预测药物治疗副效应水肿的方法

专利名称：预测药物治疗副效应水肿的方法
技术领域：
本发明涉及预测用药物(包括但不限于酪氨酸激酶抑制剂(TKI)药物)治疗的患者中水肿发生可能性的方法。具体地，本发明涉及几种形式的基因组分析用于预测药物治疗患者中做为副效应发生水肿的用途，所述药物包括TKI药物，诸如伊马替尼(Imatinib)，特别地是其甲磺酸盐(GLEEVECTM/GLIVEC；也称为STI571，Novartis Pharmaceuticals，East Hanover，NJ，USA)。此类基因组分析包括基因表达谱法和检测单核苷酸多态性(SNP)。
背景技术：
水肿被定义为胞外液体积的血管外或间质部分的增加。水肿可以出现许多形式，因此液体可以积累在腹膜腔或胸膜腔，或者可以泛化为全身性水肿。水肿的位置和分布由其病因学和机理决定。常常通过面部肿胀(这在眶周区最明显)和按压后持久的皮肤压痕(也称为压凹形式)识别水肿。
一般地，血浆体积和间质体积构成容纳了总身体水分三分之一的“细胞外间隙”。调节液体在细胞外区室的这两个部分之间的布署的力称为斯塔林(Starling)力。通常，血管系统中的静水压和间质液中的胶体膨胀压倾向于促使液体从血管向血管外空间移动。相反地，血浆蛋白质所造成的胶体膨胀压和称为组织张力的间质液中的静水压促进液体向血管区室中移动。由这种力导致持续存在液体和可扩散溶质的交换。水肿可以由这些力的任何失调，诸如毛细管压力或渗透性的增加引起。
这里特别关注的是由于药物治疗施用引起的做为副效应的各种形式的水肿。一般不知道这些药物在患者中造成水肿的机理。尽管对大多数药物应答产生的水肿是相当轻微的，诸如几乎注意不到的眶周水肿，但是药物也可能造成危害生命的水肿，诸如肺水肿或脑水肿。
伊马替尼是几种蛋白质的酪氨酸激酶活性的抑制剂，这些蛋白质在几种类型癌症的发展中构起成因或是起着非常重要的作用，然而，在一些情况下，伊马替尼的应用可以引起水肿发生。参见Druker等，Nature Med.，2卷，561-566页(1996)。
白血病的背景各种形式的白血病包括具有相似的潜在病理学的各种相关障碍。基本病理学是正常血细胞生成的调节障碍。这个过程需要严密地调节可以形成成熟外周血细胞的多能造血干细胞的增殖和分化。在所有类型白血病中，在造血进程中的某处发生了一个或多个恶性事件，并且由此通过不同机制导致产生不能正常地分化而是以不受控制的方式持续增殖的后代。根据白血病所影响的细胞系和进展的速率，白血病分成急性和慢性类型，并分成髓性和淋巴细胞性类型。
慢性髓性白血病(CML)也称为慢性骨髓性白血病，慢性髓细胞白血病或慢性粒细胞白血病。CML是以粒细胞，特别是嗜中性系列和偶尔地单核细胞系列粒细胞的过量产生为特征的疾病，这引起显著的脾肿大和非常高的白细胞计数。常见嗜碱粒细胞增多症和血小板增多症。在95％以上的病例中，在骨髓细胞中存在特征性的细胞遗传异常，费城(Ph′)染色体。这种改变的染色体的存在不仅是理解这种类型白血病的分子病理的关键也是评估患者临床改进的主要指标。参见Sawyer，N.Engl.J.MED.，340卷，1330-1340页(1999)。
CML中最显著的病理学特征是在90％以上患有典型CML的患者的骨髓细胞中存在Ph′染色体。Ph′染色体由染色体9和22长臂之间的物质平衡易位引起。因为从染色体22失去的染色体物质比从染色体9获得的染色体物质要多，所以Ph′染色体是缩短的染色体22，含有其正常互补DNA的大约60％。在染色体9长臂q34带位置出现的断裂允许细胞癌基因C-ABL易位到染色体22上称为断裂点丛集区(BCR)的位置。尽管每个患者的BCR中的此断裂点可各不相同，但是在任何一个患者的所有细胞中，该断裂点是相同的。C-ABL是引起小鼠白血病的Abelson病毒V-ABL的同系物。这两个遗传序列的并置将产生新的杂合基因(BCR/ABL)，其编码210,000kd分子量的新蛋白质(P210)。P210蛋白质，一种酪氨酸激酶，可能在触发CML细胞的无控制增殖中起作用。Ph′染色体出现在红细胞、骨髓细胞、单核细胞和巨核细胞中，不常见地出现在B淋巴细胞中，很少地出现在T淋巴细胞中，不出现在骨髓成纤维细胞中。
过去，CML的预后很差，在Ph阳性(Ph+)CML中平均存活是3-4年。用干扰素和侵入性化疗或同种异体骨髓移植进行治疗已经在一定程度上改进了这种情况，但是CML患者治疗的最大改进是伊马替尼的引入。参见Druker等，N.Engl.J.Med.，344卷，1031-1037页(2001)；和Druker等，N.Engl.J.Med.，344卷，1038-1056页(2001)；也参见Cecil Textbook ofMedicine，第21版，Goldman和Bennett编辑，W.B.Saunders，176章(2000)。
在CML中，由表征CML细胞的+(9；22)相互易位造成染色体9和22被截短，产生了两个融合基因衍生的22q染色体上的BCR-ABL，9q+染色体上的Ph′染色体和ABL-BCR。BCR-ABL基因编码210kd蛋白质，该蛋白质具有去调节的酪氨酸激酶活性。该蛋白质在CML中起致病作用。参见Daley等，Science，247卷，824-830页(1990)。伊马替尼特异性地抑制该蛋白质和其它酪氨酸激酶的活性。在治疗患有CML的患者和治疗具有Ph′染色体的CML或ALL(急性淋巴性白血病)急变期(blast crisis)的患者方面，伊马替尼已经显示了明显的效力。参见Druker(2001)，上文。
此外，伊马替尼抑制另一种酪氨酸激酶——生长因子受体末端，即c-Kit——的能力，也使得伊马替尼成为完全不相关癌症形式，胃肠基质肿瘤的有效治疗方法。参见Brief Report，Joensuu等，N.Engl.J.Med.，344卷，14期，1052-1056页，(2001)。
在患有以不受控制的酪氨酸激酶活性为特征的各种障碍的患者中，伊马替尼已经显示了高度有效性。这包括Ph+白血病。在一个伊马替尼对CML治疗效果的研究中，用300mg或更多伊马替尼治疗的54例患者中，53例具有完全的血液学应答，并且在29例中出现了细胞形成应答，其中包括17例患者(接受该剂量的54例患者中的31％)具有主要应答，即Ph′染色体阳性的分裂中期细胞为0-35％；这些患者中的7例患者具有完全的细胞遗传学消退。参见Druker等.(2001)，上文。
伊马替尼被开发为BCR-ABL酪氨酸激酶的特异性抑制剂，并且已经证明其在CML患者治疗中的高效性。尽管一般具有良好的耐受性，但是已经将水肿列为伊马替尼治疗最常出现的副效应之一。参见Kantarjian等，N.Engl.J.Med.，346卷，645-652页，(2002)；Druker等.(2001)，上文；Cohen等，Clin.Cancer Res.，8卷，935-942页(2002)；和Ebnether等，Lancet，359卷，1751-1752页，(2002)。
慢性期CML患者的临床试验报道表明，水肿/体液滞留是与伊马替尼治疗有关的最常见不利事件之一，出现在39-62％(所有级别)患者中。参见Kantarjian等.(2002)，上引文；Druker等.(2001)，上引文；和Cohen等.(2002)，上引文。这些病例的大多数具有轻度到中度严重性，并且主要是表面的，例如眶周水肿和下肢外周水肿。然而，在1-2％的患者中，观察到了更严重形式的体液滞留，包括肺水肿、胸腔和心包积液。参见，Cohen等.(2002)，上引文。而且，在用伊马替尼治疗的CML患者中，最近有2例脑水肿的报道，其中一例是致命的。参见，Ebnether等.(2002)，上引文。
然而，大多数报道的水肿病例具有轻度到中度严重性，主要为眶周水肿和下肢外周水肿。参见Cohen等.(2002)，上文。如上所述，在用伊马替尼治疗的CML患者中已经存在稀发的更严重形式的水肿，包括2例最近报道的脑水肿。参见，Ebnether等.(2002)，上文。出现这种更严重水肿情况的潜在性使得开发用于预测如下可能性的方法至关重要，所述可能性是指需要用TKI治疗的患者将发生水肿——作为该治疗的副效应——的可能性。在本发明前，没有预测这类重要药物的这种潜在严重副效应的方法。
发明概述本发明通过提供多种方法和试剂盒解决了上述问题，通过这些方法和试剂盒可以预测给定患者将发生作为药物治疗的副效应的水肿的可能性，所述药物包括但不限于TKI药物，所述TKI药物包括但不限于伊马替尼或GLEEVECTM/GLIVEC。这些方法和试剂盒依赖于几种基因的SNP分析和基因表达谱分析。
因此，本发明的一方面是预测在用包括但不限于TKI药物治疗时哪些患者将更有可能发生水肿的方法，该方法包括a)在生物样品中检测表2中所示13种报道基因/预测者基因中的多种基因的RNA表达水平；b)比较患者基因表达谱和表3中所示平均无水肿表达谱；c)由(b)中的比较来确定两种基因表达谱之间的相似性；d)通过(c)中确定的相似性程度，确定当用药物治疗时患者将发生水肿的可能性。在更优选的实施方式中，所述方法需要利用上述方法，其中(c)中所确定的相似性是通过比较所述两个基因表达谱获得的数学相关系数。在本发明最优选的实施方式中，(c)中所确定的相关系数是皮尔逊相关系数(PCC)。
在其它优选的实施方式中，本发明提供了预测用药物(包括但不限于TKI药物)治疗时哪些患者更可能发生水肿的方法，该方法包括a)在生物样品中检测表2中所示13种报道基因/预测者基因中的多种基因的RNA表达水平；b)比较患者基因表达谱和表3中所示平均无水肿表达谱；c)由(b)中的比较确定两种基因表达谱之间的皮尔逊相关系数(PCC)；d)如果PCC＜0.37，确定当用药物治疗时患者发生水肿的可能性比不发生水肿的可能性大；和e)如果PCC≥0.37，确定患者不发生水肿的可能性比发生水肿的可能性大。
在另一个实施方式中，当有必要高灵敏性地预测用药物(包括但不限于TKI药物)治疗时哪些患者将更可能发生水肿，从而使得不超过15％的水肿病例将被错分类为无水肿时，本发明提供了一种方法，该方法包括a)在生物样品中检测表2所示13种报道基因/预测者基因中的多种基因的RNA表达水平；b)比较患者基因表达谱和表3中所示平均无水肿表达谱；c)由(b)中的比较确定两种基因表达谱之间的皮尔逊相关系数(PCC)；d)如果PCC是负的并且＜0.78，则确定当用药物治疗时患者发生水肿的可能性比不发生水肿的可能性大；和e)如果负PCC≥0.78，则确定患者不发生水肿的可能性比发生水肿的可能性大。
在本发明优选的实施方式中，生物样品包括血液或组织样品。适合的血液或组织样品包括全血、血清、精液、唾液、眼泪、尿液、粪便物质、汗液、口腔涂片、皮肤和特定器官组织，诸如肌肉或神经组织的活检物及毛发。
根据其它实施方式，本发明提供了方法，其中检测13种报道基因/预测者基因中的7或8种，更优选地9或10种，最优选地11或12种基因的RNA表达水平。本发明的其它实施方式提供了方法，其中检测表2中所有13种报道基因/预测者基因的RNA水平。
在另一方面，本发明提供了预测用药物(包括但不限于TKI药物)治疗时哪些女性患者将更可能发生水肿的方法，该方法包括a)针对患者中存在的双拷贝IL-1β基因，检测在转录起始位点上游-511碱基对位置的多态性位点(在序列x04500的位置1423)的核苷酸对身份；b)如果在该位点的两个核苷酸对都是GC，确定患者将可能发生水肿；和c)如果在该位点的至少一个核苷酸对是AT，确定患者将不可能发生水肿。
在另一方面，本发明提供了预测用药物(包括但不限于TKI药物)治疗时哪些女性患者将更可能发生水肿的方法，该方法包括a)针对患者中存在的双拷贝IL-1β基因，检测在转录起始位点上游-31碱基对位置的多态性位点(在序列X04500的位置1903)的核苷酸对身份；b)如果在该位点的两个核苷酸对都是AT，确定患者将可能发生水肿；和c)如果在该位点的至少一个核苷酸对是GC，确定患者将不可能发生水肿。
本发明的其它方面提供了预测用药物治疗时哪些女性患者更可能发生水肿的方法，该方法包括步骤a)检测生物样品中IL-1β基因的转录水平和/或该IL-1β基因表达的蛋白质水平；和b)如果该水平高于阈值水平，确定用药物治疗时患者可能发生水肿。
此外，本发明提供了上述方法，其中所述药物是TKI伊马替尼或GLEEVECTM/GLIVEC。
而且，本发明提供了预测用药物治疗时哪些患者将更可能发生水肿的方法，该方法包括a)针对表2所示13种预测者基因中的2种或多种的蛋白产物，检测生物样品中的蛋白质表达模式；b)将该蛋白质表达模式与针对表3中所示水肿和无水肿表达谱预期的模式进行比较；c)确定如果该模式与无水肿模式更相似，则用药物治疗时患者不可能发生水肿；和d)确定如果该模式与水肿模式更相似，则用药物治疗时患者可能发生水肿。在该方法中，所述药物可以是任何TKI，包括但不限于伊马替尼或GLEEVECTM/GLIVEC。
在本发明方法的其它优选实施方式中，生物样品包括从患者抽取的血液。做为可替代的方案，在从患者可获得的其它生物样品诸如血清或组织样品，包括精液、唾液、眼泪、尿液、粪便物质、汗液、口腔涂片、皮肤和特定器官组织诸如肌肉或神经组织的活检物及毛发中检测转录水平或蛋白质表达水平。
本发明的其它实施方式提供了方法，其中检测表2所示13种预测者基因中的多种基因的蛋白质表达。优选地，检测13种预测者基因中的7或8种，更优选地9或10种，并且最优选地11或12种基因的蛋白质表达。在另一个最优选的实施方式中提供了方法，其中检测表2中所示所有13种预测者基因的蛋白质表达。
在本发明其它优选方面提供了设计用于药物检测的临床试验的方法，该方法包括a)通过利用上述表达谱或基因型分析方法，确定特定患者暴露于试验药物后发生水肿的可能性；和b)根据(a)中的确定结果，在临床研究中将该患者归到适当的类别中。
此外，本发明提供了用药物治疗患者的方法，该方法包括a)通过利用上述表达谱或基因型分析方法，确定特定患者暴露于预期使用的药物时发生水肿的可能性；和b)根据(a)中的确定结果，以安全和适当的方式修改预期用于该患者的药物疗法。
在一些优选的实施方式中，本发明提供了治疗患有水肿或具有患水肿风险的个体的方法，该方法包括给个体施用治疗有效量的分离的核酸分子，该核酸分子包含衍生自IL-1β基因的反义核苷酸序列，该反义核苷酸序列能够改变IL-1β基因的转录/翻译。
在另一些优选的实施方式中，本发明提供了治疗患有水肿或具有患水肿风险的个体的方法，该方法包括给个体施用治疗有效量的拮抗剂，该拮抗剂抑制/激活IL-1β基因编码的蛋白质。在利用该方法时，该拮抗剂可以是对所述蛋白质特异的任何抗体、抗体衍生物或抗体片段，包括但不限于单克隆抗体和/或缀合有毒性试剂的单克隆抗体。
在一些其它优选的实施方式中，本发明提供了治疗患有水肿或具有患水肿风险的个体的方法，该方法包括给个体施用治疗有效量的编码核酶的核苷酸序列，该核酶能够改变IL-1β基因的转录/翻译。
在一些优选的实施方式中，本发明提供了治疗患有水肿或具有患水肿风险的个体的方法，该方法包括给个体施用治疗有效量的对应于IL-1β基因的双链RNA，该双链RNA有能力改变IL-1β基因的转录/翻译。
在最优选的实施方式中，本发明提供了上述方法，其中减少IL-1β基因的转录/翻译。在其它最优选的实施方式中，增加IL-1β基因的转录/翻译。
本发明的另一方面提供了试剂盒，该试剂盒用于预测用药物治疗时哪些患者更可能发生水肿，该试剂盒包括用于检测对应于表2所示13种预测者基因中的2种或多种基因的蛋白质表达模式的手段。根据本发明优选的实施方式，所述手段能检测对应于13种预测者基因中的多种基因的蛋白质表达模式。优选地，检测13种预测者基因中的7或8种，更优选地9或10种，最优选地11或12种基因的蛋白质表达。在另一个最优选的实施方式中提供了试剂盒，其中所述手段能检测表2中所示所有13种预测者基因的蛋白质表达。
本发明的另一方面提供了试剂盒，该试剂盒用于预测用药物治疗时哪些患者更可能发生水肿，该试剂盒包括用于检测IL-1β基因表达的蛋白质水平的手段。
在本发明优选的实施方式中，用于检测蛋白质表达模式的手段包括抗体、抗体衍生物或抗体片段。检测蛋白质表达的适宜方法包括利用标记抗体的Western印迹。
本发明最优选的实施方式提供了试剂盒，该试剂盒用于预测用药物治疗时哪些患者更可能发生水肿，该试剂盒包括(a)用于检测对应于表2所示13种预测者基因中2种或多种基因的蛋白质表达模式的手段；(b)适于容纳所述手段和含有所述蛋白质的患者生物样品的容器，其中该手段可以与所述蛋白质形成复合物；(c)检测(b)的复合物的手段；和可选地(d)使用和解释试剂盒结果的说明书。
在本发明其它实施方式中提供了用于检测表2中所示13种预测者基因的蛋白质表达模式的试剂盒，该试剂盒包括a)包含或含有检测该蛋白质表达模式所需的所有试剂的容器；和b)描述如何操作和解释该分析的标签。
本发明另一方面提供了试剂盒，该试剂盒用于预测用药物治疗时哪些患者更可能发生水肿，该试剂盒包括(a)用于检测IL-1β基因表达的蛋白质的水平的手段；(b)适于容纳所述手段和含有所述蛋白质的患者生物样品的容器，其中该手段可以与所述蛋白质形成复合物；(c)检测(b)的复合物的手段；和可选地(d)使用和解释试剂盒结果的说明书。
在本发明优选的实施方式中，在血液或血清中检测IL-1β基因表达的蛋白质的水平。
本发明的另一方面提供了试剂盒，该试剂盒用于预测用药物治疗时哪些患者更可能发生水肿，该试剂盒包括用于检测表2所示13种预测者基因中2种或多种基因的转录水平的手段。根据本发明优选的实施方式，该手段能检测13种预测者基因中多种基因的转录水平。优选地，检测13种预测者基因中7或8种，更优选地9或10种，并且最优选地11或12种基因的转录水平。在另一个最优选的实施方式中提供了试剂盒，其中所述手段能检测表2中所示所有13种预测者基因的转录水平。
本发明另一方面提供了试剂盒，该试剂盒用于预测用药物治疗时哪些患者更可能发生水肿，该试剂盒包括用于检测IL-1β基因转录水平的手段。
在本发明优选的实施方式中，用于检测转录水平的手段包括能结合上述基因的转录产物的寡核苷酸或多核苷酸；最优选地，寡核苷酸或多核苷酸能结合对应于预测者基因或IL-1β基因的mRNA或cDNA。检测转录水平的适宜方法包括Northern印迹分析、逆转录酶PCR、实时PCR、RNAase保护和微阵列。
在本发明另一个优选的实施方式中，上述试剂盒进一步包含获得患者生物样品的手段。优选地，取自患者的生物样品包括血液或组织样品。适宜的血液或组织样品包括全血、血清、精液、唾液、眼泪、尿液、粪便物质、汗液、口腔涂片、皮肤和特定器官组织，诸如肌肉或神经组织的活检物及毛发。在优选的实施方式中，试剂盒还包括容器，该容器适于容纳用于检测蛋白质的手段或用于检测转录水平的手段和患者的生物样品，并且可选地该试剂盒还包括使用和解释试剂盒结果的说明书。
本发明另一个最优选的实施方式提供了试剂盒，该试剂盒用于预测用药物治疗时哪些患者更可能发生水肿，该试剂盒包括(a)能结合表2所示13种预测者基因中2种或多种基因的转录产物的多种寡核苷酸或多核苷酸；(b)适于容纳该寡核苷酸或多核苷酸及包含该转录产物的患者生物样品的容器，其中该寡核苷酸或多核苷酸可以结合该转录产物；(c)检测(b)的结合的手段；和可选地(d)使用和解释试剂盒结果的说明书。
在可替代的实施方式中，本发明提供了用于检测表2中所示13种预测者基因的表达模式的试剂盒，该试剂盒包括a)包含或含有必需的基因芯片及显影该芯片所需的试剂的容器；和b)制备、读取和解释所得到的基因表达模式的说明书。
本发明另一个实施方式提供了试剂盒，该试剂盒用于预测用药物治疗时哪些患者更可能发生水肿，该试剂盒包括a)能结合IL-1β基因的转录产物的寡核苷酸或多核苷酸；b)适于容纳该寡核苷酸或多核苷酸和包含该转录产物的患者生物样品的容器，其中该寡核苷酸或多核苷酸可以结合该转录产物；(c)检测(b)的结合的手段；和可选地(d)使用和解释试剂盒结果的说明书。
优选地，根据上述方面或本发明实施方式的药物可以是任何TKI，包括但不限于伊马替尼或GLEEVECTM/GLIVEC。
此外，本发明提供了用于鉴定患者IL-1β基因多态性模式的试剂盒，所示试剂盒包含用于检测序列x04500位置1423和/或序列X04500位置1903中IL-1β基因遗传多态性模式的手段。该试剂盒还可以包含用于获得患者生物样品的手段，所述患者生物样品包括血液或组织样品诸如全血、血清、精液、唾液、眼泪、尿液、粪便物质、汗液、口腔涂片、皮肤和特定器官组织，诸如肌肉或神经组织的活检物及毛发。优选地，这种手段包括DNA样品收集手段。
根据本发明优选的实施方式，用于检测特定多态性位点的遗传多态性模式的手段包括至少一种基因特异性基因分型寡核苷酸。最优选地，该试剂盒包含两种基因特异性基因分型寡核苷酸。做为可替代的方案，该试剂盒包含4种基因特异性基因分型寡核苷酸。在甚至更优选的实施方式中，该试剂盒包含至少一种基因特异性基因分型引物组合物，该引物组合物包含至少一种基因特异性基因分型寡核苷酸。优选地，这种基因特异性基因分型引物组合物包含至少两套等位基因特异性引物对，可选地在分开的容器中包装各套等位基因特异性引物对。
此外，本发明提供了用于检测患者双拷贝IL-1β基因中的如下核苷酸对的身份的试剂盒，该核苷酸对位于转录起始位点上游IL-1β基因的-511位置(序列X04500的位置1423)，该试剂盒包括a)包含或含有至少一种如下试剂的容器，该试剂特异检测患者中双拷贝IL-1β基因在转录起始位点上游IL-1β基因的-511位置(序列X04500的位置1423)的核苷酸对的性质；和b)用于根据所述核苷酸对的性质解释结果的说明书。
此外，本发明提供了用于检测位于转录起始位点上游-31碱基对位置的(序列X04500的位置1903)多态性位点中核苷酸对身份性的试剂盒，该试剂盒包含a)包含或含有至少一种如下试剂的容器，该试剂特异检测位于转录起始位点上游-31碱基对位置(序列X04500的位置1903)的多态性位点中核苷酸对的性质；和b)用于根据所述核苷酸对的性质解释结果的说明书。
而且，本发明的其它实施方式涉及在本发明所提供的方法的检测步骤(a)中使用上述任何一种试剂盒，其中本发明提供的方法包括预测用药物(诸如TKI，包括但不限于伊马替尼或GLEEVECTM/GLIVEC)治疗时哪些患者，包括哪些女性患者，更可能发生水肿的方法。


图1针对88个样品的“预测者”组用于预测水肿的最佳13种基因的聚类分析。阴影的程度表示表达的相对水平，最黑的阴影表示低表达，并且中度黑的阴影表示高表达。根据基因表达和平均无水肿表达谱的相关性安排样品，并且利用GENSPRING中皮尔逊相似性方法进行基因聚类。在中间图面上绘制每个样品的PCCs，最高相关性位于顶部。右侧图面表示实际水肿状态，实心(黑色)表示水肿，白色表示无水肿的患者。线条表示对于最佳准确度(0.37；实线)和最佳灵敏度(0.78；虚线)而言的阈值。
图2针对用于验证水肿预测者基因的17个样品的“试验”组的聚类分析。阴影的程度表示表达的相对水平，最黑的阴影表示低表达，并且中度黑的阴影表示高表达。根据基因表达和(从88个样品的“预测者”组计算的)平均无水肿表达谱的相关性安排样品，并且利用GENESPRING中皮尔逊相似性方法进行基因聚类。在中间图面上绘制每个样品的PCCs，顶部具有最高相关性。右侧图面表示实际水肿状态，实心(黑色)表示水肿，白色表示无水肿的患者。虚线表示利用88个样品的“预测者”组测定的最佳灵敏度时的阈值(0.78)。
图3IL-1β基因型与水肿和血管性水肿的相关性。CC基因型指在IL-1β基因的两个拷贝上在多态性位点-511(在序列X04500基因位置1423)存在GC碱基对。非CC基因型指在一个或两个拷贝上在IL-1β基因多态性位点-511(在序列x04500基因位置1423)存在AT碱基对，即，它指在转录起始位点上游-511碱基对位置的C→T碱基转换。
图4按性别分层的-511IL-1β多态性与水肿的相关性。
发明详述本发明提供了预测用药物治疗的患者中水肿副效应发生可能性的几种不同方法，该药物包括但不限于作为几种蛋白质的酪氨酸激酶活性抑制剂的药物，即，酪氨酸激酶抑制剂(TKI)药物，这类药物包括但不限于伊马替尼，甲磺酸伊马替尼或GLEEVECTM/GLIVEC；也称为STI571，Novartis Pharmaceuticals，East Hanover，NJ，USA。
在一个实施方式中，为了检测包含表2所示13种基因中多种基因的RNA表达谱，抽取需要用药物诸如TKI治疗的患者的血液。做为可替代的方案，可以在其它组织样品包括精液、唾液、眼泪、尿液、粪便物质、汗液、口腔涂片、皮肤和特定器官组织，诸如肌肉或神经组织的活检物及毛发中检测RNA表达水平。在一个实施方式中，测定的该组基因的RNA表达水平将与表3中所示相同的13种预测者基因的平均水肿表达水平或平均无水肿表达水平比较，并且确定相似性程度。
在优选的实施方式中，患者中测定的该组13种预测者基因的RNA表达水平将与表3中所示相同基因的平均无水肿表达水平比较，并且确定相似性程度。
通过产生如下结果的任何数学方法可以确定该相似性程度，所述结果的值是两组数值(即，从患者血液测量的13种预测者基因中多种基因的mRNA表达值和如图3中所示的平均无水肿表达值或平均水肿表达值)之间相似性的已知函数。
在优选的实施方式中，通过确定患者中测定的RNA表达水平和表3所示13种基因中多种基因的平均无水肿RNA表达水平之间的数学相关系数，包括但不限于皮尔逊相关系数(PCC)来确定相似性程度。
在最优选的实施方式中，相关系数是皮尔逊相关系数(PCC)，并且使用所有13种基因以获得最准确的比较。然后，这样测定的PCC值或任何其它相关系数或相似性指数可以用于预测之后用产生水肿的药物，包括但不限于TKI药物治疗患者时水肿发生的可能性，所述TKI药物包括但不限于伊马替尼，甲磺酸伊马替尼或GLEEVECTM/GLIVEC。
在优选的实施方式中，患者中测定的RNA表达谱和(来自于表3的)平均水肿或平均无水肿表达谱之间的相似性程度可以用于预测是否患者用TKI药物治疗时可能发生水肿。简单地说，如果在患者中针对表2所示13种基因中所有或大多数基因测定的RNA表达谱与没有发生水肿的个体的平均表达谱(平均无水肿表达谱)更相似，那么用TKI药物治疗时，该患者发生水肿的可能性小。如果在患者中针对表3所示13种基因中所有或大多数基因测定的RNA表达谱与TKI药物治疗时出现过任何类型水肿的个体的平均表达谱(平均水肿表达谱)更相似，那么用药物诸如TKI治疗时，该患者更可能发生水肿。
在优选的实施方式中，通过计算在患者中针对表2中13种基因测定的基因表达谱和无水肿患者的平均表达谱(表3)之间的PCC，确定相似性程度。
PCC值直接与这样的可能性相关，所述可能性指患者将与其所比较的表3表达谱出现相同的水肿副效应或无水肿的可能性。即，与平均无水肿表达谱比较，患者PCC越高，患者对TKI药物应答不发生水肿的可能性越高。另一方面，与平均水肿表达谱比较，患者PCC越高，用药物诸如TKI治疗时，患者发生水肿的可能性越高。
因此，在给定情况下，PCC值可以用于确定结果的可能性，即如果用药物，诸如TKI治疗患者时水肿发生或不发生的可能性，所述TKI药物包括但不限于伊马替尼或GLEEVECTM/GLIVEC。本领域技术人员将理解每个患者的临床情况将规定PCC值是作为截断值使用还是帮助做出针对特定患者的临床决定。例如，在一个实施方式中，可能期望最佳准确度地确定一组中发生和不发生水肿的患者的数目。这意味着最小化假阳性(错分类为水肿的无水肿患者)，并且同时最小化假阴性(错分类为无水肿的水肿患者)。
通过将PCC设定在0.37可以获得该准确度。为了使用该阈值，与平均无水肿表达谱比较，基因表达谱达到PCC≥0.37的患者被分类为无水肿组，而基因表达谱＜0.37的患者被分类为水肿组。
在另一优选的实施方式中，可以设定PCC以产生最佳灵敏度，即，为了达到最小可能数量的假阴性(错分类为无水肿的水肿患者)。在水肿发生对患者是严重或危急生命的事件的情况下，将需要这种最佳灵敏度。在该实施方式中，通过设定PCC到0.78确定阈值。在这种情况下，如果患者的表达谱与平均无水肿谱负相关且PCC＜0.78，则患者有7.2倍高的可能性发生水肿(95％置信区间(Cl)2.42-21.44)。如实施例中所示，本领域技术人员可以选择相似性程度或相关系数，包括但不限于PCC，以最大化灵敏度或最大化特异性，或者产生任何期望的假阳性或假阴性比率。本领域技术人员可以容易地据临床情况调整PCC的选择以给患者提供最大益处和安全性。
在另一个实施方式中，本发明提供了预测用药物，诸如TKI治疗时，哪些患者可能经历水肿的其它方法。这些方法包括抽取患者血液，并且测定IL-1β基因中某些多态性的存在或不存在。做为可替代的方案，可以从患者获得其它的组织样品，并且用于检测IL-1β基因多态性的存在或不存在。这种组织样品包括精液、唾液、眼泪、尿液、粪便物质、汗液、口腔涂片、皮肤和特定器官组织，诸如肌肉或神经组织的活检物及毛发。
特别地，用TKI药物治疗时，就IL-1β基因的-511多态性而言，具有CC基因型的女性患者比具有非CC基因型的女性有13.0倍高的可能性经历水肿(95％CI2.07-81.48)。在男性患者中，该多态性没有预测值。
因此，从将要接受药物诸如TKI的女性患者抽取血液，并且检测患者的两个IL-1β基因拷贝中IL-1β基因多态性位点-511 C→T(在序列X04500的1423位置)的核苷酸对身份。如果发现两个核苷酸对都是GC，那么预测用TKI药物治疗时，该女性将发生水肿。如果两个核苷酸对都是AT，或者一对是AT而另一对是GC，那么预测TKI治疗将不会引起水肿副效应。
在本发明另一个实施方式中，从将要接受药物诸如TKI的女性患者抽取血液，并且检测患者的双拷贝IL-1β基因中转录起始位点上游-31碱基对多态性位点(在序列X04500的1903位置)处的核苷酸对身份，如果在该位点的两个核苷酸对都是AT，则确定用药物治疗患者将可能发生水肿，如果在该位点的至少一个核苷酸对是GC，那么确定用药物治疗患者将不可能发生水肿。
在再一实施方式中，本发明提供了用于检测患者IL-1β基因中目的多态性位点(-511和-31位点)核苷酸对的试剂盒，该试剂盒包括a)包含或含有至少一种特异性检测IL-1β基因中所述多态性位点的核苷酸对性质的试剂的容器；和b)根据所述核苷酸对的性质，用于解释结果的说明书。
在另一实施方式中，本发明提供了用于检测表2所示13种预测者基因的表达模式的试剂盒，该试剂盒包括a)包含或含有必需的基因芯片及显影该芯片所需的试剂的容器；和b)用于制备，读取和解释所得到的基因表达模式的说明书。
实施例1方法RNA表达谱相关性方法从入选多国III期临床试验(IRIS干扰素α对伊马替尼的国际随机研究)的、新近被诊断为慢性期Ph+CML(CML-CP)的患者获得临床样品。在美国从来自多个中心的200名以上患者收集用于RNA提取的血液。这些患者中每位患者都签署了一份地方伦理委员会批准的书面药物遗传学知情同意表。在药物治疗前，于基线，从随机分到伊马替尼治疗组的患者收集了总共115份样品。这些样品中的10份样品由于患者从该研究中较早的撤出或因为非常差质量的加工RNA而被排除在分析之外。剩余的105份样品，88份样品用作“预测者”组以鉴定可以预测伊马替尼治疗后是否患者将发生水肿的基因，而17份样品用作“试验”组以验证预测者基因。
用伊马替尼治疗最少6个月后，评估不利事件的临床数据。如果患者经历了至少一次水肿的发生(不管级别)，就鉴定该患者患有水肿，其中水肿利用医学规范活动术语词典(Medical Dictionary for RegulatoryActivities Terminology)(MedDRA)中的高级别术语(High Level Term，HPL)分类。在该药物基因组学研究中评估的患者中，43％患者(105名患者中45名患者)被分类为在伊马替尼治疗后曾经经历至少一次水肿发作(水肿组)，这些病例的大多数是眶周水肿(31％)和外周水肿(19％)。除了单次出现的级别3眶周水肿(不归因于该研究药物)外，该研究中评估的所有患者水肿病例都是轻度到中度严重性的。水肿病例的细分类如下88份样品的“预测者”组有37例水肿和51例无水肿；17份样品的“试验”组有8例水肿和9例无水肿。
RNA表达谱利用高密度寡核苷酸微阵列(HG U95Av2，Affymetrix，Santa Clara，CA，USA)，从每份血液样品产生RNA表达数据，其中该微阵列代表12,000种以上已知的人类基因和已表达序列标志(ESTs)。利用来自于Affymetrix(Santa Clara，CA，USA)的方案，进行样品制备和微阵列的处理。简而言之，利用TRI REAGENTTMBD(Sigma，St.Louis，MO，USA)，从冷冻的全血提取总RNA，然后通过RNeasy小型旋转柱子(Qiagen，Valencia，CA，USA)纯化。从5-8μg纯化的总RNA开始，利用Superscript Choice系统(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA，USA)，从全长mRNA合成双链cDNA。然后，利用BIOARRAY高产率RNA转录标记试剂盒(ENZO Diagnostics，Farmingdale，NY，USA)体外转录cDNA以形成生物素标记的cRNA。将cRNA片段化，并且在45℃与微阵列杂交16小时。
根据标准的Affymetrix方案，利用Affymetrix射流工作站(fluidicsstation)洗阵列并且染色。利用Affymetrix GENEARRAY扫描仪扫描阵列，并且通过Affymetrix GENECHIP实验信息管理系统(LIMS)捕获数据(.DAT文件)。通过网络归档系统，LIMS数据库连接内部UNIX Sun Solaris服务器，该网络归档系统允许所有探针单元的平均强度(.CEL文件)被下载到内部Oracle数据库中。通过相对于150的值整体缩放，标准化每个微阵列的荧光强度以允许多个阵列之间的直接比较。
通过评估诸如背景、存在的基因的百分数、缩放因子及“持家”基因β-肌动蛋白和GAPDH的3’/5’比率，估测每个阵列的质量。对于该研究中所分析的样品，在这些质量控制参数上存在宽的范围。例如，对于这105份样品，平均的存在的基因的百分数范围是5-38％，平均值刚好是14％。这大约是从获自入选其它临床试验的非CML患者的全血所观察到的一半。这种差异可能由样品收集和处理中的问题所致，特别可能由用于本研究的血液样品被收集在不含有RNA稳定因子的EDTA管中这一事实造成，但是这种差异也可能反映了白血病患者血液中整体基因表达的基本差异。对于本实施例的目的，重要的是，注意到在水肿和无水肿组之间，或者在“预测者”组和“试验”组之间，样品质量不存在统计学上显著的差异(未示出数据)。
数据分析从88个样品的“预测者”组开始，将微阵列数据输入GENESPRING版本4.1.5软件中(Silicon Genetics，San Carlos，CA，USA)。过滤原始表达值，使得至少10％样品(88份中9份)具有100或高于背景的平均强度值。利用GENESPRING，Excel和SAS版本8.2(The SAS Institute，Cary，NC，USA)，进行另外的过滤步骤以鉴定最能区分水肿和无水肿组的一系列基因。用非参数单因素方差分析，总共88种基因符合2组之间至少1.7倍差异的标准(p＜0.05)。最后，在发现表达水平和性别的关联(只对无水肿组使用男性对女性的ANOVA)后，排除了这些基因中的4种基因。做这些研究是因为我们发现在本研究中水肿发生和患者的性别之间有显著相关性，伊马替尼治疗后女性发生水肿的可能性比男性高大约3倍(p＝0.022，Fisher确切检验)。
从这列84种潜在预测者基因，利用“留一法”(leave-one-outprocedure)确定最佳基因数目用做最后的预后组。参见van′t Veer，等，Nature，415卷，530-536页(2002)。通过表达值和预后种类(0＝无水肿；1＝水肿)之间的相关性(PCC绝对值)安排基因。从5种最高相关性基因开始，从分析中抽出一份样品，从剩余的87份样品计算每组(水肿和无水肿)的平均基因表达谱。通过比较留出的样品的表达谱的PCC与利用87份样品计算的平均水肿和无水肿谱确定该留出样品的预测结果。利用剩余的样品重复这种分析直到所有88份样品都被留出过一次。通过计算假阴性(水肿错分类为无水肿)和假阳性(无水肿错分类为水肿)的数目，确定正确预测和错误预测案例的数量。添加另外的预测者基因后重复整个“留一”法，从该列表顶部开始直到使用过所有84个基因。产生最少假阴性和假阳性的基因数目被选作最佳的预测者基因组(n＝13)。
下一步是利用优化的该组基因计算适当的阈值，用于准确预测水肿或无水肿。凭经验决定将单个样品与无水肿谱而非水肿谱进行比较(在比较来自两者的结果后)。PCC用于建立88份样品中每份样品的预测者基因表达谱与(利用88名患者中所有51名无水肿的患者计算的)平均无水肿谱的相关性。通过从最高到最低的相关性分级患者样品，并且错误率确定为该阈值相关性的描制位置的函数。在有最小假阳性和假阴性的点确定位于“最佳准确度”的阈值。然而，为了使假阴性(水肿患者错分类为没有水肿)的数量最小，确定位于“最佳灵敏度”的第二阈值，该“最佳灵敏度”允许不超过15％的水肿病例被错分类(37个病例中5个病例)。利用这些阈值，利用SAS计算比数比(odds ratio，OR)，并以0.05为p值截断值利用Fisher确切检验确定统计学上的显著性。
最后步骤是利用具有17份患者样品的“试验”组验证选定的预测者基因预测水肿状态的有效性。相对于来自于88份样品的“预测者”组的平均无水肿表达谱，计算17份样品中每份样品的预测者基因PCC，并且选定在“最佳灵敏度”位置的阈值做为水肿预测的截断值。这样，如果17份试验样品中1份样品的计算值≥阈值，该患者就被分类为没有水肿；如果相关性＜阈值，则预测患者有水肿。利用SAS，根据正确和错误预测为有水肿或未有水肿的患者的数量进行OR和Fisher确切检验。
结果利用方法部分所述的88份样品(37份水肿，51份无水肿)的“预测者”组选择用于预测水肿状态的13种基因。表2给出有关这些基因和它们的Affymetrix探针组名称、Genbank记录号、染色体基因座、功能简要描述及水肿和无水肿样品之间的倍数差异的列表。13种基因中，3种基因参与了信号转导(PTPN12，P2Y10和ARHGDIB)，2种基因是细胞周期调节物(CDKN1B和CUL1)，2种基因参与免疫应答(FCER1G和MCP)，2种基因参与RNA加工(SFRS2IP和STAU)，一种基因是转录因子(HIVEP2)，一种基因参与新陈代谢(PGC)，并且2种基因目前还不知道它们的功能(CL24711和FLJ00036)。尽管2种基因(PGC，P2Y10)在水肿群体中欠表达，但是这些基因中大多数基因在水肿组中的表达显著高于无水肿组。
如方法部分中所述，通过首先根据样品与平均无水肿表达谱的相关性安排预测者组中的样品来确定阈值。图1显示了这13种基因聚类分析的结果，其中由PCC安排样品，使得与无水肿谱具有最高相关性的那些样品位于顶部，与无水肿状态具有最小相关性的那些样品位于底部。做为最初的起始点，在最小化假阳性(无水肿错分类为水肿)数和假阴性(水肿错分类为无水肿)数的最佳准确度点确定阈值。这出现在0.37PCC值的位置(图1，实线)。利用该阈值，具有PCC≥0.37的个体(根据与平均无水肿表达谱的PCC)将被分类在无水肿组中，而具有PCC＜0.37的个体将被分类在水肿组中。确定这些观察结果的频率，并且计算OR(见表4中所示)。在这种情况下的OR表示如果患者的表达谱与平均无水肿谱负相关(PCC＜0.37)，则患者有6.8(95％CI2.6-17.4)倍高的可能性发生水肿。根据Fisher确切检验，观察值和期望值之间的差异具有高度显著性，P值为6.5×10-5(表4)。
尽管这些发现具有统计学上的显著性，但是重要的是注意到32％(37个患者中12个患者)的水肿患者实际上被错分类为无水肿(假阴性)。因为在很少的情况下水肿可能是潜在地危急生命的不利事件，在这种情况下，最小化假阴性数与临床是最相关的，这样患者就可以接受适当的监控和治疗以有助于防止水肿发生。这是在0.78PCC选择第二阈值的根本原因。优化该值的灵敏度，使得错分类的水肿病例不超过15％(37例中5例)。表4中示出的是利用该标准的频率分析结果。再次，观察值和期望值之间的差异具有高度统计学显著性，p值1.37×10-4。在这种情况下，OR表示如果患者表达谱与平均无水肿谱负相关(PCC＜0.78)，则患者有7.2(95％CI2.4-21.4)倍高的可能性发生水肿。
利用17份样品的患者“试验”组验证13种预测者基因预测患者水肿状态的有效性，该17份样品的患者“试验”组不包括在用于确定预测者基因的分析中。这些患者(8名水肿和9名无水肿)和“预测者”组的患者来自于相同的临床试验。在预测者组和试验组之间实验参数没有显著的差异(未示出数据)。在表2中示出了利用13种预测者基因对该试验组的聚类分析结果。利用0.78的最佳灵敏度阈值能正确地分类所有8名水肿患者，及9名无水肿患者中的7名，产生了88％的总体准确性。如表4中频率分析所证明的，这些结果具有0.0023p值的统计学上显著性(Fisher确切检验)。然而，由于小样品尺寸，51.0的OR可能是夸大的。
该药物基因组学分析的目的是鉴定可以用于对伊马替尼诱导的水肿的易感性进行预测的基因组标记，以及可能地对水肿的病理生理学提供一些线索。来源于随机分配到伊马替尼治疗组的患者的总共105份基线血液样品用于这些分析。在这些样品中，一个由88名患者(37名水肿和51名无水肿)组成的亚组用做“预测者”组以确切一列预测者基因。剩余的17名患者(8名水肿和9名无水肿)用做“检测者”组以验证这些预测者基因。
利用van′t Veer等.(2002)，上引文所述分析策略能够确定最佳一组13种基因以预测水肿，并且选定0.78的PCC阈值以最小化假阴性数量。对于预测者组的样品，这产生了86％的鉴定水肿患者的成功率(37名患者中32名患者)，其中OR＝7.2，p＝1.34×10-4(表4)。在试验组17名患者中验证该结果，其中正确地鉴定了所有8名水肿患者，具有88％的总预测准确度。这些结果也具有统计学显著性(p值0.0023)，但是OR 51.0，尽管有显著性，但是由于小的样品量，故可能是被夸大了的。应该在至少一个具有足够的患者样品以提供充分的统计力的独立临床试验中应用这些结果，以更充分地验证这些初步的发现。
如表2中所示，这13种基因具有各种功能。尽管目前还不知道这些基因中2种基因(CL24711和FLJ00036)的功能，但是剩余的11种基因具有包括细胞周期调节(CDKN1B和CUL1)，信号转导(PTPN12，P2Y10和ARHGDIB)，RNA加工(SFRS21P和STAU)，免疫应答(MCP和FCER1G)，转录因子(HIVEP2)和新陈代谢(PGC)的功能。这些基因的差异表达对于伊马替尼诱导的水肿具有预测性。
表1 用伊马替尼治疗的105名患者中水肿的发生水肿分类 数量(％)HLT血管性水肿 35(33.3)PT眶周水肿33(31.4)PT面部水肿3(2.9)HLT水肿NEC 24(22.9)PT外周水肿20(19.0)PTNOS水肿 3(2.9)PT压凹性水肿 1(1.0)HLT肺水肿 1(1.0)PT肺充血 1(1.0)所有水肿类别45(42.9)HLT＝MedDRA高级别术语。
PT＝MedDRA首选术语。
NEC＝没有在其它地方分类的。
NOS＝没有其他说明的。
表2 用于预测伊马替尼治疗后水肿发生的基因

注意利用“预测者”组88份患者样品(37名水肿，51名无水肿患者)，从84种潜在候选基因的“留一”分析中确定的基因。按从高到低的与水肿状态的绝对相关性排列基因。
倍数＝倍数差异(水肿对无水肿组)。
表3 13种预测者基因的平均无水肿和水肿表达谱

表4 频率分析和OR计算观察的(期望的)PCC*≥阈值PCC*＜阈值(无水肿) (水肿) OR(95％CI) p值预测者组(Thr＝0.37)水肿12(21.4) 25(15.6) 6.8(2.6-17.4) 6.25×10-5无水肿 39(29.6) 12(21.4)预测者组(Thr＝0.78)水肿5(13.5) 32(23.6) 7.2(2.4-21.4) 1.37×10-4无水肿 27(18.6) 24(32.5)试验组(Thr＝0.37)水肿6(7.1)2(0.9) 7.3(0.3-178)0.206无水肿 9(7.9)0(1.1)试验组(Thr＝0.78)水肿0(3.3)8(4.7) 51.0(2.1-1240) 0.0023无水肿 7(3.7)2(5.3)*与13种预测者基因的平均无水肿表达谱比较。
利用Fisher确切检验计算的p值。
预测者组＝用于确定预测者基因列表的88份患者样品。
试验组＝用于验证预测者基因的17份患者样品。
实施例2IL-1β基因中多态性进行药物遗传学分析以鉴定与III期临床试验中水肿不利事件有关的遗传因子。在6个月的中期分析中检查26种基因的70种SNP，并且在伊马替尼治疗的个体中观察到眶周和面部水肿与IL-1β基因中-511T→C多态性之间的显著相关性(p＝0.016，OR3.06，95％CI1.29-7.27)。根据性别对同一个分析进行分层。在女性中发现了眶周和面部水肿与此IL-1β多态性之间的显著相关性(p＝0.0005574)。用伊马替尼治疗时，对于-511多态性，具有CC基因型的女性与非CC基因型的女性相比，有13倍高的可能性经历水肿(95％CI2.07-81.48)(来自于12个月的锁定的数据(locked data))。在男性中没有观察到相关性。因此，-511 IL-1β多态性与水肿的相关性看起来对女性是特异的，并且可以解释当用伊马替尼治疗时，为什么女性出现水肿的可能性是男性的3倍。
本研究的结果表明IL-1β启动子中-511多态性可以用做伊马替尼治疗的女性中眶周和面部水肿的预测标记。
在临床试验中进行药物遗传学分析以鉴定不利事件水肿的预测标记。该临床试验是在新近诊断的、已前未接受过治疗的Ph+CML-CP患者中伊马替尼相对于联合Ara-C的IFN-α的III期研究。分析了用伊马替尼或IFN-α治疗的151名患者的基因型。总共57.72％美国患者同意参加该药物遗传学分析。
“Briefing Book on the etiology and proposed investigation strategyfor edema and fluid retention in patients treated with Gleevec”概述了在GLEEVEC伊马替尼临床试验中某些患者组的更高频率水肿趋势。这些组包括老年患者(65岁和65岁以上)，在曲线下具有更大面积(AUC)值的患者，和患有晚期CML的患者。在该相同的报告中，报道如下5种共变量与3-4级水肿显著相关年龄(65岁以上)，心血管疾病史，女性，CML晚期和具有2倍于稳态伊马替尼平均浓度的值的患者。
因此鉴定IL-1β基因启动子中-511多态性与眶周和面部水肿之间的显著相关性。由于在关于水肿的Briefing Book中概述了水肿和人口统计学因素的相关性，就该相关性检测了伊马替尼研究群体中的人口统计学因素。根据性别分层该分析，并且在伊马替尼治疗的女性中发现了-511 IL-1β基因型与眶周和面部水肿之间的显著相关性(p＝0.0005574)。男性中无相关性；因此，看起来该相关性是性别特异的。将IL-1β鉴定为预测标记可以帮助医生治疗CML女性患者和预防严重水肿。
候选基因方法被用于鉴定如下遗传多态性，该遗传多态性可以用做水肿的预测标记，并且可以提示水肿形成的作用机理。用两种不同的方法开发SNP。Third Wave Technologies，Inc.开发了一个SNP集合，而另一组SNP是利用数据库采掘方法内部开发的。利用公共数据库，诸如OMIM，SNP Consortium，Locus Link和dbSNP。根据如下基本理论选择候选基因，该基本理论包括候选基因参与水肿、DNA修复、疾病病因学或药物作用机理。Third Wave Technologies，Inc.开发了用于基因分型的SNP试验。
基因分型在治疗给药之前的研究第一天，从只在美国入选的患者获得20ml血液。根据地方伦理委员会批准的程序获得知情同意后，收集血液样品。利用PUREGENETMDNA分离试剂盒(D-50K)(Gentra，Minneapolis，MN)，根据制造商的说明提取DNA。评价了总共151名患者的基因型和表型数据。利用Invader测定法(Third Wave Technologies，Inc.)，根据制造商的说明，在60ng基因组DNA上进行基因分型。参见Lyamichev等，NatBiotechnol，vol 17，pp 292-296(1999)。
在实验室中，对与水肿显著相关的那些SNP进行二次基因分型以证实基因型。进行了另一质量控制检查；检测基因型的Hardy Weinberg平衡(HWE)。HWE定律陈述到在随机交配的大群体中，等位基因频率不随世代而改变。偏离HWE将提示下面两种可能性中的一种1)基因分型错误；或2)多态性和所研究的群体之间的相关性。
在第二种情况下，如果特定多态性以某种方式参与了疾病病因学，那么可以看到该特定多态性比所预期的更占优势。例如，在早老性痴呆(AD)患者研究中，载脂蛋白E(APOE)可能不处于HWE中，因为APOEε4使患者易于发生AD。在统计学程序8.2版本SAS中进行了所有的统计学分析。
基因表达谱分析利用TRI REAGENTTMBD，处理血液样品以用于全血的基因表达谱分析。从冷藏在-80℃的470份血液样品提取RNA。在本研究中，检测了来源于患者的96种表达谱，其中所述患者也有基因型信息。
统计学方法基因分型的群体的代表性性质为了确定基因分型的群体对于整个临床试验群体有怎样的代表性，比较了2个群体的人口统计状况和水肿发生。而且，因为基因分型的群体只由美国患者组成，所以将试验中所有美国患者作为另一群体进行了检查。利用非参数ANOVA比较年龄，而其它在统计学程序8.2版本SAS中利用Fisher确切检验分析。
基因型与水肿状态的相关性Fisher确切检验用于比较每个患者的基因型和水肿状态的临床表型。从临床数据库确定水肿状态，该临床数据库汇编了最少12个月治疗后的数据。不知道伊马替尼治疗的患者中水肿的机理。而且，不知道是否更严重的体液滞留事件与更常见的眶周和外周水肿事件具有相同的病理生理学。在所研究的患者中，一名患者出现了3级严重眶周水肿事件。大多数患者只出现了一种较轻水肿事件，或者根本无体液滞留。因此，只要在我们的统计学关联性研究中可行，关于水肿的病理生理学就尽量少的做假设。进行了基因型和水肿之间的3种关联性分析。第一种为患有任何类型水肿的患者(分析的病例中的55％)和没有水肿的所有其它个体的比较。第二和第三种分析利用具有最高水肿发生率的亚组进行。例如，组1(眶周水肿和面部水肿)被分类为具有水肿，并且所有其它患者被分类为无水肿。同样，第三种分析将组2个体(外周水肿、NOS水肿和压凹性水肿)编为具有水肿，而所有其它患者编为无水肿。
因为不预期观察伊马替尼和IFN-α的相似结果并且主要是对伊马替尼结果感兴趣，所以根据治疗对每种基因型/表型相关性进行分层。最后分析中所用的患者数量是91名伊马替尼治疗的患者。在统计学程序8.2版本SAS中进行了所有的统计学分析。
逻辑性回归利用逻辑性回归确定哪些变量对眶周和面部水肿具预示性。眶周/面部水肿是各种模型中使用的因变量。应用这些模型以允许考虑基因型和人口统计学因素的任何混杂效应。构建逻辑性回归以模拟观察到的-511 IL-1β基因型和水肿之间的原始关联性。所有模型都由用伊马替尼治疗的男性和女性(n＝91)组成。在第一次逻辑性回归分析中，向全模型中添加年龄、性别、种族和-511 IL-1β基因型做为类别。为了研究性别和基因型之间相互作用的可能性(如前面所观察的)，产生允许2方共变量相互作用的另一变量。其它的分析由在第一个模型中所用的类别及允许在基因型、性别和种族之间以及在基因型、性别和年龄之间发生3方相互作用的另外2个变量组成。由于黑人、东方人和其它个体的低比例，将种族组转换为2类，高加索人和其它个体，并且如上所述第三次完成逻辑性回归。做为探索性分析完成了逻辑性回归，以进一步表征显著的基因型/表型相关性。
在这里报道的91名伊马替尼患者加上另外的18名IFN-α治疗的患者中分析多态性，并且发现该多态性符合HWE。-511IL-1β多态性位于基因启动子区，并且是转录起始位点上游-511碱基对位置的C/T碱基转换。参见EI-Omar等，Nature，404卷，389-402页(2000)。由于-511 IL-1β多态性与相同基因中的-31变异的接近完全的连锁不平衡(LD)，对-31IL-1β多态性进行基因分型，也在伊马替尼治疗的女性中观察到它和水肿之间的相关性(p＝0.0054)。
下面的表5显示根据IL-1β基因型，伊马替尼治疗的女性中水肿和无水肿的比较。这个表显示伊马替尼治疗的女性中与水肿相关的两个IL-1β多态性的基因型分布。根据是否经历过水肿不利事件来表征女性。经历水肿的女性中在-511基因座具有CC基因型和在-31基因座具有TT的女性显著多于在该基因座具有其它替代性基因型的女性(分别地p＝0.0041和p＝0.0054)。
表5-511CC-511CT -511TT-31TT-31CT-31CC无水肿 2 12 1 112 2水肿 1041 732-511和-31IL-1βSNP的LD计算D’以证实-511和-31IL-1β启动子多态性之间的近完全LD报道，其中该D’是用于计算LD程度的统计数值。与被比较的两种多态性的频率无关，D’具有相同范围的值。使用EH连锁应用程序，以检验和估测两种标记之间的LD。基于采自随机收集的群体中的多个个体的样品数据，EH程序估计每个标记的等位基因频率。参见Xie等，Am.J.Hum.Genet.，53卷，1107页(摘要)(1993)；和Terwilliger等，John′s Hopkins University Press，Baltimore(1994)。
在此CML患者群中，-511 IL-1β多态性和-31 IL-1β多态性处于近完全LD，其中具有用EH程序计算的0.978|D’|。参见Xie等，上引文。|D’|值是1表示完全的LD，而|D’|值是零表示无LD。参见Reich等，Nature，411卷，199-204页(2001)。因此，与一种IL-1β多态性观察到的所有统计学显著相关性也将与可替代的另一IL-1β多态性具有统计学显著性。由于IL-1β(-511)C→T多态性与IL-1β启动子中位于(-31)位置处导致T→C碱基转换的另一多态性处于强LD中(99.5％)。参见EI-Omar等.(2000)，上引文，因此，预测在IL-1β启动子位置(-511)具有T的患者将在位置(-31)具有C。在这两个试验中于检测的患者中证实了该发现。在野生型IL-1β基因中，在-31位置发现了T。该T对于IL-1β基因表达非常重要，因为它是TATA盒序列(TATAAAA)的一部分，该TATA盒序列在IL-1β转录起始中起至关重要的作用。一般地，TATA盒序列参与在基因中的正确位置上募集和定位转录机器以确保在正确位置开始转录。在位置(-31)的T→C多态性将破坏这个重要的TATA盒序列(TATAAAA到CATAAAA)，由此使它失活并阻止IL-1β基因有效转录起始。已经证明了转录机器与该改变的IL-1βTATA盒序列缺少结合。参见，EI-Omar等.(2000)，上引文。相反，在-511位置的C多态性与在-31位置的T相关。因此，启动子中具有完整TATA盒的女性可能有更大的药物诱导水肿的风险。因此，与(位于位置(-31)引起T→C碱基转换的)IL-1β启动子中的多态性或位于IL-1β启动子-511(C→T)位置的多态性处于LD中的任何其它多态性的存在也对用药物治疗发生水肿的可能性具有预测作用。与(-31)多态性处于LD中的其它多态性的检测方法是本领域技术人员所熟知的。现在已知或将来发现的任何这种多态性都可以用在本发明方法中，以预测用药物治疗时患者中水肿形成的可能性，或者帮助确定针对这种情况的治疗选择。
人口统计学、基因型和表型变量间的相关性分析不同种族个体的遗传组成变化很大。为了估测这种变化，通过种族分析每种多态性。也研究了种族之间水肿发生是否存在任何差异。在研究的数据组中，将种族分类为高加索人、黑人、东方人和其它人。非高加索人数量少。为了增加分析的力度，也进行了重新将种族编为高加索人和非高加索人的分析。利用Fisher确切检验计算该部分分析中的P值。在统计学程序8.2版本SAS中进行了所有的统计学分析。
除了种族也研究了是否性别和/或年龄与水肿相关，及是否这些变量独立于与-511IL-1βSNP的关联性。检查性别和年龄是因为我们以前的经验表明它们与血管性水肿关联。从研究数据组确定性别和年龄。根据性别，对水肿表型和相关SNP之间的所有关联性研究进行分层。进行年龄和所有水肿类型之间的单因素(one-way)ANOVA。利用逻辑性回归确定哪些变量对眶周和面部水肿具预示性。眶周/面部水肿是各种模型中使用的因变量。利用这些模型以允许考虑基因型和人口统计学因素的任何混杂效应。构建逻辑性回归以模拟观察到的-511 IL-1β基因型和水肿之间的原始关联性。
所有模型都由用伊马替尼治疗的男性和女性(n＝91)组成。在第一次逻辑性回归分析中向全模型(full model)添加年龄、性别、种族和-511 IL-1β基因型做为类别。为了研究性别和基因型之间相互作用的可能性(如前面所观察的)，产生允许2-way共变量相互作用的另一变量。其它的分析由在第一次模型中所用的类别及允许在基因型、性别和种族之间以及在基因型、性别和年龄之间发生3方相互作用的另外2个变量组成。由于黑人、东方人和其它个体的低比例，将种族组转换为2类，高加索人和其它人，并且如上所述第三次完成逻辑性回归。做为探索性分析完成了逻辑性回归，以进一步表征显著的基因型/表型相关性。
通过用无水肿组中特定基因型的比数(例如，CC对非CC)除以水肿组中相同基因型的比数，计算OR和95％CI。
校正多重检验(multiple testing)因为用于鉴定水肿预测标记的方法的性质，所以对于多重检验必须进行校正。进行的检验越多，因偶然而出现p＜0.05关联性的机会越大。利用Bonferroni校正因子校正多重检验，将期望的p值除以进行的检验数。所得到的值是将被考虑为“显著性的”值。因此，对于该分析中检验的70种多态性，认为具有显著性的要求是p值0.0007。这是一个极其小的数值，并且利用该保守性截断值将遗失可能有用的预测标记。
校正多重检验的第二种方法是Bootstrapping。该方法是一种计算机加强的统计分析方法，其应用模拟来计算显著性检验。随机数产生器用于重新对数据集抽样。实施Bootstrap检验我们的显著性结果的稳定性。Bootstrap由水肿表型和68种多态性组成，并且只利用女性进行了10,000次重复。在统计学程序8.2版本SAS中进行了所有的统计学分析。
基因分型的群体的代表性性质为了确定该研究中用于药物遗传学研究的患者亚组是否代表了试验群体，检查水肿相关的几个人口统计状况。基因分型群体只由来自于美国的患者组成。因此，也比较了临床试验的所有美国患者群体与此基因分型的群体。在性别、种族、年龄和水肿发生方面，该研究的基因分型群体与来自于美国的试验群体相似。他们只是在种族方面不同。相比较，此美国群体有更多黑人(11.92％比4.78％)，较少的高加索人(80.13％比90.06％)，和稍微多些的其它类型的个体(6.62％比3.50％)。
基因型和水肿状态的相关性结果26种基因中70种遗传多态性的分析鉴定了IL-1β基因-511多态性与伊马替尼治疗的女性中眶周和面部水肿具有显著相关性，p＝0.00056。具有CC基因型的女性比非CC基因型个体有13倍高的可能性发生眶周和面部水肿(95％CI2.07-81.48)；也参见图3和图4。此IL-1β多态性位于启动子区，其代表转录起始位点上游位置-511碱基对处的C→T碱基转换。
人口统计学、基因型和表型变量之间相关性的结果发现性别和年龄与伊马替尼治疗个体中血管性水肿具有显著关联(p＜0.05)。意外地，在所有试验患者中，性别与IL-1β多态性相关联(p＝0.0106)，图4。具有CC基因型的女性比非CC基因型的女性更有可能发生血管性水肿。因为IL-1β基因位于常染色体上，故没有预料到与性别和遗传多态性的关联性。为了理解性别与-511多态性的关联性是对本研究试验群体特异的，还是在其它对照群体中也可以观察到，检验了3个另外的非相关的临床试验。对于所有试验的组合，没有观察到性别和-511 IL-1βSNP之间的显著关联性，对于3个对照试验中任何一个试验也没有观察到该显著关联性。在伊马替尼和所有其它之间，-511 IL-1β多态性的基因型分布没有显著差异。然而，当根据性别分层此分析时，该研究试验的女性与所有其它女性在基因型分布上具有显著差异。看起来缺少就-511 IL-1β多态性而言具有TT基因型的女性白血病患者。相比较，伊马替尼治疗的女性患者中CC∶CT∶TT基因型的分布是16∶19∶1，而男性是23∶25∶19。与所有其它临床试验比较，本研究的男性在基因型分布上没有显著差异。
4个种族间该多态性的基因型分布具有显著差异。为了研究所观察到的IL-1β和血管性水肿之间的关联性是否是种族特异的，根据种族对分析分层。伊马替尼治疗的男性和女性中，黑人的-511 IL-1β CC∶CT∶TT的分布是1∶6∶4，高加索人是29∶31∶13，东方人是0∶2∶0，其它人是3∶0∶2，并且在所有组的组合中是33∶39∶19。当根据性别和种族分层该数据时，高加索人占所研究的女性的77％。在高加索人中有个明显的趋势，即，当用伊马替尼治疗时，-511 IL-1β多态性的CC基因型易使女性患水肿。将来的研究应该包括来自于不同种族背景的适当数量的个体，以确定是否-511 IL-1β多态性与水肿相关是种族特异的。在表征的4个不同种族之间观察到的IL-1β多态性等位基因分布的差异可能引起种族之间水肿发生率的差异。
年龄与血管性水肿相关，非参数ANOVA p＝0.0393。然而，它不与IL-1β多态性相关，表明在血管性水肿发生中它是自变量。
多重检验的校正Bonferroni校正由于分析的SNP数和大量检验可能引入假阳性错误率的事实，进行多重检验的校正。利用Bonferroni校正方法，伊马替尼治疗的女性中发现的水肿和IL-1β变异之间的相关性将不被认为具有显著性，该方法按如下计算给出0.0007的p值Bonferroni=0.05η=0.0568=0.0007]]>η＝检验数。
用-511和-31多态性观察到的p值大于此0.0007截断值。
Bootstrapping对于伊马替尼治疗的女性中水肿和-511 IL-1β多态性之间的相关性，Bootstrapping分析产生了0.058的校正的p值。
进行药物遗传学分析以鉴定遗传标记，该遗传标记可以用于预测对伊马替尼诱导的水肿的易感性和理想地帮助理解水肿的病理生理学。进行统计检验以寻找候选者基因的基因型和该研究试验的患者出现水肿之间的关联性。只伊马替尼治疗的女性中于-511 IL-1β多态性与眶周和面部水肿之间发现了相关性。用伊马替尼治疗的、在IL-1β-511基因座具有CC基因型的女性与伊马替尼治疗的具有CT或TT基因型的女性相比有高13倍的可能性经历血管性水肿(95％CI2.07-81.48)。因此，鉴定了IL-1β基因中眶周和面部水肿的替代标记(surrogate marker)，该标记说明了在伊马替尼治疗的女性中观察到的67％病例(15个病例中的10个病例)。可能地，与血管性水肿相关的此基因型功能性地与IL-1β基因增加的表达水平相关。这种替代标记可以容易地应用于临床中以预测患者对血管性水肿的易感性，使得他们可以得到更严密的监控或预防性治疗。此检验可以是遗传学的或是可能地在血清中测定IL-1β蛋白质水平。
如这里所用术语“水肿”应该指任何类型或种类的临床显著性水肿的发生，包括但不限于血管性水肿(包括眶周水肿和面部水肿)，NEC水肿(包括外周水肿，NOS水肿和压凹性水肿)和肺水肿(包括肺充血)和脑水肿。
如这里所用术语“无水肿”应该意指不存在任何类型或种类的临床显著性水肿。
一般的微阵列技术在临床肿瘤学中，微阵列技术正在快速发展，并且得到认可，该技术可以一次评估数千种单基因的特征。该技术已经被用于鉴定可以区分不同类别癌症的遗传因子、临床应答生物标记及在急性淋巴性白血病的情况下，可以预测抗伊马替尼治疗抗性的出现的基因。本研究的目的是利用该基因表达谱分析策略鉴定用伊马替尼治疗的CML患者中水肿的预测性基因表达谱。
测定方法本发明的实验方法取决于细胞组分的测定。所测定的细胞组分可以来自细胞生物学状态的任何方面。它们可以来自转录状态，其中测定RNA丰度；来自翻译状态，其中测定蛋白质的丰度；来自活性状态，其中测定蛋白质的活性。这些细胞特征也可以来自混合方面，例如测定一种或多种蛋白质活性连同其它细胞组分的RNA丰度(基因表达)。这部分描述了用于测定药物或途径应答中细胞组分的示例性方法。本发明亦适用这种测定的其它方法。
优选地，在本发明中测定其它细胞组分的转录状态。可以通过对核酸或核酸模拟探针阵列的杂交技术(如下一小部分所述)或通过其它基因表达技术(随后小部分所述)测定转录状态。不管如何测量，结果是包括代表mRNA丰度和/或比率的值的数据，(在RNA降解速率相同的情况下)其通常反映DNA表达率。
在本发明各种备选的实施方案中，可以测定非转录状态的生物学状态(如翻译状态、活性状态)的方面或混合方面。
无细胞测定法也可以用于鉴定能与表2中一种公开基因编码的蛋白质或蛋白质结合伴侣相互作用以改变蛋白质或其结合伴侣的活性的化合物。无细胞测定也可以用于鉴定能调节编码蛋白质和其结合伴侣(如靶肽)间相互作用的化合物。
通过用检测表面等离子共振—一种光学现象—的即时BIA(生物分子相互作用分析，Pharmacia Biosensor(AB))也可以估测分子间的相互作用。检测取决于在生物特异界面上质量大分子的质量浓度的改变而不需要标记分子。在一个有用的实施方案中，可以在传感器表面，例如微流室(micro-flow cell)壁上固定试验化合物库。然后，使含有蛋白质、其功能性片段或蛋白质结合伴侣的溶液在传感器表面连续循环。信号记录上指示的共振角度的改变表明发生了相互作用。在Pharmacia的BIA技术指南中详细描述了该技术。
无细胞测定法的另一个实施方案包括a)混合至少一种基因编码的蛋白质、蛋白质结合伴侣和试验化合物以形成反应混合物；和b)在试验化合物存在或缺乏情况下检测蛋白质和蛋白质结合伴侣的相互作用。与不存在试验化合物情况下的相互作用比较，试验化合物存在情况下的蛋白质和结合伴侣相互作用的相当大的变化(增强作用或抑制作用)表明试验化合物是蛋白质活性的潜在的激动剂(模拟物或增强剂)或拮抗剂(抑制剂)。试验中的成分可以同时混合或者用试验化合物接触蛋白质一段时间后向反应混合物添加结合伴侣。通过利用各种浓度的化合物产生剂量应答曲线可以估测化合物的效力。也可以在不存在试验化合物的情况下，通过定量蛋白质和其结合伴侣间复合物的形成进行对照测定。
用可检测地标记的蛋白质如放射性标记、荧光标记或酶标记的蛋白质或其结合伴侣，通过免疫测定法或通过色谱检测法可以检测蛋白质和其结合伴侣间复合物的形成。
在优选的实施方案中，可以固定蛋白质或其结合伴侣以有利于从蛋白质和其结合伴侣的未复合形式中分离复合物和利于测定的自动化。可以在任何类型的容器，例如微量滴定板，微离心管和试管中完成蛋白质与其结合伴侣的复合。在特别优选的实施方案中，蛋白质可以与另一种蛋白质，例如谷胱甘肽-S-转移酶融合以形成融合蛋白质，该融合蛋白质可以吸附在基质，例如谷胱甘肽琼脂糖凝胶珠上(Sigma Chemical，St.Louis，MO)，然后与标记的，例如用35S标记的蛋白质伴侣和试验化合物混合，并且在足以形成复合物的条件下孵育。随后，洗涤珠以除去未结合的标记，并且固定基质，测定放射性标记。
另一个在基质上固定蛋白质的方法包括利用生物素和链霉抗生物素蛋白。例如，可以利用公知的技术用生物素NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)生物素化蛋白质，并且将其固定在链霉抗生物素蛋白包被的板的孔中。
无细胞测定法也可以用于鉴定能够与至少一种基因编码的蛋白质相互作用并且调节该基因编码的蛋白质的活性的药剂。在一个实施方案中，蛋白质与试验化合物孵育并测定蛋白质的催化活性。在另一个实施方案中，通过本领域已知的方法可以测定蛋白质对靶分子的结合亲和性。
这里所用的术语“反义”指与至少一种公开的基因的RNA表达产物的一部分互补的核苷酸序列。“互补的”核苷酸序列指根据标准Watson-Crick互补规则能进行碱基配对的核苷酸序列。即，嘌呤将和嘧啶配对以形成鸟嘌呤胞嘧啶和腺嘌呤胸腺嘧啶(在DNA中)或腺嘌呤尿嘧啶(在RNA中)的组合。其它较不常见的碱基，例如次黄苷，5-甲基胞嘧啶，6-甲基腺嘌呤，次黄嘌呤和其它碱基可以包含在杂交序列中，并且它们不干扰配对。
在所有实施方案中，细胞组分的测定应该以相对独立于测量时间的方式进行。
转灵状态的测定优选地，通过核酸和寡核苷酸阵列杂交进行转录状态的测定，见本小节描述。在本小节中稍后描述了一些其它转录状态测定方法。
转录物阵列概述在优选实施方案中，本发明利用了“寡核苷酸阵列”(这里也称为“微阵列”)。可以利用微阵列分析细胞中的转录状态，特别是测定癌细胞的转录状态。
在一个实施方案中，通过将代表细胞中存在的mRNA转录物的可检测标记的多核苷酸(例如，从总细胞mRNA合成的荧光标记的cDNA或标记的cRNA)与微阵列杂交产生转录物阵列。微阵列是具有一系列有序排列的用于细胞或生物体基因组中许多基因(优选大多数或几乎所有基因)产物的结合(例如杂交)位点的表面。可以用许多方法制备微阵列，下文描述了其中几种方法。无论如何制造，产生的微阵列有一些共同特征。阵列是可复制的，允许产生特定阵列的多个拷贝，并且这些拷贝之间易于相互比较。优选地，微阵列较小，通常小于5cm2，并且它们由在结合(例如，核酸杂交)条件下稳定的材料制成。微阵列中特定的结合位点或独特的一组结合位点将特异结合细胞的单个基因的产物。尽管每种特定mRNA可能有一个以上的物理结合位点(此后称为“位点”)，但是为了清楚的原因，下述的讨论将假定只有单个位点。在特定实施方案中，利用了在每个位置含有固定的已知序列核酸的位置可寻址阵列。
可以理解，当制备与细胞RNA互补的cDNA，并且在适合的杂交条件下将其与微阵列杂交时，与对应于任何特定基因的阵列位点的杂交水平将反映细胞中从该基因转录的mRNA的丰度。例如，当和总细胞mRNA互补的可检测标记的(例如用荧光团)cDNA或cRNA与微阵列杂交时，对应于细胞中未转录基因的阵列位点(即，能特异结合基因产物)将没有或几乎没有信号(例如，荧光信号)，而对应于编码的mRNA占优势的基因的位点将有相对强的信号。
微阵列的制备微阵列是本领域已知的，由一个表面组成，在该表面上在序列上相应于基因产物(例如cDNA、mRNA、cRNA、多肽及其片段)的探针可以特异地在已知位置发生杂交或结合。在一个实施方案中，微阵列是阵列(即矩阵)，其中每个位置代表基因编码产物(例如蛋白质或RNA)的一个离散结合位点，其中存在针对生物体基因组中大多数或几乎所有基因的产物的结合位点。在优选实施方案中，“位点”是特定关连cDNA或cRNA可以特异杂交的核酸或核酸类似物。结合位点的核酸或类似物可以是例如合成的寡聚体、全长cDNA、小于全长的cDNA或基因片段。
尽管在优选的实施方案中，微阵列含有靶生物体基因组中所有或几乎所有基因的产物的结合位点，但是这种全面性不一定是必需的。微阵列可以仅有针对部分靶生物体基因的结合位点。然而，一般地，微阵列有对应于至少约50％，常常至少约75％，更常见至少约85％，甚至更常见多于约90％和最常见至少约99％的基因组基因的结合位点。优选地，微阵列具有与测试和验证目的生物学网络模型相关的基因的结合位点。“基因”被定义为优选具有至少50，75或99个氨基酸的开放阅读框(ORF)，在生物体(例如，如果是单细胞)中或在多细胞生物体的一些细胞中将从该开放阅读框转录信使RNA。可从生物体表达的mRNA数量或通过从详细表征的基因组部分外推估测基因组中的基因数目。对感兴趣生物体的基因组测序后，通过DNA序列分析可以确定ORF数目并鉴定mRNA编码区。例如已经完整测序了酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)基因组，据报道其有约6275个长于99个氨基酸的ORF。对这些ORF的分析表明有5885个可能规定蛋白质产物的ORFs(参见，例如Goffeau等，“具有6000个基因的生命体”，Science，274卷，546-567页，(1996)，为了所有目的，整体并入该篇文献为参考文献)。相比较，估测人类基因组含有约25,000-35,000个基因。
制备用干微阵列的核酸如上所述，与特定关连cDNA特异杂交的“结合位点”通常是附着在该结合位点的核酸或核酸类似物。在一个实施方案中，微阵列的结合位点是对应于生物体基因组每种基因的至少一个部分的DNA多核苷酸。可以通过例如聚合酶链式反应(PCR)扩增来自基因组DNA、cDNA(例如，通过RT-PCR)或克隆序列的基因片段获得这些DNAs，或者可以在芯片表面例如通过照相平板印刷技术的应用从头合成序列，例如Affymetrix利用这种不同技术直接在芯片上合成了它们的寡聚体。可以根据基因或cDNA的已知序列选择PCR引物，以便扩增独特的片段(即，该片段与微阵列上任何其它片段不共有10个以上碱基的连续相同序列)。计算机程序在具有所需特异性和最适扩增特性的引物的设计中很有用(参见，例如Oligo pl5.0版本(National Biosciences))。在结合位点对应于很长的基因的情况下，有时期望扩增基因3’末端附近的片段，这样当寡聚-dT引发的cDNA探针与微阵列杂交时，小于全长的探针可以有效地结合。通常，微阵列上每个基因片段的长度在约20bp和约2000bp间，更通常地在约100bp和约1000bp间，通常约300bp至约800bp。PCR方法是公知的，例如在Innis等编辑，″PCR ProtocolsA Guide to Methods and Applications″，AcademicPress Inc.，San Diego，CA(1990)中描述了该方法，为了所有的目的，整体并入该篇文献为参考文献。很明显，计算机控制的机器人系统对于分离和扩增核酸是有用的。
产生用于微阵列的核酸的备选方法是例如利用N-磷酸酯或亚磷酰胺化学合成多核苷酸或寡核苷酸。参见Froehler等，Nucleic Acid Res.，14卷，5399-5407页，(1986)；McBride等，Tetrahedron Lett.，24卷，245-248页，(1983)。合成序列长度在约15到约500个碱基之间，更通常地在约20到约50个碱基之间。在一些实施方案中，合成的核酸包括非天然的碱基，例如次黄苷。如上所述，核酸类似物可以用作杂交的结合位点。一个适宜的核酸类似物的例子是肽核酸(参见，例如Egholm等，“PNA遵循Watson-Crick氢键键合规则与互补寡核苷酸杂交”，Nature，365卷，566-568页(1993)；也参见美国专利号5,539,083)。
在备选的实施方案中，结合(杂交)位点从基因、cDNA(例如已表达序列标志)的质粒或噬菌体克隆或来自其的插入物制备。参见Nguyen等，“通过与cDNA克隆阵列定量杂交分析小鼠胸腺中的差异基因表达”，Genomics，29卷，207-209页，(1995))。在再一个实施方案中，结合位点的多核苷酸是RNA。
将核酸结合到固相表面核酸或类似物被结合到固相支持体上，该固相支持体可以由玻璃、塑料(例如聚丙烯、尼龙)、聚丙烯酰胺、硝化纤维素或其它材料制成。优选的将核酸结合到表面的方法是在玻璃板上印刷，一般地可参见Schena等，“用互补DNA微阵列定量监测基因表达谱”，Science，270卷，467-470页，(1995)。该方法特别可用于制备cDNA微阵列。也参见DeRisi等，“使用cDNA微阵列分析人类癌症中的基因表达谱”，Nature Genetics，14卷，457-460页，(1996)；Shalon等，“使用双色荧光探针杂交分析复杂DNA样品的DNA微阵列系统”，Genome Res.，6卷，639-645页，(1996)；和Schena等，“平行人类基因组分析；1000个基因的基于微阵列的表达”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93卷，10539-11286页，(1995))。为了所有的目的，整体并入每篇前述的文章作为参考文献。
第二种优选的制备微阵列的方法是制备高密度的寡核苷酸阵列。利用用于原位合成的照相平板印刷技术生产含有数千位于表面规定位置的与规定序列互补的寡核苷酸的阵列的技术是已知的(参见Fodor等，“光指导的空间可寻址平行化学合成”，Science，251卷，767-773页(1991)；Pease等，“用于快速DNA序列分析的光导寡核苷酸阵列”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91卷，5022-5026页，(1994)；Lockhart等，“通过与高密度寡核苷酸阵列杂交监测表达”，Nature Biotech.，14卷，1675页(1996)；美国专利号5,578,832；5,556,752和5,510,270，为了所有的目的，整体并入每篇文献为参考文献)，或其它用于快速合成和沉积规定寡核苷酸的方法是已知的(Blanchard等，“高密度寡核苷酸阵列”，Biosensors & Bioelectronics，11卷，687-690页，(1996))。当利用这些方法时，直接在表面如衍生的载玻片上合成已知序列的寡核苷酸(例如25聚体)。通常，产生的阵列是冗余的，每个RNA具有几个寡核苷酸分子。可以选择寡核苷酸探针以检测可变剪接的mRNA。
也可以利用其它制备微阵列的方法，例如掩蔽法(参见，Maskos等，Nuc.Acids Res.，20卷，1679-1684页，(1992))。尽管如本领域技术人员所认识到的，优选非常小的阵列，因为这样杂交体积较小，但是原则上，可以利用任何类型的阵列，例如尼龙杂交膜上的点印迹(参见，Sambrook等，″Molecular Cloning--A Laboratory Manual(第二版)″，1-3卷，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1989)，为了所有目的，整体并入这篇文献为参考文献)。
产生标记探针制备总的和poly(A)+RNA的方法是公知的，在Sambrook等上述引文中概述了该方法。在一个实施方案中，在本发明中利用硫氰酸胍裂解各种类型目的细胞，接着通过CsCl离心提取RNA(Chirgwin等，Biochemistry，18卷，5294-5299页，(1979))。通过用寡聚-dT纤维素选择poly(A)+RNA(参见，Sambrook等，上引文)。目的细胞包括野生型细胞，暴露于药物的野生型细胞、具有修饰的/被干扰的细胞组分的细胞和具有修饰的/被干扰的细胞组分的暴露于药物的细胞。
通过寡聚dT引物或随机引物引发反转录从mRNA或备选地直接从RNA制备标记的cDNA，所述两种技术均是本领域已知的(参见，例如Klug等，Methods Enzymol.，152卷，316-325页，(1987))。可以在缀合有可检测标记的dNTP，最优选荧光标记的dNTP存在的情况下进行反转录。备选地，可以在标记的dNTP存在的情况下，通过双链cDNA体外转录合成法，将分离的mRNA转化为标记的反义RNA(参见，Lockhart等，“通过与高密度寡核苷酸阵列杂交监测表达”，Nature Biotech.，14卷；1675页，(1996))，为了所有目的，整体并入该篇文献为参考文献)。在可替代的实施方案中，在缺乏可检测标记的情况下合成cDNA或RNA探针，并随后例如通过引入生物素化的dNTP或rNTP或一些类似方法(例如光交联生物素的补骨脂素衍生物到RNA上)，接着添加标记的链霉抗生物素蛋白(例如缀合藻红蛋白的链霉抗生物素蛋白)或等同物以标记该cDNA或RNA探针。
当使用荧光标记的探针时，已知许多适合的荧光团，包括荧光素、丽丝胺、藻红蛋白、罗丹明(Perkin Elmer Cetus)、Cy2、Cy3、CY3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、FluorX(Amersham)和其它荧光团(参见，例如Kricka，“非同位素DNA探针技术”，Academic Press，San Diego，CA(1992))。可以理解的是，选择有不同发射光谱的成对荧光团以便于容易区分它们。
在另一个实施方案中，利用了非荧光标记的标记。例如，可以利用放射性标记或有不同发射光谱的成对放射性标记(参见，Zhao等，“高密度cDNA滤膜分析大规模定量分析基因表达的新方法”，Gene，156卷，207页(1995)；Pietu等，“通过与高密度cDNA阵列定量杂交揭示的在人类肌肉中优先表达的新基因转录本”，Genome Res.，6卷，492页，(1996))。然而，因为放射性粒子的散射和因此需要宽间隔的结合位点，放射性同位素的使用是不太优选的实施方案。
在一个实施方案中，通过在42℃，与反转录酶(如，TMII，LTI Inc.)温育含有0.5mM dGTP，dATP和dCTP以及0.1mM dTTP和荧光脱氧核糖核苷酸(例如，0.1mM罗丹明110UTP(Perken Elmer Cetus)或0.1mMCy3dUTP(Amersham))的混合物60分钟以合成标记的cDNA。
杂交到微阵列选择核酸杂交和洗涤条件，以便探针“特异地结合”或“特异地杂交”到特定阵列位点，即，使探针与具有互补核酸序列的序列阵列位点杂交、形成双链体或结合但是不与具有非互补核酸序列的位点杂交。如这里所用的，如果两个多核苷酸序列的短者少于或等于25个碱基且利用标准碱基配对规则两者没有错配，或者如果两个多核苷酸序列的短者长于25个碱基且错配不超过5％，那么认为其中一个多核苷酸序列与另一个多核苷酸序列互补。优选地，多核苷酸完全地互补(没有错配)。通过进行包括阴性对照的杂交分析，很容易证明特异杂交条件导致特异杂交(参见，例如Shalon等，上引文和Chee等，上引文)。
最适杂交条件取决于标记探针和固定的多核苷酸或寡核苷酸的长度(例如寡聚体相对多于200个碱基的多核苷酸)和类型(例如，RNA，DNA，PNA)。在Sambrook等以上引文和在Ausubel等，″Current Protocols inMolecular Biology″，Greene Publishing and Wiley-interscience，NY(1987)中描述了核酸特异(即严紧)杂交条件的一般参数，为了所有目的，整体并入这些文献为参考文献。当利用Schena等的cDNA微阵列时，典型的杂交条件是在65℃、5x SSC加0.2％SDS中杂交4小时，随后在25℃、低严紧性的洗涤缓冲液(1x SSC加0.2％SDS)中洗涤，接着在25℃、高严紧性的洗涤缓冲液(0.1x SSC加0.2％SDS)中洗涤10分钟(参见，Shena等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93卷，10614页，(1996))。
在例如Tijessen，″Hybridization With Nucleic Acid Probes″，ElsevierScience Publishers B.V.(1993)和Kricka，″Nonisotopic DNA ProbeTechniques″，Academic Press，San Diego，CA(1992)中也提供了有用的杂交条件。
信号检测和数据分析当利用荧光标记的探针时，优选地，通过扫描共聚焦激光显微术检测转录物阵列每个位点的荧光发射。在一个实施方案中，利用适合的激发线进行所用两个荧光团中每个荧光团的单独扫描。可替代地，可以利用可在对所用荧光团特异的波长下照射样品的激光，并且分析荧光团的发射光。在优选实施方案中，用具有计算机控制的X-Y镜台和显微镜物镜的激光荧光扫描仪扫描阵列。用多线混合气体激光完成荧光团的相继激发，按波长分开发射光，并且用光电倍增管检测。在Schena等，Genome Res.，6卷，639-645页，(1996)和其中引用的其它参考文献中描述了荧光激光扫描装置。可替代地，Ferguson等，Nature Biotech.，14卷，1681-1684页，(1996)描述的光纤束可以用于同时监测许多位点的mRNA丰度水平。
记录信号，并在优选实施方案中通过计算机，例如利用12位模数板分析。在一个实施方案中，用图形程序(例如，Hijaak Graphics Suite)除去扫描图像的光斑，然后用图像网格程序分析，该程序产生每个位点每个波长下的平均杂交的电子表格。
Agilent Technologies GENEARRAYTM扫描仪是台式488nM氩离子激光分析仪。该激光可以聚焦到小于4微米大小的点。这种精确度允许对具有小至20微米的探针单元的探针阵列进行扫描。激光束聚焦在探针阵列上，激发荧光标记的核苷酸。然后利用针对分析中所用的染料的选定滤光器执行扫描。通过移动探针阵列完成正交坐标的扫描。结合在杂交样品中的染料分子吸收激光辐射，导致它们发出荧光辐射。通过透镜校准荧光，并且穿过滤光器进行波长选择。然后通过第二透镜聚焦光线在孔隙上以进行深度鉴别。然后通过高敏光电倍增管(PMT)检测。PMT输出电流被模数转换器(ADC)转换成电压读数，处理后的数据作为样品点的荧光强度水平或当前扫描的图像元素(象素)返回计算机。随着扫描的进行计算机将数据显示为图像。此外，表示样品表达谱的所有样品的荧光强度水平以计算机可读格式记录。
如果必要，可以对两种荧光频道间的“串话”(或重叠)进行实验测定的校正。对于转录物阵列上任何特定的杂交位点，可以计算两种荧光团的发射比率。该比率独立于关联基因的绝对表达水平，但是该比率可能对于表达受到药物施用、基因缺失或任何其它受检事件显著调节的基因有用。
优选地，除了鉴定干扰为阳性或阴性外，测定干扰的幅度是有利的。这可以通过本领域技术人员显而易见的方法进行。
其它的转录状态测量方法可以通过本领域已知的其它基因表达技术测定细胞的转录状态。几种这样的技术产生用于电泳分析的具有有限复杂性的限制性片段库，如结合双限制酶消化和定相引物(phasing primer)的方法(参见，例如Zabeau等1992年9月24日提交的欧洲专利0534858A1)，或用最接近规定mRNA末端的位点筛选限制性片段的方法(参见，例如Prashar等Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93卷，659-663页，(1996))。其它方法统计地采样cDNA库，如通过测序多个cDNA之每一个的足够碱基(例如20-50碱基)以鉴定每个cDNA，或通过测定在相对于规定的mRNA末端的已知位置上产生的短标签(例如9-10碱基)的序列(参见，例如Velculescu，Science，270卷，484-487页，(1995))以鉴定途径模式。
其它方面的测量在本发明各种实施方案中，可以测定除了转录状态外的生物学状态方面，如翻译状态，活性状态或混合方面以获得药物和途径应答。在本部分描述了这些实施方案的细节。
翻译状态的测量可以通过可检测地标记的或可随后标记的探针检测基因编码的蛋白质的表达。一般地，该探针是识别所表达蛋白质的抗体。
如这里所用的术语“抗体”包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、人源化或嵌合抗体和足以结合抗体片段到蛋白质上的生物功能性抗体片段。
为了产生一种公开基因编码的蛋白质的抗体，可以通过注射多肽或其片段免疫各种宿主动物。这些宿主动物可以包括，但不限于家兔、小鼠和大鼠等。根据宿主物种，可以用各种佐剂增强免疫应答，这些佐剂包括但不限于弗氏佐剂(完全和不完全)、矿物凝胶如氢氧化铝，表面活性物质如溶血卵磷脂、多聚醇、聚阴离子、肽、油乳化佐剂、钥孔虫戚血蓝蛋白、二硝基苯酚和潜在有用的人用佐剂如BCG(bacille Camette-Guerin)和小棒杆菌(Corynebacterium parvum)。
多克隆抗体为来自利用抗原免疫的动物血清的异质抗体分子群，上述抗原例如靶基因产物或其抗原性功能衍生物。为生产多克隆抗体，可以通过利用添加了上述佐剂的编码蛋白或其部分注射来免疫例如以上所述的宿主动物。
单克隆抗体(mAb)是针对特定抗原的同质抗体群，其可以通过利用任何可允许培养的连续细胞系产生抗体分子的技术获得。这些技术包括但并不限于Kohler等的杂交瘤技术(1975，自然(Nature)256495-497；以及美国专利号4,376,110)、人B细胞杂交瘤技术(Kosbor等人，1983，今日免疫学(Immunology Today)472；Cole等人，1983，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)802026-2030)以及EBV杂交瘤技术(Cole等人，1985，单克隆抗体与癌症治疗(Monoclonal Antibodies andCancer Therapy)，Alan R.Liss公司，P77-96)。这些抗体可以为任何免疫球蛋白种类，包括Ig G、Ig M、Ig E、Ig A、Ig D以及它们的任何亚类。产生本发明mAb的杂交瘤可以在体外或体内培养。体内产生高效价mAb的方法为目前优选的生产方法。
另外，也可以使用生产“嵌合抗体”的技术(Morrison等人，1984，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)816851-6855；Neuberger等人，1984，自然(Nature)312604-608；Takeda等人，1985，自然(Nature)314452-454)，其通过将具适当抗原特异性的小鼠抗体分子的基因与具有适当生物学活性的人抗体分子的基因拼接在一起而进行。嵌合抗体是其中不同的部分来自不同的动物种类的分子，例如那些具有来自小鼠mAb的可变或高变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体。
备选地，可以适应性改进产生单链抗体的技术(美国专利号4,946,778；Bird，1988，科学(Science)242423-426；Huston等人，1988，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)855879-5883；以及Ward等人，1989，自然(Nature)334544-546)来生产差异表达的基因单链抗体。单链抗体可通过使重链和轻链的Fv区片段借助氨基酸桥相连产生单链多肽而形成。
更优选地，采用用于生产“人源化抗体”的技术来生产蛋白质、其片段或衍生物的抗体。这些技术公开在美国专利号5,932,448、5,693,762、5,693,761、5,585,089、5,530,101、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,789,650、5,661,016和5,770,429中。
识别特异表位的抗体片断可以通过公知的技术产生。例如，这些片段包括但并不限于通过胃蛋白酶消化抗体分子产生的F(ab’)2片断和通过还原F(ab’)2片断的二硫键而生成的Fab片断。另外，可以构建Fab表达文库(Huse等人，1989，科学(Science)，2461275-1281)以进行具有期望特异性的单克隆Fab片断的快速而容易的鉴定。
然后可以通过利用上述抗体的免疫测定法检测样品中已知蛋白质的表达程度。这种免疫测定法包括但不限于点印迹，western印迹，竞争性和非竞争性蛋白质结合测定法，酶联免疫吸附测定法(ELISA)，免疫组织化学，荧光激活细胞分选术(FACS)和其它在科学和专利文献中常用和广泛描述的方法及许多商用的方法。
为便于检测，特别优选使用三明治ELISA，该测定法存在多种变异方式。所有方式均包括在本发明范围内。例如，在一般的正向测定中，将未标记抗体固定于固体基质上，并将待测样品与结合的分子接触。经过适当的孵育时间，该时间将足够抗体抗原二元复合体形成。这时，再加入用能够诱导可检测信号的报告分子标记的第二抗体并孵育，孵育时间应足够抗体-抗原-标记抗体三元复合体的形成。将任何未反应物质洗去，并通过观察信号确定抗原的存在或者通过与含有已知量抗原的对照样品比较来定量。正向测定的变异方式包括同时测定和反向测定，其中在同时测定中样品和抗体同时加至结合的抗体中；而在反向测定中标记的抗体与待测试样品首先混合、孵育然后加至未标记的表面结合抗体中。这些技术为本领域技术人员所公知，并且显而易见可以进行小的改动。于此使用的“三明治测定法”意味着包括基于此基本的两位点技术的所有变异方案。对本发明的免疫测定而言，仅有的限制因素是标记的抗体必须是目的基因表达的蛋白质的特异性抗体。
在这种测定中最常使用的报告分子为酶或者含荧光团或放射性核素的分子。在酶免疫测定的案例中，将酶偶联至第二抗体，这通常通过戊二醛或过碘酸实现。然而，正如易于意识到的，存在相当大量不同的连接技术，它们为本领域技术人员所公知。通常使用的酶包括辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶等等。对于与特定酶一起使用的底物，一般选择在相应酶的水解作用后可以产生可检测的颜色改变的底物。例如对硝基苯磷酸适合与碱性磷酸酶缀合物一起使用；对过氧化物酶缀合物而言，通常使用1，2-苯二胺或甲苯胺。也可以使用荧光底物，其生成荧光产物而不是上文提及的生色底物。然后将含有适当底物的溶液加至三元复合体中。底物与连接至第二抗体的酶反应，产生定性的可见信号，该信号可以进一步通过通常地分光光度计定量以评价血清样品中存在的蛋白量。
备选地，可以将荧光化合物(例如荧光素和罗丹明)在不改变抗体的结合能力的条件下化学偶联至抗体。当利用特定波长的光照射激活后，荧光色素标记的抗体吸收光能，诱导分子进入激发状态，并随后发射出特征性的较长波长的光。该发射光在光学显微镜下表现为可观测的特征颜色。免疫荧光和EIA技术在本领域均是极为成熟的技术并且为本方法所特别优选。然而，本发明也可以使用其它报告分子，例如放射性同位素、化学发光或生物发光分子。对本领域技术人员而言，如何改变方法以适应所需用途是显而易见的。
根据几种其它方法也可以进行翻译状态的测定。例如，通过构建微阵列可以进行整个基因组的蛋白质监测(即“蛋白质组学”，Goffeau等，以上引文)，其中该微阵列的结合位点包含固定的、对细胞基因组编码的大量蛋白质种类具特异性的抗体，优选单克隆抗体。优选地，存在针对相当大部分的编码蛋白质的抗体，或至少存在与测试或验证目的生物网络模型相关的那些蛋白质的抗体。制备单克隆抗体的方法是公知的(参见，例如Harlow等，“AntibodiesA Laboratory Manual”，Cold Spring Harbor，NY(1988)，为了所有的目的，整体并入该篇文献为参考文献)。在一个优选实施方案中，产生抗合成的肽片断的单克隆抗体，所述合成肽片段是基于细胞基因组序列设计的。用这种抗体阵列，细胞的蛋白质接触阵列，并且用本领域已知的测定法测定它们的结合。
可替代地，可以通过二维凝胶电泳系统分离蛋白质。二维凝胶电泳是本领域公知的，通常包括沿着第一维的等电聚焦，随后沿着第二维的SDS-PAGE电泳(参见，例如Hames等，″Gel Electrophoresis of ProteinsAPractical Approach″，IRL Press，NY(1990)；Shevchenko等，Proc.NatlAcad.Sci.USA，93卷，1440-1445页(1996)；Sagliocco等，Yeast，12卷，1519-1533页(1996)；Lander，Science，274卷，536-539页(1996)))。可以通过许多技术，包括质谱技术，western印迹和利用多克隆和单克隆抗体的免疫印迹分析法及内部和N-末端微测序方法分析所得到的电泳图。利用这些技术，可能鉴定给定生理条件下(包括暴露于药物的细胞中(例如，酵母中)，或通过例如缺失或过表达特定基因而修饰的细胞中)产生的所有蛋白质的相当大部分。
基于生物学状态的其它方面的实施方案尽管监测mRNA丰度以外的细胞组分目前存在一些在监测mRNA时没有遇到的技术困难，但是对本领域技术人员显而易见的是，可以测定与细胞功能特征有关的蛋白质活性并可以基于此测定实现本发明方法的应用，即本发明的实施方案。可以通过适于待表征的特定活性的任何功能性的、生物化学的或物理的方法进行活性测定。当活性涉及化学转化时，可以使细胞蛋白质与天然底物接触，并且测定转化速率。当活性涉及多聚体单元中的联系，例如活化的DNA结合复合物与DNA的结合时，可以测定结合的蛋白质的量或此结合的次级结果，如转录的mRNA量。而且，当仅知道功能活性，例如细胞周期控制中的功能活性时，可以观察功能的实现。然而，不论是如何已知和测量的，蛋白质活性的变化形成了本发明上述方法分析的应答数据。
在备选的非限制性实施方案中，应答数据可以由细胞生物学状态的混合方面形成。可以从例如某些RNA丰度的改变、某些蛋白质丰度的改变和某些蛋白质活性的改变来构建应答数据。
SNP在应答预测中的应用SNP人类基因组中的序列变异主要由单核苷酸多态性(″SNP″)组成，其余序列变异是短串联重复(包括微卫星)、长串联重复(小卫星)和其它插入和缺失。SNP是人类群体中以可测频率(如＞1％)出现两个可替换碱基的位置。SNP被称为是″等位的″，因为由于此多态性的存在，一个物种的一些成员可能具有未突变序列(即，原始“等位基因”)，而其它成员可能具有突变序列(即变体或突变等位基因)。在最简单的情况下，可能仅存在一个突变序列，该多态性被称为二对等位基因多态性。可替换突变的发生可产生三对等位基因多态性等。SNP广泛存在于基因组中，改变基因功能的SNP可能直接有助于表型变异。由于它们的流行和普遍本质，SNP有潜力成为定位参与人类疾病情况的基因的重要工具，见如Wang等，Science 2801077-1082(1998)，它公开了一个探索性研究，其中2,227个SNP被作图定位于一个2.3兆碱基的DNA区域内。
单核苷酸多态性和特定表型之间的相关性不表示或需要SNP是该表型的原因。相反，这种相关性可能仅表示SNP位于表型决定因子在基因组上的存在位置的附近，由此更可能被发现与这些决定因子关联和由此与感兴趣的表型关联。因此，SNP可能与“真正”的功能变异存在连锁不平衡(LD)。当基因组两个不同位置上的等位基因的相关性比期望的相关性更高时存在LD，又称作等位基因相关(allelic association)。因此，SNP可以用作标记，由于其接近引起特定表型的突变而具有价值。
与疾病相关的SNP可能也对它们所处基因的功能具有直接作用。序列变异可能引起氨基酸改变或可能改变外显子-内含子剪接，由此直接改变相关蛋白，或SNP可能存在于调节区域，从而改变表达循环或mRNA稳定性，见Nowotny m，Current Opinions in Neuobiology，2001，11637-641。
载脂蛋白E(APOE)ε4等位基因在阿尔茨海默氏病(AD)中的作用最好地例证了普通基因组变异在疾病易感性中可能起的作用。ε4等位基因与AD的存在和该疾病在较小年龄起病高度相关。在研究的很多群体中见到强烈相关。见St George-Hyslop等，Biol Psychiatry 2000，47183-199。中风和心血管疾病中(见Wu等Am J Cardiol 2001，87；1361-1366)和多发性硬化中(见Oksenberg等J Neuroimmuol 2001，113171-184)也涉及多态性变异。
愈来愈清楚，很多常见紊乱的发生风险、个体对药物的应答和用于治疗这些病症的药物的代谢都实质地受到根本上的基因组变异的影响，尽管任何一个变异的作用可能很小。
因此，SNP与临床表型之间的相关性将提示，1)SNP在功能上负责表型，或2)基因组上SNP的位置附近有引起该表型的其它突变。第二个可能性以遗传生物学为基础。大段DNA遗传时，彼此紧邻的标记在很多代无关的个体中可能都不会发生重组，即，这些标记存在连锁不平衡(LD)。
因此，在定位、鉴定和表征与特定性状有关的基因时，多态性作为遗传连锁标记的用途具有重要的意义。特别地，这种作图技术允许鉴定负责各种疾病或障碍相关性状(包括疾病对各种治疗的应答)的基因。
SNP的鉴定知表征很多不同的技术可以用于鉴定和表征SNP，包括单链构象多态性分析，采用变性高效液相色谱(DHPLC)的异源双链分析，直接DNA测序和计算方法，见Shi，Clin Chem 2001，47164-172。基于公众数据库中丰富的序列信息，通过独立比对提交的给定基因序列(cDNA或基因组序列)，计算机工具可以用于in silico鉴定SNP。实验获得的SNP和通过in silico方法获得的SNP的比较显示SNPFinder(http//Ipgws.nci.nih.gov82/perl/snp/snp_cgi.pl)发现的候选SNP中55％通过实验也已经发现，见Cox等Hum Mutal 2001，17141-150。然而，这些in silico方法仅能找到27％的真正SNP。
最普通的SNP分型方法目前包括杂交、引物延伸和切割方法。这些方法的每一种都必须与适当检测系统联系起来。检测技术包括荧光极化(见Chan等Genome Res 1999，9492-499)，焦磷酸盐释放的发光计检测(焦磷酸测序，Pyrosequencing)(见Ahmadiian A等Anal Biochem 2000，280103-110)，基于荧光共振能量转移(FRET)的切割方法，DHPLC和质谱分析(见Shi，Clin Chem 2001，47164-172和美国专利6,300,076 B1)。检测和描述SNP特征的其它方法是美国专利6,297,018 B1和6,300,063 B1中公开的那些。上述参考文献公开的全部内容并入这里作为参考。
在特别优选的实施方案中，可以依靠所谓的INVADERTM技术(可得自Third Wave Technologies Inc.)完成多态性的检测。在这个实验中，当结合互补DNA模板时，特殊上游″invader″寡核苷酸和部分重叠的下游探针一起形成特殊结构。这个结构被Cleavase酶识别并在特异位点切割，这引起探针寡核苷酸的5’翼的释放。这个片段接着用作反应混合物中所含的第二合成靶和第二荧光标记的信号探针的″invader″寡核苷酸。这引起Cleavase酶对第二信号探针的特异切割。当用能够发生荧光共振能量转移的染料分子标记的这第二探针被切割时，产生荧光信号。对于由重叠DNA序列或翼形成的结构，Cleavase有严格要求，并因此可以用于特异性检测位于下游DNA链上的切割位点紧上游的单碱基对错配。见Ryan D等，Molecular Diagnosis Vol.4 No 2 1999135-144和Lyamichev V等NatureBiotechnology Vol 17 1999292-296，也见美国专利5,846,717和6,001,567(其公开的全部内容并入这里作为参考)。
在一些实施方案中，一种组合物含有用于同时探测两个或更多个多态性位点的寡核苷酸身份的两个或更多个不同标记的基因分型寡核苷酸。也可考虑含有两套或更多套等位基因特异性引物对以允许同时靶向和扩增含多态性位点的两个或更多个区域的引物组合物。
本发明的IL-1β基因分型寡核苷酸也可以固定在固体表面或在固体表面合成，如微芯片、珠或玻片(如见WO 98/20020和WO 98/20019)。这种固定的基因分型寡核苷酸可以用于各种多态性检测试验，包括但不限于探针杂交和聚合酶延伸试验。本发明的固定的IL-1β基因分型寡核苷酸可以包括为同时快速筛选DNA样品在多个基因中的多态性而设计的有序寡核苷酸阵列。
本发明等位基因特异性寡核苷酸引物具有与特定SNP的仅一种核苷酸互补的3’末端核苷酸，或优选地3’倒数第二个核苷酸，由此只有存在含该核苷酸的等位基因时其才可以用作聚合酶介导的延伸反应的引物。与编码链或非编码链杂交的等位基因特异性寡核苷酸引物包括在本发明中。使用本领域技术人员已知的技术可以开发检测IL-1β基因多态性的ASO引物。
本发明其它基因分型寡核苷酸与位于这里所鉴定的新多态性位点之一下游一个至几个核苷酸处的靶区域杂交。这种寡核苷酸可用于聚合酶介导的引物延伸方法中以检测这里所描述的新多态性之一，因此这种基因分型寡核苷酸这里称作“引物延伸寡核苷酸”。在优选实施方案中，引物延伸寡核苷酸的3’末端是与多态性位点紧临的核苷酸互补的脱氧核苷酸。
在另一个实施方案中，本发明提供了包括包装在分开容器中的至少两个基因分型寡核苷酸的试剂盒。该试剂盒也可以含有包装在分开容器中的其它成分如杂交缓冲液(此时寡核苷酸待用作探针)。可供选择地，当寡核苷酸待用于扩增靶区域时，该试剂盒可以含有包装在分开容器中的聚合酶和用于聚合酶介导的引物延伸如PCR的经优化反应缓冲液。上述寡核苷酸组合物和试剂盒在个体IL-1β基因的基因分型和/或单元型分型方法中有用。
基因分型方法的一个实施方案包括从个体分离包含个体中存在的两个IL-1β基因拷贝或其片段的核酸混合物，并确定两个拷贝在一个或多个多态性位点处的核苷酸对的身份，从而确定个体的IL-1β基因型。如本领域技术人员容易理解的，个体中基因的两个“拷贝”可以是相同的等位基因或可以是不同的等位基因。在特别优选的实施方案中，该基因分型方法包括确定每个多态性位点的核苷酸对的身份。
典型地，核酸混合物或蛋白质分离自取自个体的生物学样品，如血液样品或组织样品。合适的组织样品包括全血、血清、精液、唾液、泪液、尿液、粪便物质、汗液、口腔粘膜涂片、皮肤和特定器管如肌肉或神经组织的活检物及毛发。该核酸混合物可以由基因组DNA、mRNA或cDNA组成，并且在后两种情况下，生物学样品必须得自表达IL-1β基因的器官。而且，本领域技术人员会理解mRNA或cDNA制品不能用于检测位于内含子或5’和3’非转录区域或启动子区域的多态性。如果分离IL-1β基因片段，它必须含有待基因分型的多态性位点。
单元型分型方法的一个实施方案包括从个体分离仅包含个体中存在的两个IL-1β基因拷贝之一或其片段的核酸分子，在那个拷贝中确定一个或多个多态性位点的核苷酸身份，从而确定个体的IL-1β单元型。可以使用能够分离IL-1β基因或其片段之两个拷贝的任何方法分离该核酸，包括但不限于上述制备IL-1β同源基因(isogenes)的方法之一，体内定向克隆是优选方法。如本领域技术人员容易领会的，任何单个克隆将仅提供个体中存在的两个IL-1β基因拷贝之一上的单元型信息。如果想要个体的另一拷贝上的单元型信息，则需要检测另外的IL-1β克隆。典型地，应该检测至少五个克隆，以便有90％以上的可能性对个体中的两个IL-1β基因拷贝均实现单元型分型。在特别优选的实施方案中，鉴定每个多态性位点的核苷酸。
在优选实施方案中，通过鉴定个体中存在的每个IL-1β基因拷贝在一个或多个多态性位点的核苷酸定相序列(phased sequence)来确定个体的IL-1β单元型对。在特别优选的实施方案中，单元型分型方法包括鉴定IL-1β基因每个拷贝的每个多态性位点的核苷酸定相序列。当对两个基因拷贝进行单元型分型时，优选对位于分开容器中的每个基因拷贝实施鉴定步骤。然而，也可以预想到当用不同标签标记两个拷贝，或否则当两个拷贝可分别区分或鉴定时，在有些情况下可以在相同容器中实施该方法。例如，如果分别用不同的第一和第二荧光染料标记该基因的第一和第二拷贝，而用以第三不同的荧光染料标记的等位基因特异性寡核苷酸检测多态性位点时，则可以通过检测第一和第三染料的组合来鉴定第一基因拷贝中的多态性，而通过检测第二和第三染料的组合来鉴定第二基因拷贝中的多态性。
在基因分型和单元型分型方法中，可以直接从一个或两个拷贝的IL-1β基因或其片段扩增含多态性位点的靶区域，并以常规方法确定扩增区域的序列，由此确定多态性位点的核苷酸(或核苷酸对)的身份。本领域技术人员将容易领会到，对于多态性位点纯合的个体，将在多态性位点处两次检测到一个相同核苷酸，而对于该位点是杂合的个体，将检测到两个不同的核苷酸。可以直接鉴定多态性，称作正向鉴定，或通过推断鉴定称作反向鉴定。例如，当已知SNP在参考群体中是鸟嘌呤和胞嘧啶时，对于那个位点纯合的所有个体，可以正向确定该位点是鸟嘌呤或胞嘧啶，或如果该个体在那个位点是杂合的，则是鸟嘌呤和胞嘧啶。可供选择地，可以反向确定该位点不是鸟嘌呤(因此是胞嘧啶/胞嘧啶)或不是胞嘧啶(因此是鸟嘌呤/鸟嘌呤)。
此外，对与感兴趣的多态性位点连锁不平衡的这里未公开的多态性位点进行基因分型，可以间接确定在这里描述的任何一个新多态性位点中存在的等位基因的身份。如果一个位点的特定变异的存在增强了第二位点的另一个变异的预知性，两个位点被称为处于连锁不平衡(见，Stevens，JC1999，Mol Diag 4309-317)。与目前公开的多态性位点连锁不平衡的多态性位点可能位于该基因的区域或这里未检测的其它基因组区域中。可以通过但不限于任何上面提及的检测多态性位点的等位基因身份的方法，进行与这里描述的新多态性位点连锁不平衡的多态性位点的基因分型。
可以使用任何寡核苷酸指导的扩增方法扩增靶区域，包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)(美国专利4,965,188)，连接酶链式反应(LCR)(Barany等，Proc Natl Acad Sci USA 88189-193，1991；WO 90/01069)，和寡核苷酸连接试验(OLA)(Landegren等，Science 2411077-1080，1988)。在这种方法中用作为引物或探针的寡核苷酸应该与含有或相邻于多态性位点的核酸区域特异杂交。典型地该寡核苷酸长度在10和35个核苷酸之间，优选长度在15和30个核苷酸之间。最优选，该寡核苷酸是20至25个核苷酸长。该寡核苷酸的确切长度将依赖于本领域技术人员常规考虑和实践的很多因素。
其它已知的核酸扩增方法可以用于扩增靶区域，包括基于转录的扩增系统(美国专利5,130,238和5,169,766；EP 329，822；WO 89/06700)和等温方法(Walker等，Proc Natl Acad Sci USA 89392-396，1992)。
也可以在扩增前或后，使用本领域已知的几种基于杂交的方法之一检测靶区域中的多态性。典型地，实施这种方法时利用等位基因特异性寡核苷酸。等位基因特异性寡核苷酸可以以不同标记的探针对形式使用，这一对中的一个成员显示出与靶序列的一个变异完好匹配，另一个成员显示与不同变异完好匹配。在一些实施方案中，使用一组等位基因特异性寡核苷酸或寡核苷酸对可以一次检测一个以上多态性位点。优选，当与检测的每个多态性位点杂交时，该组的成员彼此之间具有5℃以内的解链温度，更优选2℃以内。
等位基因特异性寡核苷酸与靶多核苷酸的杂交可以以两个实体都在溶液中实施，或可以当寡核苷酸或靶多核苷酸共价或非共价固定于固相载体时，实施这种杂交。可以例如通过抗体-抗原相互作用，聚-L-Lys，链霉抗生物素或抗生物素蛋白-生物素，盐桥，疏水相互作用，化学键，UV交联烤焙等介导此固定。等位基因特异性寡核苷酸可以在固相载体上直接合成或在合成后结合于固相载体上。适合用于本发明检测方法的固相载体包括由硅、玻璃、塑料、纸等制造的基质，它们可以形成例如孔(如96孔板)、载片、薄片、膜、纤维、芯片、盘和珠。可以处理、包被或衍生化固相载体以利于等位基因特异性寡核苷酸或靶核酸固定。
个体的IL-1β基因的基因型或单元型也可以通过含该基因的一个或两个拷贝的核酸样品与如WO 95/11995所述的核酸阵列和亚阵列杂交来确定。该阵列将含有代表包括在该基因型或单元型中的每个多态性位点的一组等位基因特异性寡核苷酸。
也可以使用错配检测技术确定多态性的身份，包括但不限于使用riboprobe的RNA酶保护方法(Winter等，Proc Natl Acad Sci USA 827575，1985；Meyers等Science 2301242，1985)和识别核苷酸错配的蛋白，如大肠杆菌mutS蛋白(Modrich P. Ann Rev Genet 25229-253，1991)。可供选择地，单链构象多态性(SSCP)分析(Orita等，Genomics 5874-879，1989；Humphries等，《Molecular Diagnosis of Genetic Diseases》，Elles，ed.，pp.321-340，1996)或变性梯度凝胶电泳(DGGE)(Wartell et at.，Nucl Acids Res182699-2706，1990；Sheffield等，Proc Natl Acad Sci USA 86232-236，1989)可鉴定等位基因变体。
聚合酶介导的引物延伸方法也可以用于鉴定多态性。专利和科学文献中已经公开了几个这种方法，包括“遗传二进制分析”方法(WO 92/15712)和连接酶/聚合酶介导的遗传二进制分析(美国专利5,679,524)。WO91/02087，WO 90/09455，WO 95/17676，美国专利5,302,509和5,945,283中公开了相关方法。可以如美国专利5,605,798所述用质谱分析仪检测含多态性的延伸引物。另外的引物延伸方法是等位基因特异性PCR(Ruafio等，Nucl Acids Res 178392，1989；Ruafio等，Nucl Acids Res 19，6877-6882，1991；WO 93/22456；Turki等，J Clin Invest 951635-1641，1995)。此外，使用Wallace等(WO 89/10414)所述的等位基因特异性引物组同时扩增核酸的多个区域可以研究多个多态性位点。
在优选的实施方案中，检测每个地理种群组的单元型频率数据，确定它是否与哈迪-温伯格平衡(HWE)一致。哈迪-温伯格平衡(Hartl等，Principles of Population Genomics，Sinauer Associates(Sunderland，MA)，3rd Ed.，1997)假定，发现单元型对H1/H2的频率等于当H1≠H2，PH-W(H1/H2)＝2p(H1)p(H2)；当H1＝H2，PH-W(H1/H2)＝p(H1)p(H2)。观察到的和预期的单元型频率之间的统计学显著差异可能是由于一个或多个因素引起，包括该组群体中的明显近亲交配，对基因的强大选择压力，取样偏差，和/或基因分型方法中的错误。如果在一个地理种群组中观察到与哈迪温伯格平衡大的偏差，那么可以增加那个组的个体数量看看该偏差是否由于取样偏差引起。如果更大的样本量不降低观察到的和预期的单元型对频率之间的差异，那么可能希望考虑使用直接单元型分型方法对个体进行单元型分型，如CLASPER SystemTM技术(美国专利5,866,404)，SMD或等位基因特异性长距离PCR(Michalotos-Beloin等，Nucl Acids Res244841-4843，1996)。
在预测IL-1β单元型对的这个方法的一个实施方案中，单元型确定步骤包括实施下列分析。第一，每个可能的单元型对与参考群体的单元型对进行比较。通常，参考群体中仅一个单元型对与可能的单元型对匹配，故该个体被确定为该单元型对。偶尔，参考单元型对中仅一个单元型与个体可能的单元型对一致，在这种情况下，该个体的单元型对被确定为包含这个已知单元型和从该可能单元型对中减去此已知单元型得到的新单元型。在很少的情况下，参考群体中无单元型与可能的单元型对一致，或可替换地，多个参考单元型对与可能的单元型对一致。在这种情况下，优选使用直接分子单元型分型方法对个体进行单元型分型，例如，CLASPERSystemTM技术(美国专利5,866,404)，SMD或等位基因特异性长距离PCR。参见Michalotos-Beloin等，同上引文。
修饰mRNA的丰度或活性的方法在本发明各种实施方案中，通过改变或修饰表达的mRNA的丰度或活性产生临床上有益的效果。目前，修饰RNA丰度和活性的方法包括4类核酶、反义物、双链RNA和RNA适体(aptamer)(Good等，Gene Therapy，4卷，45-54页(1997))。将细胞可控性应用或暴露于这些实体允许可控的干扰RNA的丰度，包括mRNA丰度和活性(包括其向活性或可检测的基因表达产物即蛋白质的翻译)。
核酶核酶是以与DNA限制性内切核酸酶相似的方式特异切割其它单链RNA的RNA分子。核酶具有催化RNA切割反应的能力(Cech，Science，236卷，1532-1539页(1987)；1990年PCT国际公布WO 90/11364；Sarver等，Science，247卷，1222-1225页(1990))。如Cech，Amer.Med.Assn.，260卷，3030页(1988)所述，通过修饰编码RNAs的核苷酸序列，可以合成核酶以识别分子中特异核苷酸序列并将其切割。因此，仅具有特定序列的mRNA被切割和失活。
两种基本类型的核酶包括“锤头”型(如，Rossie等，Pharmac.Ther，50卷，245-254页(1991)中所述)和“发夹”型核酶(如Hampel等，Nucl.Acids Res.，18卷，299-304页(1999)和美国专利号5,254,678中所述)。可以设计发夹和锤头RNA核酶以特异切割特定的靶mRNA。已经确定了设计具有核酶活性的短RNA分子的规则，该RNA分子能以高度序列特异性方式切割其它RNA分子，并且能靶向实际上所有种类的RNA(Haseloff等，Nature，334卷，585-591页(1988)；Koizumi等，FEBS Lett.，228卷，228-230页(1988)；Koizumi等，FEBS Lett.，239卷，285-288页(1988))。
核酶方法涉及使细胞暴露于这种小RNA核酶分子，诱导其在细胞中表达，等(Grassi等，Annals of Medicine，28卷，499-510页(1996)；Gibson，Cancer and Metastasis Reviews，15卷，287-299页(1996))。可以通过靶向对应于至少一种公开基因的mRNA的锤头和发夹核酶在细胞内的表达以抑制该基因编码的蛋白质。
可以用包含核酶序列的RNA寡核苷酸形式直接向细胞递送核酶，或者以编码期望核酶RNA的表达载体形式向细胞引入核酶。核酶可以在体内以足够有效催化切割mRNA的数量常规地表达，由此修饰细胞中mRNA丰度(参见，Cotton等，“核酸介导的体内RNA破坏”，The EMBO J.，8卷，3861-3866页(1989))。特别地，可以将根据以前规则设计，并且例如通过标准亚磷酰胺化学法合成的核酶编码DNA序列连接到编码tRNA的基因的反密码子茎和环的限制性酶位点中，然后通过本领域常规方法转化其进入目的细胞并在细胞中表达。优选地，还向该构建体引入诱导型启动子(例如，糖皮质激素或四环素效应元件)，这样可以选择地控制核酶表达。对于饱和应用，可以利用具有组成型高活性的启动子。因为tDNA基因(即，编码tRNA的基因)的小尺寸和在不同种类组织中的高转录速率及普遍表达，所以tDNA基因在本申请中是有用的。
因此，可以常规地设计核酶以切割实际上任何mRNA序列，并且可以用编码这种核酶序列的DNA常规地转化细胞以可控表达催化有效量的核酶。因此，可以修饰或干扰细胞中实际上任何RNA种类的丰度。
可以用与就反义核苷酸所述的方式基本相同的方式修饰核酶序列，例如核酶序列可以含有修饰的碱基部分。
反义分子在另一个实施方案中，可以通过反义核酸的可控应用可控地抑制靶RNA(优选mRNA)种类的活性，特别是其翻译速率。高水平应用引起饱和抑制。这里所用的“反义”核酸指能够借助于与编码和/或非编码区域的一定序列互补性而与靶RNA的序列特异(例如非polyA)部分(例如其翻译起始区)杂交的核酸。本发明的反义核酸可以是双链或单链寡核苷酸，可以是RNA或DNA或其修饰物或衍生物，并且可以以可控方式给细胞直接施用，或者可以通过外源引入序列的转录-以足够干扰靶RNA翻译的可控量在细胞内产生。
优选地，反义核酸至少具有6个核苷酸，优选是寡核苷酸(范围从6到约200个寡核苷酸)。在特定方面，寡核苷酸具有至少10个核苷酸，至少15个核苷酸，至少100个核苷酸，或至少200个核苷酸。寡核苷酸可以是DNA或RNA或它们的嵌合混合物或衍生物或修饰形式，并可以是单链或双链。可以在碱基部分，糖部分或磷酸骨架修饰寡核苷酸。寡核苷酸可以包含其它附加基团，如肽或有利于跨细胞膜转运的因子(参见，例如Letsinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86卷，6553-6556页(1989)；Lemaitre等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84卷，648-652页(1987)；1998年PCT
发明者M·M·德雷斯曼, S·库达拉瓦利, R·H·马利诺夫斯基, L·A·麦克莱恩, M·H·波利梅罗普罗斯 申请人:诺瓦提斯公司