素，并在Nature上发表，之后许多学者对其进行了验证研究。虫草菌素分子式为CltlH13N5O3，其结构式如图1，分子量为251D，碱性，针状或片状結晶。虫草菌素具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、免疫调节、清除自由基等多种药理作用【王成明等2009 王成明，李磊，杨亲正，2009.虫草活性成分虫草素临床应用研究进展.广州化工，37 (5): 42-43】，以虫草素为主要成分的新药已在临床上试用于白血病的治疗【Kodama et al.2000 Kodama EN, McCaffrey RP, Yusa K，Mitsuya H，2000.Antileukemic activity ana mechanism of action of cordycepm against terminaldeoxynucleotidyl transferasepositive (TdT+) leukemic cells.BiochemicalPharmacology, 59(3): 273-281 ;蔡友华和刘学铭2007 蔡友华，刘学铭，2007.虫草素的研究与开发进展.中草药，38⑶:1269-1272】，有着良好的临床应用前景，虫草菌素的研究正成为药物化学中ー个极其活跃的领域【杨涛，董彩虹，虫草素的研究开发现状与思考。菌物学报 15 March 2011, 30(2): 180-190】。
[0004]人工培养中提高虫草菌素含量的生产应用主要分为提高液体发酵培养物中虫草菌素含量、提高固体发酵培养物中虫草菌素含量和提高子实体中虫草菌素含量三种途径。其中液体发酵培养和固体发酵培养主要以获取虫草菌素纯品为目标。而提高子实体中虫草菌素含量则是以提高蛹虫草子实体的商品质量为目标。在提高虫草菌素含量的方法上，目前已有的技术主要可概括为以下几个方面:
第一，通过菌种诱变和选育提高虫草菌素含量。
[0005]就菌株而言，自然界原始菌株的虫草素产量往往不高。Das et al.(2008)用质子束诱变(proton beam irradiation)的方法筛选出了虫草素的高产菌株，比出发菌株的虫草素含量高出72% ;李文等(2009)选择合适剂量的低能离子束注入蛹虫草，获得菌株的虫草素产量比出发菌株提高30% ;周礼红等(2009)通过对蛹虫草原生质体进行紫外诱变处理，筛选出优良菌株，经固体发酵后，虫草素含量为出发菌株的2倍，连续15代传代培养，虫草素的含量依然保持稳定。航天诱变技术也用在了蛹虫草的育种研究之中。2005年8月29日中国发射的第22颗返回式科学与技术试验卫星中有3支蛹虫草试管菌种，研究表明航天搭载蛹虫草的虫草素含量较原始菌株提高2.5倍(温鲁等2008)。[0006]第二，通过对培养基中营养成分优化提高虫草菌素含量。
[0007]关于虫草菌素培养基的优化研究较多，基本上所有的实验均考虑到了碳源、氮源以及碳氮比的影响，但是不同的实验可能因为菌株和其他实验条件的不同，优化的碳源、氮源不尽相同，但是碳源米用葡萄糖的较多(Mao et al.2005 ；Masuda et al.2006)。氮源以酵母提取物(Shih et al.2007)者酵母提取物与蛋白胨混合物(Masuda et al.2006 ；Gu et al.2007)为主，较低的碳氮比有利于提高蛹虫草的虫草素产量(Mao et al.2005 ；Shih et al.2007)。Xie et al.(2009)以农副产品糖米糊(brownrice paste)、麦芽汁和大豆汁作为培养基也得到了较高产量的虫草素。无机盐离子影响虫草素的产量。在培养基中加入适量的硒可促进蛹虫草虫草素的合成(王志高等2007 ;贲松彬等2009);硫酸亚铁和氯化钙是影响虫草素产量的关键因子(毛先兵和马开森2004)，这些离子可能作为酶的辅因子发挥作用。此外，NH4+有类似的作用，它对虫草素产量的提高可能不仅在于提供了氮源，而且与能量代谢有关，因为NH4+能激活H+-ATPase (Mao & Zhong 2006)。无机盐离子的添加虽然能增加虫草素的产量，但会给后续的分离纯化鉴定等过程带来不利影响。
[0008]第三，通过在培养基中添加前体物提高虫草菌素含量。
[0009]前体物质及激活子对虫草菌素合成有促进作用，贵州大学生命科学学院真菌资源研究所在此方面开展了大量的工作并显著提高了虫草菌素的产量。腺嘌呤核苷和腺嘌呤是虫草菌素合成的前体物质，培养基中添加适量的腺苷和腺嘌呤，虫草菌素的产量显著提高，其中添加腺嘌呤的效果好于腺嘌呤核苷(李祝等2008;文庭池等2010)。甘氨酸、L-谷氨酰胺也能刺激蛹虫草液体发酵胞外虫草菌素产量的提高，而且和前体物质腺苷、腺嘌呤有协同作用(文庭池等2010)。
[0010]第四，通过真菌激发子提高虫草菌素含量。步M等(2002)将曲霉Aspergillumsp.、青霉Penicillium sp.、根霉 Rhizopus sp.、疫霉Phytophthora sp.、灰霉 Cinereasp.等配制的真菌激发子培养液加入到蛹拟青霉的培养物中，发现疫霉、灰霉做激发子菌株可提高虫草菌素的含量，但是发挥作用的成分不明；分别提取真菌多糖作为激发子，发现不同来源的多糖激发作用并不完全相同，疫霉YL和曲霉P6-1两株真菌的菌丝体多糖可以提高虫草菌素的产量和生物量。在发酵起始阶段加入疫霉多糖，72h后再加入曲霉多糖，虫草菌素的含量可达到对照的5.7倍(李祝等2006)。有意思的是，蛹虫草与红曲霉菌株Monascus rubber MT305共培养也能提高虫草菌素含量(周礼红和蒋春玲2008)。炭角菌属银杏内生真菌Xylaria sp.YX-28菌株提取液制备的激发子和非生物型诱导子乙酸钠、硫酸铵也能促进虫草菌素的产生(刘小莉等2009 )。
[0011]第五，通过改变培养条件提高虫草菌素含量。
[0012]Shih et al.2007对蛹虫草虫草菌素培养条件的研究认为其最适pH为6左右；温鲁等2005研究认为，最适温度为20 — 25°C，采用遮光培养能促进虫草菌素的合成。
【发明内容】
[0013]本发明的目的是提供一种提高蛹虫草子实体中虫草菌素含量的方法，它主要是通过人工调控，在蛹虫草人工培养的特定时期改变培养温度以提高虫草菌素含量。该方法与目前已使用的提高虫草菌素含量的方法可叠加使用，可以大幅提高蛹虫草子实体中虫草菌素含量，是ー种极具创新性和应用价值的方法。
[0014]本发明的目的是这样实现的:
一种提高蛹虫草子实体中虫草菌素含量的方法，该方法是:在蛹虫草子实体人工培养的第10~25天期间，引入热胁迫，其热胁迫的条件为:蛹虫草培养温度为28~35°C;然后将培养物的培养温度调至常规培养温度18~25°C，进行常规培养，直到收获；具体包括以下步骤:
i蛹虫草子实体常规培养
将用常规方法制备好蛹虫草菌种接种于蛹虫草大米等粮食培养基中，分别经过避光培养、见光培养等常规培养过程(培养温度18~25摄氏度)，培养至第10天或以后。
[0015]ii蛹虫草子实体热胁迫培养
将步骤i中培养至第10~15天的培养物的培养温度调高到28~35摄氏度，其它条件不变，进行热胁迫培养，培养至第20~25天。
[0016]iii蛹虫草子实体常规培养
将步骤ii中培养至第20~25天的培养物的培养温度调至常规培养温度18~25摄氏度，其它条件不变，进行常规培养，直到收获。
[0017]本发明在蛹虫草子实体人工培养的第10~25天期间，引入热胁迫，可以使蛹虫草子实体中的虫草菌素含量比对照培养的虫草菌素含量显著增加，是ー种未见报道但简単、高效提高蛹虫草子实体中虫草菌素含量的方法；在蛹虫草子实体人工培养的第15天到第20天期间，引入热胁迫，能够使子实体中虫草菌素含量提高达到最佳效果，子实体中虫草菌素含量可以成倍增长。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1为虫草素的结构式。
【具体实施方式】
[0019]实施例1
1.1蛹虫草子实体常规培养
用常规方法制备好蛹虫草液体菌种，接种于蛹虫草大米培养基中，分别经过避光培养、见光培养等常规培养过程，培养至第10天。常规培养方法在该领域已相当成熟，该领域的技术人员均能实行。具体方法也可參考文献【高新华2008,蛹虫草(Cordyceps militaris)的交配型研究，食用菌学报15 (1):1~5.】所述相关内容。
[0020]1.2蛹虫草子实体热胁迫培养
将步骤1.1中培养至第10天的培养物的培养温度调高到28摄氏度，其它条件不变，进行热胁迫培养，培养至第20天。
[0021]1.3蛹虫草子实体常规培养
将步骤1.2中培养至第20天的培养物的培养温度调至常规培养温度22摄氏度，其它条件不变，进行常规培养，直到收获。
[0022]2012年8月至10月期间培养结果表明，相比于未经热胁迫处理的常规培养的对照组子实体中虫草菌素含量为1.8%。而言，按以上方法培养的蛹虫草子实体中虫草菌素含量4.1%。，是对照组的2.3倍左右。
[0023]实施例2
2.1蛹虫草子实体常规培养
用常规方法制备好蛹虫草菌种，接种于蛹虫草大米培养基中，分别经过避光培养、见光培养等常规培养过程，培养至第15天。
[0024]2.2蛹虫草子实体热胁迫培养
将步骤2.1中培养至第15天的培养物的培养温度调高到32摄氏度，其它条件不变，进行热胁迫培养，培养至第20天。
[0025]2.3蛹虫草子 实体常规培养
将步骤2.2中培养至第20天的培养物的培养温度调至常规培养温度22摄氏度，其它条件不变，进行常规培养，直到收获。
[0026]2012年8月至10月期间培养结果表明，相比于未经热胁迫处理的常规培养的对照组子实体中虫草菌素含量为1.8%。而言，按以上方法培养的蛹虫草子实体中虫草菌素含量
7.5%。，是对照组的约4.1倍。
[0027]实施例3
3.1蛹虫草子实体常规培养
用常规方法制备好蛹虫草菌种，接种于蛹虫草大米培养基中，分别经过避光培养、见光培养等常规培养过程，培养至第15天。
[0028]3.2蛹虫草子实体热胁迫培养
将步骤3.1中培养至第15天的培养物的培养温度调高到35摄氏度，其它条件不变，进行热胁迫培养，培养至第25天。
[0029]3.3蛹虫草子实体常规培养
将步骤3.2中培养至第25天的培养物的培养温度调高到常规培养温度22摄氏度，其它条件不变，进行常规培养，直到收获。
[0030]2012年8月至10月期间培养结果表明，相比于未经热胁迫处理的常规培养的对照组子实体中虫草菌素含量为1.8%。而言，按以上方法培养的蛹虫草子实体中虫草菌素含量
4.7%。，是对照组的约2.6倍左右。
[0031]本发明所述方法并非简单地引入热胁迫就能实现，而是在大量试验探索的基础上，找到了在蛹虫草子实体人工培养的特定时间阶段引入热胁迫提高子实体虫草菌素含量的方法。为了更好地说明此点，以下附上部分试验結果，以说明不同热胁迫时机和时间长度对子实体中虫草菌素和腺苷含量的影响。见表1。
[0032]表1.不同热胁迫时机和时间长度对子实体中虫草菌素和腺苷含量的影响
【权利要求】
1.一种提高蛹虫草子实体中虫草菌素含量的方法，其特征在于，在蛹虫草子实体人工培养的第10~25天期间，引入热胁迫，其热胁迫的条件为:蛹虫草培养温度为28~35°C ；然后将培养物的培养温度调至常规培养温度18~25°C，进行常规培养，直到收获。
2.一种提高蛹虫草子实体中虫草菌素含量的方法，其特征在于，在蛹虫草子实体人工培养的第15~20天期间，引入热胁迫，其热胁迫的条件为:蛹虫草培养温度为28~35°C ；然后将培养物的培养温度调至常规培养温度18~25°C，进行常规培养，直到收获。
【文档编号】A01G1/04GK103598006SQ201310503872
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年10月24日 优先权日:2013年10月24日
【发明者】高新华, 张红霞, 黄开华, 陈伟, 杨建军 申请人:上海市农业科学院