专利名称：用于防治青枯病的假单胞菌的筛选方法
技术领域：
本发明涉及一种用于防治作物的青枯病的细菌的筛选方法。本发明是申请号为00119018.0、申请日为2000年10月11日、发明名称为“施氏假单胞菌Zh9944及其筛选方法和防治青枯病的微生物制剂”的发明专利申请的分案申请。
背景技术：
由青枯病假单胞菌引起的青枯病发病于烟草、番茄、花生、茄子、辣椒等等作物，迄今为止尚未发现有效的农药以及防治方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于防治青枯病的假单胞菌的筛选方法。
实现本发明目的技术方案是采用平皿相互拮抗筛选模型与定向筛选相结合的方法，具体步骤为①在青枯病发生地区的田块中采集作物发病株和健康株的根、茎和根围土；②从采集样品中分离菌株；③通过分离菌株间的平皿相互拮抗试验和分离菌株的致病性试验，区分出拮抗菌株和病原菌株两类；④以生物学参数拮抗率、反拮抗率分析拮抗菌、病原菌和其他类之间相互关系，选出在细菌分类上属假单胞杆菌或芽孢杆菌的拮抗菌株；⑤进行田间小区多点试验，以田间防效不小于60％为基准对选出的拮抗菌株进行挑选，所得到的菌株即为有效菌株，从而完成了防治青枯病的假单胞菌的筛选。
上述青枯病发生地区的田块为烟草或番茄青枯病发生地区的田块。
本发明具有积极的效果(1)由于因青枯假单胞菌引起的青枯病日趋严重(包括感病程度、作物和地区的上升和扩展)，迄今为止无任何农药可治。本发明所提供的方法可以对防治细菌性青枯病的细菌菌株进行有效的筛选。(2)本发明的一个应用例中，所筛选的防治青枯病的假单胞菌保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，并命名为PSZh9944。PSZh9944能在感病作物体内外拮抗青枯病原菌；该菌株具有在感病作物根际土壤中繁殖的能力，并向作物根部聚集和进入根组织内部，向上转移至茎。并且定植于根和茎的韧皮部薄壁细胞间，构成所谓“拮抗防线”，并与感病作物形成互生关系；PSZh9944对青枯假单胞菌拮抗能力的大小与向田间接种PSZh9944的菌量成对应关系。以PSZh9944为主要成分制造出微生物农药，是一种高效、无毒、安全、无残留的新型微生物农药；这种农药对因青枯假单胞菌引起的烟草、番茄、花生、茄子、辣椒等植物的青枯病有很强的抑制作用，田间防效达60～80％左右，而且还可使受施作物具有对青枯病害的预防作用，并能刺激作物生长。
具体实施例方式
(实施例1)采用平皿相互拮抗筛选模型与定向筛选相结合的方法，具体步骤为①于1999年3月自我国江苏省常州市郊区的番茄青枯病发生地区的田块中采集发病株和健康株的根、茎和根围土；②从采集样品中分离菌株；③通过分离菌株间的平皿相互拮抗试验和分离菌株的致病性试验，区分出拮抗菌株和病原菌株两类；④以拮抗率、反拮抗率等生物学参数分析拮抗菌、病原菌和其他类之间相互关系，选出在细菌分类上属假单胞杆菌(Pseudomonas spp.)或芽孢杆菌(Bacills spp.)的拮抗菌株；⑤进行田间小区多点试验，以田间防效不小于60％为基准对选出的拮抗菌株进行挑选，所得到的菌株即为有效菌株，从而完成了防治青枯病的假单胞菌的筛选，所筛选的防治青枯病的假单胞菌于2000年9月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，保藏编号为NO.0494，名称为施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)Zh9944(简称为PSZh9944菌株)。
(应用例)以葡萄糖1.5％、淀粉2.0％、酵母粉1.5％、蛋白胨0.4％，MgSO4为0.05％，KH2PO4为0.05％，CaCO3为0.6％的比例制成培养基，灭菌前pH值为7.2～7.4，在250毫升三角瓶放置70毫升培养基，将实施例1所得的PSZh9944接种于该培养基中。在30℃、220r.p.m下振荡培养48小时作为种子液，取1000ml种子液于1吨发醇罐中，内盛600升的上述相同比例的培养基。在30℃，向发酵罐通风、搅拌培养20～24小时。培养终止后，及时将培养液与粒度为过40目筛的砻糠以1∶1～1∶3的比例混合，通风干燥至物料含水量为8～15％，活菌量达1000～6000亿CFU/g，色泽为土黄色至褐色。
根据细菌性青枯病的发病原理，对于此类病害的控制，能被普遍接受的方法只能用以生物防治为主的预防方法，以此达到阻止青枯病菌侵入植物根内潜伏和发展成为病害。因此，使用本发明的生物制剂的时机应在播种、假植、定植和定植后的20～60天，总共4～5次，总用量为2～2.5kg(3000亿CFU/g)，在使用时以水为“溶剂”、使菌体释放出来，防效可达60～80％。具体的应用情况见表1和表2。
表1
表2
权利要求
1.一种用于防治青枯病的假单胞菌的筛选方法，其所采用的是平皿相互拮抗筛选模型与定向筛选相结合的方法，具体步骤为①在烟草、番茄青枯病发生地区的田块中采集发病株和健康株的根、茎和根围土；②从采集样品中分离菌株；③通过分离菌株间的平皿相互拮抗试验和分离菌株的致病性试验，区分出拮抗菌株和病原菌株两类；④以生物学参数拮抗率、反拮抗率分析拮抗菌、病原菌和其他类之间相互关系，选出在细菌分类上属假单胞杆菌或芽胞杆菌的拮抗菌株；⑤进行田间小区多点试验，以田间防效不小于60％为基准对选出的拮抗菌株进行挑选，所得到的菌株即为有效菌株，从而完成了防治青枯病的假单胞菌的筛选。
2.根据权利要求1所述的用于防治青枯病的假单胞菌的筛选方法，其特征在于步骤①中的青枯病发生地区的田块为烟草或番茄青枯病发生地区的田块。
全文摘要
本发明属于细菌的筛选方法。其步骤为①在青枯病发生的田块中采集发病株和健康株的根、茎和根围土；②从中分离菌株；③通过分离菌株间的平皿相互拮抗试验和分离菌株的致病性试验区分出拮抗菌株和病原菌株；④以拮抗率、反拮抗率分析拮抗菌、病原菌和其他类之间相互关系，选出属假单胞杆菌或芽孢杆菌的拮抗菌株；⑤以田间防效不小于60％为基准对选出的拮抗菌株进行挑选，所得到的菌株即为有效菌株。以通过本发明的方法筛选出的防治青枯病的假单胞菌为主要成分的微生物制剂，是一种高效、无毒、安全、无残留的新型微生物农药。对因青枯假单胞菌引起的烟草、番茄、花生、茄子、辣椒等植物的青枯病有很强的抑制作用，田间防效达60～80％左右。
文档编号C12N1/04GK1515666SQ20031012446
公开日2004年7月28日 申请日期2000年10月11日 优先权日2000年10月11日
发明者杨仲华, 张春明, 任炽麓, 安凤霞, 任敏, 张逸庆, 张华泉 申请人:常州兰陵制药有限公司, 张春明