猪繁殖与呼吸综合征重组腺病毒和疫苗的制作方法

专利名称：猪繁殖与呼吸综合征重组腺病毒和疫苗的制作方法
技术领域：
本发明猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)重组腺病毒及疫苗属于生物技术高科技领域，专用于加强猪对猪繁殖与呼吸综合征病毒的免疫保护作用及减少猪场的经济损失。
二、技术背景重组腺病毒基因工程技术在人类的基因治疗方面已经得到了较为广泛的应用，很多应用于人类基因治疗的重组腺病毒已经进入临床实验三期阶段。因为重组腺病毒具有宿主范围广，感染细胞种类多，可以表达人源和非人源蛋白，而且不会插入宿主染色体，回复突变率低，可以复制到很高的滴度等特点。而GP5蛋白是由猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV的ORF5编码的大约25kD的糖蛋白，由其诱导的抗体具有中和活性。用杆状病毒表达的GP5蛋白可以对怀孕母猪提供50％的保护力，此外用杆状病毒表达的GP5、GP3免疫母猪产下的仔猪在断奶时PRRSV血清阴性。用巨细胞病毒启动子控制下的GP5质粒免疫动物后，在猪和小鼠产生抗GP5的特异性中和抗体。单克隆抗体试验证明针对GP5的单克隆抗体的中和活性要强于针对GP4的单克隆抗体，而且GP5蛋白可以诱导细胞凋亡。目前还没有构建成猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV的重组腺病毒报道。

发明内容
技术问题本发明的目的是研制一种能够有效控制猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的PRRSV重组腺病毒及疫苗，使在当前PRRS难以防治的情况下有新的突破。
技术方案本发明的实施方案如下猪繁殖与呼吸综合征重组腺病毒，其特征在于，重组腺病毒rAd-GP5在分类上属于腺病毒科(Adenoviridae)，哺乳动物腺病毒属(Mastadenovirus)，人腺病毒种(Humanadenovirus)，该重组腺病毒可以对目的蛋白进行有效的表达，用该重组腺病毒感染动物后不出现临床症状，因此可以用来表达抗原蛋白。该重组腺病毒已在中国科学院武汉病毒研究所进行保藏，保藏日期2003年8月15日，保藏号为IVCAS6.0200。
上述猪繁殖与呼吸综合征重组腺病毒，是通过以下方法构建而成的(1)GP5基因的扩增、克隆根据PRRSV美洲标准毒株ATCC VR-2332的基因序列设计了一对针对PRRSV国内分离S1毒株(GeneBank收录号为AF090173)GP5基因的特异性引物，引物序列如下AdGP5.15-GCC GGT ACC ACC ATG TTG GAG AAA TGC TTG AC-3AdGP5.25-GCA CTC GAG CTA AGG ACG ACC CCA TTG TTC-3以S1毒株的cDNA产物为模板，通过该引物扩增出了PRRSV国内分离株S1的GP5全基因。把GP5基因克隆入穿梭载体pShuttle-CMV中，然后通过酶切和PCR鉴定，获得含有GP5基因的穿梭载体pShuttle-CMV-GP5；(2)含有GP5基因的穿梭载体pShuttle-CMV-GP5与腺病毒骨架载体pAdEasy-1同源重组鉴定好的含有GP5基因的穿梭载体pShuttle-CMV-GP5经酶切线性化后与腺病毒骨架载体pAdEasy-1通过电转化方法转化入大肠杆菌菌株BJ5183中，在大肠杆菌重组酶的作用下，在穿梭载体和骨架载体之间发生同源重组，实现了把外源基因转入腺病毒骨架载体，经卡那霉素和酶切鉴定筛选获得了含有外源基因的重组腺病毒质粒；(3)重组腺病毒的获得 鉴定好的重组腺病毒质粒通过阳离子脂质体法转染HEK293-A细胞(从公司购买)，重组腺病毒质粒在293细胞内包装成完整的病毒。
用上述猪繁殖与呼吸综合征重组腺病毒制成的疫苗将纯化的重组腺病毒在HEK293-A细胞上连续传代30次，检测其猪繁殖与呼吸综合征GP5基因的转录与表达情况，证明PRRSV GP5蛋白表达稳定。重组腺病毒的毒价稳定在104.33TCID50/1.0ml。
在扩大培养过程中取用保存PRRSV的纯化重组腺病毒按104TCID50接种长成单层的HEK293-A细胞。当细胞病变达70-90％时收毒，经反复冻融一次即可获得PRRSV重组腺病毒疫苗。
有益效果本发明首次提出了用腺病毒载体构建PRRSV重组腺病毒，该重组腺病毒突破了PRRSV常规灭活疫苗和弱毒疫苗的局限性。该重组疫苗具有弱毒疫苗的复制特性和灭活疫苗的安全性，而且使PRRSV GP5蛋白获得了提前表达，改变了PRRSV感染猪后中和抗体产生量少而且慢的特点。因为该重组腺病毒疫苗采用的是人腺病毒血清5型载体，对人、猪等动物没有致病性，容易通过安全性评价。
试验证明，本发明构建的PRRSV重组腺病毒对外源蛋白表达稳定，而且其效价稳定，种毒的毒价稳定在104.33TCID50/1.0ml。通过小鼠免疫试验和中和试验证明了该重组腺病毒产生了针对PRRSV的中和抗体，其中和抗体效价为1∶28。
重组腺病毒对动物不致病，其可以通过多种途径进行传播，能够使同居猪发生感染，这在重组苗中是非常重要的。这种特性可以使没有免疫或漏免的猪也获得免疫，使群体的抗体水平较一致，能够较好的抵抗外源病毒的攻击。利用该重组腺病毒免疫小鼠获得了针对PRRSV的特异性中和抗体，该抗体在体外可以中和PRRSV。
与现在应用的PRRSV的弱毒疫苗和灭活疫苗相比，该病毒能在猪体内复制增殖并且不断表达GP5蛋白，使机体持续受到GP5蛋白的刺激，不断产生针对GP5蛋白的中和抗体，这样就能对猪体提供持久的保护力，因此在PRRS的防治方面具有广阔的应用前景。
四

图1 PRRSV GP5基因克隆入穿梭载体示意2 含GP5基因的穿梭载体与腺病毒的骨架载体的同源重组和获得重组腺病毒的示意3 PRRSV-S1 GP5基因RT-PCR产物1100bp DNA Ladder 2PRRSV-S1株GP5基因的PCR片段图4 GP5基因重组质粒pShuttle-CMV-GP5的PCR鉴定结果1100bpDNA Ladder 2-4为3个不同重组菌落质粒的PCR产物图5 GP5基因重组质粒Kpnl/HindIII酶切鉴定结果1λDNA/EcoRI+HindIII Marker 2-4三个不同重组质粒的克隆图6 pAd-GP5质粒GP5基因的PCR鉴定1100bp DNA Ladder 2-3PCR从不同克隆的pAd-GP5质粒中扩增出GP5基因片段图7重组质粒的PacI酶切鉴定1λDNA/EcoRI+HindIII Marker 21号重组质粒pAd-GP5的PacI酶切 32号重组质粒pAd-GP5的PacI酶切图8重组腺病毒表达的GP5蛋白mRNA的检测1100bp DNA Ladder 2 293-A提取总RNA的RT-PCR 3感染重组毒的293-A提取总RNA的RR-PCR图9重组腺病毒感染的HEK293-A细胞的间接免疫荧光抗体染色结果A未感染重组腺病毒的293-A细胞，没有荧光 B感染重组腺病毒的293-A细胞，有明显的荧光五具体实施例方式(一)基因工程体—PRRSV重组腺病毒(rAd-GP5)的构建1.PRRSV GP5基因的扩增、克隆、鉴定和测序分析1.1 PCR引物设计合成 根据PRRSV美洲标准毒株ATCC VR-2332的基因序列设计了一对针对PRRSV S1毒株(GeneBank收录号为AF090173)GP5基因的特异性引物，在引物的5’端分别含有限制性内切酶酶切位点。引物由上海细胞生物化学所合成。
AdGP5.15-GCC GGT ACC ACC ATG TTG GAG AAA TGC TTG AC-3AdGP5.25-GCA CTC GAG CTA AGG ACG ACC CCA TTG TTC-3。
1.2 S1毒株感染Marc-145细胞(公知公用)总RNA的提取 接种PRRSV毒株S1分离株的细胞病变达75％左右时冻融一次收集细胞，4000rpm离心10min沉淀细胞，弃上清；每一瓶细胞沉淀物加入1.0mlTRIZOL(Invitrogen公司)试剂，涡漩混匀。以下操作按试剂盒说明书进行。
1.3反转录 取Oligod(T)12-181.0μl，细胞总RNA 14.0μl，10mM dNTPs 0.5μl，5×反转录酶缓冲液4.0μl，用DEPC水补加至体积19.5μl。充分混合各内容物后，在65℃水浴中作用10min，冷却后加入鼠源反转录酶M-MLV(购自生物公司)0.5μl，充分混合后37℃作用1.0h，95℃ 5min，然后在冰上迅速冷却，作为PCR反应的模板。
1.4 PCR 取cDNA 2.0μl，AdGP5.1 1.0μl，AdGP5.2 1.0μl，10mM dNTPs 1.0μl，无Mg++缓冲液5.0μl，25mM Mg++2.0μl，rTaq DNA聚合酶1.0μl，用无菌双蒸水补至总体积50.0μl。在PCR仪上进行反应。循环参数为94℃预变性3min；94℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸60s，共进行35个循环；然后72℃延伸10min。PCR产物进行1％(g/ml)琼脂糖凝胶电泳。
1.5 RT-PCR产物的克隆1.5.1 PCR产物回收与纯化PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，在紫外灯下切下含目的条带的琼脂糖块，用DNA快速回收纯化试剂盒回收凝胶中的目的片段。具体操作步骤按华舜凝胶回收试剂盒的说明书进行。
1.5.2 PCR产物酶切与纯化 酶切反应总体积为50μl。10×M buffer 5.0μl，PCR回收片段20.0μl，KpnI 1.0μl，XhoI 1.0μl，用无菌双蒸水补至总体积50.0μl。37℃作用3.0h，然后进行琼脂糖凝胶电泳确定是否酶切完全。酶切完全后，用琼脂糖凝胶回收试剂盒对酶切后的产物进行回收，方法同上。
1.5.3 pShuttle-CMV 酶切纯化酶切反应总体积为50μl。10×M buffer 5.0μl，pShuttle-CMV质粒20.0μl，KpnI 1.0μl，XhoI 1.0μl，用无菌双蒸水补至总体积50.0μl。同时设定穿梭载体的KpnI和XhoI的单酶切对照。37℃作用3.0h，然后进行琼脂糖凝胶电泳确定是否酶切完全。酶切完全后，用琼脂糖凝胶回收试剂盒对酶切后的产物进行回收，方法同上。
1.5.4 目的片段与pShuttle-CMV的连接反应 酶切回收PCR产物2.0μl，载体pShuttle-CMV酶切回收产物4.0μl，10×连接酶缓冲液1.0μl，T4 DNA连接酶1.0μl，用无菌双蒸水补足总体积10.0μl。混匀各产物后在14℃连接过夜，同时设定载体自身连接对照。连接产物转化DH5α。
1.5.5 大肠杆菌DH5α感受态细菌的制备和转化DH5α感受态细菌的制备见分子克隆。
1.5.6 重组质粒的提取和鉴定质粒提取应用常规的碱裂解法。提取后的重组质粒采用PCR和双酶切鉴定，在PCR和双酶切鉴定中都可以见到我们所需要的目的条带。
1.6 cDNA序列分析根据pShuttle-CMV载体测序引物序列由上海细胞生化所合成一对测序引物，引物序列为Adseq15-GGT ATA TAT AAG CAG AGC TG-3；Adseq25-GTG GTA TGG CTG ATT ATGATC AG-3。测序工作由宝生物工程(大连)有限公司协助完成。在DNA测序仪(ABIPRISMTM377XL DNA Sequencer)进行双向测序。并用NCBI BLAST将所测得的序列及其推倒的氨基酸序列与GeneBank数据库中的PRRSV GP5基因的核苷酸和蛋白质进行同源性比较，再用Vector NTI和DNAstar软件进行基因的限制性内切酶和阅读框。证明了我们所克隆入的基因与与S1毒株的同源性非常高，而且克隆入的基因完全符合载体阅读框要求。
2含有GP5基因的穿梭载体(pShuttle-CMV-GP5)与腺病毒骨架载体(pAdEasy-1)同源重组2.1 pShuttle-CMV-GP5 Pmel线性化与纯化 用10×NE buffer4 5.0μl，100×BSA0.5μl，pShuttle-CMV-GP5 30.0μl，PmeI 1.0μl，用双蒸水补加至总体积50.0μl。37℃作用3.0h，然后取2.0μl进行1％(g/ml)琼脂糖凝胶电泳。利用小量胶回收试剂盒进行回收纯化。纯化方法同上。
2.2 大肠杆菌BJ5183电转化感受态细菌的制备 在链霉素(30μg/ml)抗性平板上挑取一个新鲜的BJ5183菌落接种于含30μg/ml链霉素的10ml LB培养基中，37℃200rpm过夜振荡培养；第二天按1/1000体积接种于一新的含链霉素的LB培养基中，振荡培养，使其A550≈0.8，培养物置冰浴上1.0h；4℃ 3000rpm离心10min；用初始菌液体积的无菌冰冷的WB液重悬细胞；(WB＝10％超纯甘油，90％蒸馏水v/v)；3000rpm离心30min；再一次用初始体积的WB液重悬菌体后离心；3000rpm离心30min后倾去多余的上清，剩余1/500体积的WB液重悬菌体，分装40μl每管，-70℃保存。
2.3 pShuttle-CMV-GP5与pAdEasy-1共转化BJ5183细菌 取出-70℃保存的BJ5183电转化感受态细菌两管，在冰浴上缓慢融化；取纯化的pAdEasy-1载体和线性化的pShuttle-CMV-GP5质粒在一灭菌500μl的离心管中混合；在两管BJ5183电转化感受态细菌分别加入线性化的pShuttle-CMV-GP5质粒和pAdEasy-1载体的混合物及线性化pShuttle-CMV-GP5作为对照；把加入质粒后的BJ5183细菌转入冰冷的电极杯中，使液滴悬浮在电极杯金属板中央；立即进行电转化，电转化仪的参数设置为25kV，25μF，200Ω；每转化完一管立即加入1.0ml的室温LB溶液，并把细菌充分重悬；重悬后的细菌37℃振荡培养1.0h；分别取重组菌涂布于三块卡那霉素抗性平板，对照菌体涂布一块平板，过夜培养。
2.4 重组细菌的挑选和质粒提取 经过至少24h培养，挑取卡那霉素抗性平板上的最小菌落接种于3.0ml含卡那霉素的LB培养基中，过夜培养；提取质粒，溶于20μl无菌双蒸水中，然后进行0.8％(g/ml)的琼脂糖凝胶电泳；可疑重组质粒转化DH5α感受态细菌，涂布卡那霉素平板；挑选菌落，提取质粒，进行0.8％(g/ml)的琼脂糖凝胶电泳。
2.5 重组质粒的鉴定2.5.1 重组质粒的PCR 25.0μl的反应总体积，以提取的质粒作为模板。重组质粒0.25μl，AdGP5. 10.5μl，AdGP5.20.5μl，2.5mM dNTPs 2.0μl，25mM Mg++1.0μl，10×Mg++freebuffer 2.5μl，rTaq酶0.25μl，加水至终体积25.0μl。PCR循环参数同GP5基因片段的扩增参数。
2.5.2 重组质粒的单酶切 10×NE Bufferl 2.0μl，100×BSA 0.2μl，PacI 0.2μl，重组质粒10.0μl，用无菌双蒸水补至总体积20.0μl，37℃酶切10.0h，然后进行0.8％(g/ml)的琼脂糖凝胶电泳。
2.6 重组质粒的纯化 鉴定好的重组质粒pAdEasy-1-GP5转化DH5α后涂布于卡那霉素抗性平板；挑取卡那霉素平板上的菌落接种于3.0ml含50μg/ml卡那霉素的LB培养基中，振荡过夜培养；把过夜培养物按2％的体积接种于5.0ml的LB培养基中，振荡培养，使OD600≌1.0-1.5；把5.0ml的培养物全部沉淀在1.5ml的灭菌离心管中，完全弃去上清。质粒纯化方法按Qiagen公司质粒纯化试剂盒说明书进行。
2.7 pAdEasy-1-GP5重组质粒的线性化 10×NE bufferl 20.0μl，100×BSA 2.0μl，PacI 1.0μl，重组质粒150.0μl，然后用双蒸水补加至总体积200.0μl。在37℃作用12.0h，然后进行0.8％(g/ml)的琼脂糖凝胶电泳。酶切后的产物经酚氯仿抽提，乙醇沉淀，然后在无菌条件下用无菌双蒸水溶解，使质粒浓度达到0.1-1.0μg/μl。
2.8 HEK293-A细胞的复苏、培养与冻存 在37℃水浴中轻轻振荡融化一管细胞；用70％的酒精仔细洗涤外壁后放入超净工作台中；把细胞转入一个无菌的15ml的离心管中，加入10％血清的DMEM，600g离心5min，以沉淀细胞；弃去上清，用10.0ml的10％的新生牛血清的DMEM重悬细胞，然后加入100ml的细胞瓶中；37℃ 5％的二氧化碳温箱中培养。至形成单层，再用胰酶在室温下消化1-3min分离细胞；轻敲细胞瓶壁使细胞移动，用倒置显微镜来观察细胞是否变圆和分离；用新的营养液对细胞按需要分瓶。为了保存细胞亚型的特殊表型，建立细胞贮存库的细胞密度必须低于50％。把健康生长处于对数期的细胞完全消化下来；离心，沉淀细胞；用尽少量10％的血清的DMEM重悬细胞；用血细胞计数器进行记数；用5％血清的DMEM+10％DMSO+40％新生牛血清使每毫升细胞密度达到1×106个；在1.8ml的冻存管分装1.0ml的细胞；把冻存管放在泡沫盒内置低温冰箱24h；24h后迅速把低温冰箱的细胞转入液氮中。
2.9 pAdEasy-1-GP5重组质粒转染HEK-293A细胞转染在24孔板上进行，在转染的前一天，在24孔板上的每一孔接种5.0×104个HEK293-A细胞，每一孔用营养液1.0ml，营养液含10％的新生牛血清和1％的青霉素和链霉素；在转染的前一天，取出一管新订的TransFastTM Transfection Reagent(购自公司)使之达到室温，然后加入400.0μl的室温无核酸酶的纯水，涡漩10s重悬脂质体膜，贮存于-20℃；在转染前4h，把24孔板的营养液更换为新的营养液；取出-20℃保存的转染试剂，使之达到室温并涡漩，如果溶液在管的上部，可以通过离心把它沉到管底；在一个灭菌的玻璃瓶中先加入OPTI-MEM无血清培养基1979μl，线性化pAdEasy-1-GP515.0μl(约5μg)，然后加入6.0μl的TransFastTM Transfection reagent后立即涡漩；在室温温育混合物10-15min；从二氧化碳温箱中取出细胞板，弃去上清；再一次快速涡漩混合物，把2.0ml的混合物加入24孔板的12个孔中，振荡混匀，然后立即把细胞板放入二氧化碳温箱中；温育1.0h后，轻轻加入1.0ml室温的完全生长液，把细胞放入二氧化碳温箱，每天观察细胞病变。
2.10 重组病毒的噬斑纯化在6孔细胞板的每一个孔接种3.0×105个细胞，5％的二氧化碳温箱中静止培养；待细胞长成完全单层后，把重组病毒原液、1∶5倍稀释液按6孔板所加营养液量的1/5体积(600.0μl)接种病毒，37℃吸附1.5h；加入2.0ml 2％新生牛血清的DMEM 2.0h；完全弃去上清，用预热的无菌PBS洗涤两次；高压后的2％琼脂糖放在50℃水浴锅中，含2％青霉素、链霉素和4％血清的2×DMEM预热到37℃；在一无菌的100.0ml的玻璃瓶中加入10.0ml的2×DMEM和10.0ml的2％琼脂糖，充分混匀后置37℃水浴锅中；按6孔板的每一孔加3.0ml覆盖琼脂，铺板，观察噬斑；用灭菌枪头挑取包含噬斑的琼脂糖块放入无菌离心管中，加入200.0μl的无菌PBS，将琼脂块捣碎后反复冻融三次；12000rpm离心5min；收获的病毒接种于一新的24孔细胞板中。
2.11 重组病毒的TCID50的测定 按病毒学操作手册介绍之方法，用含2％血清、1％青霉素和链霉素的维持液将病毒作10倍梯度稀释。然后分别接种于长满HEK293-A细胞单层的96孔细胞培养板，每个稀释度接种8个孔，每孔接种100μl。同时设定两排孔用维持液做对照。37℃ 5％CO2温箱培养，逐日观察细胞病变。并按Reed-Muech法计算病毒TCID50。效价值为104.33TCID50/1.0ml。
2.12 RT-PCR检测重组腺病毒GP5基因的转录 取出同步接种重组腺病毒的HEK293-A和未接种重组腺病毒的HEK293-A细胞各一瓶，用TRIZOL试剂按产品的说明书提取总RNA，并按上述方法进行RT-PCR检测GP5蛋白mRNA。证明了重组腺病毒对PRRV GP5基因进行了成功的转录。
2.13 间接免疫荧光实验 在一96孔板上接种HEK293-A细胞；用维持液对重组腺病毒进行稀释，分别取10-2、10-3两个稀释度接种细胞，同时设定空白对照；在37℃ 5％的二氧化碳温箱中温育48-72h；弃去营养液，用PBS洗涤细胞，然后弃去PBS；加入150μl4℃的冷丙酮(80％丙酮，20％双蒸水)到96孔板的每一孔中，把细胞板放在4℃ 30min；弃去丙酮，在室温下干燥96孔板；稀释血清，单克隆抗体取1∶200、1∶300、1∶400三个稀释度，而用GP5的真核表达质粒免疫的小鼠的血清取1∶20、1∶40、1∶80三个稀释度，每一个稀释度接种两个孔；加入50μl的血清到每一孔中；盖好盖子后，在湿盒内37℃温育30min；移去稀释血清，在纸巾上倒置使细胞板变干，用200μl的PBS洗涤6次；加入50μl的1∶100稀释的荧光标记羊抗鼠IgG到每一个孔中，在湿盒内37℃温育30min；移去孔内液体，在纸巾上使细胞板干燥，用PBS洗涤4次；于荧光显微镜下观察。
结果(图9)表明B组接种了病毒，感染重组腺病毒的293细胞浆出现了明显的荧光，而对照组A未接种病毒，未感染重组腺病毒则看不到荧光。
2.14 重组腺病毒的小白鼠免疫试验取20只8周龄健康清洁级小白鼠随机分成四组，每组5只。一组设定为对照，其余3组分别采取口服、皮下和肌肉注射三种免疫方式。免疫剂量为104TCID50/0.2ml，免疫间隔时间2周，连续免疫四次后采集小白鼠血清做病毒中和试验。三种免疫方式的中和抗体效价差异不显著，中和抗体效价为1∶28。
2.15 重组腺病毒的稳定性试验把重组腺病毒rAd-GP5在293细胞上连续传代30代，每5代分别检测rAd-GP5中GP5蛋白的转录与表达，同时测定其组织细胞半数感染量。结果表明，GP5蛋白在重组腺病毒rAd-GP5连续传代过程中表达稳定，其组织细胞半数感染量也未发生变化。
综上所述，将纯化的重组腺病毒rAd-GP5在HEK293-A细胞上连续传代30次，每5代检查重组腺病毒对GP5蛋白基因的转录与表达情况，同时测定其TCID50。结果证明重组腺病毒对GP5蛋白基因表达稳定，而且组织细胞半数感染量稳定，接毒后细胞病变出现规律。种毒的毒价稳定在104.33TCID50/1.0ml。
用猪繁殖与呼吸综合征重组腺病毒制备疫苗，将纯化的重组腺病毒在HEK293-A细胞上连续传代30次，检测其猪繁殖与呼吸综合征GP5基因的转录与表达情况，证明PRRSVGP5蛋白表达稳定。重组腺病毒的毒价稳定在104.33TCID50/1.0ml。
在扩大培养过程中取用纯化保存的PRRSV重组腺病毒按104 TCID50接种长成单层的HEK293-A细胞。当细胞病变达70-90％时收毒，经反复冻融一次即可获得PRRSV重组腺病毒疫苗。
权利要求
1.猪繁殖与呼吸综合征重组腺病毒，其特征在于，重组腺病毒rAd-GP5在分类上属于腺病毒科(Adenoviridae)，哺乳动物腺病毒属(Mastadenovirus)，人腺病毒种(Humanadenovirus)，该重组腺病毒可以对目的蛋白进行有效的表达，用该重组腺病毒感染动物后不出现临床症状，因此可以用来表达抗原蛋白。该重组腺病毒已在中国科学院武汉病毒研究所进行保藏，保藏日期2003年8月15日，保藏号为IVCAS6.0200。
2.根据权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征重组腺病毒，是通过以下方法构建而成的(1)GP5基因的扩增、克隆根据PRRSV美洲标准毒株ATCC VR-2332的基因序列设计了一对针对PRRSV国内分离株S1毒株GP5基因的特异性引物，引物序列如下AdGP5.15-GCC GGT ACC ACC ATG TTG GAG AAA TGC TTG AC-3AdGP5.25-GCA CTC GAG CTA AGG ACG ACC CCA TTG TTC-3以S1毒株感染的Marc-145细胞的cDNA产物为模板，应用RT-PCR技术扩增出了PRRSV国内分离株S1毒株的GP5全基因，在引物的5’端分别含有限制性内切酶酶切位点。通过这两个酶切位点，把GP5基因克隆入穿梭载体pShuttle-CMV中，然后通过酶切和PCR鉴定，获得含有GP5基因的穿梭载体pShuttle-CMV-GP5；(2)含有GP5基因的穿梭载体pShuttle-CMV-GP5与腺病毒骨架载体pAdEasy-1同源重组鉴定好的含有GP5基因的穿梭载体pShuttle-CMV-GP5经酶切线性化后与腺病毒骨架载体pAdEasy-1通过电转化方法转化入大肠杆菌菌株BJ5183中，在大肠杆菌重组酶的作用下，在穿梭载体和骨架载体之间发生同源重组，实现了把外源基因转入腺病毒骨架载体，经50μg/ml卡那霉素筛选获得了含有外源基因的重组腺病毒质粒；(3)重组腺病毒的获得鉴定好的重组腺病毒质粒通过阳离子脂质体法转染HEK293-A细胞，重组腺病毒质粒在293细胞内包装成完整的重组腺病毒rAd-GP5。
3.用权利要求1或2所述的猪繁殖与呼吸综合征重组腺病毒rAd-GP5制备的疫苗。将纯化的重组腺病毒rAd-GP5在HEK293-A细胞上连续传代30次，每5代检查重组腺病毒对GP5蛋白基因的转录与表达情况，同时测定其TCID50。证明PRRSV GP5蛋白表达稳定，接毒后细胞病变出现规律，种毒的毒价稳定在104.33TCID50/1.0ml。在扩大病毒培养过程中取用低温保存的PRRSV重组腺病毒按104TCID50接种长成单层的HEK293-A细胞。当细胞病变达70-90％时收毒，经反复冻融一次即可获得PRRSV重组腺病毒rAd-GP5。
全文摘要
本发明猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)重组腺病毒和疫苗属于高新生物技术领域。通过RT－PCR技术扩增PRRSV GP5全基因序列，并把该基因序列克隆入腺病毒载体系统的穿梭载体pShuttle－CMV中，与腺病毒载体系统的骨架载体pAdEasy－1共转化大肠杆菌BJ5183菌株获得重组质粒，重组质粒转染HEK293－A细胞获得了重组腺病毒并成功的进行了噬斑纯化，通过RT－PCR和间接免疫荧光技术证明构建成功表达了PRRSV GP5蛋白的重组腺病毒rAd－GP5。在该重组毒中可以使PRRSV的GP5蛋白表达提前和表达量提高，能更有效的刺激机体的免疫保护反应。这种重组腺病毒疫苗具有亚单位疫苗的安全性和弱毒疫苗的抗原增殖能力，能够刺激机体全方位的免疫应答，从而具有广泛的开发和应用前景。
文档编号C12N15/861GK1554766SQ200310112770
公开日2004年12月15日 申请日期2003年12月26日 优先权日2003年12月26日
发明者姜平, 李玉峰, 姜 平 申请人:南京农业大学