猪Ghrelin衍生物及其编码基因与应用的制作方法

专利名称：猪Ghrelin衍生物及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域中猪Ghrelin衍生物及其编码基因与应用，特别涉及猪Ghrelin衍生物及其编码基因与以其为活性成分的药物。
背景技术：
生长激素(Growth hormone，GH)是一种促进合成代谢的激素，能够促进蛋白质合成、脂肪降解和骨骼生长，而且与免疫系统的调节有关。GH通路的调节表达对最佳线性生长(Optimal linear growth)是非常关键的，同时对稳定碳水化合物、蛋白质和脂肪代谢也很重要(AL.Carrel et al.，Endocrine，12，163-172，2000)。生长激素分泌细胞(Somatotroph cells)分泌GH取决于下丘脑调节肽、靶腺激素以及多种生长因子以旁分泌(Paracrine)或自分泌(Autocrine)的方式相互之间的作用，其中许多生长因子至今仍不清楚。GH从垂体生长激素分泌细胞(Somatotrophs)的脉冲式(pulsatile)释放至少受到两种下丘脑神经肽生长激素释放激素(Growth hormone releasing-hormone，GHRH)与生长激素释放抑制激素(Somatostatin，SS)的调节(MF.Scanlon et al.，Hormone Research，46，149-154，1996)。而且，可能受一种内源性生长激素促释放肽Ghrelin(M.Kojima et al.，Nature，402，656-660，1999)调节。Ghrelin的分离称得上GH领域里程碑式的发现，它为更深入理解GH分泌及躯体生长(Somatic growth)调节机制提供了可能。
从本世纪70年代开始人们就陆续发现，许多人工合成的小分子肽和非肽类物质在体内和体外均可促进GH分泌(C.Bowers et al.，Endocrinology，106，663-667，1980)，并将这类人工合成的物质统称为生长激素促泌物(Growth hormonesecretagogues，GHSs)。根据GHSs在体内的促进GH分泌的信号传导机制与已知的GHRH不同，推测体内存在着GHS的相应受体(Growth hormone secretagoguesreceptor，GHS-R)。1996年AD.Howards等(Science，273，974-977，1996)成功分离到了单一编码GHS-R的cDNA，并证实GHS-R属于α螺旋7次跨膜的G蛋白耦联受体。基因比较分析显示GHS-R基因在人、猿、猪、牛、大鼠、小鼠中高度保守，人和猪GHS-R同源序列高达93％。1999年M.Kojima等(Nature，402，656-660，1999)报道了以建立的稳定表达GHS-R的CHO(Chinese hamster ovary)细胞株作为分析系统来寻找内源性GHS。通过对大鼠心、脑、肺、肾、胃肠等提取物的检测，发现大鼠胃组织提取物中GHS的活性最高。经过系列层析提纯，从中纯化出了由28个氨基酸组成的活性肽，并证明它是GHS-R的内源性配基(Ligand)，命名为Ghrelin(ghre在原欧语系就是生长的意思)。
Ghrelin成熟肽包括28个氨基酸残基，N端第三位丝氨酸残基的羟基被辛酰酯化，而且该辛酰酯化为其活性所必需。其氨基酸序列为GSSFLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR。它强烈诱导CHO-GHSR62细胞[Ca2+]增加，50％兴奋浓度(EC50)为2.5×10-9mol/L，阈值浓度为10-11mol/L。大鼠Ghrelin前体含117个氨基酸残基，N-端23肽呈现分泌信号肽的特征，从24位甘氨酸残基开始，直接连接在信号肽之后。Ghrelin最末两个残基脯-精氨酸应是加工信号。人胃Ghrelin与大鼠Ghrelin之间仅有两个残基不同。从人胃提取物中纯化的Ghrelin，也证实其N端第三位丝氨酸残基也存在n-辛酰酯化修饰。Ghrelin诱导原代垂体细胞释放GH，释放GH的EC50为2.1×10-9mol/L，GHRH为0.6×10-9mol/L，且明显地存在剂量依赖模式。此外，发现Ghrelin特异性地刺激垂体GH的释放，而不影响其他激素的分泌。Northern印迹实验对大鼠组织分析表明，Ghrelin前体mRNA存在于胃中，原位杂交表明Ghrelin的mRNA存在于分泌胃酸腺体的颈部和基部。并证明Ghrelin细胞是内分泌腺细胞。健康人血浆中Ghrelin浓度为117±37.2pmol/L。推测很可能Ghrelin从胃产生或分泌后随血液循环作用于垂体。组化分析还发现Ghrelin免疫反应的神经元位于下丘脑弓形核中。另外，RT-PCR分析指出，GHS-R在心、肺、胰腺、肠和脂肪组织中表达，故认为Ghrelin可能具有多方面的作用，如在心血管系统和代谢中起作用。
作为GHSs受体(GHS-R)的一种内源配体(Ligand)，Ghrelin最初是在大鼠胃内分泌细胞中发现的。Ghrelin成熟肽由28个氨基酸组成，在其N-端第三位丝氨酸(Ser3)羟基上有一个特殊的辛酰酯化翻译后修饰，此位置的翻译后修饰是其生物功能所必需的。辛酰化也并非是其唯一有功能的翻译后修饰，其它类型的酰酯化也是有功能的，去掉辛酰酯化或在第三位以外的其它丝氨酸上进行辛酰酯化修饰的Ghrelin是没有生物功能的。蛋白或多肽酰酯化较为少见，而辛酰酯化绝无仅有。多肽序列比较研究也显示，在已公布序列的哺乳动物中，Ghrelin N-端前7位氨基酸是高度保守的，并且都存在N-端第三位丝氨酸翻译后酰酯化修饰现象。
体外研究已表明，N-端可能是Ghrelin生物功能活性“核心”(Active core)，前4-5个氨基酸即具有与全长Ghrelin相似的生物学效应(MA.Bednarek et al.，J.Med.Chem，43，4370-4376，2000；M.Matsumoto et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun，287，142-146，2001)。体内和体外实验均已证实，Ghrelin具有明显的促进GH释放作用，静脉、脑室及腹腔给予Ghrelin均可升高血中GH水平。Ghrelin也能刺激人体GH释放(K.Takaya et al.，The Journal of Clinical Endocrinology& Metabolism，85，4908-491，2000；V.Tolle et al.，euroendocrinology，73，54-61，2001)。而且，令人振奋的是，按相同的分子比计算，Ghrelin促进GH释放的作用明显大于GHRH(M.Pombo et al.，Hormone Research 55(Suppl 1)，11-16，2001)。Ghrelin也与人工合成的GHSs一样，Ghrelin与GHRH也具有相加作用，协同刺激GH分泌。Ghrelin可能通过与GHRH不同的机制更有效调节GH释放，是体内调节GH释放的又一个重要因素，详细的机制有待阐明。但已有的证据已经表明Ghrelin发挥促GH分泌作用可能依赖于一个完整的GHRH系统(CY.Bowers et al.，TheJournal of Clinical Endocrinology & Metabolism，86，1464-1469，2001；J.Kamegai et al.，Endocrinology，142，4154-4157，2001；GS.Tannebaum et al.，Endocrinology，144，967-974，2003)。此外，Ghrelin也参与能量代谢(M.Tscho¨pet al.，Nature，407，908-913，2000；TL.Horvath et al.，Endocrinology，142，4163-4169，2001；DE.Cummings et al.，The New England Journal of Medicine，346，1623-1630，2002)。由于Ghrelin在血液中的半衰期较短，以前在体内研究Ghrelin促进GH分泌活性需要反复皮下、静脉或脑室内注射合成的Ghrelin或其类似物(M.Tscho¨p et al.，Nature，407，908-913，2000；M.Nakazato et al，Nature，409，194-198，2001)。
基因药物(Gene medicines)也称为DNA药物，它是将具有治疗意义的基因重组进真核表达载体，直接转移动物或人的细胞，表达出具有治疗作用的多肽或蛋白质，从而达到治疗疾病或调节动物生长，泌乳等性能的一种新方法(马大龙 生物技术药物 北京 科技出版社 2001)。基因药物不同于一般的基因治疗，基因转移的细胞不仅要在细胞内表达出治疗的蛋白质，而且表达的蛋白质还要释放出细胞，进入系统循环才能发挥作用。它与传统的提取，合成和蛋白质工程类药物不同，它不需要在体外合成和表达蛋白质，也不需要在体外分离和纯化，而是把人体能合成蛋白质和多肽的“工厂”-重组的基因-植入体内，让细胞自己去合成、分离和纯化蛋白质，并且自行释放入血液循环，在局部或远隔部位发挥其功能，而达到防治疾病及调节生长，泌乳等目的。它不需要“原料”，体内可以自行提供基因转录、表达所需要的条件，细胞自身可以进行合成、分离和纯化，并分泌出来；基因在细胞内，可以接受体内各种转录因子、调控因素和内外环境的调节；它不断生产、不断释放、不断利用。因此，一次植入基因可以长期有效，无需每天用药，具有高效，长效，生理，经济，实用的优势。它是对既往传统药物的一个挑战，被称为医药产业的第四次革命，成为21世纪国际生物高技术和医药产业的一个重要发展。基因药物与蛋白质类药物的区别如表1所示。基因药物主要有细胞因子、活性多肽及其受体的基因，此外，还包括反义核酸、DNA疫苗和基因转录调控的药物等。
表1.多肽药物与基因药物的比较多肽药物基因药物产物 多肽-蛋白质 基因质粒原核表达载体无信号肽真核表达载体信号肽宿主细胞 大肠杆菌、酵母(体外) 人体细胞(体内)转染 易 难生产工艺 复杂 较简单纯化复杂 较简单成本 较昂贵 较经济稳定性 不稳定 稳定保存 难 易半衰期短 长用法 长期注射 一次性注射疗效 短持久副作用高 低利用直接的质粒DNA注射方法异位表达GHRH或其蛋白酶抵抗的氨基酸替代衍生物促进小鼠或猪生长(R.Draghia-Akli et al(Nature Biotechnology，15，1285-1289，1997；Nature Biotechnology，17，1179-1183，1999；FASEB Journal，17，526-528，2003)早有报道，那么探索应用基因药物手段异位表达Ghrelin或其衍生物及Ghrelin联合GHRH，或许能够找到一种比应用GHRH更有效、更生理、更经济地促进畜禽生长，提高饲料转化率，增加度肉率，提高产乳量，促进优质、高产畜禽产品生产的方法。对于基因药物，Ghrelin及其衍生物cDNA可以锚定(Target)到外周器官，在那里多肽被合成加工、分泌，最后，转运到全身循环，并且在血液循环中是有生物活性的。骨骼肌是体内理想的直接质粒DNA转染的靶组织，质粒DNA可以在肌肉内长时间显著水平表达(HL.Davis et al.，Human Gene Therapy，4，151-159，1993；SK.Tripathy et al.，Proceedings of the National AcademySciences USA，93，10876-10880，1996)。基因药物是一种替代治疗，不同于经典的基因治疗，如肿瘤，它不象基因治疗那样需要100％的细胞都植入进基因才能抑制肿瘤的生长。有人指出，主要2％-5％的肌肉细胞转染进基因，其表达蛋白质可以通过自分泌和旁分泌和循环分泌即可达到治疗的目的。基因药物也不同于基因工程和多肽类药物，它是一种持续起作用的因素，一次注射，可以长期有效，并可重复应用。因此，它并不要求能整合进基因组，终身表达。这样不仅可以增加基因药物的安全性，还提高了基因药物应用的灵活性。
发明创造内容本发明的目的是提供一种猪Ghrelin衍生物及其编码基因。
本发明所提供的猪Ghrelin衍生物，它为至少包括GSSF或GSWF氨基酸残基序列的由猪Ghrelin衍生的多肽。
其中，所述猪Ghrelin衍生物优选为至少包括GSSFLSP或GSWFLSP氨基酸残基序列的由猪Ghrelin衍生的多肽。
上述猪Ghrelin衍生物可由常规方法合成。
所述GSSF和GSSFLSP中的第2个丝氨酸为辛酰酯化的丝氨酸；为使所述猪Ghrelin衍生物分泌到血液循环，所述猪Ghrelin衍生物的N端还连接有信号肽/引导肽序列，所述信号肽/引导肽可为猪Ghrelin或人生长激素释放激素(hGHRH)信号肽/引导肽，优选为猪Ghrelin信号肽/引导肽。
为增强所述猪Ghrelin衍生物的生物活性，可在所述猪Ghrelin衍生物的C末端添加一个碱性氨基酸，如赖氨酸。
所述猪Ghrelin衍生物优选为序列表中的SEQ ID №1、SEQ ID №2、SEQ ID№3、SEQ ID №4、SEQ ID №5、SEQ ID №6或SEQ ID №7。
SEQ ID №1由52个氨基酸残基组成，自N端第1至第24位氨基酸残基序列为猪Ghrelin信号肽序列，自N端第25至第52位氨基酸残基序列为猪Ghrelin序列；SEQ ID №2由52个氨基酸残基组成，自N端第1至第24位氨基酸残基序列为猪Ghrelin信号肽序列，自N端第25至第52位氨基酸残基序列为除第27位氨基酸残基是色氨酸残基外其余为猪Ghrelin序列；SEQ ID №3由32个氨基酸残基组成，自N端第1至第24位氨基酸残基序列为猪Ghrelin信号肽序列，自N端第25至第31位氨基酸残基序列为猪Ghrelin的自N端第1至第7位氨基酸残基序列序列，自N端第32位氨基酸残基为赖氨酸残基；SEQ ID №4由32个氨基酸残基组成，自N端第1至第24位氨基酸残基序列为猪Ghrelin信号肽序列，自N端第25至第31位氨基酸残基序列为除第27位氨基酸残基是色氨酸残基外其余为猪Ghrelin的自N端第1至第7位氨基酸残基序列，自N端第32位氨基酸残基为赖氨酸残基；SEQ ID №5由59个氨基酸残基组成，自N端第1至第31位氨基酸残基序列为人GHRH信号肽序列，自N端第32至第59位氨基酸残基序列为猪Ghrelin序列；SEQ ID №6由59个氨基酸残基组成，自N端第1至第31位氨基酸残基序列为人GHRH信号肽序列，自N端第32至第59位氨基酸残基序列为除第34位氨基酸残基是色氨酸残基外其余为猪Ghrelin序列；SEQ ID №7由39个氨基酸残基组成，自N端第1至第31位氨基酸残基序列为人GHRH信号肽序列，自N端第32至第38位氨基酸残基序列为除第34位氨基酸残基为色氨酸残基外其余为猪Ghrelin的自N端第1至第7位氨基酸残基序列，自N端第39位氨基酸残基为赖氨酸残基。
编码上述猪Ghrelin衍生物的基因也属于本发明的保护范围，含有编码上述猪Ghrelin衍生物的基因的表达载体和细胞系也属于本发明的保护范围，如表达载体pGEM-wt-sGhln(含有序列表中的SEQ ID №1编码序列)、pGEM-mt-sGhln(含有序列表中的SEQ ID №2编码序列)、pGEM-tmt-sGhln(含有序列表中的SEQ ID№4编码序列)、pGEM-twt-sGhln(含有序列表中的SEQ ID №3编码序列)、pGEM-wt-hGhln(含有序列表中的SEQ ID №5编码序列)、pGEM-mt-hGhln(含有序列表中的SEQ ID №6编码序列)、pGEM-tmt-hGhln(含有序列表中的SEQ ID№7编码序列)。
本发明的另一个目的是提供一种促进哺乳动物增重，提高饲料转化率，升高血清生长激素水平，改善机体组成，提高度肉率、纠正人类各种生长激素缺陷及促进生长激素分泌以及增加厌食人群及恶病质病人食欲的多肽药物，该药物的活性成分为上述猪Ghrelin衍生物或其可溶性盐。
本发明的再一个目的是提供一种促进哺乳动物增重，提高饲料转化率，升高血清生长激素水平，改善机体组成，提高度肉率、纠正人类各种生长激素缺陷及促进生长激素分泌以及增加厌食人群及恶病质病人食欲的基因药物，该药物的活性成分为上述猪Ghrelin衍生物的编码基因。
上述多肽药物可通过注射进行给药；上述基因药物可通过注射含有上述基因的表达载体进行给药。
本发明的猪Ghrelin衍生物及其编码基因与以其为活性成分的药物将在促进哺乳动物增重，提高饲料转化率，升高血清生长激素水平，改善机体组成，提高度肉率、纠正人类各种生长激素缺陷及促进生长激素分泌以及增加厌食人群及恶病质病人食欲等方面发挥重要作用，可用于畜禽生产、人类临床基因补充和替代治疗。


图1为猪Ghrelin及其衍生物cDNA pT-wt-sGhln或pT-wt-hGhln载体构建示意2为肌原特异表达载体框架的构建示意3为猪Ghrelin及其衍生物cDNA肌原表达载体构建示意4为生产基因药物的流程5为大鼠左侧股四头肌质粒DNA单一剂量注射后增重效果图6为大鼠左侧股四头肌质粒DNA单一剂量注射后增重效果图7为Q sepharoae XL质粒DNA纯化过程图8为质粒pGEM-tmt-sGhln DNA经Q Sepharose QL纯化后的电泳9为青年大鼠左侧股四头肌质粒DNA单一剂量注射后增重效果图10为青年大鼠直接肌内注射质粒DNA后放射免疫测定血清图11为质粒DNA注射后30天，RT-PCR检测pGEM-wt-sGhln，pGEM-tmt-sGhln编码基因表达结果具体实施方式
实施例1、猪Ghrelin成熟肽及其衍生物肌原表达载体的构建1、猪Ghrelin及其衍生物cDNA克隆猪Ghrelin及其衍生物cDNA pT-wt-sGhln或pT-wt-hGhln载体构建过程如图1所示，具体步骤如下根据Gene Bank已公布的猪Ghrelin(GeneBank登陆号No.AB035704)以及人GHRH(hGHRH)前体cDNA序列(GeneBank登陆号no.NM_021081)，合成3条寡核苷酸单链和6条引物(上海生工)，寡核苷酸链与引物序列如表2所示。寡核苷酸单链序列1包括猪Ghrelin信号肽和成熟肽前28bp cDNA序列(正义)，其中包括一个碱基突变(Ghrelin成熟肽第5位氨基酸，亮氨酸(Leu)密码子由TTG→TTA)以构成限制酶Afl II识别序列(CTTAAG)；寡核苷酸单链序列2包括人GHRH信号肽和猪Ghrelin成熟肽前20bp cDNA序列(正义)，其中也包括一个碱基突变(Ghrelin成熟肽第5位氨基酸，亮氨酸(Leu)密码子由TTG→TTA)以构成限制酶Afl II识别序列(CTTAAG)；寡核苷酸单链序列3包括猪Ghrelin成熟肽前84bp cDNA序列(反义)，前面含有12个碱基包括TAG转录终止密码子，限制酶Spe I识别序列(ACTAGT)及3个酶切保护碱基CGT。其中包括一个碱基突变(Ghrelin成熟肽第5位氨基酸，亮氨酸(Leu)反义密码子由CAA→TAA)以构成限制酶Afl II识别序列(CTTAAG)。首先，序列1与序列3退火，补齐，然后以引物1和3作PCR扩增，扩增产物克隆到测序载体pMD-18-T(Takara)形成pT-wt-sGhln；其次，以pT-wt-sGhln作为模版，以引物4和5作PCR扩增，PCR产物插入到pT-wt-sGhln的Sac I/Afl II位点产生pT-mt-sGhln；最后，以Sac I/Afl II双酶切pT-mt-sGhln，回收小片段，以引物4和6扩增小片段，PCR产物插入到pT-mt-sGhln的Sac I/SpeI位点形成pT-tmt-sGhln。以Sac I/Afl II双酶切pT-wt-sGhln，回收小片段，插入到pT-tmt-sGhln的Sac I/Afl II位点形成pT-twt-sGhln。在序列2与序列3之间，依次用引物对2和3、4和5及4和6作上述同样的操作产生相应的pT-wt-hGhln、pT-mt-hGhln及pT-tmt-hGhln。
表2.寡核苷酸序列与引物寡核苷酸序列与引物序列(5’to 3’)正义/反义寡核苷酸序列1ATGCCCTCCACGGGGACCATTTGC正义AGCCTGCTGCTCCTCAGCGTGCTCCTCATGGCAGACTTGGCCATGGCGGGCTCCAGCTT CCCCGAACACC寡核苷酸序列2ATGCCACTCTGGGTGTTCTTCTTTG 正义TGATCCTCACCCTCAGCAACAGCTCCCACTGCTCCCCACCTCCCCCTTTGACCCTCAGGATGCGGCGGGGCTCCAGCTT CCC寡核苷酸序列3GCA CTACCGGGGCTTCAGT 反义TTGGCTGCTGGCTTCTTGGACTCCTTTCTCTGCTGCACTTTCTGGTGTTCGGGG AAGCTGGAGCC引物1ATGCCCTCCACGGGGACCATTT 正义引物2ATGCCACTCTGGGTGTTCTTCTTT正义引物3GCA CTACCGGGGCTTC反义引物4TTC GGTACCCGG正义引物5GGGG AACCAGGAGC 反义引物6GCA CTACTTGGGGCTTAA 反义注下划线代表限制酶Afl II、Spe I与Sac I识别序列。引物5包含将丝氨酸反义密码子替代为反义色氨酸密码子(GCT→CCA)，引物6将在Ghrelin短肽C-末端添加一个赖氨酸反义密码子(CTT)。
退火反应总体积20μl，正义链、反义链各2.5μM，1mMdNTP，TagDNA聚合酶0.25U/μl，反应条件94℃，4min；58℃，40s；72℃，1min；一个循环。上述所有PCR反应条件都是相同的首先94℃，变性5min，然后，60℃退火30s，72℃延伸30s，94℃变性30s，共30个循环。
2、肌肉特异表达载体构建骨骼肌α-actin5’已经证明能够在体内外驱动多个报告基因的表达，而且是肌肉组织特异的。
源于pGEM-5zf(为Promega的pGEM-T Vector)的质粒DNA骨架pGEM-A5f3f的构建过程如图2所示pGEM-A5f3f含有一个2857bp Nco I/Mlu I片段，其中包括1910bp猪骨骼肌α-actin(SKA)5’侧翼、第一外显子和第一内含子。pGEM还有一个613bp Sac I/Nsi I片段的人GH(hGH)cDNA3’非翻译区。质粒DNA骨架pGEM的5’侧翼与3’侧翼均是通过PCR的方法从基因组中扩增得到。pGEM-A5f3f表达载体骨架已经申请专利保护，专利
发明者解启发, 孟庆勇, 李宁 申请人:李宁