专利名称：无机磷酸、焦磷酸及核酸的检测方法及对dna的snp序列进行标识的方法
技术领域：
本发明涉及检测无机磷酸或焦磷酸的方法，而且涉及利用上述检测以简便且高灵敏度检测试样中的目的核酸的方法，特别涉及判别SNP的方法。
背景技术：
近年来，开发研究有关基因信息的技术正处于鼎盛时期。在医疗领域，通过解析与疾病关联的基因，可在疾病的分子水平进行治疗。利用基因诊断，也可进行与每个患者相对应的特定医疗。在制药领域，使用基因信息，对抗体、激素等的蛋白分子进行特定，作为药品来使用。在农业和食品领域，也已制作出了利用多种基因信息的制品。
这些基因信息中，基因多态特别重要，就像我们的脸面和体型等，各式各样，人与人之间的基因信息相当一部分是不同的。在这些基因信息的差异中，碱基序列的变化，以人口的1％以上的频率存在，将这称之为基因多态，这些基因多态，可以说不仅关联着每个人的脸面，而且也关联着各种基因病患的原因、体质、药剂响应性、药剂的副作用，等等，当前正在加速研究这种基因多态与病患等的关联性。
在这种基因多态中，近年来特别关注的是SNP(Single nucleotidepolymorphism)。SNP是指在基因信息的碱基序列中，仅一个碱基不同的基因多态。SNP是说在人类基因组DNA内有二～三百万，很容易用作基因多态的标记，正期待着应用于临床。当前，作为SNP关联技术，正在进行SNP在基因组中的位置确定及SNPs与病患的关联性等的研究，同时也开发判别SNP部位碱基的SNPs标识技术。
一般地讲，作为判别DNA中碱基序列不同的方法，有桑格(染色脱氧)法、DNA切片法等。桑格法，是使用PCR(聚合酶连锁反应)法对想要解析的人类基因的区域进行增殖后，读取所要的部位的碱基序列，进行测序，直接决定碱基序列，进行SNP标识。DNA切片法，是将cDNA的PCR产物或15～20个碱基左右的低聚核苷酸探针固定在基板上，对在其上进行荧光标识的试样DNA进行杂交的方法。通过严格控制温度等杂交条件，利用探针与试样DNA的亲和性差异即荧光强度的差异，检测SNP。
而且，为了能进行大量的SNP标识，有特表平10-510982号公开的方法(TaqManPCR法)、特表2001-518805号公开的方法(Invader法)等等。特表平10-510982号所示方法的简要图示于图1中，在特表平10-510982号中提供了一种含有荧光分子和可对该荧光分子的荧光进行消光的消光分子的低聚核苷酸探针。使用了在靶多核苷酸的“下游区域”(即，引物结合部位的延长方向)上含有特异退火的报告分子—消光分子对的低聚核苷酸探针。配置这种报告分子和消光分子时，相互充分接近，由此激励报告分子时，这种激励状态能量常常以非放射性传递给消光分子，该能量以非放射性消失，或者以与报告分子发光频率不同的频率释放出，利用DNA聚合酶延长链时，探针进行铸型和退火，该探针利用聚合酶的5’→3’外切核酸酶活性进行消化。探针消化的结果是该报告分子有效地与消光分子分离，由此，消光分子已经越能对报告分子的荧光进行消光，就越不能充分地接近报告分子。因此，在增殖时，探针若越被消化，则溶液中的报告分子数越增加，其结果是，非消光报告分子数增加，荧光信号会越发增强。
在特表2001-518805号中公开了一种检测靶核酸分子存在的方法。该方法的简要图示于图2。该方法是准备构造特异的核酸酶、第一靶核酸源(其中，第一靶核酸具有第一区域、第二区域和第三区域，第一区域与第二区域邻接，位于其下游，第二区域与第三区域邻接，位于其下游)、具有5’部分和3’部分的第一低聚核苷酸(其中，第一低聚核苷酸的5’部分含有与第一靶核酸的第二区域互补的序列、第一低聚核苷酸的3’部分含有与第一靶核酸的第三区域互补的序列)、具有5’部分和3’部分的第二低聚核苷酸(其中，第二低聚核苷酸的5’部分含有与第一靶核酸的第一区域互补的序列，第二低聚核苷酸的3’部分含有与第一靶核酸的第二区域互补的序列)、第二靶核酸源(其中，第二靶核酸具有第一区域、第二区域和第三区域，第一区域与第二区域邻接，位于其下游，第二区域与第三区域邻接，位于其下游)、具有5’部分和3’部分的第三低聚核苷酸(其中，第三低聚核苷酸的5’部分含有与第二靶核酸的第二区域互补的序列，第三低聚核苷酸的3’部分含有与第二靶核酸的第三区域互补的序列)，形成第一低聚核苷酸的至少3’部分退火成第一靶核酸、并且第二低聚核苷酸的至少5’部分退火成第一靶核酸的第一开裂构造体，利用构造特异的核酸酶引起第一开裂构造体的开裂，使第一低聚核苷酸开裂，生成第四低聚核苷酸，该第四低聚核苷酸具有5’部分和3’部分，第四低聚核苷酸的5’部分含有与第二靶核酸的第一区域互补的序列，第四低聚核苷酸的3’部分含有与第二靶核酸的第二区域互补的序列，形成第三低聚核苷酸的至少3’部分退火成第二靶核酸、并且第四低聚核苷酸的至少5’部分退火成第二靶核酸的第二开裂构造体，引起第二开裂构造体的开裂，生成第五低聚核苷酸，该第五低聚核苷酸具有3’-羟基，然后检测上述第五低聚核苷酸。
然而，由于这些方法都在探针上使用荧光标识，所以试剂等价格很高，而且为了荧光检测需要照射激光等的光源，所以测定装置大型化，考虑到在医疗单位中临床使用时，还存在许许多多的问题。
另一方面，作为新的DNA碱基序列的确定方法，在特表2001-506864号公开了一种检测方式，即，伴随着DNA的延长反应，将生成的焦磷酸转变成ATP(三磷酸腺苷)，以ATP为基质，利用虫荧光素酶的作用，检测虫荧光素的发光。该方法的简要图示于图3。提供一种如下这样的方法，即，邻近靶位置，准备在试样DNA上杂交延长的引物，在脱氧核苷酸或二脱氧核苷酸的存在下，将试样DNA和延长引物供给聚合酶反应，由此，脱氧核苷酸或二脱氧核苷酸，仅在它与靶位置的碱基互补时，才能进入，释放出焦磷酸(PPi)，以酶检测PPi释放，将不同的脱氧核苷酸或二脱氧核苷酸，连续添加到试样—引物混合物的另一个等分试样中或者相同的试样—引物混合物的等分试样中，供给聚合酶反应，表示脱氧核苷酸或二脱氧核苷酸任何一个是否进入，其特征在于PPi检测酶包含在聚合酶反应过程中，以及使用作为聚合酶的基质可以起作用但作为上述PPi检测酶的基质不可起作用的dATP或ddATP类似物取代脱氧腺苷三磷酸(dATP)或双脱氧腺苷三磷酸(ddATP)。特表2001-506864号中公开了一种有利的、可大规模确定非电泳动固相DNA序列、由此可连续确定聚合反应随着时间进行的方法。
然而，这些方法中，检测虫荧光素酶的发光等等，需要相当大的装置，作为在医院病床方面、供给药物时的简易型系统装置来说，是不适宜的。
在特开昭63-49100号中公开了一种无机磷酸的测定方法。在该方法中，利用了有关无机磷酸的三个阶段反应，最终，氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)被还原，形成NADH，或者氧化型磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADP+)被还原，形成NADPH，利用紫外线吸收法等测定所生成的NAD(P)H的量。由于在该方法中使用了三阶段的反应，所以反应的基本过程很多，设定全部基本过程的反应条件很复杂，不一定就能在效率好的条件下进行。而且，需要使用高分光度计等比较大的测定装置，存在缺少简便性这样的问题。
另外，与上述特开昭63-49100号中记载的方法一样，在国际公开小册子WO00/04378号中记载了一种伴随着目的试样的反应、利用辅酶NAD(P)+被还原、检测目的试样的方法。然而，由于此处的检测目的试样是L-苯基丙氨酸，所以不能将此方法用于检测靶核酸分子的存在。
发明内容
本发明的目的就是为解决上述现有的问题而提供一种快速、简便的方法，并且能高灵敏度地检测无机磷酸、焦磷酸及核酸的检测方法。并且提供一种能高灵敏度且廉价地实现大量SNP标识的SNP标识方法。
本发明提供一种检测无机磷酸的方法。本方法包括以下步骤，即，将试样供给至含有甘油醛-3-磷酸、氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或氧化型磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、甘油醛磷酸脱氢酶、及电子传递介质的测定系统内的步骤；和，在上述测定系统内测定电流值的步骤。此处的电流值表示上述试样中的无机磷酸的浓度。
在一种实施方式中，上述电子传递介质是选自铁氰化物、1，2-萘醌-4-磺酸、2，6-二氯酚靛酚、二甲基苯醌、1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸酯、亚甲蓝、棓菁、硫堇、吩嗪硫酸甲酯和麦尔多拉蓝中的至少一种。
在一种实施方式中，上述测定系统还含有心肌黄酶。
在一种实施方式中，上述测定系统还含有二磷酸腺苷和磷酸甘油酸激酶。
而且，本发明提供一种检测焦磷酸的方法。本方法包括以下步骤，即，将试样中的焦磷酸转换成无机磷酸的步骤；将上述试样供给至含有甘油醛-3-磷酸、氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或氧化型磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、甘油醛磷酸脱氢酶和电子传递介质的测定系统内的步骤；和，在上述测定系统内测定电流值的步骤。此处的电流值表示上述试样中的焦磷酸浓度。
在一种实施方式中，使用焦磷酸酶将上述焦磷酸转换成无机磷酸。
而且，本发明提供一种检测核酸的方法。本方法包括以下步骤，即将试样供给至含有在上述核酸序列中具有互补序列的DNA探针、DNA聚合酶、脱氧核苷酸的反应系统内，延长上述DNA探针，此时伴随着上述DNA探针延长反应而生成焦磷酸的步骤；将试样中生成的焦磷酸转换成无机磷酸的步骤；将上述试样供给至含有甘油醛-3-磷酸、氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或氧化型磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、甘油醛磷酸脱氢酶和电子传递介质的测定系统内的步骤；和，在上述测定系统内测定电流值的步骤。此处的电流值表示上述试样中具有特定序列的核酸的浓度。
在一种实施方式中，上述DNA探针的延长反应是PCR反应。
而且，本发明提供一种对DNA的SNP序列进行标识的方法。本方法包括以下步骤，即，将试样供给至含有在上述DNA序列中具有互补序列且具有SNP部位的DNA探针、DNA聚合酶、脱氧核苷酸的反应系统内，延长上述DNA探针，此时伴随着上述DNA探针的延长反应而生成焦磷酸的步骤；将试样中生成的焦磷酸转换成无机磷酸的步骤；将上述试样供给至含有甘油醛-3-磷酸、氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或氧化型磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、甘油醛磷酸脱氢酶和电子传递介质的测定系统内的步骤；和，在上述测定系统内测定电流值的步骤。此处的电流值表示上述试样中具有特定序列的DNA的存在。
在一种实施方式中，上述DNA探针的延长反应是PCR反应。
图1是表示利用TaqManPCR法进行SNP标识的方法的简要示意图。
图2是表示利用Invader法进行SNP标识的方法的简要示意图。
图3是表示利用派罗斯编序法进行SNP标识的方法的简要示意图。
图4是表示利用SNP部位一致的探针生成焦磷酸的模式图。
图5是表示利用SNP部位不一致的探针的情形的模式图。
图6是表示实施例1中的磷酸的检测反应时间的图。
图7是表示实施例1中的磷酸浓度与电流值的关系的图。
图8是表示实施例3中的焦磷酸浓度与电流值的关系的图。
图9是表示用于测定电流值的测定装置系统示例的模式图。
图10是表示实施例6中的焦磷酸的检测反应时间的图。
图11是表示实施例6中的焦磷酸浓度与电流值的关系的图。
具体实施例方式
以下，对本发明实施方式进行说明。
(实施方式1)在本发明的实施方式1中，使用酶反应进行简便的无机磷酸的定量检测。本发明的实施方式1涉及检测无机磷酸的方法，该方法包括将试样供给至含有甘油醛-3-磷酸、氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)或氧化型磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADP+)、甘油醛磷酸脱氢酶和电子传递介质的测定系统内的步骤；和，在该系统内测定电流值的步骤。在本说明书中，“测定系统”是指参与涉及无机磷酸检测的机构的一连串的反应整体和实施这样一连串反应的场所。在“测定系统”内存在为了实施一连串反应所需的成分。“测定系统”，通常是在将上述成分溶解在适当的溶剂(例如，如Tris-HCl缓冲液这样的缓冲液)中而成的溶液的形态下获得的。所谓甘油醛磷酸脱氢酶，是将NAD+或NADP+作为辅酶、对甘油醛-3-磷酸以氧化形式进行磷酸化的酶，在本说明书中也表示甘油醛-3-磷酸脱氧酶。
使用反应式(I)～反应式(IV)对本发明的实施方式1进行说明。
首先，如反应式(I)所示，无机磷酸与甘油醛-3-磷酸一起，受到甘油醛-3-磷酸脱氧酶和NAD(P)+的催化作用，转换成1，3-二磷酸甘油酸。这时，NAD(P)+还原成NAD(P)H。
反应式(I)。
接着，如反应式(II)所示，由于来自在反应式(I)的反应中生成的NAD(P)H的电子移动，电子传递介质的氧化体(反应式(II)中的Med(Ox))被还原，形成还原体(反应式(II)中的Med(Re))。这时，NAD(P)H氧化成NAD(P)+。
反应式(II)
在使用适当的电子传递介质时，该反应会自发进行。所谓适当的电子传递介质，是其氧化体与NAD(P)H一起引起氧化还原反应，而且由此生成的还原体在施加一定以上电位的作用极中，进行电化学氧化的电子传递介质。作为本实施方式中使用的电子传递介质，可以列举出铁氰化钾、硫堇、1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸酯、2，6-二甲基-P-苯醌、1，2-萘醌-4-磺酸钾、麦尔多拉蓝、棓菁、亚甲蓝、磺化靛蓝、蒽醌-1，5-二磺酸、碱性藏红等。然而，只要是其氧化体与NAD(P)H一起引起氧化还原反应，而且由此生成的还原体在施加一定以上电位的作用极中进行电化学氧化的电子传递介质就可以，并不限于上述的。为了促进反应的进行，还可使用对反应式(II)所示的反应进行催化的酶。作为这样的酶来说，可以列举出心肌黄酶。
最后，如反应式(III)所示，反应式(II)反应的结果生成的电子传递介质的还原体，在施加一定以上电位的作用极中进行电化学氧化。
反应式(III)
通过这种氧化，释放出电子。这样的电子的释放，可以以电流值来表示，这样的电流可使用一般的电化学检测器进行测定。
更具体地讲，可使用图9所示测定装置系统进行电化学氧化的测定。该测定装置系统构成如下。在图中，6是玻璃容器，内部装有搅拌子7，并固定在搅拌机13上。在玻璃容器6中，利用电极固定器具8安装有测定电极9、对电极10、和参照电极11。测定电极9由金电极构成，对电极10由铂线构成。参照电极11由银/氯化银电极构成，使表面涂有氯化银的银线和饱和KCI溶液通过多孔性玻璃与玻璃容器连接。这些电极分别与恒电位装置、函数发生器等一体化的电化学测定系统14连接，利用个人计算机15进行控制和记录数据。
在上述玻璃容器6中装满反应溶液12，利用搅拌子7搅拌该反应溶液12。利用电化学测定系统14，相对于参照电极11，向测定电极9施加一定以上的电位时，反应溶液中的传递质进行氧化，该氧化产生的电子释放，在测定电极9和对电极10之间形成电流。上述电位随传递质种类不同而不同。可向测定电极9施加比该种传递质的氧化还原电位高的电位。例如，使用铁氰化钾作为传递质时，相对于参照电极11，向测定电极9施加+500mV左右的电位。此时的电流值，可使用电化学测定系统14来测定。
由于电流值依赖于最初的无机磷酸的存在，所以以该氧化电流值为基础，即可检测无机磷酸。
在反应式(II)中，通过电子传递介质被还原，消耗NAD(P)H，生成NAD(P)+。因此，促使反应式(I)的反应向生成1，3-二磷酸甘油酸和NAD(P)H的方向进行。即，在本实施方式中，通过电子传递介质被氧化，不仅有助于测定与无机磷酸浓度相对应的电流值，而且也有助于以高灵敏度检测无机磷酸的浓度。
如上所述，在本实施方式中，无机磷酸涉及至的反应的基本过程，仅是反应式(I)中所示的一个过程，因此，很容易地控制该基本过程有效进行。
以上所示的使用反应式(I)～反应式(III)的一连串反应的检测方法，可利用电化学方法定性检测无机磷酸。其结果，由于所得的电流值依赖于最初的无机磷酸的量，所以该检测是定量的。
在本实施方式中，如反应式(I)所示，无机磷酸和甘油醛-3-磷酸和NAD(P)+首先进行反应，其结果，生成1，3-二磷酸甘油酸和NAD(P)H，该反应是吸收能量反应。另一方面，如反应式(IV)所示，利用磷酸甘油酸激酶的催化作用，使1，3-二磷酸甘油酸与二磷酸腺苷(ADP)一起进行反应，存在生成3-磷酸甘油酸和三磷酸腺苷(ATP)的反应。为了使该反应进行，还可添加Mg2+。Mg2+在反应系统内只要以能参与反应的状态存在，就可以任何形态添加。优选使用氯化镁。在添加各反应基质是1mM时，添加的浓度为10mM。该反应是释放能量反应。因此，在本实施方式中，通过结合该反应式(IV)的反应，可以使反应式(I)的反应平衡倾向于向生成1，3-二磷酸甘油酸和NAD(P)H的方向进行。
反应式(IV)
如上所述，在本实施方式中，为了检测被检试样中的无机磷酸，测定系统内需要含有甘油醛-3-磷酸、氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或氧化型磷酸烟酸胺腺苷酸二核苷酸、甘油醛-3-磷酸脱氧酶和电子传递介质。该测定系统内还可含有心肌黄酶，由此促进反应式(II)的反应。该测定系统，根据需要，还可含有二磷酸腺苷和磷酸甘油酸激酶。二磷酸腺苷和磷酸甘油酸激酶，在本测定系统内，起到如反应式(IV)所示那样的作用，可促进无机磷酸的检测。
测定系统是以适当的浓度分别含有上述成分的反应溶液。从反应式(I)～反应式(IV)可知，在含有甘油醛-3-磷酸、氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或氧化型磷酸烟酸胺腺二核苷酸和电子传递介质、及二磷酸腺苷的情况下，二磷酸腺苷可含在该反应溶液中，使得它们的最终浓度实际上成为相同浓度，像甘油醛-3-磷酸脱氧酶、心肌黄酶和磷酸甘油酸激酶一类的酶，为了进行反应，可以以适当的浓度含有。这样的浓度，例如，在以约1mM的终浓度添加各反应物质的情况下，为0.5～1000单位/ml，优选为1～100单位/ml，最优选为5～50单位/ml。为了定量地检测无机磷酸，可将试样添加到上述反应溶液中，产生如反应式(I)～反应式(III)(以及反应式(IV))所示那样的反应，然后可以测定由该反应生成的电流值。
(实施方式2)在本发明的实施方式2中，使用酶反应简便地定量检测焦磷酸。
使用反应式(V)对本发明的实施方式2进行说明。
首先，如反应式(V)所示，将焦磷酸(反应式(V)中的PPi)水解，变成无机磷酸(反应式(V)中的Pi)。
反应式(V)
该水解反应，可以在高温下进行，也可以使用作为对该反应起催化作用的酶的焦磷酸酶来进行。
接着，通过与实施方式1同样地检测由反应式(V)的反应生成的无机磷酸，可以定量地检测焦磷酸。
在本实施方式中，反应式(V)的反应，不需要分别地进行实施方式1所示那样的无机磷酸检测中的反应，因此，为了检测被检试样中的焦磷酸，在上述实施方式中说明的用于检测无机磷酸的测定系统中，还可含有焦磷酸酶。例如，为了检测被检试样中的焦磷酸，所使用的反应溶液除了含有用于检测无机磷酸的测定系统中所含的上述各成分之外，还含有适当浓度的焦磷酸酶。为了进行反应，还可以以适当浓度含有这种焦磷酸酶。该焦磷酸酶的浓度，例如，在以约1mM的终浓度添加各反应物质的情况下，为0.001～1000单位/ml，优选为0.01～100单位/ml，最优选为0.1～1单位/ml。为了定量地检测焦磷酸，将试样添加到上述反应溶液中，产生如反应式(V)和反应式(I)～反应式(III)(以及反应式(IV))所示那样的反应，然后可测定由该反应生成的电流值。
(实施方式3)在本发明的实施方式3中，实施以高灵敏度检测具有特定序列的DNA的方法。
在本实施方式中，首先，将试样供给至含有具有与作为目的的DNA序列互补的序列的DNA探针、DNA聚合酶、脱氧核苷酸的反应系统内。此处所说的“反应系统”是指以下说明那样的一连串的核酸延长反应和实施这种反应的场所。在“反应系统”中，存在实施一连串的反应所必需的成分。“反应系统”通常可将上述成分溶解在适当的溶剂(例如，Tris-HCl缓冲液，在核酸延长反应或核酸增殖反应中通常使用的任何缓冲液(包括市场上可买到的成套工具中的缓冲液))中，以溶液形态提供。DNA聚合酶可以是市场上购到的、或者由本领域技术人员调制的、任意的DNA聚合酶。优选使用Taq聚合酶，但不限于此。脱氧核苷酸可以是各种脱氧核苷三磷酸(也称作dNTP，包括脱氧胞嘧啶三磷酸、脱氧鸟嘌呤三磷酸、脱氧腺嘌呤三磷酸和脱氧胸腺嘧啶三磷酸)，通常是可用作直接合成DNA的前躯物质。由此，可使DNA探针延长，此时伴随着该DNA探针的延长反应生成焦磷酸，对于该反应，可使用反应式(VI)进行说明。
当该DNA探针与目的的DNA杂交时，利用反应系统中存在的DNA聚合酶，使反应系统中的一个脱氧核苷酸(反应式(VI)中的dNTP)进入并延长，生成一个焦磷酸。
反应式(VI)
在反应式(VI)中，下标n和n+1表示DNA探针的碱基数。因此，反应式(VI)表示该反应使n基数的DNA探针延长到n+1基数。将这样生成的焦磷酸与实施方式2同样分解为无机磷酸，接着与实施方式1同样地检测无机磷酸，由此可检测试样中的具有特定序列的DNA。
对本实施方式中使用DNA探针进行设计，使得相对于以检测为目的的DNA序列，具有互补的序列。这种DNA探针与以检测为目的的DNA序列杂交时，起到了用于延长该DNA探针的引物作用。因此，DNA探针的长度，是起到用于延长反应的引物作用所应具有的充分的长度。例如，是至少10个碱基、至少12个碱基、至少15个碱基、至少20个碱基、至少30个碱基、至少40个碱基、至少50个碱基的长度。可使杂交和引物延长充分进行，而且考虑到易于进行该调制时，优选为15～50个碱基的长度。本发明方法中使用的DNA探针，只要对以检测为目的的DNA进行特异杂交且起到用于延长该DNA探针的引物作用，可以是任意长度。
DNA探针，由于与试样中的目的的DNA进行特异杂交，而且起到引物作用，所以在要检测的序列是已知时，对该序列完全是互补的，即，可设计成相对于序列中的碱基具有准确对应的序列(A-T或C-G碱基对)。试样中不存在具有目的的特定序列的DNA时，当然也就不可能引起与DNA探针的杂交。因此，通过使用本反应系统，不管要检测的序列是已知还是未知，都可检测与该DNA探针存在完全互补的序列的存在。
杂交和延长反应，优选在与以下实施例4本质上相同的条件下进行，但也可以在进行DNA的杂交和利用DNA聚合酶作用形成的引物及利用脱氧核苷酸进行的DNA延长反应的任意条件下来实施。DNA探针与目的DNA的杂交，例如可利用Sambrook等人(1989)MolecularCloningA Laboratory Manual、第2版、第1～3卷，Cold Spring HarborLaboratory等实验报告中记载的方法进行，该方法对于本领域技术人员是公知的。有代表性的是，杂交条件可以设定为，通常将A和T碱基对取为2℃，将G和C碱基对取为4℃，而且将在其合计上加2℃的值取作为Tm值，从该温度约下降5℃的温度条件。在本发明的实施方式中，希望具有高的特异性，所以杂交可在50～60℃进行约1秒钟。利用聚合酶进行的延长反应，可考虑该酶最适宜的反应条件，来设定条件。在使用Tag聚合酶时，可在70～74℃下进行实施，反应时间为10秒～3分钟左右。
可在反应系统中含有的DNA探针、聚合酶、脱氧核苷酸的量，可由本领域技术人员适当确定。
如反应式(VI)所示，由于脱氧核苷酸对于一个延长度，可生成一个焦磷酸，所以具有目的的特定序列的DNA和DNA探针两者的长度(基数)若是已知的，则可定量地检测具有目的的特定序列的DNA。
进而，通过将反应式(VI)的反应置换成PCR等的核酸增殖反应，可极大地增加试样中的具有目的的特定序列的DNA量。作为PCR增殖的方法来说，是在该技术领域内众所周知的PCR增殖的方法(PCRTechnologyPrinciples and Applications for DNA Amplification、HA Erich编、Freeman Press、NewYork、NY(1992)；PCR ProtocolsA Guide toMethods and Applications、Innis、Gelfland、Snisky、和White编、AcademicPress、San Diego、CA(1990)；Mattila等人(1991)Nucleic Acids Res.194967；Eckert、K.A.和Kunkel、T.A.(1991)PCR Methods andApplications 117；PCR McPherson、Quirkes、和Taylor、IRL Press、Oxford)。通过使用PCR等的核酸增殖反应，也可检测极微量的DNA。
在本实施方式中，虽然示出了高灵敏度地检测具有特定序列的DNA的方法，但是对于具有特定序列的RNA，利用同样的方法也可进行检测。
(实施方式4)在本发明实施方式4中，实施对测定系统的DNA的SNP进行快速标识的方法。
利用图4和图5对本发明的实施方式4进行说明。图4示出了在以检测为目的的DNA和DNA探针中SNP部位一致时的反应系统。图5示出了在以检测为目的的DNA和DNA探针中SNP不一致时的反应系统。在图4和图5中，1表示DNA探针，2表示具有目的的特定序列的DNA，3a表示一致的SNP部位，3b表示不一致的SNP部位，4表示DNA聚合酶，5表示dNTP。
在本实施方式中，首先，将试样供给至具有与作为目的的DNA序列互补的序列且含有3’末端是SNP部位的DNA探针、DNA聚合酶、脱氧核苷酸的反应系统中。由此，将DNA探针进行延长，此时伴随着该DNA探针的延长反应生成焦磷酸。
本实施方式中使用的DNA探针，可设计成与目的的序列互补且3’末端是SNP部位。在本实施方式中，所设计的DNA探针，除了3’末端是SNP部位之外，其他与上述实施方式3一样。本实施方式中使用的DNA聚合酶和脱氧核苷酸可与上述实施方式3一样。本实施方式中的杂交和延长的条件，也可与上述实施方式3一样。
试样中的目的的DNA和DNA探针的碱基序列，也含有SNP部位，完全互补时，该DNA探针与目的的DNA进行杂交，而且起到用于使该探针进一步延长的引物作用。此时，如图4所示，由反应系统中存在的DNA聚合酶，在DNA探针上延长一个脱氧核苷酸，生成一个焦磷酸。另一方面，试样中的目的的DNA和DNA探针的碱基序列，在SNP部位不是互补时(例如即使在其他部分是互补)，DNA探针可与目的的DNA进行杂交，但由于DNA探针的3’末端形成失配，所以起不到用于延长该探针的引物作用。此时，如图5所示，即使在反应系统中存在DNA聚合酶和必要的脱氧核苷酸，也不能引起反应式(VI)的反应，更不能生成焦磷酸。
因此，将核酸的延长反应后的试样中的焦磷酸，与实施方式2一样，分解成无机磷酸，接着与实施方式1一样地检测无机磷酸，由此可判别试样中的具有目的的特定序列的DNA和DNA探针，也含有SNP部位，并完全一致。若使用SNP部位的碱基的种类不同的最多四种的探针，则对于四种碱基也能标识试样中的具有特定列配DNA的SNP。
SNP部位的碱基的种类是已知时，不用说该标识中不一定就需要四种探针。
在本实施方式中，虽然使用3’末端是SNP部位的DNA探针，但是，即使使用在不是3’末端的碱基上具有SNP部位的DNA探针，也能对DNA的SNP进行标识。
所谓本发明中使用的“试样”是指最终可含有无机磷酸的任何试样。在实施方式2中，是可含有变成无机磷酸的焦磷酸的试样，在实施方式3和4中，是可含有利用延长反应能生成变成无机磷酸的焦磷酸的DNA的试样。尤其是关于DNA检测的方法(实施方式3或4)中，“试样”可来自含有作为目的的DNA的任意被分析物。这样的被分析物，在作为目的的DNA与病患有关时，可以是因病患而染病的细胞、组织、器官或血液。当然，本发明的方法并不限于临床用途，在所有领域中都可使用，因此，这样的被分析物可以是发现作为目的的DNA或是确认其存在的细胞、组织、器官、或血液。使用酚提取法或醇沉淀一类的常用方法，可以从这样的被分析物中提取DNA。DNA的纯度对于反应效率会产生影响，DNA的精制程序对于本领域技术人员来说是公知的。
如以上所说明的那样，根据本发明，在测定系统中含有甘油醛-3-磷酸、氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或氧化型磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、甘油醛-3-磷酸脱氧酶和电子传递介质，根据需要还可含有心肌黄酶，由此，可使用电化学方法，高灵敏度且定量地检测试样中的无机磷酸。而且，通过在上述测定系统中含有二磷酸腺苷和磷酸甘油酸激酶，能更快速地进行测定。
另外，通过使用焦磷酸酶将焦磷酸分解成无机磷酸，使用上述方法也能以高灵敏度、快速且定量地测定焦磷酸。
另外，根据本发明，通过伴随着核酸的延长反应测定所生成的焦磷酸，可定量地测定目的的核酸的有无。进而能以高灵敏度且快速地测定目的的核酸的SNP部位中的碱基。
这样，根据本发明，能够简便且快速地标识目的的核酸的SNP，而不会标识试样中的目的核酸。
以下，对本发明的无机磷酸的检测、焦磷酸的检测、DNA的检测、及SNP的标识作更具体的说明。本发明并不受以下的实施例所限定。实施例中使用的材料、试剂等，只要是没有其他限定，则可从商业供应渠道获得。
(实施例1)按以下程序制作反应溶液，将282mM甘油醛-3-磷酸1.8μl(终浓度1mM)、50mM氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸10μl(终浓度1mM)、1单位/μl甘油醛-3-磷酸脱氧酶10μl(终浓度20单位/ml)、1单位/μl心肌黄酶10μl(终浓度20单位/ml)和50mM铁氧化钾10μl(终浓度1mM)，溶解在100mM Tris-HCl缓冲液中，调整到PH7.5，使总量为500μl。向该反应溶液中加入50mM磷酸1μl(终浓度0.1mM)。将该反应溶液供给至如图9所示构成的测定装置系统中。该测定装置系统构成如下。将内部装有搅拌子7的玻璃容器6固定在搅拌机13上。玻璃容器6中，由电极固定器具8固定住测定电极9、对电极10、和参照电极11。测定电极9用金电极构成，并且对电极10用铂线构成。参照电极11用银/氯化银电极构成，将表面涂有氯化银的银线和饱和KCl溶液，通过多孔性玻璃与玻璃容器连接。将这些电极分别与电化学测定系统(北斗电工制；在附图中用14表示)连接，用个人计算机15进行控制和数据记录。上述玻璃容器6中装入上述反应溶液。利用搅拌子7搅拌该反应溶液。使用电化学测定系统，向测定电极9施加相对于参照电极11为+500mV的电位，由此，反应溶液中的传递质氧化，由于该氧化释放出电子，在测定电极9和对电极10之间形成电流。利用电化学测定系统测定该电流值。该电流值的变化示于图6。在图6中，纵轴表示电流I(μA)，横轴表示时间t(秒)。由图6可知，该反应约在100秒时达到正常值。接着在图7中示出了改变磷酸量时100秒后的电流值。在图7中，纵轴表示电流值的绝对值(μA)，横轴表示磷酸浓度(μM)，以黑点表示各磷酸浓度下的电流值。如图7所示，100秒后的电流值，相对于加入的磷酸量，呈现出良好的直线关系。
(实施例2)按以下程序制作反应溶液。将282mM甘油醛-3-磷酸1.8μl(终浓度1mM)、50mM氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸10μl(终浓度1mM)、1单位/μl甘油醛-3-磷酸脱氧酶10μl(终浓度20单位/ml)、50mM二磷酸腺苷10μl(终浓度1mM)和1单位/μl磷酸甘油酸激酶10μl(终浓度20单位/ml)、1单位/μl心肌黄酶10μl(终浓度20单位/ml)、50mM铁氰化钾10μl(终浓度1mM)和50mM氯化镁10μl(终浓度10mM)，溶解在Tris-HCl缓冲液中，调整PH7.5，使总量为500μl。向如此制作的反应溶液中加入50mM磷酸1μl(终浓度0.1mM)，与实施例1同样地测定电流值。在本实施例中，约在60秒时达到正常值。这样可以确认，由于加入二磷酸腺苷和磷酸甘油酸激酶，促进了反应。
(实施例3)按以下程序制作反应溶液。将1单位/μl焦磷酸酶10μl(终浓度20单位/ml)、282mM甘油醛-3-磷酸1.8μl(终浓度1mM)、50mM氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸10μl(终浓度1mM)、1单位/μl甘油醛-3-磷酸脱氧酶10μl(终浓度20单位/ml)、1单位/μl心肌黄酶10μl(终浓度20单位/ml)和50mM铁氰化钾10μl(终浓度1mM)，溶解在100mM Tris-HCl缓冲液中，调整PH7.5，使总量为500μl。向如此制作的反应溶液中加入50mM焦磷酸1μl(终浓度0.1mM)，与实施例1同样地测定100秒后的电流值(未示出结果)。在图8中示出了改变焦磷酸量时100秒后的电流值。在图8中，纵轴表示电流值的绝对值(μA)，横轴表示焦磷酸浓度(μM)，黑点表示各焦磷酸浓度下的电流值。如图8所示，电流值相对于所加入的焦磷酸的浓度，呈现出良好的直线关系。
(实施例4)将在测定系统内加入了控制样板(λDNA)(寶酒造製)的试样设为试样1，将未加入的试样设为试样2，进行PCR反应。作为样板，使用λDNA，作为引物，使用TaKaRa PCR Amplification Kit(寶酒造製)的控制引物1(5’-GATGAGTTCGTGTCCGTACAACT-3’(序列号1))和引物3(5’-GGTTATCGAAATCAGCCACAGCGCC-3’(序列号2))，进行了试验(500bp增殖用)。将2.5单位/μl TaKaRa Z-TaqTM0.5μl、10×Z-TaqTM缓冲液5μl、2.5mM各dNTP混合物4μl、20pmol/μl引物1和引物3各0.5μl分别加入到试样1和试样2中，然后，只在试样1中加入1μg/mlλDNA 1μl，接着，向试样1和试样2中分别加入蒸馏水，使总量为50μl。PCR反应，在98℃进行1秒、在55℃进行1秒、在72℃进行10秒，进行30个循环。将PCR反应结束的溶液1μl加入到在实施例3制作的反应溶液中(添加焦磷酸之前)，与实施例1同样地测定100秒后的电流值，结果示于表1。
表1
在作为样板添加了λDNA的试样1中，将进行PCR反应生成的焦磷酸作为始端进行酶反应，观察铁氰化钾的氧化电流，但在试样2中未进行PCR反应，因此观察不到电流。
(实施例5)
向测定系统内加入控制样板(λDNA)(同上)，进行PCR反应，将作为样板使用λDNA、作为引物使用TaKaRa PCR AmplificationKit(寶酒造製)的控制引物1(5’-GATGAGTTCGTGTCCGTACAACT-3’(序列号1)和引物3(5’-GGTTATCGAAATCAGCCACAGCGCC-3’(序列号2))的试样设为试样1，将使用改变引物1’(5’-GATGAGTTCGTGTCCGTACAACA-3’(序列号3))和引物3的试样设为试样2，进行试验(500bp增殖用)。向2.5单位/μl TaKaRa Z-TaqTM0.5μl、10×A-TaqTM缓冲液5μl、2.5mM各dNTP混合物4μl和试样1中，加入20pmol/μl引物1和引物3各0.5μl，向试样2中加入20pmol/μl引物1’和引物3各0.5μl，然后，分别加入1μg/ml λDNA 1μl和蒸馏水，使总量为50μl。PCR反应，在98℃进行1秒、在55℃进行1秒、在72℃进行10秒，进行30个循环。将PCR反应结束的溶液1μl加入到在实施例3制作的反应溶液中(添加焦磷酸之前)，与实施例1同样地测定100秒后的电流值，结果示于表2。
表2
在使用作为引物与作为铸型的λDNA碱基序列完全互补的引物1和引物3的试样1中，将进行PCR反应生成的焦磷酸作为始端进行酶反应，观察到铁氰化钾的氧化电流，但在试样2中，引物1’的3’末端侧与作为铸型的λDNA碱基序列不为互补，所以只能利用作为铸型的引物3对样板λDNA进行延长反应，而不进行PCR形成的增殖反应，因此，观察不到电流。
(实施例6)按以下程序制作反应溶液。将1mM焦磷酸50μl(终浓度100μM)、30mM甘油醛-3-磷酸17.5μl(终浓度1mM)、10mM氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸50μl(终浓度1mM)、10mM铁氰化钾50μl(终浓度1mM)、100mM氯化美8.0μl(终浓度1.6mM)、1单位/μl心肌黄酶5μl(终浓度10单位/ml)和0.2单位/μl焦磷酸酶1μl(终浓度0.4单位/ml)溶解在50mM Tricine-NaOH缓冲液中，调整PH8.8，使总量为480μl。
与实施例1同样地测定如此制作的反应溶液的电流值，同时在测定开始60秒钟后，加入0.8单位/μl甘油醛-3-磷酸脱氧酶20μl(终浓度32单位/ml)。使上述1mM焦磷分别为0.8mM(终浓度80μM)、0.6mM(终浓度60μM)、0.4mM(终浓度40μM)、0.2mM(终浓度20μM)时，同样地测定所观察到的各电流值，该电流值的变化示于图10。在图10中，纵轴表示电流值I(μA)，横轴表示时间t(秒)。由图10可知，从反应开始，约在100秒(从测定开始约160秒后)，该反应达到正常值。
接着，改变焦磷酸的量，反应开始100秒后的电流值示于图11。在图11中，纵轴表示电流值的绝对值(μA)，横轴表示焦磷酸终浓度(μM)，黑点表示各焦磷酸浓度下的电流值。如图11所示，所加焦磷酸的量和反应开始100秒后的电流值呈现出良好的相关关系。
当将本实施例得到的图11的数据与实施例3得到的图8的数据进行比较时，可知本实施例能以高灵敏度检测焦磷酸。因此，本实施例中采用的条件比实施例3中采用的条件，更能以高灵敏度检测焦磷酸。
根据本发明，提供了一种利用电化学法、以高灵敏度、快速且定量地检测试样中的无机磷酸的方法。进而提供了一种通过将焦磷酸转换成无机磷酸、以高灵敏度、快速且定量地检测焦磷酸的方法。另外，根据本发明，通过测定伴随核酸延长反应生成的焦磷酸，可定量地测定有无目的的核酸。进而，能以高灵敏度且快速地测定目的的核酸的SNP部位的碱基。
产业上的可利用性如上所述，本发明可应用于临床、制药、系统分类学等用途中。
序列表正文中的描述序列号1的<223>引物序列号2的<223>引物序列号3的<223>引物序列表<110>松下电器产业株式会社<120>无机磷酸、焦磷酸及核酸的检测方法及对DNA的SNP序列进行标识的方法<130>02P403WO<150>JP2002-077359<151>2002-03-19<160>3<210>1<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>1gatgagttcg tgtccgtaca act 23<210>2<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>2ggttatcgaa atcagccaca gcgcc 25
<210>3<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>3gatgagttcg tgtccgtaca aca 2权利要求
1.一种无机磷酸的检测方法，用来检测无机磷酸，其特征在于包括将试样供给至含有甘油醛-3-磷酸、氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或氧化型磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、甘油醛磷酸脱氢酶、和电子传递介质的测定系统中的步骤；和在该测定系统中测定电流值的步骤，在此，该电流值表示该试样中的无机磷酸的浓度。
2.根据权利要求1所述的无机磷酸的检测方法，其特征在于所述电子传递介质是选自铁氰化物、1，2-萘醌-4-磺酸、2，6-二氯酚靛酚、二甲基苯醌、1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸酯、亚甲蓝、棓菁、硫堇、吩嗪硫酸甲酯和麦尔多拉蓝中的至少一种。
3.根据权利要求1中所述的无机磷酸检测方法，其特征在于所述测定系统还含有心肌黄酶。
4.根据权利要求1所述的无机磷酸的检测方法，其特征在于所述测定系统还含有二磷酸腺苷和磷酸甘油酸激酶。
5.一种焦磷酸的检测方法，用来检测焦磷酸，其特征在于包括将试样中的焦磷酸转换成无机磷酸的步骤；将试样供给至含有甘油醛-3-磷酸、氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或氧化型磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、甘油醛磷酸脱氢酶和电子传递介质的测定系统中的步骤；和在该测定系统中测定电流值的步骤，在此，该电流值表示该试样中的焦磷酸的浓度。
6.根据权利要求5所述的焦磷酸的检测方法，其特征在于使用焦磷酸酶进行焦磷酸向无机磷酸的转换。
7.一种核酸的检测方法，用来检测核酸，其特征在于包括将试样供给至含有具有与该核酸序列互补的序列的DNA探针、DNA聚合酶、脱氧核苷酸的反应系统中、并使该DNA探针延长、此时伴随着该DNA探针的延长反应生成焦磷酸的步骤；将试样中生成的焦磷酸转换成无机磷酸的步骤；将该试样供给至含有甘油醛-3-磷酸、氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或氧化型磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、甘油醛磷酸脱氢酶和电子传递介质的测定系统中的步骤；和在该测定系统中测定电流值的步骤，在此，该电流值表示该试样中的具有特定序列的核酸的浓度。
8.根据权利要求7所述的核酸的检测方法，其特征在于所述DNA探针的延长反应是PCR反应。
9.一种对DNA的SNP序列进行标识的方法，其特征在于包括将试样供给至含有具有与该DNA序列互补的序列且具有SNP部位的DNA探针、DNA聚合酶、脱氧核苷酸的反应系统中、并使该DNA探针延长、此时伴随着该DNA探针的延长反应生成焦磷酸的步骤；将试样中生成的焦磷酸转换成无机磷酸的步骤；将该试样供给至含有甘油醛-3-磷酸、氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或氧化型磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、甘油醛磷酸脱氢酶和电子传递介质的测定系统中的步骤；和在该测定系统中测定电流值的步骤，在此，该电流值表示该试样中的具有特定序列DNA的存在。
10.根据权利要求9所述的对DNA的SNP序列进行标识的方法，其特征在于所述DNA探针的延长反应是PCR反应。
全文摘要
本发明涉及一种检测无机磷酸的方法，包括将试样供给至含有甘油醛－3－磷酸、氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或氧化型磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、甘油醛磷酸脱氢酶和电子传递介质的测定系统中的步骤；和，在该测定系统中测定电流值的步骤。在上述方法中，将试样中的焦磷酸转换成无机磷酸，以高灵敏度、快速且定量地测定焦磷酸。在这样的焦磷酸的测定中，将伴随着DNA延长生成的焦磷酸进行定量，可判别有无作为目的的核酸，并对作为目的的DNA的SNP部位的碱基进行标识。
文档编号C12Q1/68GK1545558SQ0380083
公开日2004年11月10日 申请日期2003年3月17日 优先权日2002年3月19日
发明者行政哲男, 夜久英信, 深日希美, 信, 美 申请人:松下电器产业株式会社