专利名称：一株高生物量富铁酵母及其选育方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物发酵工业技术领域中的一株富铁酵母及其选育方法与在生产中的应用，特别是涉及一株高生物量富铁酵母及其选育方法与在生产中的应用。
背景技术：
铁是人和动物维持生命和发育所必需的营养物质，是体内不可缺少的微量元素，参与血液中氧的运输作用。铁的缺乏会引起人及动物缺铁性贫血及其它一些临床症状。日常生活中，通常以无机盐方式补充铁，但这种补铁方式不利于人及动物对铁的吸收利用。
酵母细胞能将无机状态的铁转化成有机状态的铁，可以提高铁的利用率。利用富铁酵母将无机状态的铁转化成有机状态的铁是开发新型铁源，提高铁的利用率的有效措施。富铁酵母在预防和治疗人及动物缺铁性贫血及其它一些缺铁性疾病方面将发挥显著的作用。此外，富铁酵母细胞还含有丰富的蛋白质、核酸、维生素及机体必需的十几种微量元素，是一种丰富的营养物质。
近年来，尽管已有一些称为“富铁酵母”的产品，但这些产品存在明显的缺陷和不足一是没有对酵母菌种进行筛选和育种，经常是用随机得到的酵母菌种发酵生产富铁酵母产品。但是由于不同酵母菌种对铁的抗性差异较大，对铁离子的吸收转化能力差异也较大，因此产品缺乏稳定性，不利于工业化生产。
二是没有对富铁酵母发酵培养基的铁离子浓度、培养条件进行优化，虽然培养的酵母称为“富铁酵母”，但是其酵母细胞的含铁量较低，细胞生物量也较低。
目前，生产称为“富铁酵母”细胞的方法大体有三种第一种是采用混合处理方法，即将一定量的柠檬酸铁、硫酸铁或硫酸亚铁与市场上的面包酵母或啤酒酵母细胞混合而成；第二种是采用简单的吸附方法，将市场上的面包酵母或啤酒酵母细胞悬浮于含有一定浓度的柠檬酸铁、硫酸铁或硫酸亚铁的水溶液中处理一定时间，使铁离子吸附于酵母细胞表面；第三种是在含有一定铁离子的培养基中培养酵母细胞，但是对酵母菌种没有进行任何筛选和育种，酵母菌种是随机获得的。
上述方法中，第一种和第二种的主要缺陷在于酵母细胞未能有效地将无机铁转化为有机铁，导致人或动物对其所含铁的吸收利用率低。第三种方法的主要缺陷在于这种技术对培养基的铁离子浓度、培养条件未进行优化，因此采用这种技术培养的酵母中，有机铁含量较低(每克干酵母细胞有机铁的含量在10毫克以下)、细胞生物量也较低。
发明内容
本发明的目的是提供一株高生物量的富铁酵母菌株。
本发明提供的高生物量富铁酵母(Saccharomyces cerevisiae)ZYGF-15，该菌株已于2003年02月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC № 0895。
高生物量富铁酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株ZYGF-15(CGMCC №0895)的个体细胞形为椭圆形，菌落形态特征是菌落凸起、光滑、乳白色、边缘整齐。最适生长温度30℃。生长最适pH为5.5。
本发明的第二个目的是提供一种高生物量的富铁酵母菌株的选育方法。
一种高生物量的富铁酵母菌株的选育方法，包括如下步骤1)根据不同酵母菌种的生理生化特性，在含有梯度铁离子浓度的培养基中分别筛选生物量高的酵母菌种和抗铁能力强及细胞含铁量高的酵母菌种；2)对生物量高的酵母菌种和抗铁能力强及细胞含铁量高的酵母菌种进行生孢培养、单倍体分离、诱变，筛选具有不同交配型及不同遗传标记的单倍体突变菌株；3)将分离到的生物量高的酵母菌单倍体突变菌株与抗铁能力强及细胞含铁量高的酵母菌单倍体突变菌株进行杂交；4)在选择培养基上筛选高生物量和高含铁量的二倍体杂交优良菌株，即高生物量富铁酵母菌株。
本发明的第三个目的是提供一种利用高生物量富铁酵母(Saccharomycescerevisiae)菌株ZYGF-15(CGMCC №0895)生产高生物量的富铁酵母产品的方法。
一种利用高生物量富铁酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株ZYGF-15(CGMCC №0895)生产富铁酵母产品的方法，包括斜面菌种培养、液体菌种培养、至少二级液体种子培养、发酵罐发酵培养、得到产品。
所述液体种子培养为二级至六级种子培养。所述发酵罐培养完成后，收集酵母细胞并干燥、粉碎得到产品。所述斜面菌种培养、液体菌种培养、液体种子培养和发酵罐发酵培养的培养基包括8％-20％总糖量的有机物，200-800微克/毫升的铁酸盐，pH为4.0-8.0；所述发酵罐培养的接种量为5％-30％。所述铁酸盐为柠檬酸铁、硫酸铁或硫酸亚铁。所述有机物选自麦芽汁、淀粉水解糖、糖蜜或它们的任意组合。本发明的优化的发酵培养条件为接种量5-30％，25-35℃搅拌培养16-30小时。
本发明使用的高生物量富铁酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株ZYGF-15(CGMCC №0895)不仅生物量高，而且细胞的有机铁含量较高，每克干细胞含有机铁量高达25毫克。
本发明利用高生物量富铁酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株ZYGF-15(CGMCC№0895)生产高生物量的富铁酵母产品的方法使用的发酵底物为普通的麦芽汁、淀粉水解糖、糖蜜或它们的任意组合，只需调节其总糖含量，添加铁酸盐(如柠檬酸铁、硫酸铁或硫酸亚铁)等即可进行生产，方法简单，成本低廉。本发明的生产方法实用性强，操作简便，对发酵设备及生产条件没有特殊要求，利用一般发酵厂的设备和生产条件即可生产，投资少、见效快、效益高，不但适合于大规模的生产还适合于小批量的生产，具有广阔的实际应用前景。
图1为高生物量富铁酵母的生产工艺流程示意图具体实施方式
实施例1、高生物量富铁酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株ZYGF-15(CGMCC№0895)的选育高生物量富铁酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株ZYGF-15(CGMCC №0895)的选育分为以下几个步骤1)根据酵母菌对硫酸亚铁的抗性测定进行初筛，测定了402株不同种属的酵母菌分别在含有200微克/毫升、400微克/毫升、600微克/毫升、800微克/毫升、1000微克/毫升、1200微克/毫升、1400微克/毫升、1600微克/毫升、1800微克/毫升、2000微克/毫升的梯度铁离子浓度的YEPD固体培养基(酵母粉1％，蛋白胨1％，葡萄糖4％，1％琼脂粉)上的生长情况，从中选出28株在含有1600微克/毫升铁离子浓度的YEPD固体培养基上生长良好的菌株。
2)测定初筛得到的28株菌株在含有600微克/毫升铁离子浓度的YEPD液体培养基中培养的细胞生物量和细胞含铁量。通过筛选，获得7株细胞生物量较高的菌株(每升培养液的细胞干重在17克以上，但每克干细胞的含铁量在8毫克以下)和5株细胞含铁量较高的菌株(每克干细胞的含铁量在16毫克以上，但每升培养液的细胞干重在10克以下)。
3)通过生孢实验，从上述菌株中挑选出一株生物量较高、生孢好的二倍体ZY-46(啤酒酵母菌)和一株细胞含铁量较高、生孢好的二倍体ZY-173(面包酵母菌)，按常规方法对其进行生孢培养和单倍体分离。分别测定单倍体菌株的细胞生物量和细胞含铁量，从中选出生物量较高的单倍体ZY-46-12(α)和细胞含铁量较高的单倍体ZY-173-29(a)。
4)用亚硝基胍和硫酸二乙酯分别对ZY-46-12(α)和ZY-173-29(a)进行诱变，获得营养缺陷突变株，从突变株中选出带有不同氨基酸缺陷标记的突变株ZY-46-12-30(α，leu)和ZY-173-29-5(a，trp)作为杂交亲株。
5)用群体杂交法将ZY-46-12-30(α，leu)和ZY-173-29-5(a，trp)的细胞进行杂交，在基本培养基(YNB培养基)上筛选杂交子。
6)测定获得的杂交子在含有600微克/毫升铁离子的YEPD培养基中培养的细胞生物量和细胞含铁量。从中选育出细胞生物量和细胞含铁量明显优于杂交亲株的杂交菌株ZYGF-15。杂交菌株ZYGF-15具有杂交亲株的优良性状。杂交菌株ZYGF-15的细胞生物量和细胞铁含量明显高于亲株ZY-46和ZY-173，每升培养液的细胞干重达25克以上，每克干细胞的含铁量在20毫克以上，结果表明杂交菌株ZYGF-15是一株优良的富铁酵母，即高生物量富铁酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株ZYGF-15(CGMCC №0895)。
7)高生物量富铁酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株ZYGF-15(CGMCC №0895)的遗传稳定性分析将高生物量富铁酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株ZYGF-15(CGMCC №0895)在YEPD固体培养基传代培养30次，取适量细胞经适当稀释后，涂布YEPD平皿，培养后，随机分别挑取100个单菌落于无菌水中，在室温条件下饥饿4-6小时。取饥饿后的菌液分别接种于含有600微克/毫升铁离子的YEPD培养基、YNB培养基、YNB+LEU培养基和YNB+TRP培养基，培养结果证明挑取的100个单菌落在这四种培养基都生长，没有出现分离现象。随机挑10个单落在含有600微克/毫升铁离子的的YEPD培养基中培养培养后测定细胞生物量和细胞含铁量，结果表明细胞生物量和细胞含铁量无明显变化。上述结果证明高生物量富铁酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株ZYGF-15(CGMCC №0895)是一株遗传稳定的、细胞生物量高、细胞含铁量高的优良富铁酵母菌。
实施例2、高生物量富铁酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株ZYGF-15(CGMCC№0895)的优化培养条件1)采用单因子发酵实验和多因子正交实验进行高生物量富铁酵母(Saccharomycescerevisiae)菌株ZYGF-15(CGMCC №0895)的培养条件(包括培养基组分、铁酸盐浓度、培养基的pH值、通气量、接种量及发酵时间等)实验，确定了优化培养条件麦芽汁培养基(或糖蜜培养基或淀粉水解糖培养基)，总糖含量为8％-20％，培养基中铁酸盐(如柠檬酸铁、硫酸铁或硫酸亚铁)浓度为200微克-800微克/毫升，培养基的pH为4.5-7.0，接种量为5％-30％，25℃-35℃搅拌培养16-30小时。
2)在优化的发酵培养条件下发酵培养高生物量和高含铁量的富铁酵母在优化的培养条件下，每升培养液的细胞干重达30克以上，每克干细胞的含铁量达25毫克以上。
实施例3、富铁酵母的生产高生物量和高铁含量的富铁酵母产品的生产工艺包括斜面菌种→液体菌种→一级液体种子培养→二级液体种子培养→三级液体种子培养→发酵罐发酵培养→收集酵母细胞及干燥→粉碎→高生物量及高铁含量的富铁酵母。下面对各生产工艺进一步说明如下(1)斜面菌种将高生物量富铁酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株ZYGF-15(CGMCC №0895)接种于含有总糖含量为8％、铁酸盐(如柠檬酸铁、硫酸铁或硫酸亚铁)浓度为400微克/毫升的麦芽汁固体斜面上，在25-35℃的条件下，培养48小时后，放入4℃冰箱保存。
(2)液体菌种将保存的高生物量富铁酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株ZYGF-15(CGMCC №0895)活化后，接一环细胞于装有150毫升总糖含量为10％、铁酸盐(如柠檬酸铁、硫酸铁或硫酸亚铁)浓度为400微克/毫升的麦芽汁培养基的三角瓶中，于25-35℃的条件下，搅拌培养18小时，即为液体菌种。
(3)一级液体种子培养按15％的接种量将液体菌种接入装有150毫升总糖含量为18％、铁酸盐(如柠檬酸铁、硫酸铁或硫酸亚铁)浓度为600微克/毫升的麦芽汁培养基的三角瓶中，在25-35℃的条件下，搅拌培养16小时，即为一级液体种子培养物。
(4)二级液体种子培养按15％的接种量将一级种子培养液接入装有45升总糖含量为20％、铁酸盐(如柠檬酸铁、硫酸铁或硫酸亚铁)浓度为600微克/毫升的麦芽汁培养基的小卡氏发酵罐，在25-35℃的条件下，搅拌培养16小时，即为二级液体种子培养物。
(5)三级液体种子培养按15％的接种量将二级种子培养液接入装有450升总糖含量为20％、铁酸盐(如柠檬酸铁、硫酸铁或硫酸亚铁)浓度为600微克/毫升的麦芽汁培养基的大卡氏发酵罐，在25-35℃的条件下，搅拌培养16小时，即为三级液体种子培养物。
(6)发酵罐发酵培养按40％的接种量将三级种子培养液接入装有2250升总糖含量为20％、铁酸盐(如柠檬酸铁、硫酸铁或硫酸亚铁)浓度为600微克/毫升的麦芽汁培养基的发酵罐，在25-35℃的条件下，搅拌培养14小时。
(7)收集酵母细胞及干燥采用板框压榨或离心收集富铁酵母细胞。在45～85℃条件下风干使其含水量小于5％。
(8)粉碎用粉碎机将风干的富铁酵母细胞粉碎。
(9)包装用不透气的包装袋包装，即为高生物量的高富铁含量的富铁酵母。
实施例4、富铁酵母的生产以淀粉水解糖为培养基，其发酵培养基配方和培养条件是总糖量为8-20％的淀粉水解糖，0.5％的玉米水解液，0.4％硫酸铵，400-600微克/毫升的铁酸盐(如柠檬酸铁、硫酸铁或硫酸亚铁)，培养基的pH为6，接种量为15％，在28-35℃的条件下，搅拌培养20小时。
本实施例的生产工艺增加四级液体种子培养，其条件与三级液体种子培养大体相同，其他工艺条件与实施例3相同。
实施例5、富铁酵母的生产以淀粉水解糖和甜菜糖蜜为培养基，其发酵培养基配方和培养条件是总糖量20％的淀粉水解糖和甜菜糖蜜，其重量份数比为1∶3，0.8％的玉米水解液，0.8％硫酸铵，0.10％磷酸，600微克/毫升的铁酸盐(如柠檬酸铁、硫酸铁或硫酸亚铁)，培养基的pH为5，接种量为30％，在25-35℃搅拌培养16小时。
其生产工艺包括液体菌种→一级液体种子培养→二级液体种子培养→三级液体种子培养→四级液体种子培养→五级液体种子培养→发酵罐发酵培养→收集酵母细胞及干燥→粉碎→高生物量高铁含量的富铁酵母。
本实施例的生产工艺增加五级液体种子培养，其条件与三级液体种子培养大体相同，其他工艺条件与实施例4相同。
权利要求
1.高生物量富铁酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株ZYGF-15(CGMCC №0895)。
2.一种富铁酵母的选育方法，包括以下步骤1)在梯度铁离子浓度的培养基中分别筛选生物量高的酵母菌种和抗铁能力强及细胞含铁量高的酵母菌种；2)对生物量高的酵母菌种和抗铁能力强及细胞含铁量高的酵母菌种进行生孢培养、单倍体分离、诱变，筛选具有不同交配型及不同遗传标记的单倍体突变菌株；3)将生物量高的酵母菌单倍体突变菌株与抗铁能力强及细胞含铁量高的酵母菌单倍体突变菌株进行杂交；4)在选择培养基上筛选高生物量和高含铁量的二倍体杂交优良菌株，即富铁酵母菌种。
3.根据权利要求2所述的选育方法，其特征在于所述铁离子浓度为200μg/ml-2000μg/ml。
4.根据权利要求2所述的选育方法，其特征在于所述选择培养基所含铁离子浓度200微克/毫升-2000微克/毫升的YEPD培养基。
5.一种利用高生物量富铁酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株ZYGF-15(CGMCC№0895)生产富铁酵母产品的方法，包括斜面菌种培养、液体菌种培养、至少二级液体种子培养、发酵罐发酵培养、得到产品。
6.根据权利要求5述的方法，其特征在于所述液体种子培养为三级-六级种子培养；所述发酵罐培养完成后，收集的酵母细胞进行干燥、粉碎后得到产品。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于所述斜面菌种培养、液体菌种培养、液体种子培养和发酵罐发酵培养的培养基包括8％-20％总糖量的有机物，200-800微克/毫升的铁酸盐，pH为4.0-8.0。
8.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于所述发酵罐培养的接种量为5％-30％。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述铁酸盐为柠檬酸铁、硫酸铁或硫酸亚铁。
10.根据权利要求7所述的生产方法，其特征在于所述有机物选自麦芽汁、淀粉水解糖、糖蜜或它们的任意组合。
全文摘要
本发明公开了一株高生物量富铁酵母菌株及其选育方法与应用，本发明提供的菌株为高生物量富铁酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株ZYGF－15(CGMCC №0895)。其选育方法包括以下步骤1)分别筛选生物量高的酵母菌种和抗铁能力强及细胞含铁量高的酵母菌种；2)筛选生物量高的酵母菌种和抗铁能力强及细胞含铁量高的酵母菌种的单倍体突变菌株；3)生物量高的酵母菌单倍体突变菌株与抗铁能力强及细胞含铁量高的酵母菌单倍体突变菌株进行杂交；4)在选择培养基上筛选高生物量和高含铁量的二倍体杂交优良菌株，即高生物量富铁酵母菌种。本发明利用高生物量富铁酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株ZYGF－15(CGMCC №0895)生产的富铁酵母产品具有广阔的市场前景。
文档编号C12N15/04GK1530436SQ03119430
公开日2004年9月22日 申请日期2003年3月12日 优先权日2003年3月12日
发明者张博润, 郭雪娜, 傅秀辉, 何秀萍 申请人:中国科学院微生物研究所