专利名称：一株高生物量富锌酵母及其选育方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物发酵工业技术领域中的一株富锌酵母及其选育方法与在生产中的应用，特别是涉及一株高生物量富锌酵母及其选育方法与在生产中的应用。
背景技术：
锌是人和动物维持生命和发育的必需营养物质，是体内必需的微量元素之一。缺锌会影响体内DNA复制及蛋白质合成，严重影响皮肤、骨骼及其它器官的正常发育。儿童生长期、妇女妊娠、哺乳期、外伤、反复出血等都易引起缺锌症状和免疫功能下降。我国学龄前儿童普遍存在缺锌现象。服用无机锌盐(如硫酸锌等)虽然有一定作用，但是吸收利用率低，常有肠胃不适等反应，严重者会引起肠出血。
富锌酵母能将无机状态的锌转化成有机状态的锌，可以提高锌的利用率。利用富锌酵母将无机状态的锌转化成有机状态的锌是开发新型锌源，提高锌的利用率的主要措施。富锌酵母在预防和治疗人及动物缺锌性疾病方面将发挥显著的作用。此外，富锌酵母细胞还含有丰富的核酸、蛋白质、氨基酸、维生素等，是一种高营养价值的补锌蛋白质食品和饲料添加剂。
近年来，尽管已有一些称为“富锌酵母”的产品问世，但这些产品存在明显的缺陷和不足一是没有对酵母菌种进行筛选和育种，经常是用随机得到的酵母菌种发酵生产富锌酵母产品。但是由于不同酵母菌种对锌的抗性差异较大，对锌离子的吸收转化能力差异也较大，因此产品缺乏稳定性，不利于工业化生产。
二是没有对发酵生产富锌酵母的培养基的锌离子浓度、培养条件进行优化，因此培养的酵母虽然称为“富锌酵母”，但是其酵母细胞的锌含量较低，细胞生物量也较低。
目前，生产称为“富锌酵母”的方法大体有三种，第一种是采用混合处理方法，即将一定量的锌盐(如硫酸锌、醋化锌、氯化锌、氧化锌等)与市场上的面包酵母或啤酒酵母细胞混合而成。其主要缺陷在于未将无机锌转化成为有机锌，这种将锌盐(如硫酸锌、醋化锌、氯化锌、氧化锌等)与酵母细胞混合在一起的所谓“富锌酵母”的生物学作用较差，吸收利用率低。
第二种是采用简单的吸附方法，将市场上的面包酵母或啤酒酵母细胞悬浮于含有一定浓度的锌盐(如硫酸锌、醋化锌、氯化锌、氧化锌等)的水溶液中处理一定时间，使锌离子吸附于酵母细胞表面，其主要缺陷在于这种处理仍然不能将无机锌转化成为有机锌。这种吸附锌盐(如硫酸锌、醋化锌、氯化锌、氧化锌等)的酵母细胞与上述第一种方法没有本质的区别，人或动物对其吸收率低，产生的生物学作用较差。
第三种是在含有一定锌离子的培养基中培养酵母细胞，但是对酵母菌种没有进行筛选和育种，随机选用一种酵母菌种即进行发酵，其主要缺陷在于由于不同酵母菌种对锌的抗性能力有较大差异，从而对锌离子的吸收转化能力差异较大。此外，这种技术对培养基的锌离子浓度、培养条件未进行系统优化，因此采用这种技术培养的酵母中，有机锌含量较低(每克干酵母细胞有机锌的含量在10毫克以下)、细胞生物量也较低。
发明内容
本发明的目的是提供一株高生物量的富锌酵母菌株。
本发明提供的富锌酵母菌株高生物量富锌酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae)ZGFH-94，该菌株已于2003年02月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC №0896。
高生物量富锌酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae)ZGFH-94(CGMCC №0896)的个体细胞形为椭圆形，菌落形态特征是菌落凸起、光滑、乳白色、边缘整齐。最适生长温度30℃。生长最适pH为5.5。
本发明的第二个目的是提供一种高生物量的富锌酵母菌株的选育方法。
一种高生物量的富锌酵母菌株的选育方法，包括如下步骤1)根据不同酵母菌种的生理生化特性，在含有梯度锌离子浓度的培养基中分别筛选生物量高的酵母菌种和抗锌能力强及细胞含锌量高的酵母菌种；2)对生物量高的酵母菌种和抗锌能力强及细胞含锌量高的酵母菌种进行生孢培养、单倍体分离、诱变，筛选具有不同交配型及不同遗传标记的单倍体突变菌株；3)将分离到的生物量高的酵母菌单倍体突变菌株与抗锌能力强及细胞锌含量高的酵母菌单倍体突变菌株进行原生质体融合；4)在选择培养基上筛选高生物量和高锌含量的融合二倍体优良菌株，即富锌酵母菌种。
其中，所述梯度锌离子浓度为200微克/ml锌-2000μg/ml。所述生物量高的酵母菌种和抗锌能力强及细胞含锌量高的酵母菌种的原生质体融合比例为1∶1-1∶2。所述选择培养基为含有200μg/mL-2000μg/mL锌离子的YEPD培养基。
本发明的第三个目的是提供一种利用高生物量富锌酵母(Saccharomycescerevisiae)ZGFH-94 CGMCC №0896生产富锌酵母产品的方法。
一种利用高生物量富锌酵母(Saccharomyces cerevisiae)ZGFH-94 CGMCC №0896生产富锌酵母产品的方法，包括斜面菌种培养、液体菌种培养、至少二级液体种子培养、发酵罐发酵培养、得到产品。
所述液体种子培养为三级-六级种子培养；所述发酵罐培养完成后，收集酵母细胞并干燥、粉碎得到产品。所述斜面菌种培养、液体菌种培养、液体种子培养和发酵罐发酵培养的培养基包括8％-20％总糖量的有机物，200-1000微克/毫升的锌酸盐，培养基的pH为3.5-8.5；所述发酵罐培养的接种量为5％-35％。所述锌酸盐为硫酸锌、醋化锌、氯化锌或氧化锌。所述有机物选自麦芽汁、淀粉水解糖、糖蜜或它们的任意组合。
本发明使用的高生物量富锌酵母(Saccharomyces cerevisiae)ZGFH-94 CGMCC №0896，不仅生物量高，而且细胞的有机锌含量较高，每克干细胞含有机锌量高达15毫克。
本发明生产富锌酵母产品的方法以普通的麦芽汁、淀粉水解糖、糖蜜或它们的任意组合为发酵底物，只需调节其总糖含量，添加锌盐(如硫酸锌、醋化锌、氯化锌、氧化锌等)等即可进行生产，方法简单，成本低廉。本发明的生产方法实用性强，操作简便，对发酵设备及生产条件没有特殊要求，利用一般发酵厂的设备和生产条件即可生产，投资少、见效快、效益高，不但适合于大规模的生产还适合于小批量的生产，具有广阔的实际应用前景。
图1为富锌酵母产品的生产工艺流程示意图具体实施方式
实施例1、高生物量富锌酵母(Saccharomyces cerevisiae)ZGFH-94 CGMCC №0896的选育高生物量富锌酵母(Saccharomyces cerevisiae)ZGFH-94 CGMCC №0896的选育分为以下几个步骤1)根据酵母菌对硫酸锌的抗性测定进行初筛，测定了435株不同种属的酵母菌在含有200微克/毫升、400微克/毫升、600微克/毫升、800微克/毫升、1000微克/毫升、1200微克/毫升、1400微克/毫升、1600微克/毫升、1800微克/毫升、2000微克/毫升的梯度锌离子浓度的YEPD固体培养基(酵母粉1％，蛋白胨1％，葡萄糖4％，1％琼脂粉)上的生长情况，从中选出32株在含有1400微克/毫升锌离子的YEPD固体培养基上生长好的菌株。
2)测定初筛得到的32株菌株在含有400微克/毫升锌离子的YEPD液体培养基中培养的细胞生物量和细胞含锌量。通过筛选，获得6株细胞生物量较高的菌株(每升培养液的细胞干重在15克以上，但每克干细胞的含锌量在5毫克以下)和8株细胞含锌量较高的菌株(每克干细胞的含锌量在10毫克以上，但每升培养液的细胞干重在8克以下)。
3)通过生孢实验，从上述菌株中挑选出一株生物量较高、生孢好的二倍体Y-78(啤酒酵母菌)和一株细胞含锌量较高、生孢好的二倍体Y-389(葡萄酒酵母菌)，按常规方法对其进行生孢培养和单倍体分离。分别测定单倍体菌株的细胞生物量和含锌量，从中选出生物量较高的单倍体Y-78-8(a)和细胞含锌量较高的单倍体Y-389-15(a)。
4)用亚硝基胍和硫酸二乙酯分别对单倍体Y-78-8(a)和单倍体Y-389-15(a)进行诱变获得营养缺陷突变株，从突变株中选出带有不同氨基酸缺陷标记的Y-78-8-21(a，his)和Y-389-15-16(a，met)作为融合亲株。
5)按常规方法制备Y-78-8-21(a，his)和Y-389-15-16(a，met)的原生质体，将两菌株的原生质体按1∶1比例混合，用聚乙二醇作融合诱导剂进行融合，在基本培养基(YNB培养基)上筛选融合子。
6)测定融合子在含有400微克/毫升锌离子的YEPD培养基中培养的细胞生物量和细胞锌含量。从中选育出细胞生物量和细胞锌含量明显优于融合亲株的融合菌株，即高生物量富锌酵母(Saccharomyces cerevisiae)ZGFH-94 CGMCC №0896。高生物量富锌酵母(Saccharomyces cerevisiae)ZGFH-94 CGMCC №0896具有双亲株的优良性状。高生物量富锌酵母(Saccharomyces cerevisiae)ZGFH-94 CGMCC №0896的细胞生物量和细胞锌含量明显高于亲株Y-78和Y-389，每升培养液的细胞干重达24克以上；每克干细胞的锌含量在12毫克以上。
7)高生物量富锌酵母(Saccharomyces cerevisiae)ZGFH-94 CGMCC №0896的遗传稳定性分析将高生物量富锌酵母(Saccharomyces cerevisiae)ZGFH-94 CGMCC№0896在YEPD固体培养基传代培养30次，取适量细胞经适当稀释后，涂布YEPD平皿，培养后，随机分别挑取100个单菌落于无菌水中，在室温条件下饥饿4-6小时。取饥饿后的菌液分别接种含有1400微克/毫升锌离子的YEPD培养基、YNB培养基、YNB+HIS培养基和YNB+MET培养基，培养结果证明挑取的100个单菌落在这四种培养基都生长，没有出现分离现象。随机挑10个单落在含有600微克/毫升锌离子的YEPD培养基中培养培养后测定细胞生物量和细胞含锌量，结果表明细胞生物量和细胞含锌量无明显变化。上述结果证明高生物量富锌酵母(Saccharomyces cerevisiae)ZGFH-94 CGMCC №0896是一株遗传稳定的、细胞生物量高、细胞锌含量高的优良富锌酵母菌。
实施例2、高生物量富锌酵母(Saccharomyces cerevisiae)ZGFH-94 CGMCC №0896的优化培养条件1)采用单因子发酵实验和多因子正交实验进行高生物量富锌酵母(Saccharomycescerevisiae)ZGFH-94 CGMCC №0896的培养条件(包括培养基组分、铁酸盐浓度、培养基的pH值、通气量、接种量及发酵时间等)实验，通过的培养条件实验，确定了优化培养条件糖蜜培养基(或麦芽汁培养基或淀粉水解糖培养基)，总糖含量为8％-20％，培养基中锌盐(如硫酸锌、醋化锌、氯化锌、氧化锌等)浓度为200微克-1000微克/毫升，培养基的pH为4.0-7.0，接种量为5％-30％，25℃-35℃搅拌培养16-30小时。
2)在优化的发酵培养条件下发酵培养高生物量和高含锌量的富锌酵母在优化培养条件下，每升培养液的细胞干重达28克以上，每克干细胞的锌含量达15毫克以上。
实施例3、富锌酵母的生产高生物量和高锌含量的富锌酵母产品的生产工艺包括斜面菌种→液体菌种→一级液体种子培养→二级液体种子培养→三级液体种子培养→发酵罐发酵培养→收集酵母细胞及干燥→粉碎→高生物量及高锌含量的富锌酵母。下面对各生产工艺进一步说明如下(1)斜面菌种培养高生物量富锌酵母(Saccharomyces cerevisiae)ZGFH-94 CGMCC №0896接种于含有总糖含量为16％、锌盐(如硫酸锌、醋化锌、氯化锌、氧化锌等)浓度为800微克/毫升的麦芽汁固体斜面上，在25-35℃培养48小时后，放入4℃冰箱保存；(2)液体菌种培养将保存的高生物量富锌酵母(Saccharomyces cerevisiae)ZGFH-94 CGMCC №0896菌种活化后，接一环细胞于装有150毫升总糖含量为10％、锌盐(如硫酸锌、醋化锌、氯化锌、氧化锌等)浓度为400微克/毫升的麦芽汁培养基的三角瓶中，于25-35℃搅拌培养16小时即为液体菌种；(3)一级液体种子培养按5％的接种量将液体菌种接入30个装有150毫升总糖含量为12％、锌盐(如硫酸锌、醋化锌、氯化锌、氧化锌等)浓度为600微克/毫升的麦芽汁培养基的三角瓶中，在25-35℃搅拌培养18小时，即为一级液体种子培养物；(4)二级液体种子培养按15％的接种量将一级种子培养液接入装有45升总糖含量为12％、锌盐(如硫酸锌、醋化锌、氯化锌、氧化锌等)浓度为800微克/毫升的麦芽汁培养基的小卡氏发酵罐，在25-35℃搅拌培养17小时，即为二级液体种子培养物；(5)三级液体种子培养按20％的接种量将二级种子培养液接入装有450升总糖含量为16％、锌盐(如硫酸锌、醋化锌、氯化锌、氧化锌等)浓度为700微克/毫升的麦芽汁培养基的大卡氏发酵罐，在25-35℃搅拌培养19小时，即为三级液体种子培养物；(6)发酵罐发酵培养按30％的接种量将三级种子培养液接入装有2250升总糖含量为14％、锌盐(如硫酸锌、醋化锌、氯化锌、氧化锌等)浓度为500微克/毫升的麦芽汁培养基的发酵罐，在25-35℃搅拌培养18小时；(7)收集酵母细胞及干燥采用板框压榨或离心收集富锌酵母细胞，在45～85℃风干使其含水量小于5％；(8)粉碎用粉碎机将风干的富锌酵母细胞粉碎；(9)包装用不透气的包装袋包装，即为高生物量、高富锌含量的富锌酵母(每克干富锌酵母细胞含有机锌高达15毫克以上)。
实施例4、富锌酵母的生产以淀粉水解糖为培养基，其发酵培养基配方和培养条件是总糖量为8％的淀粉水解糖，0.5％的玉米水解液，0.4％硫酸铵，200微克/毫升的锌盐(如硫酸锌、醋化锌、氯化锌、氧化锌等)，培养基的pH为6，接种量为15％，在25-35℃的条件下，搅拌培养22小时。
其生产工艺包括斜面菌种→液体菌种→一级液体种子培养→二级液体种子培养→三级液体种子培养→四级液体种子培养→发酵罐发酵培养→收集酵母细胞及干燥→粉碎→高生物量高锌含量的富锌酵母。
本实施例的生产工艺增加四级液体种子培养，其条件与三级液体种子培养大体相同，其他工艺条件与实施例3相同。
实施例5、富锌酵母的生产以淀粉水解糖和甜菜糖蜜为培养基，其发酵培养基配方和培养条件是总糖量20％的淀粉水解糖和甜菜糖蜜，其重量份数比为1∶3，0.5％的玉米水解液，0.8％硫酸铵，0.10％磷酸，1000微克/毫升的锌盐(如硫酸锌、醋化锌、氯化锌、氧化锌等)，培养基的pH为7.0，接种量为20％，在25-35℃搅拌培养20小时。
其生产工艺包括液体菌种→一级液体种子培养→二级液体种子培养→三级液体种子培养→四级液体种子培养→五级液体种子培养→发酵罐发酵培养→收集酵母细胞及干燥→粉碎→高生物量高锌含量的富锌酵母。
本实施例的生产工艺增加五级液体种子培养，其条件与三级液体种子培养大体相同，其他工艺条件与实施例4相同。
实施例6、富锌酵母的生产以蔗糖糖蜜和麦芽汁为培养基，其发酵培养基配方和培养条件是总糖量16％的蔗糖糖蜜和麦芽汁，其重量份数比为4∶1，1.0％的玉米水解液，0.6％硫酸铵，0.05％磷酸，400微克/毫升的锌盐(如硫酸锌、醋化锌、氯化锌、氧化锌等)，培养基的pH为7.5，接种量为30％，在25-35℃搅拌培养18小时。
其生产工艺包括液体菌种→一级液体种子培养→二级液体种子培养→三级液体种子培养→四级液体种子培养→五级液体种子培养→发酵罐发酵培养→收集酵母细胞及干燥→粉碎→高生物量高锌含量的富锌酵母。
本实施例的生产工艺增加五级液体种子培养，其条件与三级液体种子培养大体相同，其他工艺条件与实施例4相同。
权利要求
1.高生物量富锌酵母(Saccharomyces cerevisiae)ZGFH-94 CGMCC №0896。
2.一种选育高生物量富锌酵母的方法，包括以下步骤1)在梯度锌离子浓度的培养基中分别筛选生物量高的酵母菌种和抗锌能力强及细胞含锌量高的酵母菌种；2)对生物量高的酵母菌种和抗锌能力强及细胞含锌量高的酵母菌种进行生孢培养、单倍体分离、诱变，筛选具有不同交配型及不同遗传标记的单倍体突变菌株；3)将生物量高的酵母菌单倍体突变菌株与抗锌能力强及细胞锌含量高的酵母菌单倍体突变菌株进行原生质体融合；4)在选择培养基上筛选高生物量和高锌含量的融合二倍体优良菌株，即富锌酵母菌株。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述梯度锌离子浓度为200微克/毫升-2000微克/毫升。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述生物量高的酵母菌种和抗锌能力强及细胞含锌量高的酵母菌种的原生质体融合比例为1∶1-1∶2。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述选择培养基所含锌离子浓度400微克/毫升-2000微克/毫升的YEPD培养基。
6.一种利用高生物量富锌酵母(Saccharomyces cerevisiae)ZGFH-94 CGMCC №0896生产富锌酵母产品的方法，包括斜面菌种培养、液体菌种培养、至少二级液体种子培养、发酵罐发酵培养、得到产品。
7.根据权利要求6述的方法，其特征在于所述液体种子培养为三级-六级种子培养；所述发酵罐培养完成后，收集酵母细胞并干燥、粉碎得到产品。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于所述斜面菌种培养、液体菌种培养、液体种子培养和发酵罐发酵培养的培养基包括8％-20％总糖量的有机物，200-1000微克/毫升的锌酸盐，培养基的pH为3.5-8.5；所述发酵罐培养的接种量为5％-35％。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述锌酸盐为硫酸锌、醋化锌、氯化锌或氧化锌。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述有机物选自麦芽汁、淀粉水解糖、糖蜜或它们的任意组合。
全文摘要
本发明公开了一株富锌酵母及其选育方法与应用，本发明提供的菌株为高生物量富锌酵母(Saccharomycescerevisiae)ZGFH－94 CGMCC №0896。其选育方法包括1)分别筛选生物量高的酵母菌种和抗锌能力强及细胞含锌量高的酵母菌种；2)筛选生物量高的酵母菌种和抗锌能力强及细胞含锌量高的酵母菌种的单倍体突变菌株；3)生物量高的酵母菌单倍体突变菌株与抗锌能力强及细胞含锌量高的酵母菌单倍体突变菌株进行原生质体融合；4)在选择培养基上筛选高生物量和高含锌量的融合二倍体优良菌株，即富锌酵母菌种。本发明利用高生物量富锌酵母(Saccharomyces cerevisiae)ZGFH－94 CGMCC №0896生产富锌酵母产品的方法，具有广阔的实际应用前景。
文档编号C12N15/08GK1530435SQ03119428
公开日2004年9月22日 申请日期2003年3月12日 优先权日2003年3月12日
发明者张博润, 郭雪娜, 傅秀辉, 何秀萍 申请人:中国科学院微生物研究所