用于鉴定基因功能的方法和组合物的制作方法

专利名称：用于鉴定基因功能的方法和组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及有效鉴定核酸序列编码产物的一种或多种功能的方法及其相关组合物。该方法利用在细胞中过量和/或不足表达此产物的能力，以及这些结果的联合，使得能够鉴定该产物的至少一种细胞或体内功能特性。
背景技术：
测定人类和其它生物的基因组序列所作出的巨大努力已产生了大量可用于额外分析的核酸和蛋白质序列信息。许多序列信息现在，或者将来，将是生化和功能特征研究的主题。该序列信息还可作为“生物信息学”的原材料，其中该序列本身用于与以前已鉴定了结构、功能、或其它特征的其他序列作比较。这些努力的主要希望和期待是鉴定遗传序列所编码的功能，可开发用于人类和其它生物疾病的其它治疗学产品或疗法。
鉴定遗传序列所编码的功能的努力，至少最初集中于编码实际的基因产物的序列，或“基因”上。早期寻找克隆和编码基因的序列的方法依据通过定位克隆法对基因作图和克隆的策略和工具。由于人们大量的努力，定位克隆在确定各种疾病相关基因的位置上取得了成功。首先，基因作图是依据相关个体的大家族进行的，在染色体定位水平上和厘摩的范围内确定疾病相关基因的位置。其次，随着此种努力的显著增强，这项工作成为一种对基因物理作图的工作，因此从厘摩降低至兆碱基对，然后最终至具体的核苷酸。定位克隆成功的例子包括囊性纤维化和杭廷顿氏舞蹈病(Huntington’s disease)相关基因的鉴定。
分离基因的其它方法包括外显子截留(Buckler等(1991)P.N.A.S.884005-4009)和直接选择(Morgan等(1992)N.A.R.205173-5179)。这些方法可在大范围的基因组区域内鉴定潜在的基因，然后测定该基因的序列并用于当实际表达时证实该基因。在有些情况下，正常表达某潜在基因的细胞是未知的，因此仍然需要证实该基因的表达和鉴定基编码产物的功能。
定位克隆较之上述两种方法可获得的主要优越性在于它不需要知道被鉴定基因的基因产物的功能或生理作用，可根据随后的表型性状进行鉴定，之后研究具有该性状的具体序列的遗传分离。但是，鉴定后，在确定用于设计适当疗法的基因产物的功能作用中仍有困难。不知道编码产物的功能作用，仍难以(例如)鉴定出用作药物的适当制剂，来适当地将该基因产物靶向。此外，尚不知所鉴定的基因是怎样参与发病后的进展以及疾病后期的进展。
最近基因分离的一种方法是根据设计用来鉴定基因组中所有表达序列的大量测序成果。最近报道了在人和果蝇以及一些微生物基因组中已完成的该成果。但是随着这种大量序列信息的产生，需要进一步增加用于鉴定所编码的基因产物的功能的快速和有效的方法。这一需要导致对于鉴定基因功能的其它方法的大量的商业和工业行为活动。
一种鉴定功能的方法是通过生物信息学，它根据某新序列和其它先前已鉴定了结构、功能、或其它特征的序列之间的相似性而寻求确定功能。生物信息学最通常使用计算机程序来进行因此被称为发生“在硅片中”。然而，生物信息学的一个缺点是它仅提供可能验证一个基因序列的假定功能的起点。直到在活细胞或生物体内实际表达和特征分析了一个新序列，所提出功能仍然是特证明的假说。
验证给定基因功能的一种方法是通过使用小动物模型。例如，用转基因小鼠过量表达某基因序列以试图鉴定其编码的功能。基因序列还用于产生内源性小鼠序列不再表达的“敲除”小鼠。但是转基因方法的时间和花费限制了它们的用途每次只能研究少数几个序列。
已采用另一种细胞培养方法来过量表达感兴趣的基因序列。不幸地是还没有快速而有效的方法来可靠地产生内源性细胞序列不表达或过量表达的“敲除”细胞。然而，过量表达方法受到了用于传递和表达基因的载体系统所限制。首要的问题是，已知的载体系统限制了受基因转染的细胞的数量。例如，质粒载体具有低的转染效率并因此需要使用选择标记以分离转染的细胞。但是，由于感兴趣基因不是细胞中唯一被过量表达的基因，因此来自质粒载体的标记基因的表达有扭曲被测表型的倾向。不同的表述是，感兴趣基因的表达不只是发生于细胞中的唯一的主要干扰。同样，基因功能的确定可能由于标记基因的表达造成的扭曲而产生显著错误。使用一些病毒载体，例如致癌-逆转录病毒载体(onco-retroviral vectors)看到了相同的这种选择性标记介导的扭曲。
可从其它的病毒载体获得较高的转染效率，例如莫过于腺病毒的载体，但是这些载体常常不能提供感兴趣基因的稳定表达。更重要的是，这些载体经常表达大量的它们自身的基因或由于辅助病毒共转染而要冒污染的风险。载体和/或辅助病毒基因的表达也会干扰细胞内环境和扭曲受检表型并因此影响基因功能的测定。
发现使用载体为基础的过量表达的另一种局限，是不能确定应当或可能检测转染细胞中产生的那种表型。而且，这种方法很少使用原代细胞，而是使用由于不正常的细胞环境受鉴定的基因功能尚有怀疑的细胞系或患病细胞。
上述文献的引用不意味着承认任何上述都是恰当的优选技术。所有对于时间的陈述或这些文献内容的说明都是基于申请者可获得的信息，并不构成对于这些文献的日期或内容的正确性的任何许诺。
发明简述本发明提供了能提高对未受鉴定基因序列编码产物的一种或多种功能的鉴定能力或进一步鉴定或证实已知基因序列的一种或多种功能的组合物和方法。本发明通过至少两种方法测定某给定的未受鉴定的或感兴趣的已知基因序列的一种或多种功能。首先，将该基因序列，或其一个或多个部分插入一载体中并导入细胞中以表达编码的基因产物。表达的水平当然可被削弱，但较佳地是，该序列被过量表达。表达发生后，与不具有所述载体的正常细胞比较，检测和分析内源性细胞因子的表达、组成、或类型的变化。这使得能够鉴定那些细胞因子受到表达或过量表达的序列的影响。不限制本发明的范围，对于细胞因子的实际影响可包括对其表达水平的变化(例如在蛋白质和/或RNA水平上)、其氨基酸组成的变化(例如亚基和/或剪接变体的数量和类型)、和其翻译后修饰的状态(例如磷酸化和/或糖基化和/或脂类修饰)或定位(例如亚细胞定位和可溶性、膜结合、或该因子的至少一个部分插入膜的疏水部分)的变化的影响。细胞因子包括具有一种或多种已鉴定了功能的细胞因子以及其功能尚未鉴定的细胞因子。
其次，抑制或终止细胞中未受鉴定的或已知的基因序列的表达。不限制本发明的范围，可通过利用全部或部分基因序列与所述细胞中该序列的内源性单拷贝或多拷贝重组进行抑制来终止其表达。另外，可将该基因序列，或其一个或多个部分，以反义方向插入载体。可调节该序列或其部分的表达，这样只有当希望产生反义核酸时它才被表达。
较佳地，将反义序列连接于协同定位序列，依据该反义序列的表达，该协同定位序列能够用互补的内源性细胞的、和“有义”序列协同定位该反义序列。在本发明的一些实施例中，反义序列用于靶向核酶以切割内源性mRNA。将载体导入细胞中以表达反义序列，该反义序列结合于互补的内源性细胞序列并导致其表达抑制。在反义序列的表达(或使用其它手段)抑制了互补的细胞序列表达后，与未处理的正常细胞相比，检测和分析上述细胞因子的表达、组成、或类型的变化。这使得能够鉴定哪些细胞因子受到对应于感兴趣基因的内源性细胞序列(与所用反义序列互补的)表达的降低或抑制的影响。
较佳地，上述感兴趣基因序列的过量或不足表达可通过使用能够高效转导而不引起内源性载体基因序列明显表达或辅助病毒污染的病毒载体来进行。这种载体的例子包括描述于2000年9月22日提交的题名为“改良的条件性复制载体，它们的产生和使用方法”(Improved Conditionally Replicating Vector，Methods forTheir Production and Use)待批美国专利申请09/667,893中的哪些载体，该文献全部引用作为参考。甚至更佳的是本发明的实施例，其中转导的细胞是原代细胞。
任选地，作为转导过程的一部分，将上述用于过量和不足表达的载体整合进入细胞的基因组中。
在本发明的一个较佳形式中，检测细胞因子表达的变化。另外，可联合并比较两种方法中检测到的细胞因子表达的变化，以提供研究的未鉴定的或已知基因序列的一种或多种功能的其他信息。将检测到的细胞因子表达的变化联合，类似于用于研究细胞因子的差别表达对细胞状态的扰乱，例如在温度改变前或改变后或加入生长因子时的，“减法”技术。
详细的分析过量表达、不足表达以及二者的结果，使得能够鉴定感兴趣序列的一种或多种功能，根据主要是由于过量或不足表达感兴趣基因序列造成的变化受到干扰的可靠的细胞内环境。因此，根据对受所述序列表达变化影响的一个或多个细胞因子的鉴定或影响，可鉴定出所述感兴趣基因序列的功能。可能的功能的非限制性例子包括调节所述一个或多个因子的表达和影响所述一个或多个因子的活性。
该分析还使得能够鉴定与感兴趣序列在功能上相关的一个或多个细胞因子。一组这样的细胞因子将对感兴趣序列的过量表达显示表达增加，以及对感兴趣序列的表达抑制显示表达减少。另一组细胞因子将与上述相反，对感兴趣序列的过量表达显示表达减少，对感兴趣序列的表达抑制显示表达增加。
这样鉴定到的n组细胞因子在可被视为对感兴趣序列表达的干扰起“协同反应”的一部分。该“协同反应”可能是细胞的一种调节性、生化或代谢途径或其它功能。它还提供了鉴定细胞因子和感兴趣基因序列产物之间的功能关系的手段。
通过观察感兴趣序列的过量或不足表达的影响鉴定“协同反应”细胞因子的能力，提供了减少或消除花费在评价或考虑细胞因子上的时间的一种便利方法，该细胞因子显示了仅仅由于感兴趣序列的过量表达或者不足表达而致的表达变化。这种“协同反应”细胞因子可容易地分类为不同的组用于分别的研究、考虑和/或分析。本发明改进了快速和有效鉴定感兴趣基因序列的功能的能力，因为本发明降低了时间的耗费以及花费在与干扰感兴趣序列的表达同时相关的所有影响上的经费。本发明提供的方法仅集中在与感兴趣基因序列的过量和不足表达相关的那些影响。
本发明可通过检测在已发现感兴趣基因序列被表达的细胞或细胞型中的一个或多个细胞因子的变化来进行。这种感兴趣基因序列的非限制性例子，是在某些细胞类型中或在某些疾病条件下发现被表达的一种开放阅读框。另外，本发明可通过检测细胞或细胞类型的变化进行，在该细胞或细胞类型中没有检测到感兴趣的基因序列表达。较佳地，该细胞或细胞类型是人的细胞，尽管也可使用任何动物、植物或微生物的细胞。下面讨论将感兴趣基因序列导入细胞的方法。
这样，本发明提供含有用于鉴定感兴趣基因序列的一种或多种功能的两个或更多载体的分析方法、组合物和系统。任选地，至少可使用经三个载体来过量或不足表达另一种基因序列，以提供关于感兴趣基因序列的一种或多种功能的进一步信息。
在本发明的另一个方面，提供了一种高产量、和任选地计算机化的或机器人操纵的鉴定基因功能的系统。在这样的实施例中，本发明提供了载体文库和排列多重区室中的转导的细胞。对于载体，该文库包含具有用于感兴趣基因过量表达的载体或用于感兴趣的基因不足表达的载体的区室。这种载体文库可非常有效地用于转导细胞以在多重区室中产生细胞文库，每个区室含有用一个载体转导的细胞。在它们用于细胞转导前此载体文库可任选地在包装细胞中增殖。
通过使用本领域已知的机械操纵的显微阵列和宏观阵列技术，可分析转导细胞的文库中过量或不足表达感兴趣基因序列的影响。其一个例子是“基因芯片”技术，借此技术大量序列的基因表达可通过用于自细胞分离的mRNA或相应的cDNA的杂交的一张“芯片”来测定。本发明包括一种组合物，该组合物是用于实施所公开方法的一种阵列，任选地与来自过量和/或不足表达一个或多个感兴趣基因序列的细胞的物质接触(例如，与RNA、蛋白质、其它细胞物质、或这种细胞的细胞外物质接触)。
在分析对细胞因子的影响前，可将转导细胞文库作进一步处理或改变条件。因此，也可即时地分析细胞对细胞因子的影响。也可将该细胞移植到体内以进一步测定基因功能。
可使用各种方法检测细胞因子的变化。这些方法包括测定信使RNA水平、蛋白质表达水平、蛋白质活性水平、对蛋白质磷酸化的影响、对蛋白质或核酸加工的影响、对RNA稳定性的影响、对信号转导或第二信使的影响等等。
本发明还提供通过过量表达、或抑制表达经上述方法其功能已被鉴定的基因序列，改变细胞中的一个或多个细胞因子的表达、组成、或形式的方法。这些方法还可用于改变所述细胞的表型。
本发明提供了超过鉴定尚不知其活性的编码的基因产物的一种或多种功能的能力的许多优越性。这些优越性包括对有些活性信息已知的基因产物的功能提供其他的信息的能力；一种无功能基因产物的过量或不足表达对另一种无功能的基因产物表达的影响提供信息的能力；在表达不同内源性序列的不同细胞类型上进行相同的分析的能力。
本发明还提供了提高已知基因产物的表达的方法。一旦发现感兴趣基因序列所提高所需和已知的细胞基因产物的表达，则至少可使用该感兴趣基因序列来提高此产物的表达用于随后的分离或纯化。
本发明的另一个优越性是不需要知道或推测感兴趣基因的功能。在了解关于感兴趣基因的功能的本发明的实施例中，本发明有利地提供了鉴定可能以前未知的一种或多种其它功能性的方法，和/或证实可能以前已知的或怀疑有的一种或多种其它功能性的方法。后者对于与疾病相关的感兴趣基因序列有特殊关联，它可与本发明联合使用以鉴定或证实此序列的一种或多种其它功能性。例如，不限制本发明，可鉴定到某疾病相关基因序列编码产物的水平下降视作对此疾病的有效药理学治疗。但该序列表达水平的下降可怀疑引起另一种细胞因子的补偿性增加，这将降低此治疗的效果。在本发明中使用的疾病相关基因序列提供了一种测定这种补偿性增加发生以及鉴定补偿性细胞因子的有利手段。该因子是可以被同时减少以改进此病治疗的第二个靶标。
本发明另一个优越性是可确定基于基因功能的关系并用此关系产生功能关系图谱。
附图的简要说明

图1显示了当感兴趣的各个序列，“Seq”1-4，过量或不足表达时样品的结果。与以任意相对单位表示为“100”的对照细胞中的表达水平一起，说明了对各个细胞基因序列表达的影响。在该图中，“Seq”1-4可代表未鉴定的、推测已鉴定的和/或已知的序列。根据包含的更多的用于评估的细胞基因序列(增加更多的行)或更多的感兴趣的序列过量或不足表达(增加更多的列)，该结果可随意地增加。
进行本发明的方式本发明提供了鉴定某给定序列基因产物的一种或多种功能的方法和组合物。较佳地，该序列是人的序列，但一个或多个非人序列也可与本发明联合使用以鉴定它们对人细胞中细胞因子的影响。优选地，不需要事先知道编码的功能。然而，如果该功能是已知的，本发明则允许证实所述功能以及可能鉴定事先未知的或未认可的功能。
在一个较佳的实施例中，本发明提供了一个过量表达细胞中某给定的未鉴定的或已知的基因序列的载体。这种表达较佳地在严格的和/或可诱导的调节控制下。认为“未鉴定的”序列还没有证实具有细胞或生化功能。认为“已知”序列已被证实具有一种或多种细胞或生化功能。较佳地，发生了而不同时表达其它载体负载的序列过量表达，例如，但不限于，选择性标记。因此，细胞内环境仅受到感兴趣序列的过量表达的影响，并且所述过量表达的影响更确切地反映了所述序列的一种或多种功能。
分析本发明这一实施例转导细胞的细胞因子，本文定义为细胞基因产物(例如蛋白质或RNA)或其代谢产物(例如糖和脂类分子)，它们受到所述基因序列过量表达的影响。过量表达的影响与没有过量表达所述序列的正常细胞进行比较。较佳地，正常细胞用此载体模拟转染但并不表达所述基因序列。通过实施例，并不限制本发明，某给定基因序列(例如编码细胞分化的诱导剂)的过量表达与正常细胞相比将提高编码一种或多种细胞因子(例如参与分化或分化状态的基因编码的那些细胞因子)的RNA的表达。另外，一些基因序列(例如转录阻遏物)的过量表达将导致一种或多种细胞因子表达的下降。最后，一些细胞因子不受一些基因序列过量表达的影响。本发明包括鉴定感兴趣基因序列的一种或多种功能的能力，该基因序列通过与编码或调节所述细胞因子表达的核酸相结合而编码一种或多种细胞因子的调节剂。
在另一个实施例中，本发明提供了用于抑制或换句话说降低细胞中未鉴定的或已知的基因序列的表达的载体。这又是优选发生在缺乏其它载体负载序列，但不限于选择性标记的表达时。因此，细胞内环境又是仅缓到所述序列的完全或部分不足表达的影响，这种影响更精确地反映了所述序列的一种或多种功能。虽然基因序列的此种不足表达似乎需要细胞正常表达内源性序列，本发明仍可用不表达该序列的细胞来进行，因为在用载体转导来影响不足表达的细胞和模拟转导的细胞之间简直没有明显的差异。另外，正常表达内源性序列并因此能够不足地表达该序列的细胞，可先用本领域熟知的标准方法鉴定，例如使用该序列的全部或部分作为探针的Northern印迹法。为了快速地鉴定这种细胞，可使用“组织印染法”，其中制备各种细胞类型的RNA并同时进行Northern印迹法。
为了不足表达未鉴定或已知的基因序列，但不限制本发明，可将该序列以反义方向插入一载体以在细胞中转导和表达。这种表达优选在严密的和/或可诱导的调节控制下。当然不需要将整个序列以反义方向插入，可使用未鉴定的或已知序列的一个或多个部分。较佳地，将反义序列操作性连接于协同定位序列，其与反义序列一起表达，将待追踪的反义序列协同定位到与互补的内源性细胞或“有义”序列相同的细胞位置。虽然可直接使用反义序列以导致内源性mRNA不表达，但反义序列还可以是靶向序列的一部分以指导核酶切割该内源RNA。在这样的实施例中，当然要设计能够表达反义序列作为编码的核酶的有效部分以靶向此内源序列的载体。然后将该载体导进入细胞来表达反义序列，反义序列结合该互补内源性细胞序列并导致其表达的抑制。
可先用衍生自待抑制基因序列的各个部分的多种反义序列来测定哪一种最适合于降低细胞序列的表达。在本发明的一个实施例中，为了最完全抑制内源性细胞表达，如果细胞是待抑制基因序列的杂合性细胞，反义序列应针对内源表达序列的保守部分。另外，可用感兴趣基因序列来制备载体，该载体将与感兴趣基因序列的内源性拷贝重组以抑制它们的表达。
虽然各种协同定位序列可用于将反义分子协同定位到内源性RNA上，但优选的序列是U1、U2、U3、U4、U5或U6 snRNA，所有这些序列可操作性连接于述反义或核酶序列。更优选，所用的协同定位序列是U1 snRNA/启动子盒，如Dirtz(USP58,814,500中所述)，该文献全文引入作为参考。
虽然对于许多基因序列而言，完全抑制其表达的能力提供了对于其不足表达的结果的最清楚的信息，应注意部分或完全抑制序列表达的能力只是本发明的一个方面。当某基因序列编码对细胞活力具有关键性作用的产物时，部分抑制该基因表达具有特别的优越性。可能通过对细胞表达的完全或几乎完全抑制的致死作用，不难鉴定出这种基因序列。怎样获得部分抑制的非限制性的例子是在对所述序列为杂合性的细胞中靶向唯一的内源性性表达的序列。
分析本发明这一实施例的转导细胞受所述基因序列的不足表达所影响的细胞因子，与表达所述序列的正常细胞相比较。较佳地，正常细胞还是用该载体模拟转染，但不引起所述基因序列的不足表达。通过实施例，并不限制本发明，与正常细胞相比，某给定基因序列(例如编码转录阻遏物)的不足表达将提高编码一种或多种细胞因子(例如由所述阻遏物抑制的基因编码的那些细胞因子)的RNA的表达。另外，一些基因序列(例如转录活化剂)的不足表达将导致一种或多种细胞因子表达的下降。最后，一些细胞因子不受某些基因序列不足表达的影响。
虽然对于实施本发明不是绝对必需的，但是本发明用于过量或不足表达序列的载体，优选能够高效和稳定地转导细胞高达100％的效率。另外，尽管用低拷贝数的游离构建物也可实施本发明，但优选它们保持游离形式、高拷贝数。可通过用适当的配体激活待转导细胞，随后在标准条件下培养这些细胞来提高稳定的整合(见于2000年8月31日提交的待批美国申请序列号09/653,088，题为“用病毒载体稳定转导细胞的方法”(METHODS FOR STABLE TRANSDUCTION OF CELLS WITHVIRAL VECTORS)，该文献全文引入作为参考。较佳地，还设计了种载体不论以有义或反义方向，除感兴趣的基因外，只少量表达或不表达载体负载的序列。在本发明的一些实施例中，此载体进一步含有足以允许此载体整合进入细胞基因组的序列。这种重组可基于同源重组或基于整合酶介导能使存在于载体上的序列整合的重组。作为一个非限制性例子，当使用慢病毒衍生载体时，正常的慢病毒整合序列可促进稳定整合进入宿主细胞基因组中。
待过量或不足表达的给定的未鉴定或已知的基因序列可取自任何来源甚至可被部分鉴定。未鉴定的或部分鉴定的序列的非限制性例子包括从EST(表达的序列标记物)序列的分离和特征鉴定得到的那些序列，以及认为可能编码基因产物的任何核酸序列，或是RNA或蛋白质形式。这种序列包括通过EST序列的装配而鉴定的那些序列或其它测定编码基因产物的序列。这些序列包括那些进行生物信息学分析并因此与其它已知或未特征鉴定的序列具有同源性的序列。通过实施例，并不限制本发明，可将可排布的没有功能的编码开放阅读框的序列，用于本发明以鉴定其在细胞中的一种或多种功能。相似地，编码与DNA结合蛋白质具有同源性的开放阅读框的序列(例如基于生物信息学分析)可用于本发明以证实其作为转录因子的推定的功能。
已知序列的非限制性例子可取自任何来源并包括已指定了一种或多种功能性的那些序列。这种序列包括在公众可获得的数据库中的序列以及编码已特征鉴定的基因产物的任何序列。这种序列可用于本发明来证实已知的功能和/或鉴定其他的功能。通过实施例，并不限制本发明，可发现编码仅鉴定为使胞浆蛋白磷酸化的激酶的序列，引起由于该激酶的过量表达而提高了核转录因子的表达。不受理论的束缚，该激酶可通过其激酶活性直接或间接地导致转录因子增加表达。一种可能性是该激酶磷酸化转录因子而使之失活，借此通过反馈环提高了其表达。如本文所述对细胞因子的其它影响也可通过一个或多个反馈环产生。
另外，人工序列，例如重组性融合或其它嵌合性构建物以及上述序列的突变型也可用于本发明以鉴定它们的功能。本发明的这一方面在证实作为能够替代野生型蛋白质功能的具体的人工蛋白或诱变蛋白中可能具有特别的优越性。例如，并不限制本发明，能够自身形成多聚体，但不具有p53的显性失活突变体形式的p53蛋白质的合成性突变体，可用于本发明以证实其替代野生型功能p53的能力。通过这种证实，该合成性突变体可用于治疗含有显性失活p53突变的细胞的疗法中。
对于实施本发明可通过任何手段将未鉴定的或已知序列导入载体。较佳地，通过高效的方法进行，该方法以平行方式进行并可将对于多重克隆步骤的需要和证实克隆步骤的需要减到最小。更佳地，序列插入载体通过自动化技术进行。作为一个非限制性例子，可将感兴趣基因序列先克隆入最初的载体，该载体能够使的序列随后导入本发明过量或不足表达的载体中。这可通过使用重组介导的插入系统，例如Life Technologies的GatewayTM克隆系统，该系统利用质粒中的att位点使得序列可在载体之间高效转移。这样，在本发明的一个实施例中，用于过量或不足表达某基因序列的载体可包含适当的att位点以允许基因序列的有效插入。
在一个自动化的实施例中，基因序列的插入可基于含有基因序列文库的阵列的使用。这种含有序列的阵列可用于产生多个另外的阵列，这些阵列基于含有该基因序列的经一个文库而组成。这种多个阵列可依次包括一个或多个如下阵列含有用适当的接头修饰的该基因序列的阵列；含有用于扩增的修饰的基因序列的阵列含有导入用于增殖或进一步克隆的最初载体的修饰的序列的阵列；从最初的载体转移入本发明的一个或多个载体的序列的阵列；以及在用于转导细胞前适当地包装的这种载体的阵列。
使用这种阵列所提供的一个优越性，是当本发明基因序列文库过量和不足表达时能够继续使用存在于这种阵列中的组织结构。例如，含有包装载体文库的阵列排布可用于转导一细胞阵列，然后可部分或全部收获该细胞阵列，以分析该阵列的基因序列过量和不足表达对细胞因子的影响。
用于本发明的细胞可以是任何种类的细胞。但对于功能的最佳测定，当该基因序列被过量或不足表达时细胞应来自相同的生物。不过序列可与细胞异源，在该细胞中序列被表达以确定它们在细胞中的功能。较佳地，该细胞是人的细胞，研究感兴趣基因序列至少最初是在发现该序列被表达的细胞中。通过非限制性例子，可在哺乳动物细胞中表达真菌序列以测定它在那里的功能。如果已知与真菌序列相对应的哺乳动物序列，本发明的这一方面具有特殊的优越性。这得以比较不足表达哺乳动物序列的影响以证实真菌序列能够作为哺乳动物序列的替代物而行使功能。如果这样，该真菌序列可编码一种产物，该产物可以是哺乳动物序列编码的产物的治疗性替代物。
用于实施本发明的较佳的细胞类型是真核细胞，更佳的是原代真核细胞，最佳的是原代哺乳动物细胞和人类细胞。较佳的细胞是人组织细胞，包括但不限于，神经元细胞、脑细胞、上皮细胞、结缔组织细胞(例如成纤维细胞、成骨细胞和脂肪细胞)、血细胞(例如白细胞、淋巴细胞、单核细胞和嗜中性白细胞)、感觉细胞、肌肉细胞、感觉细胞(例如视觉细胞和毛发细胞)、肺细胞、心脏细胞、肝细胞、皮肤细胞、胰细胞、乳房细胞、肾细胞、小肠细胞、胃细胞、结肠细胞、前列腺细胞、卵巢细胞、和精细胞。还可使用包括衍生自上述任何一种细胞的培养的细胞系。然而，在本发明的另一个方面，如果需要还可采用部分或完全分化的细胞。通过非限制性的例子，如果待不足表达的基因序列仅在所述分化的细胞中正常地表达，那么采用分化细胞是优选的。对于不同细胞类型的转导，载体可通过采用本领域已知的假型和两性包装系统适当地包装。
转导各种细胞类型的能力提供了本发明的另一个优越性，其中在各种(异源的)细胞类型中某基因序列的过量和不足表达可用于提供更多的信息并因此提高了基因功能的排布。这种提高部分是由于内源性基因在不同的细胞类型中表达的差异。因此，一个基因序列的整个功能范围可通过评估其在各种细胞类型中过量和不足表达要更好地阐明。
根据如本发明所鉴定的一种或多种功能，感兴趣基因序列在异源细胞中的表达还提供了一种改变所述细胞表型的方法。作为一个非限制性例子，某基因序列的过度表达可导致在正常表达该序列的细胞中细胞表面标记表达的提高。在正常情况下不表达该序列的异源细胞中，该序列的表达可导致异源细胞表面上的细胞标记的表达，因此提供了一种鉴定和/或靶向那些异源细胞的新方法。
在本发明一个较佳的实施例中，将上述用于过量和不足表达某基因序列的载体整合入细胞的基因组国作为转导加工的一部分。
本发明的另一个方面，可比较由于其序列的过量和不足表达而检测到的细胞因子的表达变化，以提供对所研究的基因序列的功能的另外信息。在图1中，例如，未鉴定的序列2(“Seq 2”)的过量表达(O)显示为提高了“结构蛋白1”的表达。但与对照细胞(Con)比较，Seq 2的不足表达(U)显示为对“结构蛋白1”的表达具有非常小的影响。象这样，Seq 2和结构蛋白1之间的关系可能是其中Seq 2行施功能活化或诱导了结构蛋白1的表达，而Seq 2的不足表达对结构蛋白1的背景表达具有极小的影响。
相似地，可通过观察哪些细胞因子受到类似地影响来分析某序列编码产物的功能作用。例如，在图1中，序列1(“Seq 1”)的过量和不足表达同样地影响了“转录阻遏物1”和“转录阻遏物2”的表达。因此，Seq 1的表达产物以同样的方式行使调节这两种阻遏物的功能。另一方面，Seq 1的过量和不足表达对“转录因子2”的表达具有相反的影响。这表明Seq 1的功能是同时调节这两种阻遏物和“转录因子2”的细胞表达。
而且，本发明提供了鉴定未鉴定的序列之间的功能关系的方法。例如，在图1中，“Seq 3”和“Seq 4”对“氧化还原酶1”的表达具有相同的影响。这将表明Seq 3和Seq 4的表达产物至少在二者调节“氧化还原酶1”表达的程度上彼此功能相关。此外，图1中“Seq 2”的过量表达显示为增加了“Seq 3”的表达(见对于Seq 3行的Seq 2的O、U和C列)。
图1中的结果还显示了某基因序列的其它功能性。例如，当分析“Seq 4”自身的表达水平时，显示“Seq 4”自动调节其自身的表达。当Seq 1、2或3过量表达时，相比之下(对于相同的Seq列比较Seq 1、2、3和4四行)Seq 4的过量表达没有导致同样多的Seq 4 RNA表达)。这将例证Seq 4的过量表达导致内源性Seq4表达的反馈抑制的情况。相似地，由于内源性Seq 4表达的反馈性激活。Seq 4的不足表达没有消除Seq 4的表达。
还可将细胞因子表达中检测到的变化联合起来以提供关于功能关系的其他信息。作为非限制性的例子，可采用减数杂交定量地测定过量表达和不足表达某基因序列的细胞之间表达RNA的差异。例如，可采用过量表达某基因序列的第一组细胞表达的总RNA来产生cDNA，用于进行针对从不足表达该基因序列的第二组细胞表达的总RNA的减数杂交。如果第一组细胞中特异性RNA的量比第二组细胞中的高，杂交后将会有作为单链分子的对应于剩余的特异性RNA的过量的cDNA。然后可分离和检测该cDNA。较佳地，减数杂交还使用不足表达某基因序列的细胞作为第一组和过量表达该序列的细胞作为第二组来进行。这样减数杂交的结果显示于图1中，其中(如果可应用)在“C”列下对于每个未鉴定的序列“Seq”有两个数字。第一个数字是指用过量表达组(O)的cDNA进行的减数杂交，而第二个数字是指用不足表达组的cDNA进行的减数杂交。
另外，减数杂交还可用于比较对照细胞和过量或不足表达某具体基因序列的细胞之间表达的RNA。这样可从过量或不足表达某基因序列的细胞所表达的RNA中“减去”，对照细胞中表达的RNA以提供关于所述基因序列功能的其他信息。该方法对于克隆在正常细胞和过量或不足表达某具体基因序列的细胞之间差别性表达的RNA也是优选的。
图1中的结果还可通过将细胞放置在不同的培养条件下进行修饰。通过非限制性的例子，在RNA制备前，可将细胞放置在活跃生长和/或增殖的条件下、静止条件下、温度改变的条件下、和配体存在的条件下。这些条件的使用提供了测定感兴趣基因序列的一种或多种功能性的更多信息。
在本发明的另一个方面，一个或多个添加的基因序列的过量或不足表达与第一个感兴趣基因的过量或不足表达联合同时进行。作为非限制性的例子，并基于图1，用过量表达Seq 1的载体转导的细胞可分别代替用同时过量或不足表达另一个序列(例如“Seq 5”)的载体转导的细胞。相似地，用不足表达Seq 1的载体转导的细胞可分别代替用同时过量或不足表达Seq 5的载体转导的细胞。这种同时过量或不足表达技术提供了鉴定或证实任何基因序列的功能及功能关系的更多信息。
在这种同时方法的另一个实施例中，至少可采用第三个载体来同时过量或不足表达一个或多个添加的基因序列。当然该载体应是一种与用于过量或不足表达第一个基因序列的载体相容的载体。在这种同时方法的另一个实施例中，第一个基因序列可能与同时过量或不足表达的一个或多个添加的基因序列密切相关。作为一个非限制性的例子，第一个基因序列可以是野生型序列，所用的细胞对于该序列的错误机能突变体可以是纯合性细胞，并且待表达的添加基因序列是编码该错误机能突变体内源序列的反义型。通过使用添加的基因序列同时表达野生型序列和不足表达错误机能突变体序列，可将第一基因序列的野生型活性保存在细胞中。
在这种同时方法的另一个实施例中，该添加基因序列可编码致癌基因或肿瘤抑制基因。
本发明的另一个方面是实施本发明高产量的系统的应用。在这一方面的一个实施例中，该系统可任选地计算机化或用机器人操纵，并还可包括上述阵列的应用。在本方法的一个实施例中，本发明提供基因序列文库，含有它们的过量和不足表达的载体，用所述载体转导的细胞，以及通过分析所述细胞明确对细胞因子的影响。较佳地，该基因序列文库存在于多个区室中，各个区室含有一个基因序列。在一个特别优选地的形式中，这些区室存在于一个多孔的容器中，例如但不限制本发明，一个多孔平板中。这样一种多孔容器可被认为是含有全部或部分基因序列文库的阵列，并且存在于这种阵列中的序列的组织结构可在实施本发明的整个过程中被保持，直到和包括分析对细胞因子的影响。实施本发明的具体的优越性是使用仅含有一种基因序列的载体来中转导各个区室的细胞。
在本发明的另一个方面，分离的阵列可用于过量和不足表达感兴趣的基因序列。但较佳的是将对于包含在这种分离阵列中的细胞因子的影响联合起来以提供更容易的分析。作为一个非限制性的例子，一旦确定了某基因序列的过量和不足表达对文库的每个序列的影响，可联合该信息然后进一步分析结果。例如，图1显示文库序列1-4(见顶端行)的过量(见列“O”)和不足(见列“U”)表达对许多细胞因子(见左边的列)的联合影响。也可通过例如上文讨论的“减数杂交“方法联合，对细胞功能的实际影响然后用过量和不足表达数据同时分析(例如见图1中的列“C”)。
在实施本发明的另一个方法中，过量和不足表达对细胞因子的作用在能够机械操纵的是微或宏观阵列上进行。这种机械优选能够部分或完全自动化收集过量或不足表达某基因序列的细胞以测定对细胞因子的影响。在一个用于分析对基因表达的影响的非限制性例子中，含有编码细胞因子的序列的“基因芯片”用于测定这些因子中哪一种受到过量或不足表达某具体基因序列的影响。这样，RNA或与之相对应的cDNA可从细胞分离、标记和与所述芯碎片上的序列杂交。可将这样杂交的结果可与用对照细胞杂交见到的结果相比较，以测定对存在于芯片上的各种细胞因子编码序列的影响。当然，可采用多样性芯片以得以分析已知的许多细胞因子，以及得以针对其它未鉴定的序列分析每个未鉴定的序列。另外，相同芯片的复制品用于分析过量或不足表达某具体基因序列的细胞。
分析前，可对过量和不足表达各种序列的转导细胞文库作进一步处理或改变条件。除本文描述的添加的序列同时过量或不足表达外，可将该细胞置于各种因子存在的条件下或在各种生长条件下培养。作为一个非限制性的例子，可使该细胞接触一个或多个配体以诱导各种效应。另外，可随时间分析该细胞或将它移植入体内以使得能够鉴定对细胞因子的其它影响。
在本发明的另一个实施例中，对细胞因子影响的分析可通过采用任何试验进行。如下是提供作为实施本发明的附加的非限制性的例子。当然这些例子可通过部分或完全自动化手段进行。
在第一个非限制性的例子中，可分析细胞过量或不足表达某基因序列对细胞因子的蛋白质水平的影响。如此，一个细胞的样品可用于采用对各种细胞因子具有特异性的抗体的蛋白质印迹分析。另外，该分析可通过其它手段，例如定量免疫试验进行。这种分析可与本文描述的基因表达分析结合进行以提供对细胞因子影响的更完全描绘，因为RNA表达水平的变化可能不总是与所述RNA编码的蛋白质水平的变化密切相关。而且，该方法可通过采用唯一针对已观察到表达变化的RNA编码的蛋白质的抗体，继续基因表达的分析。
在第二个非限制性的例子中，可分析细胞过量或不足表达某基因序列对蛋白质活性的影响。这对于编码另一个蛋白质或酶的激活剂或抑制剂的基因序列可能是特别感兴趣的。一个细胞的例子可用于酶或其它蛋白质试验以检测活性的变化。例如，某特异性激酶的激活剂的过量表达，将提高适当试验中所述激酶的可检测活性。这种作用可能或不可能独立于该激酶的基因表达或蛋白质水平的任何变化。
在第三个非限制性的例子中，可分析细胞中过量或不足表达某基因序列对蛋白质磷酸化的影响。可培育过量或不足表达某基因序列的细胞以便于通过磷基团放射性标记该磷酸化蛋白质。然后可采用双向凝胶或适当的免疫试验(例如采用对已知的磷蛋白具有特异性的抗体)分析从这种细胞的样品以检测蛋白质磷酸化的变化。
在第四个非限制性的例子中，可分析细胞过量或不足表达某基因序列对不是基因产物的细胞因子的影响。例如，可分析对各种小分子(例如钙、钠和氯离子；各种酶促循环中的中间体；脂类；等等)的细胞内浓度的影响。在另一个例子中，检测细胞表面上各种细胞因子的产生和表达，例如脂类或糖。
本发明还提供了分离某基因序列编码产物的有利方法，这可通过收集过量表达所述序列的细胞和纯化所述产物而简单地完成。
本发明进一步提供了不需要知道待过量或不足表达的序列的功能的优点件。这样，可任选地去掉生物信息学所需的时间和花费，虽然在实施本发明中包含生物信息学的信息将增加精确赋予某基因序列功能的可能性。
而且，本发明提供了使一种未鉴定的基因序列的功能与另一种基因序列的功能性相关联的能力。本发明还允许将这种能力与鉴定未鉴定的和已知的序列之间的功能关系的有利能力相联合，以提供功能上相关的基因序列家族的测定。各个家族成员之间的关系可表达为基于功能关系的图谱，如果没有进行广泛的研究将不会认识该图谱。
本文所引用的全部参考文献以全文引入作为参考，不论是否事先已特别引入。如本文所使用，所有以单数形式表达的术语是指包括单数和复数形式。
现在已全面描述了本发明，本领域技术人员应理解在具有等效参数、浓度和不背离本发明思路或范围的条件下以及无须过度实验可进行与本发明相同的实验。
虽然已结合具体的实施例描述了本发明，应理解它能够作进一步的修饰。本申请意图包括，概括地说遵循本发明的原理对本发明所作的任何变化应用或改进，以及包括本公开的这种背离来自本发明从属领域中的已知或常规实践中，并在陈述前可应用于本文的本质特征。
权利要求
1.一种鉴定细胞类型中感兴趣基因序列功能的方法，其特征在于，所述方法包括a)在所述类型的第一细胞群中过量表达所有或部分所述序列；b)在所述类型的第二细胞群中抑制所述序列的表达；c)检测所述第一和第二细胞群中一种或多种细胞因子的变化；d)根据对所述一种或多种细胞因子的鉴定或影响，鉴定所述感兴趣基因序列的功能。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述变化是所述细胞因子表达的增加和/或减少。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述变化是所述细胞因子的翻译后修饰。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述变化是所述细胞因子的磷酸化或糖基化。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述变化是所述细胞因子的活性变化。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一细胞群中的过量表达是通过使用假型慢病毒载体进行的。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二细胞群中抑制表达是通过使用能够以反义方向表达所有或部分所述基因序列的假型慢病毒载体进行的。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞类型是原代细胞。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞类型是培养的细胞系。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述感兴趣基因序列是当在所述细胞类型的细胞中表达时先鉴定的。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述感兴趣基因序列是当在所述细胞类型的细胞中表达时没有事先鉴定的。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述感兴趣基因序列编码一种产物，该产物通过与编码或调节所述一种或多种细胞因子表达的核酸结合，调节所述一种或多种细胞因子的表达。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述感兴趣基因序列编码一转录激活剂。
14.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述感兴趣基因序列编码一转录阻遏物。
15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述感兴趣基因序列是人的序列。
16.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞类型是人的细胞类型。
17.一种改变在含有过量表达或抑制某基因序列表达的细胞中的一种或多种细胞因子表达的方法，其特征在于，该方法采用如权利要求1所述的方法鉴定该基因序列的功能。
18.一种改变含有过量表达或抑制某基因序列表达细胞的表型的方法，其特征在于，该方法采用如权利要求1所述的的方法鉴定该基因序列的功能。
19.一种鉴定某感兴趣基因序列在与所述序列的细胞来源异源的细胞中的功能的方法，其特征在于，所述方法包括a)在所述类型的第一细胞群中过量表达所有或部分所述序列；b)在所述类型的第二细胞群中抑制所述序列的表达；c)检测所述第一和第二细胞群中一种或多种细胞因子的变化；d)根据对所述一种或多种细胞因子的鉴定或影响，鉴定所述感兴趣基因序列的所述功能。
全文摘要
本发明涉及用于有效鉴定感兴趣核酸序列编码产物的一种或多种功能的方法和组合物。所述方法利用在细胞中过量和/或不足表达该产物的能力，以及这些结果的联合使得能够鉴定该产物的至少一种细胞或体内功能。
文档编号C12Q1/02GK1524126SQ02806861
公开日2004年8月25日 申请日期2002年1月25日 优先权日2001年1月25日
发明者B·德罗普利克, B 德罗普利克 申请人:VIRxSYS股份有限公司