紫花苜蓿Na的制作方法

专利名称：紫花苜蓿Na的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种植物Na+/H+逆向转运蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及一种紫花苜蓿Na+/H+逆向转运蛋白及其编码基因与应用。
背景技术：
盐胁迫主要是由Na+引起，细胞质中过高的Na+浓度引起的离子毒害、渗透胁迫以及K+/Na+比率的不平衡使得植物新陈代谢异常，从而对大多数器官造成伤害。而Na+在植物细胞中区隔化是植物抵御盐分胁迫、提高耐盐性的一种重要机制。大量研究显示盐生植物以及较耐盐的甜土植物液泡膜上Na+/H+逆向转运蛋白具有催化Na+和H+的跨膜逆向运输功能，从而可以将细胞质中过多Na+区隔在液泡里。而液泡膜上H+移位酶即H+-ATPase和H+-PPiase产生跨膜的H+电化学势梯度为Na+/H+逆向转运蛋白提供驱动力。
Na+在液泡中累积一方面可以使过多的Na+离开代谢位点，减轻Na+对酶类和膜系统的伤害；另一方面，植物可以利用累积在液泡内的Na+作为渗透调节剂，降低细胞水势，抵抗盐份造成的渗透胁迫，变害为利。同时盐分在液泡中累积还是维持细胞质中较高的K+/Na+比的最有效的机制之一。
既然液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白对植物的耐盐性起重要的作用，因此对于植物Na+/H+逆向转运蛋白基因的克隆、表达、结构与功能的分析，有利于在分子水平上详细了解该基因，从而促进植物耐盐基因工程的进展。目前编码该蛋白的基因在许多盐生植物以及一些甜土植物都已克隆出来，并且经过功能分析显示，其表达水平的高低对植物的耐盐性具有重要的调节作用。在拟南芥、芸苔、西红柿中过表达拟南芥的液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白(AtNHX1)，获得的转基因植株在盐胁迫条件，液泡中累积Na+能力水平大大上调，其耐盐性大幅度地提高。而在非盐胁迫条件下，转基因植株长势良好，没表现出明显的生长缺陷。目前含有AtNHX1基因西红柿在美国已经开始大面积的推广。
紫花苜蓿作为一种较为耐盐的甜土植物，也具有将细胞质中过高浓度Na+区隔到液泡中的功能。研究显示，其悬浮培养细胞的液泡中Na+、Cl-含量分别占到原生质体Na+、Cl-总量的73.8％-91.2％和74％-89.4％。
发明创造内容本发明的目的是提供一种紫花苜蓿Na+/H+逆向转运蛋白及其编码基因。
本发明所提供的紫花苜蓿Na+/H+逆向转运蛋白，来源于紫花苜蓿(Medicagosativa)，是具有序列表中SEQ ID №2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将SEQID №2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白质。
紫花苜蓿Na+/H+逆向转运蛋白的编码基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)编码序列表中SEQ ID №2蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中的SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
序列表中序列1由2232个碱基组成，其读码框为自5’端第336到第1961位碱基；序列表中序列2由541个氨基酸残基组成。
含有本发明基因的表达载体及细胞系均属于本发明的保护范围。
扩增紫花苜蓿Na+/H+逆向转运蛋白的编码基因中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。
本发明的紫花苜蓿Na+/H+逆向转运蛋白的编码基因将为苜蓿耐盐分子机制研究，以及对植物耐盐性状的改良打下坚实的基础，具有重要意义。


图1为中间片段扩增产物凝胶电泳图谱图2为3’端扩增产物凝胶电泳图谱图3为5’端扩增产物凝胶电泳图谱图4为紫花苜蓿Na+/H+逆向转运蛋白与其它植物Na+/H+逆向转运蛋白同源性分析图5为紫花苜蓿Na+/H+逆向转运蛋白与其他植物Na+/H+逆向转运蛋白疏水性比较图6示PBINHX表达载体的构建图7为200mM的NaCl胁迫下野生型和转基因拟南芥Na+含量的直方图具体实施方式
实施例1、紫花苜蓿Na+/H+逆向转运蛋白编码基因的获得1.1简并引物设计通过比较现已公开的植物液泡膜上Na+/H+逆向转运蛋白氨基酸的序列，寻找保守区域，并根据保守区域序列设计一对简并引物MsNHX15’-CCACCCAT(AT)AT(AT)TT(CT)AATGC(AGC)GG(AG)TT-3’
MsNHX25’-TAAC(AT)ACACC(CG)TC(AG)CC(AG)AAGAC(AG)AG(AC)CT-3’1.2材料处理紫花苜蓿品种中苜一号(Medicago sativa L.)种子在24℃下催芽2d后，在26℃光照培养，每天光照12h，至两叶一心期开始用1％(170mmol/L)NaCl胁迫处理6h，提取总RNA。
1.3 RNA的提取RNA提取参照张劲松等人的方法进行(张劲松，等.中国科学，B辑，1995，25(5)659～669)，苜蓿叶片在液氮中研碎，悬于抽提液(4mol/L硫氰酸胍中钠，5g/l十二烷基肌氨酸，25mmol/L柠檬酸钠，0.1mol/Lβ巯基乙醇)，混合物用酸性苯酚、氯仿抽提，上清中加入无水乙醇沉淀总RNA，再经4mol/LLiCl悬浮RNA沉淀、氯仿抽提1次，然后用乙酸钠/乙醇沉淀总RNA，最后将RNA溶于水中，贮存于-20℃备用，用0.8％的琼脂糖检测RNA的完整性。
1.4中间片段的扩增苜蓿cDNA合成按Promega公司M-MLV Reverse Transcriptase说明书(Promega，Cat.No.
M1701)的实验程序合成cDNA第一链，反应体系为，2ug制备的RNA模板，1.0ulOligo(dT)18，5ul5×RT缓冲液，1.25uldNTP(10mmol/L)，1ulRNA酶蛋白质抑制剂(RNAasin)，1ul逆转录酶，42℃反应60min，70℃变性5min，合成的cDNA贮存于-20℃备用。
中间片段的扩增体系为25ul，反应条件94℃变性4分钟；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，循环40次；72℃延伸5min。取5μl反应液，1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。获得一300bp左右的DNA片段(如图1所示)。
1.5A/T克隆回收纯化的PCR产物5ul，pMD-18T载体1ul，连接缓冲液5ul，16℃连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌DH5α。经菌体PCR、质粒酶切鉴定含有目的片段的阳性克隆，由上海生工测序，测序结果得到SEQ ID №3。
1.5该基因cDNA全序列的获得以获得的cDNA片段序列为基础，设计用于扩增3’端和5端’特异引物GSP15’-ATAACCACGGGTGCTACTTTTGC-3’GSP25’-CATAGGCACTGAGCAGACCTGTCACAACG-3’按照SMART RACE cDNA Amplification Kit(Clontech，Cat.no.K1811-1)的方法作RT-PCR。3’端的扩增的循环参数为94℃变性5s，68℃退火10s，72℃延伸2min，35个循环。产物经琼脂糖凝胶电泳检测扩出一1500bp左右的DNA片断(如图2所示)。5’端的扩增循环参数为94℃变性5s，72℃延伸3min，5个循环；94℃变性5s，70℃退火10s，72℃延伸3min，5个循环；94℃变性5s，68℃退火10s，72℃延伸2min，25个循环。产物经琼脂糖凝胶电泳检测扩出一1000bp左右的DNA片段(如图3所示)。产物回收纯化，连接，转化，测序，测序结果3’端序列为SEQ ID №4，5’端序列为SEQ ID №5。
借助DNA拼接软件contig，获得该基因的cDNA的完整序列，该序列全长为2232bp，具有SEQ ID №1的DNA序列，336-1961bp为其完整编码区域，编码的蛋白含有541个氨基酸残基，具有SEQ ID №2的氨基酸残基序列。
实施例2、紫花苜蓿Na+/H+逆向转运蛋白的功能分析2.1序列比较分析用BLAST和DNAMAN软件对克隆出紫花苜蓿Na+/H+逆向转运蛋白的序列进行比较分析，结果表明紫花苜蓿液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白与拟南芥、水稻、小麦、大麦、冰叶日中花、裂叶牵牛、碱篷等液泡膜Na+/H+逆向转运器具有极大的同源性(如图4所示)。其中与裂叶牵牛InNHX1(BAB16380)有78％的同源性，与拟南芥的AtNHX1(AAD16946)有77％的同源性，与碱篷的SsNHX1(AAP15178)有77％的同源性，与冰叶日中花的AgNHX1(BAB11940)有77％的同源性，与水稻的OsNHX1(BAA83337)有74％的同源性，与大麦的HvNHX2(AA091943)有73％的同源性，与小麦的TaNHX(AAK76737)有70％的同源性。另外，如图5所示，蛋白的疏水性分析显示紫花苜蓿Na+/H+逆向转运蛋白与这些植物Na+/H+逆向转运蛋白具有类似的疏水结构，具有多个跨膜结构。说明其与这些的植物液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白具有类似功能。
2.2转基因分析2.2.1表达载体的构建设计引物2对引物用于构建植物表达载体A15’-CGGAGTCCACCGATTCATCATCACGC-3’A25’-TTTGAGCTCCGTTGAATGACTTTTCACAAATC-3’B15’-atggctattgaaatgtcttctattg-3’，B25’-gcTCAACCCCATTGATTACCATTGCGT-3’，(其中下划线分别表示BamH I，Sac I酶切位点)。
PBINHX表达载体的构建过程如图6所示，提取苜蓿的总RNA，用oligo(dT)18作反转录。反转录产物用引物A1，A2进行PCR，得到MsNHX1的全长cDNA，连接到pMD-18T载体上，获得重组克隆载体，命名为pMD-NHX。以载体pMD-NHX为摸板，用引物B1和B2进行PCR扩增。用BamH I和Sac I分别双酶切PCR产物和PBI21载体，回收、纯化酶切产物。按照载体∶插入片段为1∶3的比例，取适量线性化载体PBI121和MsNHX1的cDNA片段混合，用T4DNA连接酶于16℃连接过夜，从而获得含有MsNHX1编码序列的重组表达载体，命名为PBINHX。
2.2.2农杆菌感受态细胞制备及重组载体对其转化挑取农杆菌LBA4404单菌落接种到2ml YEB液体培养基(含链霉素125ug/ml)中，28℃振荡培养过夜。将过夜培养物500ul接种于50ml的YEB液体培养基中，285 000g，4℃离心5min，收集菌体200rmp振荡培养至OD600为0.5左右。5 000g，4℃离心5min，收集菌体。于冰上加入10ml 0.15M的Nacl溶液悬浮细胞。5 000g，4℃离心5min，收集菌体。加入预冷的1ml 20mMCaCl重悬。取200ul感受太细胞，加入1ug表达载体DNA，冰浴30min，液氮中冻1min。37℃热激。加入1ml的YEB液体培养基，28℃振荡培养4h，10 000g离心30s，加入100ul的YEB重悬细胞。菌液涂布于含有100ug/mlkan和125ug/ml链霉素的YEB固体选择培养基平板上，28℃培养过夜。
2.2.3真空渗透法转化拟南芥(1)待萌发植物培养至茎高3-10cm时，去其顶生花序，避免伤及腋生花序，刺激腋生花序的生长。继续生长7-9天后，即可转化。
(2)农杆菌在4ml YEB中活化48小时，然后将菌液倒入250ml YEB中继续培养至OD600 1.2-1.8(约需48小时)。
(3)5000rpm离心10分钟，收集菌液，用渗透培养基悬浮菌液至OD600＝0.8。
(4)将农杆菌悬液倒在搪瓷盘中，将生有植物的培养杯倒扣其间，保证植物包括基生叶以上部分都浸没在菌液中，中间不能有大气泡，放入真空箱中，0.05Ba，抽真空10分钟。
(5)放气后，取出转化的植物，横放在一个塑料盘内，用塑料盖好，以保持湿度，闭光恒温培养2天后，竖立培养。
(6)荚果变黄后，小心收集种子。
2.2.4阳性植株的筛选(1)制备MS(0.43％ MS盐，3％蔗糖，1％琼脂，用KOH调pH至5.7)选择培养基。
(2)T1代种子表面消毒(2min in 70％乙醇，10min in 0.5％次氯酸钠，无菌水2min×5次)。
(3)平铺于含相应抗生素(40μg/ml Kan和50μg/ml的羧苄西啉钠)的MS选择培养基中，密度为1000-2000粒种子/皿。
(4)4℃春化3天，移入生长箱中(22℃恒温，24小时光照，光强为30-40μmol.m-2.s-1)。
(5)7天后挑选转化体，表现为真叶健康呈深绿色，根伸长至培养基中。
(6)将转化体转至正常的MS培养基中，10天后转入土壤。
(7)收获T2代种子，备用观察，并做生理生化鉴定。
2.2.5转基因植耐盐性的鉴定(1)植株根弯勾法耐盐性生理鉴定将野生型T2代种子经表面消毒后，播种于正常MS培养基中，22℃恒温，24小时光照，光强为30-40μmol.m-2.s-1生长5天，根长约2厘米。从中随机选取四棵，转移到另一MS培养基中，倒置培养，继续生长5天，此组为对照组。随机选取另外四棵，转到含100mM NaCl的MS培养基中，180°倒置培养，继续生长5天，此组为转化组。
(2)转基因植株的盐胁迫处理鉴定将野生型和T3转基因拟南芥代种子分别在1/4MS，和含100ug/ml Kan的抗性平板上萌发，在抗性平板上生长两周后，将幼苗载入土中，在室温中培养两周后进行NaCl胁迫处理，用0、10Mm、100mM、200mM的NaCl浇灌植株，两天浇灌一次。两周后观察表型。并将上述材料从培养土中取出，取地上部分测鲜重、干重。同时，取上述材料在70℃烘烤至恒重后称干重，并用Z 5300型原子吸收光谱仪进行Na+含量的测定。
2.2.6结果分析(1)以根弯勾生长方法做植物耐盐性生理鉴定，在对照组中，对于野生型和转基因，植株倒置培养5天后，野生型植株根平均伸长2.1厘米，转基因植株植株根平均伸长2.0厘米，野生型植株和转基因植株差别并不明显，除具有一定弯曲长度的主根外，都有比较发达的侧根出现。而在100mM NaCl培养基中倒置生长5天后，野生型植株根平均伸长0.4厘米，几乎不表现弯曲，也无明显的侧根出现；转基因植株植株根平均伸长1.9厘米，弯曲明显，且有明显的侧根出现，与对照组差别不大。说明，转基因植株的耐盐能力得到了部分提高。
(2)对T3转基因拟南芥和对照拟南芥进行盐处理两周后，在0、10mM的NaCl盐胁迫下，无论是野生型还是转基因拟南芥植株长势都很正常。但是在100mM，200mM的NaCl处理下，野生型拟南芥的根生长受到抑制，且变短变粗、分叉减少，叶片变黄，基部叶片脱落并伴有坏死。但转基因拟南芥的根的生长情况优于对照，没有受到明显的生长限制。
在盐胁迫下，转基因拟南芥地上部分的鲜重、干重明显高于野生型；如在100mM的NaCl处理下，与未经盐处理的相比，野生型拟南芥的鲜重下降了42％，而转基因拟南芥却仅下降约21％。
另外，在200mM的NaCl胁迫下，对照和转基因拟南芥地上部分的Na+含量都升高，但转基因植株中Na+含量升高更为显著，结果如图6所示。说明克隆出来的紫花苜蓿液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白与基因可以增强植物的耐盐性，可以作为植物耐盐基因工程的侯选基因加以应用，用来改良植物的耐盐性状。
序列表<160>5<210>1<211>2232<212>DNA<213>紫花苜蓿(Medicago sativa)<220>
<221>CDS<222>(336)..(1961)<400>1acgcggggaa tccaacccat tgtataacaa caactaccgg agatatataa tatctctctc 60ctctaaatag aatatcgaca gagtgactca acaagattat taggagtgat aatcttccac120ggcagctcaa aaacaaacaa catccgattc atcatcacgc gttgctcgag agatacttgt180gttgatgaga tcagaaggtt cttaaaatgg acagctcaga aacataaata tctgggattc240attattacta ctggactttg aaatttggaa attcagcaat aatctcaatt tgttcttaaa300tctgcttttg aaatttgtgg agggtggacg acatc atg gct att gaa atg tct 353Met Ala Ile Glu Met Ser1 5tct att gtt tca aaa cta tca atg tta tcc act tcc gat cat gct tct 401Ser Ile Val Ser Lys Leu Ser Met Leu Ser Thr Ser Asp His Ala Ser10 15 20gtt gtt tct atg aac ttg ttt gtg gca ctt ctg tgt gct tgt att gtc 449Val Val Ser Met Asn Leu Phe Val Ala Leu Leu Cys Ala Cys Ile Val25 30 35ctt ggt cat ctt ctc gag gag aat cga tgg atg aat gaa tcc atc act 497Leu Gly His Leu Leu Glu Glu Asn Arg Trp Met Asn Glu Ser Ile Thr40 45 50gcc ctt ttg att ggt att tgc act ggt gta gtg att ttg ctg ttt agt 545Ala Leu Leu Ile Gly Ile Cys Thr Gly Val Val Ile Leu Leu Phe Ser
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权利要求
1.一种紫花苜蓿Na+/H+逆向转运蛋白，是具有序列表中SEQ ID №2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将SEQ ID №2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于所述紫花苜蓿Na+/H+逆向转运蛋白是序列表中的SEQ ID №2。
3.紫花苜蓿Na+/H+逆向转运蛋白的编码基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)编码序列表中SEQ ID №2蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中的SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于所述紫花苜蓿Na+/H+逆向转运蛋白的编码基因是序列表中的SEQ ID №1。
5.根据权利要求4所述的基因，其特征在于所述紫花苜蓿Na+/H+逆向转运蛋白的编码基因的读码框为序列表中SEQ ID №1的自5’端第336到第1961位碱基。
6.含有权利要求3所述紫花苜蓿Na+/H+逆向转运蛋白的编码基因的表达载体。
7.含有权利要求3所述紫花苜蓿Na+/H+逆向转运蛋白的编码基因的细胞系。
8.扩增权利要求3所述紫花苜蓿Na+/H+逆向转运蛋白的编码基因中任一片段的引物。
9.权利要求3所述紫花苜蓿Na+/H+逆向转运蛋白的编码基因在苜蓿耐盐分子机制研究中的应用。
10.权利要求3所述紫花苜蓿Na+/H+逆向转运蛋白的编码基因在植物耐盐性状改良中的应用。
全文摘要
本发明公开一种紫花苜蓿Na
文档编号C12N15/29GK1634984SQ20031011293
公开日2005年7月6日 申请日期2003年12月26日 优先权日2003年12月26日
发明者杨青川, 吴明生, 王凭青, 康俊梅 申请人:中国农业科学院畜牧研究所